DE3603242A1 - Verwendung von putrescin, ornithin und uridin allein oder in mischung, ggfs. zusammen mit lactat und/oder pyruvat zur steigerung der aktivitaet von helfer t-lymphozyten und davon abhaengiger anderer immunreaktionen - Google Patents

Description

Immunmodulatoren, also Substanzen, welche eine Immunsuppression oder Immunstimulation bewirken, haben in der letzten Zeit wachsendes Interesse gefunden, und zwar einerseits um den Immunabstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen und Autoimmunerkrankungen entgegenwirken zu können und andererseits zur Aktivierung der körpereigenen Abwehr gegen Tumoren und Infektionen.

So wurde kürzlich berichtet, daß die Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten in vivo stark durch Pyruvat erhöht wird.

Anderseits wurde beobachtet, daß die Aminosäure Ornithin selektiv die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten hemmt. Diese Aktivierung war insofern selektiv, als die Aktivierung von Helfer-T-Zell-Funktionen (Interleukin 2-Produktion) und proliferative T-Zell-Reaktionen nicht gehemmt wurden.

Derartige Substanzen bieten somit die Möglichkeit, gezielt in das Immunsystem einzugreifen und je nach Wunsch eine Hemmung oder Verstärkung von Immunreaktionen generell oder bestimmten Typen von Immunreaktionen herbeizuführen.

Es besteht auch weiterhin ein Bedarf, weitere Substanzen oder Substanz-Kombinationen mit größerer Wirksamkeit oder mit Selektivität zu finden, um gezielt bestimmte Immunreaktionen je nach dem vorliegenden Fall zu beeinflussen.

Es wurde nun gefunden, daß Putrescin, Ornithin und Uridin allein oder in Mischung gegebenenfalls zusammen mit Lactat und/oder Pyruvat, insbesondere jedoch die Kombination von Putrescin und/oder Ornithin mit Lactat und/oder Pyruvat, gegebenenfalls noch mit Uridin, eine außerordentlich große superadditive Stimulierung der Interleukin Produktion zur Folge haben. Die Eigenschaften der Einzelsubstanzen oder bestimmter Unterkombinationen können graduell oder grundsätzlich verschieden sein. Die Interleukin 2-Produktion ist eine Aktivität der Helfer T-Lymphozyten. Die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten wird im Gegensatz dazu von L-Ornithin gehemmt, wie bereits in einem älteren Vorschlag (Patentanmeldung P 35 14 328) gezeigt wurde.

Da sowohl humurale als auch T-Zell-vermittelte Immunreaktionen von der Helfer T-Zell Aktivität abhängen, werden durch die Applikation der genannten Substanzen indirekt auch andere Immunreaktionen moduliert. Insbesondere ist gezeigt worden, daß Putrescin und Ornithin allein die in vivo Immunisierung für eine spätere sekundäre T-Zell-vermittelte Immunreaktion (sekundäre zytotoxische Reaktion in vitro) verstärkt. Nach dem bisherigen Verständnis heißt dies, daß die Expansion potentiell reaktiver Zellklone verstärkt wird, während (wie früher gezeigt) die Aktivierung der reifen zytotoxischen Effektorzellen durch Ornithin gehemmt wird. Letzteres kann z. B. zur Hemmung der Transplantatabstoßung genutzt werden.

Verstärkt wird u. a. auch die in vivo Immunisierung gegen Tumoren oder Transplantate, die in den Haupt-Transplantationsantigenen mit dem immunisierten Organismus übereinstimmen. Dies bedeutet, daß Putrescin und Ornithin eine Wirkung für körpereigene Tumoren haben, und wenigstens im Hinblick auf die primäre in vivo Immunisierung prinzipiell als Antitumormittel wirken.

Wenn man nun Lactat oder Pyruvat mit Putrescin oder Ornithin oder beiden kombiniert, insbesondere wenn auch noch Uridin zugegeben wird, erfolgt eine massive Stimulierung der Interleukin 2-Produktion und somit eine Stimulierung der Helfer T-Lymphozyten und der davon abhängigen anderen Immunreaktionen. Es handelt sich dabei nicht nur um additive sondern um synergistische Effekte, da Uridin allein ohne die Kombination mit Lactat/Pyruvat etwas Gegenteiliges bewirkt, nähmlich die Hemmung der Interleukin 2-Produktion.

