DE3629052A1 - ANTITUMOR ANTIBIOTICS - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft neue antitumor-antibiotische Substanzen sowie ihre Herstellung und Isolation.The invention relates to new anti-tumor antibiotic substances as well their manufacture and isolation.
Die Struktur der Antitumorverbindungen nach der Erfindung ist bis jetzt noch nicht aufgeklärt. Aufgrund ihrer einzigartigen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften handelt es sich bei den Antibiotika BBM-1675C und BBM-1675D um neue Substanzen.The structure of the anti-tumor compounds according to the invention is up to not yet cleared up. Because of their unique physical, chemical and biological properties antibiotics BBM-1675C and BBM-1675D for new substances.
Die britische Patentanmeldung 21 41 425, veröffentlicht am 19. Dezember 1984, beschreibt die Fermentierung von Actinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638) zur Herstellung eines neuen Antitumor- Antibiotikum-Komplexes mit der Bezeichnung BBM-1675. Zwei hauptsächlich bioaktive Komponenten des dort beschriebenen BBM-1675-Komplexes werden als BBM-1675A1 und BBM-1675A2 bezeichnet. Die Struturen der BBM-1675A1 und BBM-1675A2 Antibiotika, die auch als Esperamicin A1 bzw. Esperamicin A2 bezeichnet werden, sind noch nicht aufgeklärt, jedoch zeigen beide Komponenten hervorragende antimikrobielle und Antitumor-Aktivität.British patent application 21 41 425, published on December 19, 1984, describes the fermentation of Actinomadura verrucosospora strain H964-92 (ATCC 39334) or Actinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638) for the production of a new antitumor-antibiotic complex called BBM -1675. Two mainly bioactive components of the BBM-1675 complex described there are referred to as BBM-1675A 1 and BBM-1675A 2 . The structures of the BBM-1675A 1 and BBM-1675A 2 antibiotics, which are also referred to as Esperamicin A 1 and Esperamicin A 2 , have not yet been elucidated, but both components show excellent antimicrobial and antitumor activity.
Im US-Patent 45 30 835, erteilt am 23. Juli 1985 (Bunge et al.) ist die Fermentierung eines nicht identifizierten Actinomycetes Isolats WP-444 (ATCC 39363) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung CL-1577A und CL-1577B beschrieben. Die Strukturen der CL-1577-Antibiotika sind noch nicht aufgeklärt, aber charakteristische Eigenschaften dieser Antibiotika zeigen, daß CL-1577A und CL-1577B in der Struktur des BBM-1675-Antibiotika und insbesondere BBM-1675A1 und A2 der britischen Patentanmeldung 21 41 425 ähnlich sind.U.S. Patent 4,530,835, issued July 23, 1985 (Bunge et al.) Discloses the fermentation of an unidentified Actinomycetes isolate WP-444 (ATCC 39363) for the manufacture of anti-tumor antibiotics called CL-1577A and CL- 1577B. The structures of the CL-1577 antibiotics have not yet been elucidated, but characteristic properties of these antibiotics show that CL-1577A and CL-1577B in the structure of the BBM-1675 antibiotics and in particular BBM-1675A 1 and A 2 of the British patent application 21 41 425 are similar.
In Journal Antibiotics, 37(12), 1566-1571 (1984) beschreiben R. H. Bunge et al. die Fermentierung von Actinomadura sp. (ATCC 19363) um einen bioaktiven Komplex zu gewinnen, aus dem zwei Hauptbestandteile, PD 114,759 und PD 115,028 isoliert wurden. In J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) beschreiben J. H. Wilton et al. die teilweise Strukturaufklärung der Antibiotika PD 1 14 759 und PD 1 15 028. Die Herstellung, Isolierung und Charakterisierung der Antibiotika PD 1 14 759 und PD 1 15 028 scheint gleich zu sein wie bei den oben erwähnten Antibioka CL-1577A bzw. CL-1577B.In Journal Antibiotics, 37 (12), 1566-1571 (1984), R. H. Bunge et al. the fermentation of Actinomadura sp. (ATCC 19363) to get a bioactive complex that consists of two main components, PD 114.759 and PD 115.028 were isolated. In J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) describe J.H. Wilton et al. the partial structure elucidation of antibiotics PD 1 14 759 and PD 1 15 028. The manufacture, isolation and characterization of antibiotics PD 1 14 759 and PD 1 15 028 appear to be the same as those above mentioned antibiotics CL-1577A and CL-1577B.
Die europäische Patentanmeldung 95 154, veröffentlicht am 30. November 1983, beschreibt die Fermentierung von Actinomadura pulveraceus sp. nov. Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung WS 6049-A und WS 6049-B. Die Struktur der Antibiotika WS 6049 ist noch nicht aufgeklärt, die Charakterisierenden Eigenschaften dieser Antibiotika zeigen jedoch, daß WS 6049-A und WS-6049B in der Struktur den Antibiotika BBM-1675 der britischen Patentanmeldung 21 41 425 und der Antibiotika CL-1577 des US-Patents 45 30 835 verwandt sind. Spektraldaten zeigen jedoch, daß weder WS 6049-A noch WS 6049-B identisch mit einem BBM-1675-Bestandteil ist. Der in der europäischen Patentanmeldung 95 154 beschriebene produzierende Organismus kann jedoch klar unterschieden werden von Actinomadura verrucosospora, des Verfahrens nach der britischen Patentanmeldung 21 41 425 und zwar in Bezug auf die Farbe seines Luftmycels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4 und seiner positiven Milchpeptonisierung und seiner positiven Verwertung auf D-Fructose, D-Mannit, Trehalose und Zellulose.European patent application 95 154, published November 30 1983, describes the fermentation of Actinomadura pulveraceus sp. nov No. 6049 (ATCC 39100) for the production of anti-tumor antibiotics with the designation WS 6049-A and WS 6049-B. The structure the antibiotics WS 6049 has not yet been elucidated, the characterizing ones However, properties of these antibiotics show that WS 6049-A and WS-6049B in the structure of the antibiotics BBM-1675 British patent application 21 41 425 and antibiotics CL-1577 of U.S. Patent 4,530,835. However, spectral data show that neither WS 6049-A nor WS 6049-B are identical to a BBM-1675 component is. The one described in European patent application 95 154 producing organism can clearly differentiate are used by Actinomadura verrucosospora, the process according to the British Patent application 21 41 425 in relation to the color his aerial mycelium on ISP medium No. 2, 3 and 4 and his positive Milk peptonization and its positive utilization on D-fructose, D-mannitol, trehalose and cellulose.
Durch die vorliegende Erfindung werden neue Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung BBM-1675C und BBM-1675D (auch als BMY-27305 bzw. BMY-27307 bezeichnet) geschaffen. Diese Substanzen können hergestellt werden durch selektive chemische Hydrolyse der bioaktiven Bestandteile BBM-1675A1 (Esperamicin A1) oder BBM-1675A2 (Esperamicin A2). Diese Komponenten können ihrerseits hergestellt werden durch Kultivieren eines BBM-1675 produzierenden Stammes von Actinomadura verrucosospora. Die bioaktiven Substanzen BMM-1675C und BBM-1675D können durch herkömmliche chromatographische Verfahren isoliert und gereinigt werden. Beide Substanzen zeigen hervorragende antimikrobielle Aktivität und antitumor Aktivität.The present invention creates new anti-tumor antibiotics called BBM-1675C and BBM-1675D (also referred to as BMY-27305 and BMY-27307, respectively). These substances can be produced by selective chemical hydrolysis of the bioactive constituents BBM-1675A 1 (Esperamicin A 1 ) or BBM-1675A 2 (Esperamicin A 2 ). These components can in turn be made by cultivating a strain of Actinomadura verrucosospora producing BBM-1675. The BMM-1675C and BBM-1675D bioactive substances can be isolated and purified by conventional chromatographic methods. Both substances show excellent antimicrobial activity and antitumor activity.
Weitere Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der Zeichnung und den Unteransprüchen.Further features and details of the invention emerge from the following description in connection with the drawing and the subclaims.
