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Verfahren und Vorrichtung zum kontinuierlichen
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Abbau von cellulose- und hemicellulosehaltigen Substraten (Für diese
Patentanmeldung wird die Priorität der Deutschen Patentanmeldung P 34 45 480.2-41
vom 13. Dezember 1984 in Anspruch genommen) Die Erfindung geht aus von einem anaeroben
submersen Verfahren zum microbiellen oder microbiellen und enzymatischen Abbau von
Cellulose und/oder Hemicellulose mit Ausdampfen flüchtiger Endprodukte aus der Gärlösung
sowie von einer Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Das Verfahren soll
in besonderem Maße für die Ethanolerzeugung aus Cellulosematerial, aus Hemicellulose
und aus Pentosen Verwendung finden.
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Da Polysaccharide, wie Cellulose, praktisch wasserunlöslich sind,
handelt es sich bei ihrem enzymatischen Abbau immer um eine Zweiphasenreaktion,
bei der sich Transportprobleme an der Phasengrenze ergeben. Man muß deshalb z.B.
auf die Verwendung von - anderweitig bereits mit großem Erfolg eingesetzten - immobilisierten
Enzymen verzichten und statt dessen in einem wässrigen System die Viskosität so
niedrig und und die Umwälzung so stark wählen, daß ein optimaler enzymatischer Angriff
erfolgen kann.
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Ferner ist ein vollständiger Umsatz des Substrates nicht gegeben,
wenn sich im Laufe des Prozesses Zwischen- oder Endprodukte ansammeln, die auf die
verwendeten Enzyme oder Mikroorganismen inhibierend wirken. Beim Abbau von Cellulose
sind dies Cellobiose, Glucose und Ethanol, die hemmend auf Cellulasen wirken; bei
der Vergärung von Pentosen mit Candida und verwandten Hefen ist der gebildete Alkohol
ein Hemmstoff für diese Hefen.
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Für die Cellulosevergärung ist bereits eine Kombination von enzymatischer
Spaltung und Fermentation in einem Reaktionsraum bekannt, um die Glucosekonzentration
auf einem Minimum zu halten (DE-AS 25 41 960). Darüberhinaus läßt sich durch fortlaufende
Entfernung der gebildeten Endprodukte während der Fermentation die Produkthemmung
weiter minimieren. Bisbekannt her sind einige Wege geworden, auf denen eine Lösung
prinzipiell möglich ist, wenn es sich um flüchtige Verbindungen handelt. So wird
bei einem Verfahren die Vergärung von Cellulosematerial ganz oder teilweise in einem
Teilvakuum durch geführt, bei dem entsprechend der Gärtemperatur ein Unterdruck
so gewählt wird, daß die Gärflüssigkeit sich in der Nähe ihres Siedezustandes befindet,
und der gebildete Alkohol als Dampf abgezogen wird (DE-OS 30 27 108). Bei einem
anderen Verfahren erfolgt die Vergärung in einer von einem Gasstrom getragenen Wirbelschicht,
die aus einem feuchten Hefegranulat mit eingeschlossenem oder aufgesprühtem Substrat
besteht, wobei der gebildete Alkohol entsprechend seinem Partialdruck in die Gasphase
übertritt. Die vergärbaren Saccharide liegen in konzentrierter Form vor, um eine
besonders feststoffreiche "Schlempe" zu erhalten (DE-OS 31 05 581) Die bisher bekannten
Verfahren zur kontinuierlichen Ethanolfermentation sind in erster Linie für die
Vergärung von Glucose konzipiert und gehen auf die besonderen Verhältnisse bei der
direkten Fermentation von pflanzlichen Polysacchariden (ausgenommen Stärke) nicht
näher ein. So wird zwar ein hoher Endvergärungsgrad angestrebt, der momentanen Glucosekonzentration
jedoch kaum Beachtung geschenkt. Vor allem finden sich keine Angaben, nach denen
die Ethanolkonzentration definiert unter einem bestimmten Wert zu halten wäre. -
Das Arbeiten mit einer Wirbelschicht erfordert sehr hohe Substratkonzentrationen,
was relativ hohe momentane Ethanol-und Glucosekonzentrationen zur Folge hat. Ferner
ergeben sich aufgrund der Partikelstruktur und -größe Transportprobleme beim Celluloseabbau.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur kontinuierlichen
Entfernung von flüchtigen Endprodukten aus fermentierenden Systemen zu entwickeln,
welches speziell auf die Fermentation nativer und teilhydrolysierter Cellulose und
Hemicellulose abgestimmt ist. Durch einen Aufbau aus ein fachen Elementen soll das
System unempfindlich gegenüber Sta rungen sein und lange Laufzeiten ermöglichen.