Demgemäß betrifft die Erfindung die Verwendung von Putrescin, Ornithin und Uridin allein oder Mischung, gegebenenfalls zusammen mit Lactat und/oder Pyruvat, zur Steigerung der Helfer T-Zell-Aktivität und damit indirekt auch anderer, von der Helfer-Aktivität-abhängigen Immunreaktionen. Insbesondere betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Putrescin und/oder Ornithin allein bei der in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre T-Zell-vermittelte Immunreaktion inklusive der Immunisierung gegen Tumoren.

Die genannten Wirkungen kann man ausnutzen für ganz normale Pharmaca, mit dem Ziel, selektiv bestimmte Immunreaktionen zu stimulieren. Dies bedeutet, daß man unterschiedliche Funktionen des Immunsystems unterschiedlich anspricht.

Material und Methoden

Es wurden Mäuse von Bomholtgard, Ry, Dänemark, oder aus dem Bestand des Deutschen Krebsforschungszentrums verwendet, die meistens 8 bis 12 Wochen alt waren. Die in vivo Immunisierung wurde durch ip. Injektion von bestrahlten (1500 rad) allogenen Milzzellen oder Mitomycin C behandelten Tumorzellen (45 Min. Inkubation mit 80 µg/ml Mitomycin C von SIGMA) durchgeführt.

Assay auf Interleukin 2 (IL-2) Aktivität
Die IL-2 Titer wurden mit der IL-2-abhängigen W-2 T-Zellinie, wie von Falk et al. in J. Immunol. 130 : 2214 beschrieben, bestimmt.

Die Herstellung der IL-2-haltigen Überstände erfolgte aus einer IL-2 produzierten El-4 Thymom-Unterlinie nach Induktion mit Phorbolmyristinsäureacetat (PMA), wie von Farrar et al. in J. Immunol. 125 : 2555 beschrieben. Es wurden 10⁶ Zellen pro ml zusammen mit 10 ng PMA/ml 48 Stunden inkubiert. Der Überstand wurde gesammelt und gefroren bei -20°C gelagert.

Die Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen in vitro erfolgte, indem 10 Millionen Milzzellen von normalen oder immunisierten Mäsuen als Responderzellen mit 5 × 10⁶ bestrahlten (1500 rad) allogenen Stimulatorzellen in einem Gesamtvolumen von 5 ml Kulturmedium (RPMI 1640, GIBCO Medium ergänzt mit 10 mM L-Glutamin (GIBCO), Streptomycin/Penicillin (GIBCO; 100 U/ml, 0.5% HEPES (GIBCO), 10% fötales Kälberserum (GIBCO) und 3 × 10⁵ M 2-Mercaptoethanol) 5 Tage bei 37°C in 5% CO₂, wenn nicht anders angegeben, inkubiert wurden. Die Kulturen wurden nach 5 Tagen auf zytotoxische Aktivität gegen Concanavalin A-aktivierte allogene Milzzellblasten in in einem vierstündigen ⁵¹Cr-Freigabeassay, wie von Reddehase et al., J. Immunol. 128 : 61 bzw. Galli et al., J. Immunol. 10 : 87 beschrieben, untersucht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Wirkung von Putrescin auf die in vitro Immunisierung (Priming) für eine nachfolgende sekundäre zytotoxische Immunreaktion in vitro. - Demonstration der MHC-Restriktion.

Mäuse unterschiedlicher Stämme wurden durch ip. Injektion von suboptimalen Dosen (5 × 10⁵) an MHC-kompatiblen Zellen immunisiert und gleichzeitig mit abgestuften Konzentrationen an Putrescin in 0,3 ml BSS (balanzierte Salzlösung) behandelt. Die Mäuse wurden 7 bis 8 Tage später getötet. Milzzellen dieser Mäuse wurde weitere 5 Tage zusammen mit 5 × 10⁶ bestrahlten Zellen des ursprünglichen Stimulatortyps und mit oder ohne 5 × 10⁶ bestrahlten MHC-unverträglicher C57BL/6 Milzzellen behandelt. Die letzteren sollten einen zusätzlichen Stimulus für die endogene Helfer Zellen-Aktivierung (IL-2 Produktion) in der Kultur ergeben.

