DE3686867T2

DE3686867T2 - Verfahren und mittel zum erkennen einer infektion bei tieren.

Info

Publication number: DE3686867T2
Application number: DE8686309347T
Authority: DE
Inventors: John Francis Thomas Griffin
Original assignee: University of Otago
Current assignee: University of Otago
Priority date: 1985-12-02
Filing date: 1986-12-01
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2006-12-02
Also published as: EP0227335A3; DE3686867D1; AU6581786A; EP0227335A2; AU597313B2; EP0227335B1; US4886655A; NZ214400A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion in Wiederkäuern. Insbesondere betrifft es ein Verfahren zum Nachweis verschiedener Krankheiten in einem Wiederkäuer, indem vom Wiederkäuer entnommene Blutproben getestet werden.
Die zentrale Bedeutung von Wiederkäuern im Primärproduktbereich unterstreicht die Notwendigkeit, diese Tiere vor Krankheiten zu schützen. Die Bekämpfung dieser Krankheiten ist entscheidend für die Rentabilität dieser Art der Industrie. Dementsprechend ist der Nachweis einer Infektion in einer Tierherde von großer Bedeutung, um zum Schutz des Restes der Herde infizierte Tiere zu isolieren und/oder auszumerzen.
Das Immunsystem ist der zentrale, am Schutz vor einer Infektion beteiligte, physiologische Mechanismus. Setzt man ein Individuum einem virulenten Organismus aus, wird das Immunsystem zur Herstellung von Antikörpern oder aktivierten Lymphocyten (T-Zellen) angeregt, die den angreifenden Organismus unwirksam machen oder abtöten und seine Vernichtung verursachen. Obwohl eine akute durch toxinherstellende Bakterien verursachte Infektion durch Antikörperbildung wirksam bekämpft wird, hat diese keine direkte Wirkung auf eine chronische bakterielle Infektion durch Organismen wie die, die Tuberkulose verursachen. Eine spezifische T-Zellen erzeugte zellvermittelte Immunität (CMI, "cell mediated immunity") bekämpft eine Infektion, indem die Organismen innerhalb einer zellulären Läsion (Granulom) eingeschlossen werden. Nach dem Verschwinden der Infektion bleibt eine Resterinnerung an den Organismus zurück.
In der Tiermedizin wurden Immunitätsparameter häufig verwendet, um Tiere zu identifizieren, die, nachdem sie einer Infektion ausgesetzt waren, eine Immunantwort aufgebaut haben. Insbesondere in den letzten 50 Jahren wurde die Messung von CMI durch intradermales, cervicales Testen der Haut (CT, "cervical skin testing") häufig zur Identifizierung von tuberkuloseinfizierten Menschen und Vieh angewendet. Obwohl der Test eine Reihe von Vorteilen hat, besitzt er auch eine Reihe von Einschränkungen. Die Einschränkungen von besonderer Bedeutung sind wie folgt:
bedingt durch die nicht nachweisbare Immunantwort (falsch (-) Reaktanden) fehlt dem Test die Fähigkeit, einige infizierte Tiere in einer Herde nachzuweisen; wird nur das Rindertuberculin im CT verwendet, so wird es Reaktionen in nicht tuberkuloseinfizierten Tieren erzeugen, die nichtvirulenten Organismen, wie M. avium, ausgesetzt waren (falsch (+) Reaktanden); da das Vorkommen von tuberkuloseinfizierten Herden abnimmt, könnte die Zahl der beobachteten nicht erkennbaren Läsions- Reaktanden (NVL, "non-visible lesion") signifikant werden; und es ist ein relativ langer Abstand zwischen dem Testen der Herden notwendig (bis zu 3 Monaten), da das Testen der Haut eine Unterdrückung der Reaktionsfähigkeit von bis zu 60 Tagen nach Durchführung des Testens bewirkt. Eine weitere Einschränkung bezüglich der Verwendung des CT-Tests als Mittel zur Identifizierung einer Infektion besteht darin, daß dieser Test die Möglichkeit zur Impfung der Tiere ausschließt, da sich ein positiver Hauttest unabhängig davon ergeben wird, ob das Tier infiziert oder immun ist.
Das Versagen des CT-Tests, stark infizierte, eine nicht nachweisbare Immunantwort erzeugende Tiere nachzuweisen, stellt für die Industrie eine Hauptgefahr dar, nämlich, daß dadurch infizierte Tiere in der Herde gelassen werden, die weitere zuvor gesunde Tiere infizieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einige Schritte in die Richtung zur Bewältigung der vorstehenden Nachteile zu machen, oder zumindest der Öffentlichkeit eine nützliche Auswahl zu bieten.
Dementsprechend besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion in einem Wiederkäuer, wobei man
(a) sich eine Blutprobe des Wiederkäuers verschafft;
(b) einen Test über die Funktion mononuclearer Zellen durchführt;
(c) einen Entzündungsparameter der Probe mißt; und
(d) die in den Schritten (b) und (c) erhaltenen Ergebnisse mit einer vorher bestimmten Datenbank vergleicht, um den Infektionsstatus des Wiederkäuers zu bestimmen.
Die Anwesenheit von Mikroorganismen unter Bedingungen, die zur Replikation führen und eine als Läsion bezeichnete Wirtsantwort hervorrufen, wird hier mit dem Begriff "Infektion" bezeichnet.
Zweckmäßigerweise testet der in Schritt (b) durchgeführte Test auf die Transformation von T-Zellen oder auf von aktivierten T-Zellen erzeugte Lymphokine.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der getestete Entzündungsparameter eine Makrophagenzellzahl, eine Neutrophilenzellzahl, die Viskosität des Plasmas der Probe oder die Bestimmung des Spiegels von eine Entzündung anzeigenden Plasmaproteinen in der Probe.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Unterscheidung zwischen Infektion und Immunität in einem Wiederkäuer, wobei man
(a) sich eine erste Blutprobe des Wiederkäuers verschafft;
(b) einen Test über die Funktion mononuclearer Zellen in der ersten Probe durchführt;
(c) einen Entzündungsparameter der ersten Probe mißt;
(d) die in den Schritten (b) und (c) erhaltenen Ergebnisse mit einer vorher bestimmten Datenbank vergleicht, um eine vorläufige Diagnose des Infektionsstatus des Wiederkäuers zu stellen;
(e) sofern die vorläufige Diagnose darauf schließen läßt, daß der Wiederkäuer infiziert ist, auf das Verstreichen einer Zeitspanne wartet, die für eine Bestätigung ausreicht, daß sich die Infektion manifestiert oder verschwindet;
(f) sich eine zweite Blutprobe des Wiederkäuer verschafft;
(g) die vorstehenden Schritte (b), (c) und (d) mit der zweiten Probe wiederholt, um die Diagnose des Infektionsstatus des Wiederkäuers zu bestätigen; und
(h) den vorläufigen ersten Infektionsstatus und den bestätigenden Infektionsstatus vergleicht, um zu bestimmen, ob sich die Infektion manifestiert oder verschwindet.
Die Erfindung wird durch die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert, wobei
Fig. 1 eine Darstellung der Zellinteraktionen bei der Immunantwort ist.
Fig. 2 eine multivariante Analyse der Immun- und Entzündungszellparameter ist.
Fig. 3 eine Reihe von multivarianten, über eine Zeitspanne von 8 Monaten mit einem infizierten Tier durchgeführten Analysen zeigt.
Die vorliegende Erfindung besteht darin, das Vorliegen oder Fehlen einer Infektion in einem Wiederkäuer durch Untersuchung von dessen Blut nachzuweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung einer Blutprobe, um das Vorliegen oder Fehlen von Faktoren festzustellen, die eine Infektion anzeigen.