Insbesondere soll durch Abstimmen der Gärungsparameter, wie Ethanolkonzentration,
Konzentration an Metaboliten, Gärtemperatur und Durchmischung, ein optimaler Umsatz
erzielt werden.
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Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruchs
erfindungsgemäß durch die Vereinigung aller Merkmale gemäß diesem Hauptanspruch
gelöst. Dabei wird durch das kontinuierliche Ausdampfen der Abbauprodukte, insbesondere
durch die Entfernung des Alkohols, aus der anaerob geführten Gärlösung über die
Parameter Gasdurchsatz, Enzym-, Substrat-, Hefekonzentration, pH-Wert und Temperatur
bewirkt, daß sich ein quasistationärer Zustand so einstellt, daß für die Zwischen-
und Endprodukte der enzymatisch/mikrobiellen Spaltung ein Konzentrationsbereich
erzielt wird, in dem dieee Produkte bei den katabolischen Reaktionen keine wesentliche
Hemmung mehr verursachen.
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Im einzelnen bedeutet dies für das Ethanol eine Konzentrat im zwischen
1 bis 10 g/l, für die Glucose eine Konzentration zwischen 0,01 und 0,1 g/l und für
die niederen ß-Oligomeren der Glucose bei der Cellulosespaltung (insbesondere Cellobiose)
eine Konzentration, die unter 0,05 g/l liegt. Um für die Hefen genügend vergärbares
Substrat zur Verfügung zu stellen, sollte die Glucosekonzentration vorzugsweise
zwischen 0,05 und 0,1 g/l liegen.
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Aus dem Trägergasstrom kann das darin als Dampf enthaltene Ethanol
zusammen mit dem ausgedampften Wasser durch Abkühlen bis nahe an den Gefrierpunkt
des abgeführten Ethanol-Wasser-Gemisches (Kondensats) gewonnen werden. Eine andere
Möglichkeit zur Gewinnung des Alkohols ist die Abtrennung des in
dem
Trägergasstrom als Dampf enthaltenen Ethanols durch eine selektive, zumindest semipermeable
Membran, die vorzugsweise nur für Ethanol durchlässig ist, während andere Komponenten
von ihr zurückgehalten werden. Eine solche Membran kann bspw.
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aus Celluloseacetat bestehen. In beiden Fällen wird der Trägergasstrom
nach weitgehender Abtrennung des Alkohols über ein Gebläse wieder in den Fermenter
zurückgeführt.
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Im Fermenter wird der Trägergasstrom von einer Gasfritte odg einer
Düse aus verteilt. Wichtig ist eine starke Zerteilung des Trägergasstroms und seine
innige Vermischung mit der Fer mentationsflüssigkeit. Der durchschnittliche Durchmesser
der Gasblasen liegt dabei zwischen 0,5 und 1 mm.
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Wird das Trägergas über eine Düse eingeführt, so wird es vor teilhaft
mittels eines der Gaszuführungsdüse vorzugsweise im Bodenbereich des Reaktors beigeordneten
Rührers verteilt. Der Fermenterinhalt wird also im wesentlichen durch den Trägergasstrom
durchmischt. 1 Die Erfindung wird nachstehend aufgrund von Ausführungsbeispielen
anhand der Figur erläutert.
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Die Figur zeigt, daß der Trägergasstrom über eine Gasfritte 2 in den
Fermenter 1 gelangt, von wo er durch die Gasheizung 3 und die Gaskühlung 4 zu dem
Gebläse 5 gelangt, mit welchem sich der Kreislauf des Trägergasstroms schließt.