In einer Stammkombination (Balb/c immunisiert gegen B10.D2 (H-2^d)) war die Kontrollantwort ohne Putrescin praktisch nicht nachweisbar wie Fig. 1, untere Hälfte, zeigt. Diese Antwort wurde schon stark durch die verhältnismäßig geringe Konzentration an 7 × 10^-5 M Putrescin erhöht (der gleiche Ansatz von BALB/c Mäusen erzeugte 33,5% Tötung beim Angreifer : Targetzell- Verhältnis 25 : 1 nach der primären in vivo- Immunisierung mit 8 × 10⁶ Zellen ohne Putrescin). Eine weitere Stammkombination (C3H immunisiert gegen C57/H-2^k) erzeugte schon eine beträchtliche zytotoxische Aktivität nach Immunisierung mit 5 × 10⁵ Zellen ohne Putrescin wie Fig. 1 und Fig. 2, obere Hälfte zeigen. Diese Antwort erforderte verhältnismäßig hohe Konzentrationen (8 × 10^-3 M) and Putrescin für die optimale Aktivierung. (Der gleiche Ansatz von C3H Mäusen erzeugte 69,9% Tötung bei dem Angreifer : Targetzell- Verhältnis 5 : 1 nach in vivo primärer Immunisierung mit 8 × 10⁶ Zellen ohne Putrescin). Die zytotoxische Aktivität von BALB/c Milzzellen nach Immunisierung mit MHC-verträglichen B10.D2 Zellen in Kombination mit Putrescin konnte an B10.D2 und B10A Targetzellen gezeigt werden (d. h. an Zellen, welche die Nebentransplantations-Antigene und wenigstens einen Teil der Haupttransplantations-Antigene (MHC-Komplex) mit den ursprünglichen Stimulatorzellen gemeinsam haben), jedoch war die zytotoxische Aktivität nicht nachweisbar an B10.S, B10.M oder C57BL/6 Targetzellen, welche die Nebentransplantions- Antigene gemeinsam hatten, jedoch nicht den H-2^d Haplotyp für die Haupttransplantaions-Antigene, wie Fig. 2 zeigt. Die starke zytotoxische Antwort der Putrescin- behandelten Mäuse zeigt somit die typische MHC-Restriktion, die in sekundären zytotoxischen Antworten gegen nicht-MHC- Antigene nach üblicher Immunisierung in der Literatur beobachtet wurden (Bevon, M. J., J. Exp. Med. 142 : 1439 (1975) und Bevon, M. J., Immunol. 117 : 2233 (1976)). Entsprechende Ergebnisse wurden mit der Stammkombination C3H-anti-C57/H-2^k erhalten.

Die in vivo-Immunisierung wird in ähnlichem Ausmaß durch Putrescin und L-Ornithin erhöht. Die sekundäre in vitro- Antwort wird durch eine äußere Quelle von IL-2 nicht erhöht.

Der Versuch in Fig. 3 zeigt die Erhöhungswirkung von Putrescin in einer anderen Stammkombination (DBA/2 gegen B10.D2). Es zeigt auch, daß die sekundäre in vitro-Antwort nicht weiter durch die Zugabe eines IL-2-enthaltenden El-4 Überstandes erhöht wird, was zeigt, daß die Helferaktivität in diesen Kulturen nicht beschränkend ist. Dieser Schluß wird auch gestützt durch die Tatsache, daß sekundäre in vitro-Antworten in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 × 10⁶ bestrahlten MHC-unverträglichen C57BL/6 Stimulatorzellen gewöhnlich nicht deutlich verschieden waren.

Der Versuch in Fig. 3 zeigt schließlich, daß die Antwort gegen eine kleine immunisierende Zelldosis (5 × 10⁵) nicht nur durch Putrescin sondern auch durch seinen biosynthetischen Vorläufer L-Ornithin erhöht wird. Der gleiche Ansatz von Mäusen erzeugte 56% und 26% Tötung bei dem Angreifer : Targetzell- Verhältnis 25 : 1 nach Immunisieren mit 2 × 10⁶ und 8 × 10⁶ B10.D2 Zellen.