Obwohl die Erfindung insbesondere im Hinblick auf den Nachweis von Tuberkulose (TB) in Rotwild beschrieben wird, wird darauf hingewiesen, daß Tuberkulose und Rotwild nur ein Beispiel für eine chronische Infektion in einem Wiederkäuer sind, bei dem das Verfahren verwendet werden kann. Das Verfahren kann auch bei anderen Wiederkäuern wie Rindvieh, Schafen und Ziegen, und bei anderen Infektionen solcher Wiederkäuer verwendet werden.
Der erste Schritt des Verfahrens beinhaltet den Schritt, eine Blutprobe von einem Wiederkäuer zu entnehmen. Dies kann durch jedes bekannte, für diesen Zweck geeignete Verfahren erreicht werden. Zweckmäßigerweise verwendet man eine Spritze, um eine 20 ml Blutprobe von dem Wiederkäuer zu entnehmen.
Im dem zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Blutprobe zur Bestimmung der mononuclearen Zellfunktion getestet. Mononucleare Zellen sind ein integraler Bestandteil der Antwort des Immunsystems auf einen eindringenden Organismus. Die grundlegenden Mechanismen dieser Antwort sind in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1 sind Beispiele bevorzugter Stellen angegeben, an denen derartige Tests mononuclearer Zellen durchgeführt werden können, wobei diese Stellen mit (l), (i), bzw. (p) bezeichnet sind.
Der Test an der Stelle (l) ist allgemein als Lymphocyten- Transformationstest (LT) bekannt und überwacht die spezifische Aktivierung einer Teilpopulation der T-Lymphocyten (den Td-Zellen). Insbesondere beinhaltet dieser Test, daß aus einer Blutprobe erhaltene mononucleare Zellen einem Antigen ausgesetzt werden und anschließend die mononuclearen Zellen in Gegenwart von radioaktiv markierten Nucleotiden, wie tritiummarkiertem Thymidin, kultiviert werden. Die Aufnahme der radioaktiv markierten Nukleotide mißt die Rate, mit der die T-Zellen unter dem spezifischen Einfluß des Testantigens replizieren. Diese Spezifität der Antwort ist von besonderer Bedeutung für die Entscheidung, ob eine echte Infektion vorliegt oder nicht.
Der Test an der Stelle (i) beinhaltet die Messung des Lymphokins Interleukin-2 (IL-2), das durch eine andere Teilpopulation der T-Lymphocyten, den Th-Zellen, erzeugt wird. Die Blutprobe wird beispielsweise durch Zentrifugation in Blutzellen und Überstand getrennt, und der Überstand wird zurückbehalten. Die Menge an erzeugtem Interleukin-2 wird durch die Fähigkeit des Kulturüberstands quantifiziert, Standardzielzellen zu aktivieren. Da IL-2 in einem frühen Stadium der Immunantwort erzeugt wird, erlaubt dieser Test festzustellen, bis zu welchem Stadium die Infektion fortgeschritten ist.
Der Test an der Stelle (p) mißt ebenfalls die Aktivierung der Td-Zellen. Wenn die Zellen aktiviert sind, erzeugen sie ein anderes Lymphokin in Form eines speziellen, entzündungsfördernden Faktors, der Procoagulans genannt wird. Die Erzeugung dieses Faktors aktiviert die Entzündungszellen, so daß sie den Koagulierungsweg und insbesondere die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin anregen. Die vorhandene Menge an Procoagulans wird durch Abtrennen der Zellen aus einer Blutprobe, Zugabe der Zellen zu calciumfreiem Blutplasma und Messen des Zeitraums quantifiziert, den das Plasma zum Verklumpen braucht.
Andere Tests, die zur Messung mononuclearer Zellfunktion verwendet werden können, beinhalten ebenfalls die Quantifizierung der Lymphokinherstellung durch aktivierte Zellen. Beispiele solcher anderer Tests beinhalten eine Bestimmung der Produktionsrate von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) oder Interferon.
Das Vorstehende stellt eine allgemeine Beschreibung der Tests dar, die im zweiten Schritt des Verfahrens verwendet werden können. Die Einzelheiten dieser Tests sind einem Fachmann bekannt.
Der dritte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Messung eines Entzündungsparameters der Blutprobe. Beispiele für Parameter, die zweckmäßigerweise gemessen werden können, sind Makrophagenzellpopulationen, Neutrophilenzellpopulationen, Viskosität des Plasmas und der Spiegel von eine Entzündung anzeigenden Plasmaproteinen, wie Fibrinogen oder α- 2-Globuline.
Obgleich es möglich ist, einen dieser Parameter in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden, wird in den bevorzugten Ausführungsformen mehr als ein Entzündungsparameter gemessen, um die Möglichkeit eines Irrtums zu verringern. Beispielsweise können alle vier der vorstehend genannten Parameter gemessen werden.
Die Zellpopulationen einer Blutprobe können leicht durch die Verwendung eines automatischen Zell-Zählgeräts ("cellcounter"), wie der "Technicon Haematology Analyser H 6000/C", gemessen werden. Ein solches Gerät quantifiziert die Population einer bestimmten Zelle durch Messung des durch die Zelle gestreuten Lichts und der Zellgröße sowie durch Messung des Enzymgehalts der Zelle.
Die Viskosität des Plasmas kann ebenfalls mit einem Gerät zur Messung dieses Faktors, wie ein "Harkness"-Viskosimeter, bestimmt werden. Dieses Gerät mißt die Viskosität des Plasmas, indem die Durchflußrate einer Probe durch ein Kapillarröhrchen mit standardisierter Größe bei einer kontrollierten Temperatur gemessen wird.
Der Fibrinogenspiegel der Probe wird durch Bestimmung der Zeit gemessen, die zur Fibrinbildung nach Zugabe von Thrombin zu der Probe benötigt wird.
Die Anwesenheit von α-2-Globulinen in der Probe kann mit Hilfe von Standard-ELISA-Techniken gemessen werden.
Der verbleibende Schritt des Verfahrens umfaßt das Vergleichen der Ergebnisse des Tests in Schritt (b) und der Messung in Schritt (c) mit einer vorher bestimmten Datenbank, um den Infektionsstatus des Wiederkäuers zu bestimmen. Die Datenbank wird erstellt, indem eine große Anzahl von als normal anzusehenden Tieren eingesetzt wird, um die mononucleare Zellfunktion zu testen und jeden der Parameter des Blutes zu messen, das den Tieren entnommen wurde. Der Mittelwert der erhaltenen Ergebnisse wird dann zusammen mit der Mittelwertabweichung berechnet, um einen Vergleichs-Verteilungsbereich zu erstellen.
Obgleich die Vergleichs-Datenbank mit als normal anzusehenden Tieren erstellt worden ist, wird darauf hingewiesen, daß der Mittelwert und Verteilungsbereich von jedem Ergebnis durch Daten von Tieren verbessert und wenn nötig präzisiert werden kann, deren Infektionsstatus später durch Autopsie bestätigt wurde. Unter optimalen Bedingungen wird die Datenbank nur Daten von Tieren enthalten, deren Infektionsstatus in dieser Weise bestätigt wurde.
Ein Beispiel für eine wie vorstehend bestimmte Datenbank für Rotwild ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Ergebnisse werden als "counts" pro Minute (Cpms) angegeben, die sich nach Inkubation von 2·10&sup5; mononuclearen Zellen aus Rotwild mit 0.5 uCi³ H-Thymidin über die letzten 18 Stunden eines 144 Stunden Kultivierungszeitraums ergeben. Vergleichsbereich, Mittelwerte und Standardabweichungen entstammen 205 Rotwildtieren verschiedenen Alters, bei denen keine Hauttestreaktionen durchgeführt wurden und die aus Tbfreiem Gebiet stammen. Der Bereich der Reaktanden wird aus 145 Vogel-Reaktanden und 450 Rinder-Reaktanden gebildet. Vergleichswerte der Kontrolltiere Vogel-PPD Rinder-PPD Concanavalin A Kontrolle Mittelwert Standardabweichung * Cpms Klassifikationsgrenzwerte Vogel-Reaktanden-TransformationRinder-Reaktanden-Transformation