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Das Destillat fällt an der Kühlschlange 6 an und gelangt übg den Hahn
7 in den Auffangbehälter 8, an dem der Druckausgleich über ein Gärrohr 9 erfolgt.
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Die Kühlschlange 6 der Gaskühlung 4 wird von einer Kühlsole durchströmt,
deren Temperatur mit Hilfe einer Wärmepumpe 20 konstant gehalten wird. Die abgeführte
Wärmeenergie ist zur Thermostatisierung 11 des Fermenters, des später beschriebenen
Mischgefäßes 15 sowie auch der Gasheizung 3 geeignet.
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Der Fermenter 1 muß dem Druck des einströmenden Trägergases entsprechend
gasdicht sein. Beim Arbeiten mit Cellulase, aber auch mit Xylose, kann mit einer
pH-Wert-Regelung 10, bestehend aus einer Registrierung und aus Soll-Ist-Wert-ge-
steuerten
Säure- und Laugenpumpen, gearbeitet werden, um die jeweils optimalen Bedingungen
einzustellen. Zur Thermostatisierung des Fermenters ist die Heizung 11 vorgesehen.
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Bei der Cellulosespaltung sind die optimalen Bedingungen bei einem
pH-Wert zwischen 4,5 und 5 sowie bei einer Temperatur zwischen 32 und 38 OC (mit
Berücksichtigung der Temperaturtoleranz der Hefen) gegeben. Für die Xylosevergärung
ist je nach Hefe ein pH-Wert zwischen 2,5 und 5 und eine Temperatur zwischen 30
und 38 °C günstig.
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Als Substrate sind im wesentlichen alle cellulosehaltigen Roh- und
Abfallstoffe geeignet; ebenso ist an teilhydrolysierte Cellulosematerialien zu denken.
Steht aus einem solchen Hydrolyseprozeß eine als "Vorhydrolysat" bezeichnete, pentosehaltige
Lösung zur Verfügung, so kann diese der Xylose entsprechend vergoren werden. Für
Hemicellulosen bietet sich eine enzymatische oder säurehydrolytische Vorbehandlung
an.
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Beim Cellulaseabbau wird als Substrat vorteilhaft native oder teilhydrolysierte
Cellulose zusammen mit Cellulasen, vorzugsweise von einer Trichoderma und/oder einer
Aspergillusspezies, sowie eine Hefe der Gattung Saccharomyces verwendet. Als Cellulasen
kommen sowohl handelsübliche Fertigprodukte oder technische Cellulasen als auch
labormäßig dargestellte Präparate in Betracht. - Für die Pentosenvergärung ist es
vorteilhaft, eine Hefe der Gattung Pachysolen, Pichia oder Candida sowie als Substrat
hydrolysierte Hemicellulose zu verwenden.
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Damit der Fermenter während der Gärung im wesentlichen immer gleich
gefüllt ist, wird eine der ausgedampften Ethanol-Wassermischung entsprechende Flüssigkeitsmenge,
die Substrat entsprechend dem gebildeten Ethanol enthält, eingespeist.
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Die Menge an ausgedampftem Destillat beträgt bei einem Gasdurchsatz
von etwa 0,3 Nm3 Gas pro Liter Fermenterinhalt und pro Stunde etwa 20 ml.
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Zur Einspeisung des Substrats, die über die Pumpe 12 kontinuierlich
oder diskontinuierlich erfolgen kann, dient eine
geeignete Vorrichtung.
Je nach Art des Substrats (flüssig oder reich an Feststoffen) wird zu der entsprechenden
Pumpe 12 auch ein geeigneter Leitungsdurchmesser gewählt. Dabei ist für feststoffreiche
Substrate eine diskontinuierliche Einspeisung etwa in der Art empfehlenswert, daß
z.B. jede Stunde ein Substrateintrag bei einem gegenüber der kontinuierlichen Arbeitsweise
entsprechend vergrößerten Leitungsdurchmesser erfolgt. Diese Vorgehensweise bringt
für die Gärung im Vergleich zur kontinuierlichen Einspeisung keinerlei Nachteile.