Die beigefügte Fig. 1 zeigt die Wirkung von Putrescin auf die in vivo Primär-Immunisierung für eine sekundäre in vitro zytotoxische Antwort.

• A) Weibliche C3H Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ bestrahlten (1500 rad) C57/H-2^k Milzzellen immunisiert und gleichzeitig mit 0,3 ml 8 × 10^-3 M Putrescin in BSS ip. behandelt. Die Mäuse wurden 8 Tage später getötet und 2 × 10⁷ Milzzellen wurden mit 5 × 10⁶ bestrahltenC57/H-2^k Milzzellen weitere 5 Tage inkubiert. Die Figur zeigt die zytotoxische Aktivität (%spezifische ⁵¹Cr-Freigabe) auf C57/H-2^k Targetzellen bei dem angegebenen Angreifer : Targetzell-Verhältnissen.
• B) Männliche BALB [c Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ bestrahlten B10. D2 Milzzellen immunisiert und gleichzeitig mit 0,3 ml 7 × 10^-5 M Putrescin in BSS ip. behandelt. Die Mäuse wurden 7 Tage später getötet und 2 × 10⁷ Milzzellen wurden mit 5 × 10⁶ bestrahlten B10.D2 Milzzellen für weitere 5 Tage inkubiert. Die Figur zeigt die zytotoxische Aktivität gegen B10.D2 Targetzellen.

Fig. 2 zeigt die Wirkung von abgestuften Konzentrationen an Putrescin auf die in vivo Priming für eine sekundäre in vitro zytotoxische Antwort.

Sie zeigt die gleichen zwei Versuche wie in Fig. 1, jedoch ist die Wirkung abgestufter Konzentrationen von Putrescin bei einem konstanten Angreifer : Targetzell-Verhältnis wiedergeben. Dieses Verhältnis betrug 5 : 1 in der oberen Hälfte (A) und 25 : 1 in der unteren Hälfte (B). Die untere Hälfte zeigt auch die zytotoxische Aktivität gegen vier andere Targetzellen, die sich teilweise oder vollständig von den B10.D2 Target-Zellen am MHC (major histocompatibility complex). Dieser Versuch zeigt die starke MHC-Restriktion der zytotoxischen Aktivität in mit Putrescin-behandelten Mäusen.

Fig. 3 zeigt die Wirkung von L-Ornithin und Putrescin auf die in vivo Aktivierung von DBA/2 Mäusen für eine sekundäre zytotoxische Antwort in vitro gegen B10.D2-Zellen.

• A) Weibliche/2 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ bestrahlten (1500 rad) B10.D2 Milzzellen immunisiert und gleichzeitig mit 0,3 ml BSS enthaltenden abgestuften Konzentrationen an L-Ornithin oder Putrescin behandelt. Die Mäuse wurden 8 Tage später getötet und 2 × 10⁷ Milzzellen wurden mit 5 × 10⁶ bestrahlten B10.D2 Milzzellen weitere 5 Tage in 5 ml Kulturbrühe mit oder ohne 0,4 ml eines IL-2 enthaltenden El-4 Überstandes inkubiert. Die Figur zeigt die zytotoxische Aktivität gegen B10.D2 Targetzellen beim Angreifer : Targetzell-Verhältnis 25 : 1.
• B) Die Figur zeigt das gleiche Experiment wie in A). Die Daten zeigen die zytotoxische Aktivität bei abgestuften Angreifer : Targetzell-Verhältnissen von Mäusen, die mit 0,3 ml BSS mit oder ohne 1,6 × 10^-4 M L-Ornithin oder Putrescin behandelt waren.

Beispiel 2 Die Erhöhung der in vivo Vorimmunisierung (Priming) für die sekundäre zytotoxische Antwort in vivo durch L-Ornithin.

Die sekundäre zytotoxische Antwort gegen MHC-verträgliche Zellen in vivo ist im Gegensatz zur sekundären in vitro Antwort gewöhnlich sehr klein, selbst nach Immunisieren mit verhältnismäßig hohen Zelldosen. Die Verabreichung von L-Ornithin kurz nach der primären Immunisierung vermittelt jedoch eine beträchtliche sekundäre zytotoxische Antwort auch in vivo, wie Tabelle I zeigt.