In der Zeichnung zeigenShow in the drawing
Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum von BBM-1675C Fig. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum of BBM-1675C
Fig. 2 das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum von BBM-1675D Figure 2 shows the ultraviolet absorption spectrum of BBM-1675D
Fig. 3 das Infrarot-Absorptions-Spektrum vom BBM-1675C (KBr, Film) Fig. 3 shows the infrared absorption spectrum of BBM-1675C (KBr, film)
Fig. 4 das Infrarot-Absorptions-Spektrum von BBM-1675D (KBr, Film) Fig. 4 shows the infrared absorption spectrum of BBM-1675D (KBr, film)
Fig. 5 das relative Abundanz-Massenspektrum von BBM-1675C Figure 5 shows the relative abundance mass spectrum of BBM-1675C
Fig. 6 das relative Abundanz-Massenspektrum von BBM-1675D Figure 6 shows the relative abundance mass spectrum of BBM-1675D
Fig. 7 das protonenmagnetische Resonanzspektrum von BBM-1675C in CDCl3 (360 MHz) Fig. 7 shows the proton magnetic resonance spectrum of BBM-1675C in CDCl3 (360 MHz)
Fig. 8 das protonenmagnetische Resonanzspektrum von BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (360 MHz) Fig. 8 is the proton magnetic resonance spectrum of BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (360 MHz)
Fig. 9 das 13C magnetische Resonanzspektrum von BBM1675C in CDCl3 (90,6 MHz) Fig. 9 shows the 13 C magnetic resonance spectrum of BBM1675C in CDCl3 (90.6 MHz)
Fig. 10A das 13C magnetische Resonanzspektrum (110-200 ppm) von BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (90,6 MHz) FIG. 10A, the 13 C magnetic resonance spectrum (110-200 ppm) of BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (90.6 MHz)
Fig. 10B das 13C magnetische Resonanzspektrum (0-110 ppm) von BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (90,6 MHz) FIG. 10B, 13 C magnetic resonance spectrum (0-110 ppm) of BBM-1675D in CDCl3 + 10% CD3OD (90.6 MHz)
Fig. 11A das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Verbindung 3A (α-Anomer) in CDCl3 (360 MHz) und FIG. 11A, the proton magnetic resonance spectrum of compound 3A (α-anomer) in CDCl3 (360 MHz) and
Fig. 11B das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Verbindung 3B (β-Anomer) in CDCl3 (360 MHz). FIG. 11B, the proton magnetic resonance spectrum of compound 3B (β-anomer) in CDCl3 (360 MHz).
Wie oben erwähnt bezieht sich die Erfindung auf zwei neue Antitumor- Antibiotika mit der Bezeichnung BBM-1675C und BBM-1675D (auch als BMY-27305 bzw. BMY-27307 bezeichnet). Diese Substanzen können hergestellt werden durch selektive chemische Hydrolyse der bioaktiven Komponenten BBM-1675A1 (Esperamicin A1) oder BBM-1675A2 (Esperamicin A2). Diese Komponenten können ihrerseits hergestellt werden durch Kultivierung eines BBM-1675-produzierenden Stammes von Aktinomadura verrucosospora, insbesondere Aktinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Aktinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638), einem Mutanten davon. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von BBM-1675C durch selektive Hydrolyse der bioaktiven Bestandteile BBM-1675A1 oder BBM-1675A2, ferner die Herstellung von BBM-1675D durch selektive Hydrolyse von BBM-1675C oder insbesondere der bioaktiven Komponenten BBM-1675A1 oder BBM-1675A2. Die Isolierung und Reinigung von BBM-1675C und BBM-1675D aus der Reaktionsmischung kann durch herkömmliche chromatographische Verfahren bewerkstelligt werden.As mentioned above, the invention relates to two new anti-tumor antibiotics called BBM-1675C and BBM-1675D (also referred to as BMY-27305 and BMY-27307, respectively). These substances can be produced by selective chemical hydrolysis of the bioactive components BBM-1675A 1 (Esperamicin A 1 ) or BBM-1675A 2 (Esperamicin A 2 ). These components can in turn be produced by culturing a BBM-1675 producing strain of Aktinomadura verrucosospora, in particular Aktinomadura verrucosospora strain H964-92 (ATCC 39334) or Aktinomadura verrucosospora strain A1327Y (ATCC 39638), a mutant thereof. The invention further relates to a process for the production of BBM-1675C by selective hydrolysis of the bioactive constituents BBM-1675A 1 or BBM-1675A 2 , furthermore the production of BBM-1675D by selective hydrolysis of BBM-1675C or in particular the bioactive components BBM-1675A 1 or BBM-1675A 2 . Isolation and purification of BBM-1675C and BBM-1675D from the reaction mixture can be accomplished by conventional chromatographic methods.
Die bioaktiven Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D zeigen antimikrobielle Aktivität gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen und haben auch schon gezeigt, daß sie inhibitorische Wirksamkeit gegenüber verschieden Mäuse-Tumorsystemen besitzen, wie P-388 Leukämie und B16 Melanome. Die neuen hier beschriebenen Substanzen nach der Erfindung können deshalb sowohl als antimikrobielle Mittel als auch als Antitumor-Mittel zum Inhibieren von Tumoren bei Säugern verwendet werden.The bioactive substances BBM-1675C and BBM-1675D show antimicrobial Activity against a wide range of microorganisms and have also shown that they have inhibitory activity against have different mouse tumor systems, such as P-388 and leukemia B16 melanoma. The new substances according to the invention described here can therefore be used both as antimicrobial agents and as Antitumor agents used to inhibit tumors in mammals will.
Im Laufe der Durchführung von Abbaustudien zur Klärung der Struktur der Antitumor-Antibiotika BBM-1675A1 (Esperamicin A1) und BBM-1675A2 (Esperamicin A2) wurde eine Mischung von Komponenten hergestellt, welche zur Isolation und Identifizierung von zwei inaktiven Fragmenten führte, nämlich Verbindung der Formel 1 und der Formel 2. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der chemische Abbau zur stufenweisen Freisetzung von zwei bioaktiven Fragmenten BBM-1675C und BBM-1675D führte. Noch überraschender war, daß die beiden verschiedenen Antibiotika BBM-1675A1 und A2 dieselben bioaktiven Fragmente bildeten, wie in Schema 1 dargestellt ist. Besonders überraschend ist, daß die Fragmente BBM-1675C und BBM-1675D mit geringerem Molekulargewicht (sie haben etwa 70% bzw. 55% des Molekulargewichts der Ausgangsantibiotika BBM-1675A1 bzw. A2) als Antitumormittel und antimikrobielle Mittel wirksamer als BBM-1675A2 und vergleichbar mit BBM-1675A1 sind.During the course of degradation studies to clarify the structure of the anti-tumor antibiotics BBM-1675A 1 (Esperamicin A 1 ) and BBM-1675A 2 (Esperamicin A 2 ), a mixture of components was produced which led to the isolation and identification of two inactive fragments , namely compound of formula 1 and formula 2. Surprisingly, it was found that chemical degradation led to the gradual release of two bioactive fragments BBM-1675C and BBM-1675D. It was even more surprising that the two different antibiotics BBM-1675A 1 and A 2 formed the same bioactive fragments as shown in Scheme 1. It is particularly surprising that the lower molecular weight fragments BBM-1675C and BBM-1675D (they have about 70% and 55% of the molecular weight of the starting antibiotics BBM-1675A 1 and A 2, respectively) are more effective than BBM-1675A as anti-tumor and anti-microbial agents 2 and comparable to BBM-1675A 1 .
Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D können durch selektive chemische Hydrolyse des Antibiotkum BBM-1675A1 hergestellt werden, wie in Schema 2 dargestellt. The substances BBM-1675C and BBM-1675D can be prepared by selective chemical hydrolysis of the antibiotic BBM-1675A 1 , as shown in Scheme 2.
Die Ausgangsverbindung BBM-1675A1 wird nach dem in der britischen Patentanmeldung 21 41 425 beschriebenen Verfahren hergestellt. Das gereinigte BBM-1675A1 wird mit einer Mineralsäure oder organischen Säure wie Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure und der gleichen in einem organischen oder gemischten wässrigen/organischen inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von ca. 0°C bis Rückflußtemperatur des Lösungsmittels hydrolisiert, bis eine wesentliche Menge des gewünschten BBM-1675c oder BBM-1675D produziert ist. Die Hydrolyse wird vorzugsweise in C1-C6- Alkohollösungsmitteln durchgeführt, wobei eine Alkoholyse in Methanol besonders bevorzugt ist. Die Temperatur der Reaktion ist nicht kritisch, doch wird die Reaktion vorzugsweise bei ungefähr Umgebungstemperatur bis 60°C insbesondere zwischen ca. 40 und 60°C durchgeführt.The starting compound BBM-1675A 1 is prepared according to the method described in British patent application 21 41 425. The purified BBM-1675A 1 is hydrolyzed with a mineral acid or organic acid such as hydrogen chloride, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like in an organic or mixed aqueous / organic inert solvent at a temperature of about 0 ° C. to the reflux temperature of the solvent until a substantial amount of the desired BBM-1675c or BBM-1675D is produced. The hydrolysis is preferably carried out in C 1 -C 6 alcohol solvents, with alcoholysis in methanol being particularly preferred. The temperature of the reaction is not critical, but the reaction is preferably carried out at about ambient temperature to 60 ° C, especially between about 40 and 60 ° C.