+Cpms.·10²

Hämatologiebereich (frisch entwöhnte Tiere)

Fibrinogen 167-387 (mg/dl) Neutrophile 26-65%
Plasmaviskosität 1003-1171 (cp) Neutrophile 0.79-4.21·10&sup9;/l
Hämoglobin 160-213 (g/l) Lymphocyten 1.34-3.61·10&sup9;/l
Wie in der vorstehenden Tabelle gezeigt, werden die Tiere je nach den in den durchgeführten Tests erhaltenen Ergebnissen in Klassen A1-A6 oder B1-B8 unterteilt, wobei die Klassen A1- A6 die Vogel-Reaktanden beinhalten und die Klassen B1-B8 die Rinder-Reaktanden beinhalten. Weist ein Tier ein hohes Maß an Vogel-Reaktivität (z. B. > A3) oder ein niedriges Maß an Rinder-Reaktivität (z. B. > B1) auf, so wird sein Infektionsstatus generell als unklar betrachtet. Bei solchen Tieren wird eine zweite Blutprobe entnommen und getestet, wobei das Tier als infiziert oder infektionsfrei diagnostiziert werden kann.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Infektion und Immunität in einem Wiederkäuer.
Dementsprechend wird eine erste Blutprobe von dem Wiederkäuer entnommen und der Infektionsstatus gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Wird der Wiederkäuer als Ergebnis dieser Bestimmung als infiziert diagnostiziert, wird eine zweite Blutprobe nach dem Verstreichen einer Zeitspanne gewonnen, die für eine Bestimmung ausreicht, ob sich die Infektion manifestiert oder verschwindet.
Um dies zu erreichen werden die Tests, Messungen und Vergleiche der Schritte (b), (c) und (d) des Verfahrens wie vorstehend beschrieben durchgeführt, und der aus der Analyse der zweiten Blutprobe bestimmte Infektionsstatus wird mit dem aus der ersten Blutprobe bestimmten verglichen. Wo sich die Infektion manifestiert hat, werden die von der zweiten Blutprobe erhaltenen Ergebnisse den Wiederkäuer in die Kategorie einordnen, die den relativen Rang der zum Schlachten vorgesehenen Tiere beinhaltet. Im Gegensatz dazu werden sich die Ergebnisse der zweiten Probe dort, wo der Wiederkäuer eine Immunität gegen die Infektion entwickelt hat und die Infektion deshalb verschwunden ist, nach unten in Richtung des Vergleichs-Verteilungsbereichs bewegt haben, der für gesunde Tiere bestimmt wurde. Dies ist ein besonders wichtiger Vorteil des vorliegenden Verfahrens, da Tiere gerettet werden können, die ansonsten geschlachtet worden wären. Dadurch werden unnötige Verluste im Hinblick auf Zuchtvieh und Kapital vermieden.
In Fällen, wo der Unterschied zwischen erstem und zweitem Infektionsstatus anzeigt, daß die Infektion verschwindet, können eine oder mehrere zusätzliche Proben genommen werden, um das Verschwinden der Infektion zu überwachen.
Erfindungsgemäß ist es vorteilhaft, eine Zeitspanne von mindestens einem Monat zwischen den Proben verstreichen zu lassen. Vorzugsweise liegt diese Zeitspanne zwischen 3 und 6 Monaten. Besonders bevorzugt ist die Zeitspanne zwischen den Proben so lang, wie es im Hinblick auf die anfängliche Klassifizierung des Tieres möglich ist.
Das erfindungsgemäße in vitro-Verfahren bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem in vivo-Hauttestverfahren. Diese Vorteile umfassen den der Flexibilität, d. h. ausgewählte Tests können zur Messung der individuellen T-Zellfunktion verwendet werden; den Vorteil der Spezifität, d. h. innerhalb eines Tests können Reaktionen auf nahe verwandte Antigene (M.bovis und M.avium) unterschieden werden; den Vorteil der Sensitivität, d. h. Labortests können unter besonders kontrollierten Bedingungen ausgeführt werden, wobei die Überwachung der Reaktionen bestimmter Zell-Teilpopulationen eindeutigere Reaktionen bereitstellt, um zwischen "resistenten" und "infizierten" Tieren zu unterscheiden, und der Vorteil der Wiederholbarkeit d. h. über eine kurze Zeitspanne können viele Wiederholungstests durchgeführt werden, ohne daß diese durch vorheriges Testen beeinträchtigt werden.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren wird durch eine Reihe von Beispielen näher erläutert.
In vitro-Tests zur Bestimmung des Spiegels der zellulären Immunität und Entzündung wurden durchgeführt, indem Blutproben aus Hauttest-Reaktanden und Kontrollrotwild verwendet wurden. In den Beispielen wurde der LT-Test verwendet, der wie folgt durchgeführt wurde.
Eine Probe von etwa 20 ml Blut wurde jedem Tier entnommen. Mit Hilfe des folgenden Verfahrens wurden Leucocytenkulturen aus den Proben erhalten. Die Blutzellen wurden auf einem Dichtegradienten abgetrennt und nach Waschen mit Kulturmedium (RPMI) in mit Vergleichsserum angereichertem Kulturmedium in einer Standardkonzentration resuspendiert.
Die so erhaltenen Leucocytenkulturen wurden unter Verwendung von herkömmlichen Aufarbeitungen aus Rinder-, Vogel- oder Menschen-Tuberkulin-PPD und Johnin-PPD getestet, die alle von CSL erhalten wurden. Positive Kontroll-Transformationstests wurden unter Verwendung von unspezifischen Stimulantien (Kermesbeere, "Pokeweed" Mitogen-PWM und Concanavalin A - Con A) durchgeführt, um die Lebensfähigkeit jeder Zellpräparation sicherzustellen. Negative Kontrollen wurden durchgeführt, indem Leucocyten in Abwesenheit jeglicher Stimulantien kultiviert wurden.
Anschließend wurden 100 ul der Leucocytenzellen dreifach in sterile Mikrokultur-Vertiefungen verteilt. In die jeweiligen Vertiefungen wurden dann 50 ul des entsprechenden Antigens, Referenzmitogens oder Kontrollkulturmediums gegeben. Danach wurden die Zellen 5 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator, der eine bestimmte Luftfeuchtigkeit aufweist, inkubiert.
50 ul eines 0.5 uCi einer radioaktiven Markierung (³H-Thymidin) enthaltenden Mediums wurden in jede Vertiefung gegeben. Vor dem Trocknen und Zählen in einem β'- Szintillationszähler wurden die Inhalte aus jeder Vertiefung auf Glasfaserplatten gesammelt. Die Ergebnisse wurden als Menge an Radioaktivität pro Dreifach-Kultur in "counts" pro Minute (cpms)· 10² ausgedrückt. Gruppenmittelwerte wurden für jedes Stimulans erhalten und die relative Reaktivität wurde durch Vergleich mit den positiven und negativen Kontrollwerten bestimmt.
Die in den Beispielen gemessenen Entzündungsparameter beinhalten Zell-Zahlen von Makrophagen- und Neutrophilenpopulationen ebenso wie die Bestimmung der Viskosität des Plasmas und des Fibrinogenspiegels in der Probe. Die Messungen wurden wie folgt durchgeführt.
Die Blutzellpopulationen wurden gezählt, indem eine 3 ml- Probe in einen automatischen "Harvester" gegeben wurde. Ein Aliquot wurde dann durch das Gerät entnommen und in einem automatischen Zyklus nach Zugabe von bestimmten Chemikalien die entsprechenden Zellpopulationen überwacht. Die Daten wurden dann durch Vergleich mit internen Standards analysiert und als Gesamtzellzahl pro ml oder in Form von Zellverhältnissen in Prozentwerten ausgedrückt.
Die Viskosität des Plasmas wurde durch Durchfluß von 500 ul Plasma durch ein Harkness-Viskosimeter gemessen.
Die vorhandene Fibrinogenmenge wurde durch Zugabe von 165 ul Thrombin zu 165 ul Plasma und Messung des gebildeten Fibrins bestimmt.

Beispiel 1:

Eine Untersuchung wurde mit einer "Problemherde" gemacht, in der klinische TB diagnostiziert worden war. Die vom Testen der "Problemherde" stammenden Ergebnisse ermöglichten eine kritische Einschätzung der Korrelation zwischen Hauttestreaktionen und Lymphocytenreaktivität. In dieser Herde wurde klinische TB erstmalig im Februar 1984 bei einer ausgewachsenen Hirschkuh diagnostiziert.
Das Testen der Herde begann am 10. Februar 1985 und von 200 getesteten Tieren waren 62 Reaktanden. Alle Reaktanden wurden geschlachtet. Im zweiten Test der Herde (13. Juni 1985) wurden unter 127 Tieren 30 Reaktanden gefunden. Fünf Reaktanden-Hirschkühe (15. Juli 1985) wurden durch Autopsie und auf Lymphocytenreaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Vier tot aufgefundene frisch entwöhnte Tiere (1. August 1985) zeigten nach einer Autopsie klinische TB-Läsionen. Alle diese Tiere wiesen beim letzten Test der Herde (13. Juni 1985) einen negativen Hauttest auf. Der dritte Test der Herde begann am 29. August 1985, wobei Blutproben von jedem dieser Tiere vor dem "CT" entnommen wurden. Von 66 getesteten Tieren reagierten 15; 7/21 frisch entwöhnte Tiere, 7/20 2 Jahre alte Hirschkühe und 1/25 ausgewachsene Hirschkuh.
Die von den frisch entwöhnten Tieren (Tabelle 3) und von den Hirschkühen (Tabellen 4 und 5) erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß in der Herde TB-Exposition weit verbreitet war, wobei eine große Zahl von Tieren sehr stark auf Myco bovis reagierte. Zur Überprüfung der Gültigkeit wurden sieben Reaktanden, und zwar die frisch entwöhnten Tiere, sowie ein Tier (Nr. 0998-Tabelle 3) geschlachtet, das im Hauttest negativ war, aber in der Leucocytenkultur starke Reaktion auf TB zeigte. Die Befunde bestätigten unsere Vorhersage, daß 6 der Reaktanden (frisch entwöhnten Tiere) Läsionen haben würden und daß Nr. G301, trotz positiven Hauttests, nicht infiziert sein würde, da es im Labortest negativ war. Von unseren Befunden ausgehend sagten wir vorher, daß Nr. 0998 im Hauttest falsch (-) sein würde und TB-Läsionen haben sollte. Unsere Annahme wurde durch die Bestätigung, daß dieses Tier Läsionen hatte (retropharyingal und mesenterisch), erhärtet. Unsere Ergebnisse können außerdem darauf schließen lassen, daß eine Zahl von falsch (-)-Tieren innerhalb der Gruppe der frisch entwöhnten Tiere verbleiben (5 von 10). Ausgehend von diesen Befunden läßt sich auch vorhersagen, daß es eine signifikante Anzahl von falsch (-)-Tieren in der Gruppe der 2 Jahre alten Tiere (7 von 13, Tabelle 4) und in der Gruppe der ausgewachsenen Tiere (16 von 24, Tabelle 5) gibt. Alle diese Tiere reagierten auf die 3 kürzlich abgeschlossenen Hauttests nicht. Die Steigerung der Reaktivität bei älteren Tieren ist ebenfalls auffallend und legt eine verstärkte TB-Exposition über einen langen Zeitraum nahe.

Beispiel 2:

In diesem Beispiel wird die relative Vorhersagbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und des CT-Tests bei der Bestimmung des Läsionsstatus in Tieren verglichen. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Tabelle 2
Vergleich zwischen der Reaktivität bei Läsions-positiven Hauttest-Reaktanden: Ausgewachsenes Rotwild und Kontrollen Tier Nr. Rinder Vögel Kontrolle Läsions-Reaktanden Reaktand ohne Läsion Negative Kontrolle

(Ergebnisse in cpms·10²)

Anmerkung:

a) Maß an Lymphocytenreaktivität auf Rinder- Tuberkulin ( > 200) bei Läsions-Reaktanden
b) Rinder > Vögel
c) Geringe Reaktion in zu überprüfendem Reaktand ohne Läsion falsch (+) Hauttest-Reaktand

Tabelle 3

Transformation bei Hauttest-Reaktanden aus der Gruppe der frisch entwöhnten Tiere und Kontrollen aus einer mit Myco bovis infizierten Herde Hauttest-Reaktanden Tier Nr. Rinder Vögel Kontrolle Autopsiestatus Läsionen * keine sichtbaren Läsionen Hauttest-Nagative nicht anwendbar + Läsionen nach Autopsie

Anmerkung:

Ausgewählte Autopsie, die bei allen Hauttest-positiven, frisch entwöhnten und einem (0998) Hauttestnegativen, verdächtigen Tieren durchgeführt wurde
1. * falsch (+) Reaktand + falsch (-) Reaktand
2. Hinreichende Korrelation zwischen Hauttest-Reaktanden-Status und Lymphocyten-Transformation
3. Bereich 1-160 für Rinderstimulation Tabelle 4 Transformation bei 2 Jahre alten Hirschkühen aus einer mit Myco bovis infizierten Herde Reaktanden Tier Nr. Rinder Vögel Kontrolle Kontrolle

Anmerkung:

1. Vorhersage 0970 falsch (+)
0982, 0960, 0975, 0956, 0963, 0988, 0976 falsch (-)
2. Myco bovis impliziert durch Rind > Vogel Lymphocytenreaktion
3. Hinreichende Korrelation zwischen Hauttest-Reaktivität und Lymphocyten-Transformation Tabelle 5 Transformation bei ausgewachsenen Hirschkühen aus einer mit Myco bovis infizierten Herde (* 1/25 Tieren war ein Hauttest-Reaktand) Tier Nr. Rinder Vögel Kontrolle

Anmerkung:

1. Abweichende Korrelation zwischen Hauttest-Status und Lymphocyten-Transformation
2. Die Reaktivität der Kultur läßt vermuten, daß nur 1/25 (Y40) über jeden Verdacht erhaben ist Tabelle 6 Vorhersagbarkeit des Labortests bei der Bestimmung des Läsionsstatus in Tieren Bluttests August 1985 Vor Autopsie 1986 Tier Nr. Rinder Vögel Hauttest Läsionen Falsch (-) Hauttest-Reaktanden, die Versuche vereiteln, TB zu kontrollieren Falsch (+) - verursachen unnötige und kostspielige Verschwendung + Läsions-Klassifizierung Negativ minimale maximale Zahl an Läsionen
Wie aus Tabelle 6 zu ersehen ist, identifizierte der Hauttest 5 Tiere als Reaktanden, die nach Autopsie keine Läsion zeigten, während 5 Tiere als negative Reaktanden identifiziert wurden, die tatsächlich nach Autopsie Läsionen zeigten. Diese Ergebnisse zeigen nach Umrechnung in Prozentwerte, daß der Hauttest eine Fehlerrate von 15% bei der Vorhersage von falsch (+)- und falsch (-)-Tieren hatte.
Im Gegensatz dazu hatte bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens jedes Tier, von dem vorhergesagt wurde, daß es Läsionen aufweist, nach der Autopsie tatsächlich Läsionen. Das Verfahren identifizierte jedoch ein Tier als tuberkuloseaufweisend, bei dem nach der Autopsie keine Läsionen entdeckt wurden.