Tabelle I:

Erhöhung der in vivo Priming für die sekundäre in vivo zytotoxische Antwort durch L-Ornithin.

BALB/c Mäuse wurden mit 8 × 10⁶ bzw. 5 × 10⁷ bestrahlten (1500 rad) DBA/2 Milzzellen am Tag 0 bzw. am Tag 9 immunisiert. Einige der Mäuse erhielten auch 5 × 10^-2 M L-Ornithin in 0,2 ml BSS ip. am Tag 0 oder am Tag 2. Die Mäuse wurden am Tag 14 getötet und ihre Milzzellen wurden auf zytotoxische Aktivität gegen Concanavalin A-aktivierte DBA/2 Milzzellen als Targetzellen untersucht. Die Werte zeigen die %-spezifische ⁵¹Cr-Freigabe bei Angreifer : Targetzell-Verhältnissen 100 : 1 und 20 : 1.

Beispiel 3 Erhöhung der in vivo Immunisierung gegen syngene Tumorzellen.

Es wurden DBA/2 Mäuse ip. mit einer kleinen Dosis (2-5 × 10⁵) Mitomycin C-behandelten syngenen ESb-D Tumorzellen zusammen mit abgestuften Dosen von Putrescin oder L-Ornithin immunisiert, und es wurde wiederum die sekundäre zytotoxische Antwort in vitro analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben. Der ESb-D Tumor ist eine immunogene Variante, die durch Mutagenisieren und stufenweise Drogenauswahl von dem nicht-immunogenen T-Zell Lymphom L 5178 Y ESb abstammt.

Fig. 4 zeigt die Wirkung von L-Ornithin und Putrescin auf das in vivo-Priming von DBA/2 Mäusen mit einer kleinen Anzahl von syngenen Tumorzellen (ESb-D).

Linke Hälfte: Weibliche DBA/2 Mäuse wurden mit 2,2 × 10⁵ Mitomycin C-behandelten (80 µg/ml für 45 Min.) ESb-D Tumorzellen immunisiert und gleichzeitig mit 0,3 ml BSS enthaltenden abgestuften Konzentrationen von L-Ornithin behandelt. Die Mäuse wurden 9 Tage später getötet und 2 × 10⁷ Milzzellen wurden mit 5 × 10⁶ bestrahlten Mitomycin C-behandelten ESb-D Tumorzellen plus 5 × 10⁶ bestrahlten C57BL/6 Milzzellen für weitere 5 Tage inkubiert. Die Figur zeigt die zytotoxische Aktivität gegen ESb-D Targetzellen beim Angreifer : Targetzell-Verhältnis 25 : 1.

Rechte Hälfte: Versuchseinzelheiten wie für linke Hälfte, jedoch wurden die Mäuse mit abgestuften Konzentrationen von Putrescin behandelt. Überdies enthielten die sekundären in vitro Kulturen in diesem Versuch keine C57BL76 Simulatorzellen.

Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß die Antwort gegen diese Tumorzellen durch L-Ornithin und Putrescin beträchtlich erhöht wird.

Somit zeigen die Beispiele 1 bis 3, daß die in vivo Immunogenisierung mit MHC verträglichen allogenen Milzzellen oder syngenen Tumorzellen durch L-Ornithin und dessen decarboxylierten Derivat Putrescin stark erhöht wird. Die Antwort gegen suboptimale Dosen von immunisierenden Zellen in Gegenwart von Putrescin zeigt auch die beträchtliche MHC-Restriktion, die früher nach Immunisierung mit größeren Zelldosen bei Abwesenheit von L-Ornithin oder Putrescin beobachtet wurde.

Beispiel 4 Die Wirkung von L-Ornithin auf die in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre zytotoxische Antwort in vitro gegen allogene Zellen, d. h. Zellen mit fremden Haupt-Transplantations- Antigenen.

Der Versuch in Tabelle II zeigt, daß L-Ornithin auch die in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre zytotoxische Antwort gegen allogene Zellen, d. h. Zellen mit fremden Haupt-Transplantations-Antigenen, in vitro stark erhöht.