Die selektive Hydrolyse von BBM-1675A1 schreitet stufenweise mit der anfänglichen Produktion des BBM-1675C-Antibiotikums und des inaktiven Fragmentes der Formel 1 fort. Nachfolgende oder kontinuierliche Behandlung unter Hydrolisierungsbedingungen führt zur Freisetzung einer Mischung von α und β Anomeren des Thiozuckers nach Formel 3 und zur Bildung des Antibiotikums BBM-1675D. Es ist für den Fachmann verständlich, daß eine Änderung der Reaktionsbedingungen wie Zeit, Temperatur und Säurekonzentration eine Variation der relativen Mengen der Antibiotika BBM-1675C und BBM-1675D zur Folge hat. Es ist deshalb wünschenswert, den Fortschritt der Reaktion durch Dünnschicht- Chromatographie wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, zu verfolgen.The selective hydrolysis of BBM-1675A 1 progresses gradually with the initial production of the BBM-1675C antibiotic and the inactive fragment of Formula 1. Subsequent or continuous treatment under hydrolysis conditions leads to the release of a mixture of α and β anomers of thio sugar according to formula 3 and the formation of the antibiotic BBM-1675D. It will be understood by those skilled in the art that changing reaction conditions such as time, temperature and acid concentration will result in a variation in the relative amounts of the antibiotics BBM-1675C and BBM-1675D. It is therefore desirable to monitor the progress of the reaction by thin layer chromatography as described in the examples below.
Wenn es erwünscht ist, nur das Antibiotikum BBM-1675D herzustellen, dann wird die selektive Hydrolyse vorzugsweise mit einer organischen Säure wie p-Toluolsulfonsäure durchgeführt, wie hier beschrieben, um eine quantitative Menge an BBM-1675D zu erhalten. If it is desired to make only the BBM-1675D antibiotic, then the selective hydrolysis is preferably carried out with an organic one Acid such as p-toluenesulfonic acid, as described here, to get a quantitative amount of BBM-1675D.
Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D können auch durch selektive chemische Hydrolyse des Antibiotikums BBM-1675A2 hergestellt werden, wie in Schema 3 dargestellt.The substances BBM-1675C and BBM-1675D can also be prepared by selective chemical hydrolysis of the antibiotic BBM-1675A 2 , as shown in Scheme 3.
Die Ausgangsverbindung BBM-1675A2 wird nachdem in der britischen Patentanmeldung 21 41 425 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die selektive Hydrolyse des gereinigten BBM-1675A2 schreitet gleichfalls schrittweise fort mit der anfänglichen Produktion des Antibiotikums BBM-1675C und des inaktiven Fragmentes der Formel 2. Fortgesetzte Behandlung unter Hydrolisierungsbedingungen führt zur Freisetzung einer Mischung von α und β Anomeren des Thiozuckers nach Formel 3 und der Bildung des Antibiotikums BBM-1675D.The starting compound BBM-1675A 2 is prepared according to the procedure described in British patent application 21 41 425. The selective hydrolysis of the purified BBM-1675A 2 also progresses gradually with the initial production of the antibiotic BBM-1675C and the inactive fragment of the formula 2. Continued treatment under hydrolysis conditions leads to the release of a mixture of α and β anomers of the thio sugar according to formula 3 and formation of the antibiotic BBM-1675D.
Die Reaktionsbedingungen, die für die selektive chemische Hydrolyse von BBM-1675A2 angewendet werden, sind im wesentlichen die gleichen wie die für die oben beschriebene Hydrolyse von BBM-1675A1 angewendeten.The reaction conditions used for the selective chemical hydrolysis of BBM-1675A 2 are essentially the same as those used for the hydrolysis of BBM-1675A 1 described above.
In ähnlicher Weise wie bei der Herstellung von BBM-1675D aus BBM-1675A1 wird auch hier die Hydrolyse von BBM-1675A2 durchgeführt bis im wesentlichen das gesamte BBM-1675A2 und BBM-1675C in BBM-1675D umgewandelt ist, wenn es bevorzugt ist, nur das BBM-1675D-Antibiotikum herzustellen. Besonders bevorzugt wird die Hydrolyse mit einer organischen Säure wie p-Toluolsulfonsäure durchgeführt.Similar to the production of BBM-1675D from BBM-1675A 1 , the hydrolysis of BBM-1675A 2 is carried out until essentially all of the BBM-1675A 2 and BBM-1675C are converted to BBM-1675D, if preferred is to make only the BBM-1675D antibiotic. The hydrolysis is particularly preferably carried out with an organic acid such as p-toluenesulfonic acid.
Da gefunden wurde, daß dieselben Antibiotika BBM-1675C bzw. BBM-1675D aus zwei verschiedenen Antibiotika BBM-1675A1 und BBM-1675A2 unter gleichzeitigem Verlust von zwei inaktiven Fragmenten der Formeln 1 bzw. 2 und des Thiozuckers der Formel 3 hergestellt werden können, ergibt sich ein zusätzlicher Vorteil für die Erfindung. Dementsprechend kann nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung das Verfahren zur Herstellung von BBM-1675C und BBM-1675D wie in Schema 4 illustriert auch durch selektive Hydrolyse einer Mischung vom BBM-1675A1 und A2 durchgeführt werden. Since it was found that the same antibiotics BBM-1675C and BBM-1675D can be produced from two different antibiotics BBM-1675A 1 and BBM-1675A 2 with the simultaneous loss of two inactive fragments of the formulas 1 and 2 and the thio sugar of the formula 3 , there is an additional advantage for the invention. Accordingly, according to a further embodiment of the invention, the process for producing BBM-1675C and BBM-1675D as illustrated in Scheme 4 can also be carried out by selective hydrolysis of a mixture of BBM-1675A 1 and A 2 .
BBM-1675A1 + BBM-1675A2 → BBM-1675C → BBM-1675DBBM-1675A 1 + BBM-1675A 2 → BBM-1675C → BBM-1675D
Dieser Vorteil wird offensichtlich, wenn man bedenkt, daß die relativen Mengen von BBM-1675A1 und A2, die in dem Fermentierungsprozess gebildet werden, Variationen unterliegen. Die Produktion von BBM-1675C und BBM-1675D ist demgegenüber unabhängig von den relativen Mengen von BBM-1675A1 und A2, die als Ausgangsmaterial gemäß der Erfindung verwendet werden.This advantage is evident when one considers that the relative amounts of BBM-1675A 1 and A 2 that are formed in the fermentation process are subject to variation. In contrast, the production of BBM-1675C and BBM-1675D is independent of the relative amounts of BBM-1675A 1 and A 2 used as the starting material according to the invention.
Wie oben beschrieben, führt die Hydrolyse der Antibiotika BBM-1675A1, BBM-1675A2 und BBM-1675C zu der Freisetzung eines inaktiven Thiozuckerfragmentes. Dieser Thiozucker wurde isoliert, um eine weitere Information über die chemische Struktur von BBM-1675C und damit der Antibiotika BBM-1675A1 und A2 zu erhalten. Die Verbindung nach Formel 3 wurde identifiziert als eine Mischung von α und β Anomeren eines Thiozuckers, der die in den Schemata 2 und 3 beschriebene Struktur hat. Eine weitere Charakterisierung war nach Isolation der Produkte der Alkoholyse, der und Anomere möglich. Protonenmagnetische Resonanzspektren (360 MHz) der Verbindung 3A (α-Anomer) und der Verbindung 3B (β-Anomer) sind in den Fig. 11A bzw. 11B gezeigt. Aus einer Analyse der Spektraldaten wurden die Thiozucker-Methylglycoside nach Formel 3 versuchsweise der relativen Stereochemie der nachfolgenden Formel zugeordnet As described above, hydrolysis of the antibiotics BBM-1675A 1 , BBM-1675A 2 and BBM-1675C leads to the release of an inactive thiosugar fragment. This thiosugar was isolated in order to obtain further information about the chemical structure of BBM-1675C and thus the antibiotics BBM-1675A 1 and A 2 . The compound of Formula 3 was identified as a mixture of α and β anomers of a thio sugar having the structure described in Schemes 2 and 3. A further characterization was possible after isolation of the products of alcoholysis, the and anomers. Proton magnetic resonance spectra (360 MHz) of compound 3A (α-anomer) and compound 3B (β-anomer) are shown in Figures 11A and 11B, respectively. From an analysis of the spectral data, the thiosugar methylglycosides according to Formula 3 were tentatively assigned to the relative stereochemistry of the following formula
Derzeit ist die absolute Stereochemie, d. h. D oder L noch nicht bestimmt. Aufgrund der derzeitigen Interpretation der Spektraldaten wird dementsprechend gefolgert, daß der Thiozucker nach Formel 3 (verringert um die CH3-Gruppe des anomerischen Methoxy, welche während der Methanolyse eingeführt wurde) eine Komponente in der Struktur des Antibiotikums BBM-1675C ist und darüberhinaus auch eine Komponente in der Struktur der Ausgangsantibiotika BBM-1675A1 und A2 ist.Absolute stereochemistry, ie D or L, has not yet been determined. Accordingly, based on the current interpretation of the spectral data, it is concluded that the thiosugar according to formula 3 (reduced by the CH 3 group of the anomeric methoxy which was introduced during the methanolysis) is a component in the structure of the antibiotic BBM-1675C and also a component Component in the structure of the parent antibiotics BBM-1675A 1 and A 2 .