Auch bei Zudosierung von teilhydrolysierter Cellulose, die Glucose und Glucoseoligomere
in einer Konzentration über 2 g/l enthält, stellen sich nach einer vorübergehenden
Phase die Konzentrationsbereiche des oben angeführten quasistationären Zustands
wieder ein.
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Wenn Cellulosematerial als Substrat verwendet wird, ist es sinnvoll,
dieses nicht erst im Fermenter mit den Enzymen zusammenzubringen. Vorteilhaft wird
ein Gefäß 13 benutzt, in dem eine Vorrichtung 14 zum Mischen enthalten ist und in
dem das zerkleinerte Cellulosematerial als Feststoff mit einer Flüssigkeit, vorzugsweise
mit Wasser, und einer entsprechenden Enzymmenge zusammengebracht wird. Vorteilhaft
ist es auch, wenn in diesem Gefäß optimale Bedingungen durch eine Thermostatisierung
15 und eine pH-Regelung 16 für das Enzym eingestellt werden können. Bei der enzymatischen
Hydrolyse sind diese Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 6 und einer
Temperatur zwischen 45 und 55 °C gegeben. - Um in dem Gefäß 13 eine Säurehydrolyse
in günstiger Weise durchzuführen, ist bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 eine Temperatur
von 160 bis 220 OC für eine Zeitdauer zwischen einer Sekunde und mehreren Minuten
aufrecht zu erhalten.
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Um, wie bei kontinuierlichen Gärverfahren mit Hefen der Gattung Saccharomyces
üblich, die Gärung microaerob zu führen bzw. den Hefen stets eine geringe Menge
Sauerstoff für oxidative Reaktionen zur Verfügung zu stellen, ist es vorteilhaft,
über eine Pumpe 17 ständig eine gewisse Menge an gefilterter Umgebungsluft in den
Fermenter perlen zu lassen. Diese Menge liegt für 1 1 Fermenterinhalt in der Größenordnung
von
0,1 1 pro Stunde. - Bei Hefen der Gattung Pichia erweist sich dagegen eine anaerobe
Gärführung ohne Einbringen von Sauerstoff als günstiger.
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Es ist ferner vorteilhaft, laufend eine bestimmte Menge an Enzym für
den Abbau der Polysaccharide und/oder ständig eine eine gewisse Dosis an Nährstoffen
für die Hefe bei 18 zuzuführen. Bei den Enzymen handelt es sich dabei insbesondere
um Cellulasen, bei den Nährstoffen um anorganische Nährsalze, auch in Verbindung
mit Hefeextrakt.
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Um aus dem Fermenter nicht umsetzbares Substrat oder Zellmasse zu
entfernen ist ein Austrag 19 vorgesehen, für den die Ausführungen über die Einspeisung
entsprechend gelten.
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Im Fermenter 1 kann der Trägergasstrom entweder von einer Gasfritte
oder von einer Düse aus verteilt werden. Wichtig ist eine starke Zerteilung des
Trägergasstromes und seine innige Vermischung mit der Fermentationsflüssigkeit.
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Bei dem strömenden Trägergas kann es sich um ein Inertgas handeln.
Arbeitet man mit Hefen der Gattung Saccharomyces, so beginnt man bei der Gärung
vorzugsweise mit der Umgebung luft. Der anfänglich in dieser enthaltene Sauerstoff
wird dann zum Aufbau von Hefebiomasse verwendet. Im Laufe der Gärung wird durch
das entstehende Kohlendioxid anderes Gas aus dem Fermenter verdrängt, und zwar erfolgt
der Druckausgleich mit der Umgebungsluft über ein Gärrohr, welches mit einer geeigneten
Sperrlüssigkeit, wie Wasser, Schwefelsäure oder einem Desinfektionsmittel, gefüllt
ist.
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Eine Gaserhitzung nach der Destillatabscheidung ist nicht erforderlich,
wenn die Kompressionsanlage (Gebläse 5) zwischen Gaskühler 4 und Fermenter 1 gelegt
wird. Die dort freiwerdende Kompressionswärme bewirkt eine ausreichende Beheizung
des trockenen Trägergases.