Tabelle II

BALB/c Mäuse wurden mit 8 × 10⁶ bestrahlten C57BL/6 Milzzellen ip. am Tag 0 in 0,3 ml BSS mit oder ohne die angegebene Konzentration an L-Ornithin immunisiert. Die Mäuse wurden am Tag 14 getötet und 2 × 10⁷ Milzzellen wurden mit 5 × 10⁶ bestrahlten C57BL/6 Milzzellen weitere 5 Tage in 5 ml Kulturmedium inkubiert. Die Werte zeigen die %spezifische ⁵¹Cr-Freigabe von C57BL/6 Targetzellen.

Beispiel 5 Wirkung von L-Ornithin und Putrescin in Kombination mit Uridin und L-Lactat oder Pyruvat auf die Erzeugung von IL-2 in Kulturen von Concanavalin A-aktivierten Milzzellen und PMA-aktivierten EL-4 Zellen (Tabelle III).

Tabelle III

2 × 10⁷ an Nylonwolle nicht-haftende NH₄Cl-behandelte C3H Milzzellen wurden mit 20 µg Concanavalin A in 4 ml Kulturmedium 48 Stunden inkubiert. Alle Kulturen erhielten die angegebenen Konzentrationen von Lactat und Putrescin zu Beginn der Züchtungsperiode und wurden dann 48 Stunden inkubiert. Die Überstände wurden dann auf IL-2 untersucht.

Es zeigte sich (Tab. III), daß die IL-2-Produktion in Kulturen von Concanavalin A-aktivierten Milzzellen durch Putrescin stark erhöht wurde, wenn es in Kombination mit L-Lactat angewandt wurde.

Es zeigte sich auch, daß die IL-2-Produktion schon durch L-Lactat oder Pyruvat allein erhöht wurde, wie Fig. 5 zeigt oder Putrescin allein, wie Tab. III zeigt. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, daß wechselnde Mengen der entsprechenden komplementären Substanz (Putrescin bzw. Lactat) endogen durch die Milzzellen in der Kultur freigesetzt wurden.

L-Ornithin erhöhte die IL-2 Produktion durch Concanavalin A-aktivierten Milzzellen nur in Gegenwart von verhältnismäßig hohen Konzentrationen an Uridin (2,5 × 10^-3 M) plus Lactat oder Pyruvat, wie die folgende Tabelle IV zeigt.

Tab. IV zeigt die Erhöhung der IL-2 Produktion durch L-Ornithin in Kombination mit Uridin plus L-Lactat oder Pyruvat. Uridin zeigte bei Konzentrationen von etwa 10^-3 M Inhibierung der IL-2 Produktion, jedoch wird dieser inhibierende Effekt durch die Zugabe von L-Lactat oder Pyruvat vermindert.

Tabelle IV

C3H Milzzellen (2 × 10⁷) wurden mit 20 µg Concanavalin A in 4 ml Kulturmedium mit 3 × 10^-5 M 2-ME 48 Stunden inkubiert. Alle Kulturen erhielten auch die abgegebene Konzentration an Uridin zusammen mit oder ohne 2 × 10^-3 M L-Ornithin und mit oder ohne 2 × 10^-2 M L-Lactat (Endkonzentrationen) zu Beginn der Züchtungsperiode. Die Überstände wurden nach 48 Stunden geerntet und dann auf IL-2 geprüft.

Die IL-2 Produktion in Kulturen von PMA-aktivierten El-4 Zellen wurde ebenfalls durch Putrescin oder L-Ornithin in Gegenwart von L-Lactat oder Pyruvat erhöht, wie Tab. III zeigt. Zwar war die Erhöhung in diesem Falle nicht so stark wie die Erhöhung der IL-2-Produktion in stimulierten Milzzellkulturen, jedoch zeigen die Versuche, daß diese Substanzen direkt auf die IL-2-produzierenden Lymphozyten und nicht nur auf die akzessorischen Zellen (accessory cells) wirken.

Tabelle V

Wirkung von L-Lactat und Pyruvat in Kombination mit Putrescin oder L-Ornithin auf die IL-2 Produktion durch PMA aktivierte EL-4 Thymomazellen

El-4 Thymomazellen (4 × 10⁶) wurden mit 40 ng PMA und den angegebenen Substanzen in 4 ml Kulturmedium 48 Stunden inkubiert. Die Kulturüberstände wurden dann gesammelt und auf IL-2 geprüft, wie in "Materialien und Methoden" angegeben.