Es wurden die physiochemischen Eigenschaften von BBM-1675C untersucht:
Beschreibung: amorpher Feststoff
Ultraviolett Absorptionsspektrum: Fig. 1
Instrument: Hewlett-Packard 8458
Lösungsmittel: Methanol
Konzentration: 0,0155 g/l
λ max (nm)Absorptionsvermögen
21021770
2749340
313 sh (Schulter)4190
Keine wesentliche Änderung wurde mit Säure oder Base beobachtet.The physiochemical properties of BBM-1675C were examined:
Description: amorphous solid
Ultraviolet absorption spectrum: Fig. 1
Instrument: Hewlett-Packard 8458
Solvent: methanol
Concentration: 0.0155 g / l
λ max (nm) Absorbance 21021770 2749340 313 sh (shoulder) 4190 No significant change was observed with acid or base.
Infrarot-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 3
Instrument: Nicolet 5DX FT-IR
Hauptabsorptionsbanden (KBr, Film):
540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,
1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,
1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930,
2970, 3450 cm-1
Infrared absorption spectrum: see Fig. 3
Instrument: Nicolet 5DX FT-IR
Main absorption bands (KBr, film):
540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,
1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,
1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930,
2970, 3450 cm -1
Massenspektrum: siehe Fig. 5
Instrument: Finigan 4500 TSQ
Methode: schnelle Atombombardierungs (FAB)-
Ionisation
Mass spectrum: see Fig. 5
Instrument: Finigan 4500 TSQ
Method: rapid atomic bombing (FAB) ionization
Instrument: Kratos MS-50
Hohe Auflösung FAB (m/z): [M+H]⁺ = 856.3362
Molekulargewicht: scheinbares Molekulargewicht = 855
(bezogen auf die oben beschriebenen Massenspektraldaten)
Elemtarzusammensetzung: C36H61N3O14S3
(bezogen auf die oben beschriebenen Hochauflösungsdaten)
Protonenmagnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 7
Instrument: WM 360 Bruker
Lösungsmittel: CDCl3 Instrument: Kratos MS-50
High resolution FAB (m / z): [M + H] ⁺ = 856.3362
Molecular weight: apparent molecular weight = 855
(based on the mass spectral data described above)
Elemental composition: C 36 H 61 N 3 O 14 S 3
(based on the high-resolution data described above)
Proton magnetic resonance spectrum: see Fig. 7
Instrument: WM 360 Bruker
Solvent: CDCl 3
1H NMR 360 MHz δ (ppm):
6.54 (1H, dd, J = 7.7, 7.0); 6.21 (1H, brs); 5.87 /1H, d,
J = 9.6); 5.78 (1H, dd, j = 9.6, 1.5); 5.66 (1H, brd,
J = 2.9); 4.94 (1H, dd, J = 10.3, 1.8); 4.61 (1H, d,
J = 7.7); 4.25 (1H, s); 4.09 (1H, q, J = 2.6); 3.97 (1H, t,
J = 9.6); 3.92-3.53 (1OH), 3.45 (1H, dt, J = 10.3, 4.0);
3.37 (3H, s); 2.77 (1H, m); 2.69 (1H, dt, J = 9.9, 5.2);
2.49 (1H, dd, J = 10.3, 2.6); 2.48 (3H, s); 2.30 (2H, m);
2.13 (1H, m); 2.09 (3H, s); 1.50 (2H, m); 1.37 (3H, d,
J = 5.9); 1.32 (3H, d, J = 6.3); 1.08 (6H). [Abfeld (downfield)
aus Tetramethylsilan]
1 H NMR 360 MHz δ (ppm):
6.54 (1H, dd, J = 7.7, 7.0); 6.21 (1H, brs); 5.87 / 1H, d, J = 9.6); 5.78 (1H, dd, j = 9.6, 1.5); 5.66 (1H, brd, J = 2.9); 4.94 (1H, dd, J = 10.3, 1.8); 4.61 (1H, d, J = 7.7); 4.25 (1H, s); 4.09 (1H, q, J = 2.6); 3.97 (1H, t, J = 9.6); 3.92-3.53 (1OH), 3.45 (1H, dt, J = 10.3, 4.0); 3.37 (3H, s); 2.77 (1H, m); 2.69 (1H, dt, J = 9.9, 5.2); 2.49 (1H, dd, J = 10.3, 2.6); 2.48 (3H, s); 2.30 (2H, m); 2.13 (1H, m); 2.09 (3H, s); 1.50 (2H, m); 1.37 (3H, d, J = 5.9); 1.32 (3H, d, J = 6.3); 1.08 (6H). [Downfield from tetramethylsilane]
13C Magnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 9
Instrument: WM 360 Bruker
Lösungsmittel: CDCl3
13C NMR 90.6 MHz δ (ppm):
13.7, 17.5, 19.8, 22.3, 22.7, 23.5, 34.2, 35.2, 39.5,
47.7, 52.7, 55.8, 56.1, 57.7, 62.4, 64.7, 67.4, 69.3,
69.8, 71.9, 76.1, 77.1, 77.7, 79.7, 83.2, 88.4, 97.3,
99.7, 123.4, 124.6, 130.1, 193.1. [Abfeld (downfield)
aus Tetramethylsilan] 13 C Magnetic resonance spectrum: see Fig. 9
Instrument: WM 360 Bruker
Solvent: CDCl 3
13 C NMR 90.6 MHz δ (ppm):
13.7, 17.5, 19.8, 22.3, 22.7, 23.5, 34.2, 35.2, 39.5, 47.7, 52.7, 55.8, 56.1, 57.7, 62.4, 64.7, 67.4, 69.3, 69.8, 71.9, 76.1, 77.1, 77.7, 79.7, 83.2, 88.4, 97.3, 99.7, 123.4, 124.6, 130.1, 193.1. [Downfield from tetramethylsilane]
Die physiochemischen Eigenschaften von BBM-1675D wurden untersucht:
Beschreibung: amorpher Feststoff
Ultraviolettes Absorptionsspektrum: siehe Fig. 2
Instrument: Hewlett-Packard 8458
Lösungsmittel: Methanol
Konzentration: 0,01 g/l
λ max (nm)Absorptionsfähigkeit
21427000
27412800
3255400
Keine signifikante Änderung wurde mit Säure oder Base beobachtet.The physiochemical properties of BBM-1675D were examined:
Description: amorphous solid
Ultraviolet absorption spectrum: see Fig. 2
Instrument: Hewlett-Packard 8458
Solvent: methanol
Concentration: 0.01 g / l
λ max (nm) Absorbance 21427000 27412800 3255400 No significant change was observed with acid or base.
Infrarot-Absorptionspektrum: siehe Fig. 4
Instrument: Nicolet 5DX FT-IR
Hauptabsorptionsbanden (Kr, Film)
735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195,
1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,
1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm-1
Massenspektrum: siehe Fig. 6
Instrument: Finigan 4500 TSQ
Methode: schnelle Atombeschuß (FAB-
Ionisation
Matrix: Thioglycerin
Molekularion (m/z): [M+H]⁺ = 696
Relative Abundanz: 100%
Instrument: Kratos MS-50
Hochauflösungs FAB (m/z): [M+H]⁺ = 696.2794Infrared absorption spectrum: see Fig. 4
Instrument: Nicolet 5DX FT-IR
Main absorption bands (Kr, film)
735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195,
1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,
1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm -1
Mass spectrum: see Fig. 6
Instrument: Finigan 4500 TSQ
Method: rapid atomic bombardment (FAB ionization
Matrix: thioglycerin
Molecular ion (m / z): [M + H] ⁺ = 696
Relative abundance: 100%
Instrument: Kratos MS-50
High resolution FAB (m / z): [M + H] ⁺ = 696.2794
Molekulargewicht: scheinbares Molekulargewicht = 695 (bezogen auf die oben beschriebenen Massenspektraldaten)Molecular weight: apparent molecular weight = 695 (based on the mass spectral data described above)
Elemtarzusammensetzung: C29H49N3O12S2 (bezogen auf die oben beschriebenen Hochauflösungsdaten)Elemental composition: C 29 H 49 N 3 O 12 S 2 (based on the high-resolution data described above)
Die Korrelation von [M + H]⁺ und [(M + H) + 2]⁺ relativen Abundanzen zu ihren berechneten Werten bestätigt die aus den Hochauflösungs- FAB-Messungen abgeleiteten Elementarzusammensetzungen.The correlation of [M + H] ⁺ and [(M + H) + 2] ⁺ relative abundances to their calculated values confirmed by the high-resolution FAB measurements derived elementary compositions.
Protonenmagnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 8
Instrument: WM 360 Bruker
Lösungsmittel: CDCl3 + 10% CD3ODProton magnetic resonance spectrum: see Fig. 8
Instrument: WM 360 Bruker
Solvent: CDCl 3 + 10% CD 3 OD
1H NMR 360 MHz δ (ppm):
6.43 (1H, dd, J = 4.4, 10.3); 6.13 (1H, s); 5.81 (1H, d,
J = 8.8); 5.70 (1H, d, J = 8.8); 5.48 (1H, 6 brs); 4.48
(1H, d, J = 8.1); 4.02 (1H, d, J = 2.0); 3.95-3.80 (solvent
background); 3.77 (1H, t, J = 9.0); 3.70-3.40 (11H, brm);
3.35 (1H, m); 3.28 (3H, s); 3.22 (3H, brs); 2.66-2.55
(2H, m) 2.38 (3H, s); 2.23-2.12 (2H, m); 1.42 (1H,
brdt); 1.22 (3H, d, J = 5.9); 0.94 (3H, d, J = 6.6); 0.87
(3H, d, J = 5.9). [Abfeld (downfiel) aus Tetramethylsilan]
1 H NMR 360 MHz δ (ppm):
6.43 (1H, dd, J = 4.4, 10.3); 6.13 (1H, s); 5.81 (1H, d, J = 8.8); 5.70 (1H, d, J = 8.8); 5.48 (1H, 6 brs); 4.48 (1H, d, J = 8.1); 4.02 (1H, d, J = 2.0); 3.95-3.80 (solvent background); 3.77 (1H, t, J = 9.0); 3.70-3.40 (11H, brm); 3.35 (1H, m); 3.28 (3H, s); 3.22 (3H, brs); 2.66-2.55 (2H, m) 2.38 (3H, s); 2.23-2.12 (2H, m); 1.42 (1H, brdt); 1.22 (3H, d, J = 5.9); 0.94 (3H, d, J = 6.6); 0.87 (3H, d, J = 5.9). [Downfield from tetramethylsilane]
13C magnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 10A und 10B
Instrument: WM 360 Bruker
Lösungsmittel: CDCl3 + 10% CD3OD 13 C magnetic resonance spectrum: see Figs. 10A and 10B
Instrument: WM 360 Bruker
Solvent: CDCl 3 + 10% CD 3 OD
13C NMR 90.6 MHz δ (ppm):
17.5, 21.6, 22.2, 23.0, 33.4, 39.2, 46.4, 52.3, 55.8,
62.1, 67.8, 69.8, 70.1, 71.3, 75.8, 77.1, 78.1, 82.4,
83.3, 88.2, 97.4, 99.6, 122.6, 124.8, 130.1, 130.8,
134.3, 148.7, 192.8. [Abfeld (downfield) aus Tetramethylsilan] 13 C NMR 90.6 MHz δ (ppm):
17.5, 21.6, 22.2, 23.0, 33.4, 39.2, 46.4, 52.3, 55.8, 62.1, 67.8, 69.8, 70.1, 71.3, 75.8, 77.1, 78.1, 82.4, 83.3, 88.2, 97.4, 99.6, 122.6, 124.8, 130.1, 130.8, 134.3, 148.7, 192.8. [Downfield from tetramethylsilane]
Nachfolgend werden die biologischen Eigenschaften der BBM-1675-Substanzen geschildert.Below are the biological properties of the BBM-1675 substances described.
Die antimikrobielle Aktivität der BBM-1675-Substanzen wurde gegenüber einer Anzahl von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen bestimmt. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt Daten in der Form der Ergebnisse eines antimikrobiellen screening Verfahrens, das die Muttersubstanz BBM-1675A1 und die erfindungsgemäßen Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D umfasste. Bei dem Screening-Verfahren wurde jede Testsubstanz in Form eines Papierstreifens, der mit einer einheitlichen Konzentration von 10 µg/ml Lösung imprägniert wurde, auf die Wachstumskultur gegeben. Das Mass der antibiotischen Aktivität ist die sich aus dem Papierstreifen ergebende Inhibitionszone. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität, welche mindestens so groß war wie die von BBM-1675A1. Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D waren insbesondere aktiver als Inhibitoren gegen gram-negative Organismen. The antimicrobial activity of the BBM-1675 substances was determined against a number of gram-positive and gram-negative microorganisms. Table 1 below shows data in the form of the results of an antimicrobial screening process which comprised the parent substance BBM-1675A 1 and the substances BBM-1675C and BBM-1675D according to the invention. In the screening process, each test substance was placed on the growth culture in the form of a paper strip impregnated with a uniform concentration of 10 µg / ml solution. The measure of antibiotic activity is the zone of inhibition resulting from the paper strip. As shown in Table 1, the substances BBM-1675C and BBM-1675D showed a broad spectrum of antimicrobial activity which was at least as great as that of BBM-1675A 1 . The substances BBM-1675C and BBM-1675D were in particular more active than inhibitors against gram-negative organisms.
Die Aktivität gegen P-388 Leukämie wurde untersucht:Activity against P-388 leukemia was examined:
Die Tabellen II und III enthalten die Ergebnisse von Labortests mit CDF1-Mäusen, denen intraperitoneal ein Tumor Inokulum von 106 Asziteszellen von P-388 Leukämie eingepflanzt und die mit verschiedenen Dosen von BBM-1675A1, C oder D behandelt wurden. Die Substanzen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Gruppen von 6 Mäusen wurden für jede Dosismenge verwendet. Sie wurden mit einer Einzeldosis der Substanz einen Tag nach der Inokulation behandelt. Eine Gruppe von 10 mit Kochsalzlösung (Träger) behandelten Kontrollmäuse wurde in jede Serie von Experimenten mit einbezogen. Die mit BBM-1675A1 behandelten Gruppe in Tabelle III wurde in den direkten Vergleich mit einbezogen. Ein 30-tägiges Protokoll wurde geführt. Notiert wurde die für jede Mäusegruppe bestimmte mittlere Überlebenszeit in Tagen und die Anzahl an Überlebenden am Ende der 5-Tages-Periode. Die Mäuse wurden vor der Behandlung gewogen und wiederum an Tag 4. Die Gewichtsänderung wurde genommen als ein Mass für die Toxizität der Probe. Es wurden jeweils Mäuse mit 20 g Gewicht verwendet, und ein Gewichtsverlust bis zu annähernd 2 g wurde nicht als übermäßig angesehen. Die mit dem Träger behandelten Kontrolltiere starben normalerweise innerhalb von 9 Tagen. Die Ergebnisse wurden berechnet in Ausdrücken von %T/C, das ist das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Lebenszeit der mit dem Träger behandelten Kontrollgruppe × 100. Ein Effekt ausgedrückt in %T/C = 125 zeigt, daß ein signifikanter Antitumoreffekt erreicht wurde. Die Screeningergebnisse nach Tabelle II zeigen den anfänglich unerwarteten Spiegel von Antitumor-Aktivität der BBM- 1675C-Substanz. In Tabelle III sind die Ergebnisse eines direkten Vergleichs von BBM-1675A1 (Esperamicin A1) und der Substanzen BBM- 1675C und BBM-1675D wiedergegeben. Die Daten lassen erkennen, daß BBM-1675C ungefähr vergleichbar ist mit BBM-1675A1 in Bezug auf Stärke und Antitumorwirksamkeit und daß es nicht verabreichungsabhängig ist, während BBM-1675D nur geringfügig weniger wirksam ist. Weiterhin ist bereits darauf hingewiesen worden, daß gem. der Erfindung dieselben Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D auch aus der Komponente BBM-1675A2 (Esperamicin A2) gewonnen werden können. Im Vergleich zu den berichteten Daten für BBM-1675C und BBM-1675D und die Daten, die in der britischen Patentanmeldung 21 41 425 für BBM-1675A2 angegeben sind, wurde überraschenderweise gefunden, daß die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D als Antitumor-Mittel wirksamer sind als die Muttersubstanz BBM-1675A2, aus der sie abgeleitet sind.Tables II and III contain the results of laboratory tests with CDF 1 mice, in which a tumor inoculum of 10 6 ascites cells of P-388 leukemia was implanted intraperitoneally and which were treated with different doses of BBM-1675A 1 , C or D. The substances were administered by intraperitoneal injection. Groups of 6 mice were used for each dose amount. They were treated with a single dose of the substance one day after the inoculation. A group of 10 control mice treated with saline (vehicle) were included in each series of experiments. The group treated with BBM-1675A 1 in Table III was included in the direct comparison. A 30-day log was kept. The average survival time in days determined for each group of mice and the number of survivors at the end of the 5-day period were noted. The mice were weighed before treatment and again on day 4. The change in weight was taken as a measure of the toxicity of the sample. Mice weighing 20 g each were used, and weight loss up to approximately 2 g was not considered excessive. The control animals treated with the vehicle usually died within 9 days. The results were calculated in terms of% T / C, which is the ratio of the mean survival time of the treated group to the mean lifetime of the control group treated with the vehicle × 100. An effect expressed in% T / C = 125 shows that a significant Antitumor effect was achieved. The screening results in Table II show the initially unexpected level of anti-tumor activity of the BBM-1675C substance. Table III shows the results of a direct comparison of BBM-1675A 1 (esperamicin A 1 ) and the substances BBM-1675C and BBM-1675D. The data indicate that BBM-1675C is roughly comparable to BBM-1675A 1 in terms of strength and anti-tumor activity and that it is not dependent on administration, while BBM-1675D is only slightly less effective. Furthermore, it has already been pointed out that according to. the invention, the same substances BBM-1675C and BBM-1675D can also be obtained from component BBM-1675A 2 (Esperamicin A 2 ). In comparison to the reported data for BBM-1675C and BBM-1675D and the data given in British patent application 21 41 425 for BBM-1675A 2 , it was surprisingly found that the substances BBM-1675C and BBM-1675D as an anti-tumor Are more effective than the parent substance BBM-1675A 2 from which they are derived.