Beispiel 3:

Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens Tiere als entweder "infektionsfrei", "immun" oder "infiziert" zu klassifizieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Aus dieser Tabelle ist zu ersehen, daß eine signifikante Zahl von anfangs infizierten Tieren Immunität entwickelten und die Infektion verschwand. Dieses Verschwinden wurde durch Autopsie bestätigt, wobei bei infizierten Tieren, die Immunität entwickelt hatten, keine Läsionen gefunden wurden.
Dies ist ein bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung, da 57 "infizierte" Tiere gerettet und zu der Herde zurückgebracht werden können. Ferner sind diese Tiere, die Immunität gegen die Infektion entwickelt haben, von sehr großem Wert für den Farmer.

Beispiel 4:

Diese Untersuchung dient dazu, die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu beweisen, in Hauttest-Reaktanden zwischen der von M.bovis und M.avium verursachten Sensitivierung zu unterscheiden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.
Alle getesteten Tiere reagierten positiv im CT-Test. Dennoch zeigt sich nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß alle 12 Tiere in der Herde A Vogel-Reaktanden sind und deshalb keine Infektion aufweisen. Diese Tiere können deshalb gerettet werden.
Diese Schlußfolgerung wurde nach einer Autopsie bestätigt, wobei in den Tieren der Herde A keine Läsionen gefunden wurden.
Die Daten von Herde B zeigen dagegen, daß alle Tiere mit Ausnahme des Tiers 11 Rinder-Reaktanden waren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß alle Tiere außer Tier 11 geschlachtet werden sollten. Tier 11 kann gerettet werden.
Diese Vorhersagen wurden nach der Autopsie mit Ausnahme der Vorhersage für Tier 10 bestätigt, bei dem keine Läsionen gefunden wurden.
Insgesamt ließen sich durch Verwendung der vorliegenden Erfindung 13 der getesteten Tiere vor dem Schlachten retten und zur Herde zurückbringen. Tabelle 7 Die Fähigkeit von Testsystemen den "infektionsfreien", "immunen" oder "infizierten" Status von Testtieren zu bestimmen Status am Tag 0 Autopsiebefunde Infektionsstatus keine Läsionen oder verkalkte Läsionen infektionsfrei - nicht-infiziert Infektion nicht verschwunden infektionsfrei - vor Tb-Exposition; manifestiert immun gegen Tb (ernsthaft angegriffene Tiere)
+ Zahlen in Klammern = Anzahl der Testtiere
Der konventionelle Hauttest hat nicht die Fähigkeit, eine Bestimmung von INFEKTIONSFREI gegenüber IMMUN oder INFIZIERT vorzunehmen
Falsche Ergebnisse beim Hauttesten der vorstehenden Gruppen ergeben:
(a) Verlust von nicht-infizierten Tieren
(b) & (e) Unfähigkeit, mit der Ausbreitung der Infektion fertig zu werden, Zusammenbruch der Kontrolle
(c) & (d) Verlust von immunen (Elite) Tieren
± In 3 Monatsabständen gewonnene Wiederholungsproben

Beispiel 5:

Diese Untersuchung diente dazu, den Einfluß des CT-Hauttests auf die durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Ergebnisse zu zeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.
Aus den Ergebnissen geht deutlich hervor, daß bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kein signifikanter Abfall in der aufgenommenen Reaktion auftritt. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren in Verbindung mit dem CT-Test ohne Warten auf den Ablauf einer bestimmten Zeitspanne verwendet werden kann. Das Verfahren kann deshalb sofort nach der Diagnose von einigen als Hauttest-positiv eingestuften Tieren angewendet werden, um so deren wahren Infektionsstatus zu bestimmen.

Beispiel 6:

Dieses Beispiel erläutert die Ergebnisse einer neueren Fallstudie mit einer Gruppe von Tieren, die alle als Hauttestpositiv identifiziert wurden. Aus einer Herde von 172 positiven Reaktanden wurden Proben entnommen und in Einzeltests dem vorliegenden Verfahren unterworfen. Dieser Test zeigte, daß 105 der Tiere keine Infektion aufwiesen, 49 unbestimmten Status zeigten und 18 Tiere wahrscheinlich tuberkulös waren. Tabelle 8 Fähigkeit des Bluttests in Hauttest-Reaktanden zwischen M-bovis und M-avium zu unterscheiden Bluttest-Reaktionen Herde A Herde B Rinder Vögel Autopsie-Läsionen Anmerkung: *) Herde A alle sind Vogel-Reaktanden - keine Läsionen Herde B alle sind Rinder-Reaktanden außer Nr. 11, die ein Vogel-Reaktand ohne Läsionen ist Ein Bluttest würde alle Tiere aus Herde A und Nr. 11 aus der schwer infizierten Herde B retten Ein einziger Bluttest läßt schwere Infektion in Herde B vermuten, umfangreiches Schlachten ist notwendig Tabelle 9 Einfluß des Hauttests auf die Bluttest-Reaktion auf Rinder Tb Tier Nr. Vor Hauttest 3 Tage nach Hauttest

Anmerkung:

kein signifikanter Abfall in der Bluttest-Reaktion zum Zeitpunkt der Auswertung des Hauttests, 3 Tage nach Anwendung des Hauttests.
Der Bluttest kann in Verbindung mit dem Hauttesten zur Bestimmung des wahren Infektionsstatus von Hauttest-Reaktanden verwendet werden.
Ein zweiter Bluttest, der routinemäßig einen Monat nach dem ersten Bluttest durchgeführt werden kann, kann dann eine verläßliche Trennung der ursprünglich als unbestimmt eingestuften Gruppe in entweder die infektions-freie oder die tuberkulöse Gruppe ermöglichen.
Diese besondere Fallstudie hebt die Vorteile der vorliegenden Erfindung für den Farmer hervor, da bei Verlaß auf den CT- Test 172 Tiere geschlachtet worden wären. Im Gegensatz dazu werden bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mehr als 130 Tiere zur Herde zurückgebracht, was zu enormen Kosteneinsparungen für den Farmer führt.
Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren bereit, mit dem Infektion und Immunität mit großer Genauigkeit bestimmt werden können. Bis heute wurden insgesamt 361 getestete Tiere anschließend einer Autopsie unterzogen. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde vorhergesagt, daß 123 dieser Tiere tuberkulös sein würden, während 238 keine Läsionen haben würden. Nach der Autopsie wurde gezeigt, daß 118 Tiere tuberkulös waren und 226 nicht. Für jeden Fall ergibt sich prozentual ausgedrückt eine korrekte Diagnose von zumindest 95%.
Die vorstehend genannten Tiere stammten aus insgesamt 18 Herden. In 8 dieser Herden wurde das Vorkommen von tuberkulösen Tieren vorhergesagt. Anschließende Schlachtung und Autopsie der Tiere bestätigte in jedem Fall, daß Tuberkulose in den von uns vorhergesagten Herden vorkam.
Im Gegensatz dazu wurden nach Autopsie in den Herden keine Läsionen gefunden, in denen nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Infektion angezeigt wurde. Folglich waren bezogen auf die Herde die unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens gemachten Vorhersagen vollständig richtig.
Das Vergleichen der im mononuclearen Zelltest und bei der Messung der Entzündungsparameter erhaltenen Ergebnisse mit der Datenbank kann durch Erstellen eines zusammengesetzten, die beteiligten, multivarianten Analysen zeigenden Bildes durchgeführt werden. Dieses zusammengesetzte Bild kann dann mit dem "normalen" aus der Datenbasis erstellten Bild verglichen werden.
Ein Beispiel für ein solches zusammengesetztes Bild ist in Fig. 2 gezeigt. Durch Kombination von Hämatologie, Blutchemie und Leucocytenreaktivität kann die Verzerrung des Blutprofils der Läsionen aufweisenden Tiere (Reaktanden) (L) mittels Vergleich mit dem von aus der Datenbasis erstellten, normalen Tieren (N) festgestellt werden. Bei einem infizierten Tier sind die Neutrophilenzahl (NAN), Prozentwerte (%N) und die Fibrinogenspiegel (Fib) erhöht, während die Lymphocytenzahl (Lym) verringert ist. Aus dieser Analyse geht hervor, daß von den beteiligten Tieren die ausgewachsene Hirschkuh RB (Tabelle 5) ein klassisches "Läsions- Reaktanden"- Profil zeigte, obwohl sie beim intradermalen CT- Test nicht reagierte. Die Vorhersage war daher, daß dieses Tier wahrscheinlich ein falsch (-)-Reaktand war und TB hat. Die hämatologischen Parameter in vielen der verbleibenden ausgewachsenen Tiere (10 von 24) waren ebenfalls mit TB-Läsionen vereinbar.
Die erwachsene Hirschkuh RB war von besonderem Interesse, da dieses Tier durchweg negativ auf den CT-Test reagierte. Dieses Tier wurde dann bei drei weiteren Gelegenheiten über einen Zeitraum von annähernd 8 Monaten getestet, um eine Reihe von zusammengesetzten Bildern zu erhalten. Diese Reihe wird in Fig. 3 gezeigt.
Aus Fig. 3 geht hervor, daß die ausgewachsene Hirschkuh RB eine eindeutige Verzerrung des Blutprofils zeigt, verglichen mit der Vorhersage für ein normales nicht-infiziertes Tier. Gleichzeitig zu den erfindungsgemäßen Tests wurde die Hirschkuh RB auch unter Verwendung des konventionellen CT-Tests untersucht. Sämtliche dieser CT-Tests zeigten negative Reaktivität.
Nach der Autopsie wurde festgestellt, daß die ausgewachsene Hirschkuh RB einen der schwersten der bisher gefundenen Fälle von TB-Infektion hatte. Sie hatte dennoch bei 14 aufeinanderfolgenden CT-Tests negativ reagiert.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Infektion und Immunität in Wiederkäuern bereit, das signifikante Vorteile gegenüber den gegenwärtig verwendeten Verfahren aufweist. Die vorliegende Erfindung erweitert daher erheblich die Palette an Diagnosemöglichkeiten für Infektion bei Wiederkäuern.
Die besonderen Vorteile der Erfindung werden besonders deutlich, wenn die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose von TB bei Rotwild mit bestehenden Verfahren verglichen wird.
Erstens zeigen die aus einer Blutkultur erhaltenen Daten (Tabellen 2-5), daß das vorliegende Verfahren besonderen Wert bei spezieller Anwendung in bestimmten Herden hat. Die von den frisch entwöhnten Tieren erhaltenen Daten (Tabelle 3) wurden zur Vorhersage des Status von 8 frisch entwöhnten Tieren (7 Reaktanden und ein Hauttest-negatives Tier) verwendet und ermöglichten
(a) den Reaktanden-Läsionsstatus bei 6 Tieren zu bestätigen;
(b) falsch (+)- Myco bovis-Reaktanden (1 Tier) auszuschließen; und
(c) falsch (-)- Myco bovis-Reaktanden (1 Tier) zu identifizieren.