Die Beispiele 1-3 zeigen, daß die in vivo Immunisierung mit MHC verträglichen allogenen Milzzellen und syngenen Tumorzellen durch L-Ornithin und seinem decarboxylierten Derivat Putrescin kräftig erhöht wird. Die Antwort gegen suboptimale Dosen von immunisierenden Zellen in Gegenwart von Putrescin zeigt ebenfalls die ausgeprägte MHC-Restriktion, die früher schon nach Immunisierung mit größeren Zelldosen bei Abwesenheit von Ornithin oder Putrescin beobachtet wurde (Bevan, M. J., J. Exp. Med. 142 : 1439 (1975) und Bevan, M. J., J. Immunol. 117 : 2233 (1976)).

Beispiel 4 zeigt, daß Ornithin auch die in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre zytotoxische Reaktion gegen MHC-unverträgliche allogene Milzzellen verstärkt. Diese Steigerung der "Vorimmunisierung" (Interleukin 2 abhängige Expansion der spezifischen T-Zell-Klone) ist zu unterscheiden von der Hemmung der Aktivierung reifer Effektor-T-Zellen durch Ornithin (siehe Patentanmeldung P 35 14 328).

Beispiel 5 zeigt, daß die IL-2-Produktion durch mitogenaktivierte Lymphozyten oder PMA stimulierte EL-4 Thymomzellen stark durch eine Kombination von Putrescin, L-Lactat und Uridin oder durch die biosynthetischen Vorläufer L-Ornithin bzw. Pyruvat erhöht wird.

Die benötigten Dosierungen aller hier in Betracht gezogenen Substanzen sind je nach Fall leicht abzuschätzen. Der jeweilige Fachmann kann die wirksame Dosis am Einzelfall bemessen. Für die Herstellung von Präparaten, die insbesondere in Form von Lösungen in pyrogenfreiem Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung in Betracht gezogen werden, kann die Konzentration vorzugsweise eine Zehnerpotenz unter bis eine Zehnerpotenz über den in den Beispielen verwendeten Mengen liegen. Als allgemeine Regel kann für die Verwendung in Präparaten eine Konzentration von 10^-3 - 10^-2 mol pro L von L-Ornithin, Putrescin und/oder Uridin sowie 0,1 bis 1 mol pro L Pyruvat bzw. Lactat und für die Dosierung eine Menge von 1-10 mg/kg Ornithin, Putrescin und/oder Uridin sowie 0,1 bis 1 g pro kg im Falle vom Pyruvat bzw. Lactat in Betracht gezogen werden.

Da es bei den angegebenen Substanzen Lactat und Pyruvat nur auf die Ionen ankommt, ist es im Prinzip gleichgültig, welches Metallsalz vorliegt. Aus Zweckmäßigkeitsgründen wird man ein Kalium-, Natrium- oder Ammoniumsalz wählen, jedoch ist jedes Salz, das nicht physiologisch schädlich oder zu wenig löslich ist, einsetzbar.

Claims (6)

1. Verwendung von Putrescin, Ornithin und Uridin allein oder in Mischung, gegebenenfalls zusammen mit Lactat und/oder Pyruvat zur Steigerung der Aktivität von Helfer T-Lymphozyten und davon abhängiger anderer Immunreaktionen.

2. Verwendung von Putrescin, Ornithin und Uridin allein oder in Mischung, gegebenenfalls zusammen mit Lactat und/oder Pyruvat nach Anspruch 1 zur Steigerung der Produktion von Interleukin 2.

3. Verwendung nach Anspruch 1 von Lactat oder Pyruvat mit Putrescin oder Ornithin, gegebenenfalls noch mit Uridin, zur Steigerung der Aktivität von Helfer T-Lymphozyten und davon abhängiger anderer Immunreaktionen.

4. Verwendung von Putrescin und/oder Ornithin zur Verstärkung der Immunisierung in vivo inklusive der Immunisierung gegen Tumoren.

5. Verwendung von Putrescin allein nach Anspruch 4 bei der in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre T-Zell- vermittelte Immunreaktion.

6. Verwendung von Ornithin allein nach Anspruch 4 bei der in vivo Immunisierung für eine nachfolgende sekundäre T-Zell- vermittelte Immunreaktion.