Tumor Inoculum: 106 Tumor inoculum: 10 6
Asziteszellen i.p. implantiert
Wirt: CDF1 Ascites cells implanted ip
Host: CDF 1
männliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Wirkung: §T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle × 100
Kriterien: %T/C 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität
erachtet
AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelte Kontrolle) in Gramm
(an Tag 4)
male mice
Evaluation: MST = mean survival time
Effect: §T / C = (MST treated / MST control × 100
Criteria:% T / C 125 is considered significant anti-tumor activity
AWC: mean weight change (treated control) in grams (on day 4)
Tumor Inoculum: 106 Tumor inoculum: 10 6
Asziteszellen i.p. implantiert
Wirt: CDF1 Ascites cells implanted ip
Host: CDF 1
weibliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Wirkung: %T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) × 100
Kriterien: %T/C 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität
erachtet
AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelt - Kontrolle) in Gramm
(an Tag 4)female mice
Evaluation: MST = mean survival time
Effect:% T / C = (MST treated / MST control) × 100
Criteria:% T / C 125 is considered significant anti-tumor activity
AWC: mean weight change (treated - control) in grams (on day 4)
Die Aktivität gegen B16 Melanom wurde untersucht:The activity against B16 melanoma was examined:
Tabelle IV enthält die Ergebnisse von Antitumor-Tests unter Verwendung von B16 Melanom, das in Mäusen gewachsen ist. BDF1-Mäusen wurde das Tumorimplantat subkuntan inokuliert. Ein 60-Tage-Protokoll wurde verwendet. Gruppen von 10 Mäusen wurde für jede Dosismenge getestet. Die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe wurde bestimmt. Kontrolltiere, die in der gleichen Weise wie die Testtiere inokuliert wurden und mit dem Injektionsträger ohne die Droge behandelt wurden, zeigten eine mittlere Überlebenszeit von 22,5 Tagen. Für jeden Dosisspiegel wurden die Testtiere mit der Testverbindung an den Tagen 1, 5 und 9 durch intraperitoneale Injektion behandelt. Ein Effekt ausgedrückt in % T/C 125 zeigt einen signifikanten Antitumor-Effekt an. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß in einem direkten Vergleich BBM-1675C ebenfalls wirksam in der Behandlung von B16 Melanom-tragende Mäusen ist und daß die Potenz ungefähr vergleichbar der von BBM-1675A1 ist. Table IV contains the results of anti-tumor tests using B16 melanoma grown in mice. The tumor implant was subcutaneously inoculated in BDF 1 mice. A 60 day protocol was used. Groups of 10 mice were tested for each dose level. The mean survival for each group was determined. Control animals that were inoculated in the same manner as the test animals and treated with the injection vehicle without the drug showed an average survival time of 22.5 days. For each dose level, the test animals were treated with the test compound on days 1, 5 and 9 by intraperitoneal injection. An effect expressed in% T / C 125 indicates a significant anti-tumor effect. The results in Table 4 show that in a direct comparison BBM-1675C is also effective in the treatment of B16 melanoma-bearing mice and that the potency is approximately comparable to that of BBM-1675A 1 .
Tumor Inokulum: 0,5 ml eines 10%-igen Breis
Wirt: BDF1 Tumor inoculum: 0.5 ml of a 10% pulp
Host: BDF 1
weibliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Effekt: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) × 100
Kriterium: % T/C 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität
erachtet
AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelt - Kontrolle) in Gramm
(an Tag 12)
female mice
Evaluation: MST = mean survival time
Effect:% T / C = (MST treated / MST control) × 100
Criterion:% T / C 125 is considered significant anti-tumor activity
AWC: mean weight change (treated - control) in grams (on day 12)
Wie sich aus den obigen antimikrobiellen und Mäusetumor-Daten ergibt, sind BBM-1675C und BBM-1675D wertvoll als Antibiotika in der therapeutischen Behandlung von Säugern und anderen Tieren bei infektiösen Krankheiten und auch als Antitumor-Mittel für die therapeutische Inhibierung des Wachstums von Säugertumoren.As can be seen from the above antimicrobial and mouse tumor data, BBM-1675C and BBM-1675D are valuable as antibiotics in therapeutic Treatment of mammals and other animals in infectious Diseases and also as anti-tumor agents for therapeutic Inhibition of mammalian tumor growth.
Die vorliegende Erfindung bietet daher auch ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen Wirts, der durch eine mikrobielle Infektion oder einen malingnen Tumor beeinträchtigt ist, in dem dem Wirt eine wirksame antimikrobielle oder tumorinhibierende Dosis von BBM-1675C oder BBM-1675D oder eine pharamazeutische Zusammensetzung dieser verabreicht wird.The present invention therefore also offers a method for therapeutic Treatment of an animal host by a microbial Infection or malignant tumor is compromised the host an effective antimicrobial or tumor inhibiting Dose of BBM-1675C or BBM-1675D or a pharmaceutical composition this is administered.
Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame antimikrobielle oder tumorinhibierende Menge an BBM-1675C oder BBM-1674D in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Solche Zusammensetzungen können auch andere aktive antimikrobiellen oder Antitumor- Mittel enthalten und können in jeder pharmazeutischen Form aufbereitet sein, die für die gewünschte Verabreichungsform geeignet ist. Beispiele für solche Zusammensetzungen umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabreichung wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzungen für die orale Verabreichung wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixire, und Präparationen für die parenterale Verabreichung wie sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in der Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen Injektionsmedium kurz vor der Anwendung aufgelöst werden, hergestellt sein. The invention also relates to pharmaceutical compositions, an effective antimicrobial or tumor inhibiting amount BBM-1675C or BBM-1674D in combination with a pharmaceutical acceptable carrier or diluent. Such compositions other active antimicrobial or anti-tumor Agents contain and can be in any pharmaceutical form be prepared, suitable for the desired form of administration is. Examples of such compositions include solid compositions for oral administration such as tablets, capsules, Pills, powders and granules, liquid compositions for the oral administration such as solutions, suspensions, syrups or elixirs, and preparations for parenteral administration such as sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. They can also be in the form of sterile solid compositions, which in sterile water, physiological saline or a other sterile injection medium just before use will be made.