Die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum CT-Test wird ebenfalls unter Bezugnahme auf Tabelle 6 deutlich, wo der CT-Test den Status von 10 Tieren nicht korrekt vorhersagt, während das vorliegende Verfahren nur in einem Fall nicht korrekt war.
Ein weiterer und sehr wichtiger Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht in seiner Fähigkeit zwischen einem infektionsfreien, immunen und infizierten Status von Tieren einer tuberkulösen Herde zu unterscheiden, die positiv im CT- Test reagiert haben. Ausgehend von den soweit durchgeführten Tests, kann ein signifikanter Teil der positiven Reaktanden als entweder infektionsfrei oder immun zur Herde zurückgebracht werden. Diese Fähigkeit ist für den Farmer von großem Nutzen, da sie zu einer Verringerung des Bestands- und folglich des Kapitalverlusts führt.
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, zwischen infizierten und immunen Tieren zu unterscheiden, hat ebenfalls große Auswirkung auf den Umgang mit einer infizierten Herde. Nachdem der anfängliche Infektionsstatus der Tiere durch Testen der ersten Probe bestimmt wurde, können die drei Gruppen von Tieren getrennt werden, um sicherzustellen, daß sich die Infektion nicht ausbreitet. Nachdem die zweite Blutprobe genommen und für die unbestimmten und infizierten Gruppen getestet worden ist, kann bestimmt werden, ob die Tiere in diesen Gruppen tatsächlich noch infiziert sind oder ob die Infektion verschwunden ist. Die Tiere, bei denen die Infektion verschwunden ist, können dann zur Herde zurückgebracht werden, während die Tiere ausgemerzt werden können, bei denen sich die Infektion manifestiert hat.
Die Tabellen 2-5 verdeutlichen weitere Auswirkungen der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Leitung einer Farm. Das in einer "Problemherde" auftauchenden Reaktivitätsmuster und die Krankheitsanfälligkeit legen nahe, daß bestimmte Gruppen besonders dazu neigen falsch (-)-Reaktionen im Hauttest hervorzurufen (bei der Geburt infizierte, frisch entwöhnte Tiere und trächtige Hirschkühe). Dies ermöglicht einen dementsprechend angepaßten Umgang mit der Herde, um so sicherheitshalber die Gruppen mit hohem Risiko von den verbleibenden nicht-infizierten Tieren zu isolieren. Zusätzlich ermöglicht eine risikoorientierte Klassifizierung dem Farmer eine objektive Auswertung von allen Tieren mit Reaktandenstatus innerhalb seiner Herde. Der Risikofaktor kann dann gegen die möglichen Vorteile abgewogen werden, ein Tier zu behalten, bei dem nachfolgendes Testen nachweist, daß es keine Infektion aufweist.
Ein zusätzlicher Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht in seiner Fähigkeit zwischen der atypischen M.avium-Sensitivierung und der echten M.bovis-Infektion zu unterscheiden. Gegenwärtig können positive Reaktionen auf den CT-Test in einer Herde aufgrund von M.avium-Sensitivierung entstehen. In der gegenwärtigen Situation kann dies zum Ausmerzen von Tieren aus einer Herde führen, in der es keine TB-Infektion gibt.
Schließlich hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil der Wiederholbarkeit. Der gegenwärtig verwendete CT-Test kann über eine Zeitspanne von annähernd 3 Monaten nicht mit dem gleichen Tier wiederholt werden. Im Gegensatz dazu kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung sofort nach dem CT-Test durchgeführt werden, um die Richtigkeit des Ergebnisses zu überprüfen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein allgemein anwendbares Verfahren zum Nachweis von Infektion und Immunität bei Wiederkäuern bereit. Obwohl die Erfindung insbesondere in bezug auf den Nachweis von TB in Rotwild erläutert wurde, ist es offensichtlich, daß die erläuterten Verfahren auch bei anderen Krankheiten und Wiederkäuern angewendet werden können.
Anfängliche Untersuchungen mit einer kleinen Zahl von Blutproben aus Vieh zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren problemlos und einfach zum Nachweis von Infektionen (z. B. TB) bei Rindern angewendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Tabelle 10 Leukocytenreaktivität bei sechs Tb-Rinder-Reaktanden (Alle zeigten "Post Mortem"-Läsionen) Tier Nr. Vogel-Reaktivität Rinder-Reaktivität Positive Kontrolle Negative Kontrolle * Gereinigtes Leucocyten + Gesamt-Blutkulturen Tabelle 2: Tb freie Kontrollen Alle Ergebnisse sind als "counts" pro Minute·10³ angegeben
Zweckmäßigerweise werden die vorstehend in Tabelle 10 zusammengefaßten Daten mit Messungen der Entzündungsparameter kombiniert und mit einer wie vorstehend erläutert erstellten Datenbank verglichen, um den Infektionsstatus der Tiere zu bestimmen. Sogar in diesem Anfangsstadium erscheint es sicher, daß eine Infektion allgemein dort angezeigt wird, wo die Rinderreaktivität, die Vogelreaktivität um mindestens den Faktor 2 überschreitet.
Vorstehend wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
M. bovis (Mycobacterium bovis);
M. avium (Mycobacterium avium);
PPD (purified protein derivative)- gereinigtes Proteinderivat; CSL (Commonwealth Serum Laboratory).
RPMI, so wie es hier verwendet wurde, ist ein registriertes Warenzeichen für ein Kulturmedium, das speziell für Lymphocytenwachstum entwickelt wurde.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Infektion in einem Wiederkäuer, wobei man