Für die Verwendung als antimikrobielles Mittel wird das BBM-1675C oder BBM-1675D oder eine pharmazeutische Zusammensetzung daraus so verabreicht, daß die Konzentration des aktiven Bestandteils größer ist als die minimale Inhibitions-Konzentration für den jeweiligen zu behandelnden Organismus. Für die Verwendung als Antitumormittel kann die optimale Dosierung und Handhabung von BBM-1675C oder BBM- 1675D für einen gegebenen Säugerwirt vom Fachmann leicht sichergestellt werden. Dabei ist es verständlich, daß die tatsächlich verwendetet Dosis von BBM-1675C oder BBM-1675D in Abhängigkeit von der jeweiligen formulierten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung und dem jeweiligen Situs, Wirt und der zu behandelnden Krankheit variiert. Weitere Faktoren, die die Wirkung des Mittels beeinflussen können, sind in Betracht zu ziehen, wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Kondition des Patienten, Arzneimittelkombinationen, reaktive Sensitivitäten und Schwere der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis erfolgen. Optimale Verabreichungsraten für gegebene Bedingungen kann der Fachmann anhand herkömmlicher Tests zur Bestimmung der Dosis im Zusammenhang mit den obigen Richtlinien sicherstellen.For use as an antimicrobial agent, the BBM-1675C or BBM-1675D or a pharmaceutical composition thereof administered that the concentration of the active ingredient is greater is the minimum inhibitory concentration for each organism to be treated. For use as an anti-tumor agent the optimal dosage and handling of BBM-1675C or BBM- 1675D easily assured by those skilled in the art for a given mammalian host will. It is understandable that the actually used Dose of BBM-1675C or BBM-1675D depending on the respective formulated composition, the mode of administration and the respective site, host and the disease to be treated varies. Other factors that affect the effectiveness of the agent may be considered, such as age, weight, gender, Diet, administration time, route of administration, excretion rate, condition of the patient, drug combinations, reactive sensitivities and severity of the disease. Administration can be continuous or periodically within the maximum tolerated dose. The optimal administration rates for given conditions can Expert using conventional tests to determine the dose related ensure with the guidelines above.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung von bevorzugten Ausführungsformen für die Herstellung von BBM-1675C und BBM-1675D.The following examples serve to explain preferred ones Embodiments for making BBM-1675C and BBM-1675D.
Eine Probe von BBM-1675A1 (50 mg) wurde in 2,5 ml Methanol gelöst und mit 2,5 ml einer 0,1 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol behandelt. Man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von ca. 50°C fortschreiten und überwachte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (annähernd 30 min.), in dem man alle 5-10 min. eine Dünnschichtchromotographie (TLC) auf Silicagelplatten (Analtech, 250 micron, GF) mit Toluol zu Aceton (3 : 2, vol/vol) als Elutionsmittel durchführte. Nachdem das Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde die Reaktionsmischung mit einer gesättigten Lösung von NaHCO3 in Methanol neutralisiert und dann unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein trockener, die bioaktiven Fragmente enthaltender Rückstand erhalten wurde. Die Substanz BBM-1675C wurde aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer 2 cm (Durchmesser) mal 10 cm Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 micrometer Teilchengröße) gepackt war, isoliert. Die Säule wurde mit Toluol : Aceton (3 : 2, vol/vol) eluiert, wobei 3 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) [Silicagel mit Toluol : Aceton (3 : 2, vol/vol) als Eluirmittel] analysiert, und die Flecken der Dünnschichtchromatographie wurden mit einer UV-Lichtquelle von 254 µm und einem Cersulfat-Spray (1% Cersulfat und 2,5% Molybdänsäure in 10% Schwefelsäure) sichtbar gemacht. Fraktionen 6-12 (Rf-Wert für BBM-1675C ist 0.28) wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 12 mg (35%) im wesentlichen eines BBM-1675C erhalten wurden.A sample of BBM-1675A 1 (50 mg) was dissolved in 2.5 ml of methanol and treated with 2.5 ml of a 0.1 molar solution of hydrogen chloride in methanol. The reaction was allowed to proceed at a temperature of about 50 ° C. and the disappearance of the starting material was monitored (approximately 30 min.) By washing every 5-10 min. performed a thin layer chromatography (TLC) on silica gel plates (Analtech, 250 micron, GF) with toluene to acetone (3: 2, vol / vol) as eluent. After the starting material was consumed, the reaction mixture was neutralized with a saturated solution of NaHCO 3 in methanol and then evaporated under reduced pressure to obtain a dry residue containing the bioactive fragments. The BBM-1675C substance was isolated from the residue by rapid column chromatography on a 2 cm (diameter) by 10 cm column packed with Woelm silica gel (32-63 micrometer particle size). The column was eluted with toluene: acetone (3: 2, vol / vol), collecting 3 ml fractions. Each fraction was analyzed by thin layer chromatography (TLC) [silica gel with toluene: acetone (3: 2, vol / vol) as eluent] and the spots of thin layer chromatography were analyzed with a 254 µm UV light source and a cerosulfate spray (1% Cerium sulfate and 2.5% molybdic acid in 10% sulfuric acid). Fractions 6-12 (R f value for BBM-1675C is 0.28) were pooled and evaporated to dryness to give 12 mg (35%) essentially of a BBM-1675C.
Die physikochemischen Eigenschaften von BBM-1675C sind in der vorhergehenden Beschreibung aufgeführt, und die Ultraviolett-, Infrarot-, Massen-, 1H NMR- und 13C NMR-Spektren der Verbindung sind in den Fig. 1, 3, 5, 7 und 9 dargestellt.The physicochemical properties of BBM-1675C are listed in the foregoing description, and the ultraviolet, infrared, mass, 1 H NMR and 13 C NMR spectra of the compound are shown in Figures 1, 3, 5, 7 and 9 shown.
Wird die Reaktionsdauer des Verfahrens nach Beispiel 1 ausgedehnt, dann nimmt die Menge an BBM-1675C ab und zwei neue Produkte, bezeichnet als Verbindung 3 (Rf = 0.65) und BBM-1675D (Rf bleibt an der Basislinie) [TLC: Silica, Toluol : Aceton (3 : 2, vol/vol)], erscheinen und nehmen im Lauf der Zeit in der Menge zu. If the reaction time of the process according to Example 1 is extended, the amount of BBM-1675C decreases and two new products, designated compound 3 (R f = 0.65) and BBM-1675D (R f remains at the baseline) [TLC: silica , Toluene: acetone (3: 2, vol / vol)], appear and increase in quantity over time.
Verbindung BBM-1675D, welche normalerweise die Herstellung von BBM- 1675C begleitet, wurde aus der in Beispiel 1 beschriebenen Chromatographiesäule isoliert, indem die Säule mit Chloroform : Methanol (5 : 1, vol/vol) eluiert wurde. Die richtigen Fraktionen wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 18 mg im wesentlichen reines BBM-1675D nach dem in Beispiel beschriebenen Verfahren erhalten wurden.BBM-1675D, which is normally used to make BBM- Accompanied by 1675C, was from the chromatography column described in Example 1 isolated by column with chloroform: methanol (5: 1, vol / vol) was eluted. The right fractions were pooled and evaporated to dryness, 18 mg essentially pure BBM-1675D were obtained by the method described in Example.
Die Substanz BBM-1675D zeigt einen Hauptfleck bei Rf = 0.37 in der Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (Whatman MKT18F, 200 Mikrometer) unter Verwendung von 30% Wasser in Methanol als Eluiermittel und bei Rf = 0.22 in Normalphasen-Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Chloroform : Methanol (5 : 0.5, vol/vol) als Eluiermittel.The substance BBM-1675D shows a main spot at R f = 0.37 in reverse phase thin layer chromatography (Whatman MKT 18 F, 200 micrometers) using 30% water in methanol as eluent and at R f = 0.22 in normal phase thin layer chromatography (TLC) using chloroform: methanol (5: 0.5, vol / vol) as eluent.
Eine wesentliche Verbesserung der Ausbeute von BBM-1675D kann erzielt werden unter Verwendung von p-Toluolsulfonsäure anstelle von Chlorwasserstoff bei der chemischen Hydrolyse von BBM-1675A2 oder BBM-1675A1, wie dies in den Verfahrensweisen der Beispiele 3 bzw. 5 erläutert ist.A significant improvement in the yield of BBM-1675D can be achieved using p-toluenesulfonic acid instead of hydrogen chloride in the chemical hydrolysis of BBM-1675A 2 or BBM-1675A 1 , as explained in the procedures of Examples 3 and 5, respectively.