(a) sich eine Blutprobe des Wiederkäuers verschafft;

(b) eine Untersuchung über die Funktion mononuklearer Zellen durchführt;

(c) einen Entzündungsparameter der Probe mißt; und

(d) die in den Schritten (b) und (c) erhaltenen Ergebnisse mit einer vorher bestimmten Datenbank vergleicht, um den Infektionsstatus des Wiederkäuers zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Schritt (b) durchgeführte Untersuchung auf die Transformation von T- Zellen oder auf von aktivierten T-Zellen erzeugte Lymphokine testet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Lymphokine, auf die getestet wird, Interleukin-2, Procoagulans, Interferon oder Tumornekrose-Faktor sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der gemessene Entzündungsparameter eine Makrophagenzellzahl, eine Neutrophilenzellzahl, die Viskosität des Plasmas der Probe oder der Spiegel von eine Entzündung anzeigenden Plasmaproteinen in der Probe ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die gemessenen, eine Entzündung anzeigenden Plasmaproteine Fibrinogen oder α- 2-Globuline sind.

6. Verfahren zur Unterscheidung zwischen Infektion und Immunität in einem Wiederkäuer, wobei man

(a) sich eine erste Blutprobe des Wiederkäuers verschafft;

(b) eine Untersuchung über die Funktion mononuklearer Zellen in der ersten Probe durchführt;

(c) einen Entzündungsparameter der ersten Probe mißt;

(d) die in den Schritten (b) und (c) erhaltenen Ergebnisse mit einer vorher bestimmten Datenbank vergleicht, um eine vorläufige Diagnose des Infektionsstatus des Wiederkäuers zu stellen;

(e) sofern die vorläufige Diagnose darauf schließen läßt, daß der Wiederkäuer infiziert ist, auf das Verstreichen einer Zeitspanne wartet, die für eine Bestätigung ausreicht, daß sich die Infektion manifestiert oder verschwindet;

(f) sich eine zweite Blutprobe des Wiederkäuers verschafft;

(g) die vorstehenden Schritte (b), (c) und (d) mit der zweiten Probe wiederholt, um die Diagnose des Infektionsstatus des Wiederkäuers zu bestätigen; und

(h) den vorläufigen ersten Infektionsstatus und den bestätigenden Infektionsstatus vergleicht, um zu bestimmen, ob sich die Infektion manifestiert oder verschwindet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei man ferner die Schritte (b) bis (d) mit einer dritten Probe wiederholt, bei der die Infektion verschwindet, um das Verschwinden der Infektion zu überwachen.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zeitspanne zwischen jeder Probe mindestens einen Monat beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zeitspanne zwischen jeder Probe 3 bis 6 Monate beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mehr als ein Entzündungsparameter gemessen wird.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Infektion Tuberkulose ist.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Wiederkäuer ein Rotwild ist.