Eine Probe von BBM-1675A2 (15,2 mg) wurde mit einer 0.03 molaren Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1 ml) bei einer Temperatur von ca. 360°C während ca. 1 Stunde hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde dann unter vermindertem Druck bei ca. 30°C zur Trockne eingedampft. Die Substanz BBM-1675D wurde aus dem trocknen Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer mit Woelm Silicagel (32-63 Mikrometer Teilchengröße) isoliert. Die Säule wurde mit Chloroform : Methanol (5 : 0.5, vol/vol) eluiert und die gesammelten Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie [(Silicagel mit Chloroform : Methanol (5 : 0.5, vol/vol) als Eluiermittel] analisiert. Die angewendeten Bedingungen der Chromatographie erlaubten die Abtrennung der Mischung der inaktiven Verbindungen 2 und 3 (7 mg) von der bioaktiven Substanz BBM-1675D, welche einen Rf-Wert von 0.22 hatte. Die richtigen Fraktionen wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 8 mg im wesentlichen reines BBM-1675D in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten wurden.A sample of BBM-1675A 2 (15.2 mg) was hydrolyzed with a 0.03 molar solution of p-toluenesulfonic acid in methanol (1 ml) at a temperature of approx. 360 ° C. for approx. 1 hour. The reaction mixture was then evaporated to dryness at about 30 ° C. under reduced pressure. The BBM-1675D substance was isolated from the dry residue by rapid column chromatography on a Woelm silica gel (32-63 micron particle size). The column was eluted with chloroform: methanol (5: 0.5, vol / vol) and the collected fractions were analyzed by thin layer chromatography [(silica gel with chloroform: methanol (5: 0.5, vol / vol) as the eluent). Chromatography conditions used allowed the mixture of inactive compounds 2 and 3 (7 mg) to be separated from the bioactive substance BBM-1675D, which had an R f value of 0.22, and the correct fractions were pooled and evaporated to dryness, with 8 mg of essentially pure BBM -1675D were obtained in almost quantitative yield.
Die physikochemischen Eigenschaften von BBM-1675D sind in der Beschreibung erwähnt, und die Ultraviolett-, Infrarot-, Massen-, 1H NMR- und 13C NMR-Spektren der Verbindung sind in den Fig. 2, 4, 6, 8 bzw. 10A und 10B dargestellt.The physicochemical properties of BBM-1675D are mentioned in the description, and the ultraviolet, infrared, mass, 1 H NMR and 13 C NMR spectra of the compound are shown in Figs. 2, 4, 6, 8 and 10A and 10B.
Eine Probe von BBM-1675A2 (40 mg) wurde mit 5 ml einer 0.5 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol bei ca. 50°C während ca. 2 Stunden nach der allgemeinen Verfahrensweise und Isolationsmethode nach Beispiel 1 behandelt. Nach der Neutralisierung mit NaHCO3 und Eindampfen zur Trockne wurde die BBM-1675C-Substanz aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war unter Verwendung von Toluol : Aceton (3 : 2, vol/vol) als Eluiermittel isoliert. Die richtigen Fraktionen wurden kombiniert und zur Trockne eingedampft, wobei 8,4 mg im wesentlichen reines BBM-1675C erhalten wurden, welches identisch mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt ist.A sample of BBM-1675A 2 (40 mg) was treated with 5 ml of a 0.5 molar solution of hydrogen chloride in methanol at approx. 50 ° C. for approx. 2 hours according to the general procedure and isolation method according to Example 1. After neutralization with NaHCO 3 and evaporation to dryness, the BBM-1675C substance was removed from the residue by rapid column chromatography on a column packed with Woelm silica gel (32-63 micrometer particle size) using toluene: acetone (3: 2 , vol / vol) isolated as eluent. The correct fractions were combined and evaporated to dryness to give 8.4 mg of substantially pure BBM-1675C, which is identical to the product obtained in Example 1.
Die obige Chromatographiesäule wurde dann mit Chloroform : Methanol (5 : 0.25, vol/vol) eluiert, und die gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei BBM-1675D erhalten wurde. Die Substanz BBM-1675D wurde weiter gereinigt durch eine zusätzliche Schnellchromatographiesäule mit Silicagel unter Verwendung von Chloroform : Methanol (5 : 0.5, vol/vol) als Eluiermittel. Die richtigen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei 6,3 mg im wesentlichen reines BBM-1675D erhalten wurde, welches identisch mit dem Produkt nach Beispiel 3 ist.The above chromatography column was then run with chloroform: methanol (5: 0.25, vol / vol) eluted and the fractions collected combined and evaporated to dryness to give BBM-1675D. The BBM-1675D substance was further purified by an additional one Rapid chromatography column with silica gel using of chloroform: methanol (5: 0.5, vol / vol) as eluent. The correct fractions were pooled and evaporated to dryness, whereby 6.3 mg of substantially pure BBM-1675D was obtained which is identical to the product according to Example 3.
Eine Probe BBM-1675A1 (49,3 mg) wurde mit einer 0.037 M-Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1,5 ml) bei einer Temperatur von ca. 60°C während ca. 1,5 Stunden hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockne unter vermindertem Druck bei ca. 30°C eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher BBM-1675D und die inaktiven Verbindungen 1 und 3 enthielt. Die bioaktive Substanz BBM-1675D wurde aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer Säule, welche mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war, unter Verwendung von Chloroform : Methanol (5 : 0,25, vol/vol) als Eluiermittel isoliert. Die richtigen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei 27 mg im wesentlichen reines BBM-1675D erhalten wurden, welches identisch ist mit dem in Beispiel 3 isolierten Produkt.A sample of BBM-1675A 1 (49.3 mg) was hydrolyzed with a 0.037 M solution of p-toluenesulfonic acid in methanol (1.5 ml) at a temperature of about 60 ° C. for about 1.5 hours. The reaction mixture was evaporated to dryness under reduced pressure at about 30 ° C, whereby a residue was obtained which contained BBM-1675D and the inactive compounds 1 and 3. The bioactive substance BBM-1675D was removed from the residue by rapid column chromatography on a column packed with Woelm silica gel (32-63 micrometer particle size) using chloroform: methanol (5: 0.25, vol / vol) as the eluent isolated. The correct fractions were pooled and evaporated to dryness to give 27 mg of substantially pure BBM-1675D, which is identical to the product isolated in Example 3.
Eine Probe von BBM-1675C (5,1 mg) wurde mit einer 0.5 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol (1 ml) bei ca. 40-50°C über Nacht hydrolisiert. Nach Neutralisation mit NaHCO3 und Eindampfen zur Trockne wurde die bioaktive Substanz BBM-1675D aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromathographie auf einer Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war, unter Verwendung von Chloroform : Methanol (5 : 0.5, vol/vol) als Eluiermittel isoliert. Die richtigen Fraktionen ergaben im wesentlichen reines BBM-1675D, welches mit dem in Beispiel 3 isolierten Produkt identisch ist. A sample of BBM-1675C (5.1 mg) was hydrolyzed with a 0.5 molar solution of hydrogen chloride in methanol (1 ml) at approx. 40-50 ° C overnight. After neutralization with NaHCO 3 and evaporation to dryness, the bioactive substance BBM-1675D was removed from the residue by rapid column chromatography on a column packed with Woelm silica gel (32-63 micrometer particle size) using chloroform: methanol (5: 0.5 , vol / vol) isolated as eluent. The correct fractions gave essentially pure BBM-1675D, which is identical to the product isolated in Example 3.
Wird die allgemeine Verfahrensweise der Beispiele 1 und 2 wiederholt mit der Ausnahme, daß das Ausgangsmaterial BBM-1675A1 durch eine equimolare Menge einer Mischung aus BBM-1675A1 und BBM-1675A2 ersetzt wird, dann werden die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D ebenfalls gebildet.If the general procedure of Examples 1 and 2 is repeated with the exception that the starting material BBM-1675A 1 is replaced by an equimolar amount of a mixture of BBM-1675A 1 and BBM-1675A 2 , the substances BBM-1675C and BBM- 1675D also formed.
Wenn die allgemeine Verfahrensweise nach Beispiel 5 wiederholt wird, mit der Ausnahme, daß das Ausgangsmaterial BBM-1675A1 durch eine equimolare Menge einer Mischung aus BBM-1675A1 und BBM-1675A2 ersetzt wird, dann wird ebenfalls die Substanz BBM-1675D gebildet.If the general procedure of Example 5 is repeated, except that the starting material BBM-1675A 1 is replaced by an equimolar amount of a mixture of BBM-1675A 1 and BBM-1675A 2 , then the substance BBM-1675D is also formed.
Claims (29)
540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,
1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,
1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930,
2970, und 3450 reziprogen Zentimetern;(f) it has an infrared absorption spectrum (KBr, film) substantially as shown in Fig. 3 and shows major absorption peaks
540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,
1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,
1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930,
2970 and 3450 reciprocal centimeters;
735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195,
1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,
1720, 1735, 2880, 2930, 2960, und 3400 reziprogen Zentimetern(f) It has an infrared absorption spectrum (Kbr, film) substantially as in Fig. 4 and shows major absorption peaks
735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195,
1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,
1720, 1735, 2880, 2930, 2960, and 3400 reciprocal centimeters
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