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Damit die in dem Trägergasstrom enthaltene Ethanol-Wasser-Mischung
nicht in der Zuleitung zu der Gaskühlung 4 kondensiert, wird diese möglichst kurz
gehalten und entsprechend isoliert. Außerdem ist es günstig, unmittelbar anschließend
an
den Fermenter 1 eine Heizstrecke (Gasheizung 3) für den Trägergasstrom derart vorzusehen,
daß ein Teil der Gasableitung mit einem wasserdurchströmten Mantel versehen wird,
der eine Temperatur von ca. 5 bis 10 °C über der Gärtemperatur aufweist.
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Die Abscheidung des Destillats erfolgt vorteilhaft dadurch, daß in
die entsprechend verdickte Trägergasleitung eine Kühlschlange 6 derart eingebaut
wird, daß an dieser Kühlschlange abgeschiedenes Destillat nach unten in den Auffangbehälter
8 abtropfen kann, während das getrocknete Trägergas über eine separate Leitung aus
diesem Kühler nach oben abgezogen wird. Der Druckausgleich zur Umgebungsluft wird
zweckmäßig an dem Auffangbehälter 8 durchgeführt.
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Zum Anfahren des Fermenters wird dieser mit einer wässrigen Suspension
des Substrats, dem Enzym und dem Mikroorganismus, evtl. mit entsprechenden Nährsalzen,
beschickt. Nach Einstellung des genschten pH-Wertes kann mit der Umwälzung des Trägergases
begonnen werden. Zu Beginn der Gärung ist es voF teilhaft, wenn eine bestimmte Menge
an Monosacchariden (etwa 1 % in der Lösung) vorhanden ist. Dazu kann das Substrat
mit dem Enzym schon eine gewisse Zeit vor der Zugabe des Mikroorganismus inkubiert
werden.
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Beispiel 1: Cellulosefermentation In einem Fermenter mit 3 1 Nutzinhalt
wurde der Umsatz von Cellulosepulver gemessen. Die Fermentation erfolgte bei pH
4,8 und einer Temperatur von 36 00. Die Versuchszeit betrug 162 Stunden. Zu Beginn
war in dem Fermenter eine wässrige Lösung mit 0,04 % Diammoniumhydrogenphosphat
und 0,04- % Hefeextrakt. Als Infektionsschutz dienten 0,01 % Formalin. Als Hefe
wurde dickbreiige Bierhefe verwendet, deren Einsaat 50g Preßhefe entsprach.
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Die 12-prozentige Gellulosesuspension wurde in dem Gefäß 13 bei 50
OC und pH 4,8 mit 1 % technischer Cellulase inkubiert.
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Der Luftdurchsatz im Fermenter 1 betrug ca. 1 Nm pro Stunde. Stündlich
wurden 54 g Destillat mit einem durchschnittlichen
Ethanolgehalt
von 2 Gew.-% erhalten. Im Fermenter stellte sich eine quasistationäre Ethanolkonzentration
von 0,4 Gew.-% ein. Glucose wurde im Fermenter mit einer maximalen Konzentration
von 0,1 g/l bestimmt, was praktisch Ciner Endvergärung entspricht. Insgesamt betrug
der Einsatz an alpha-Cel lulose 522 g, die 5r:0 9 Glucose äquivalent sind.
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Daraus wurden 157 g Ethanol erhalten, was einer Ausbeute von 53 %
der Theorie entspricht.
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Beispiel 2: Xylosefermentation Die Fermentation von Xylose mit der
Hefe Pachysolen tannophilus wurde bei einen Gasdurchsatz von 0,3 Nm' pro Stunde
in einem Formenter mit @@@ Nutzinhalt durchgefüht. Die versuchszeit betrug 94 Stunden.
Im Fermenter befand sich eine wässrige Lösung aus 0,2 % Diammoniumhydrogenphosphat,
0,15 % Hefeextrakt und 0,01 % Formalin. Die Hefeeinsaat entsprach 30 g Preßhefe.
Im Fermenter wurde eine Temperatur von 34 °C und ein pl von 2,7 aufrechterhalten
Nach Erreichen eines quasistationären Zustandes betrug die Ethanolkonzentration
im Fermenter 0,2 Gew.-% und im Destillat 1,4 Gew.-%. Die Xylosekonzentration stellte
sich bei etwa 1 Gew.-% ein. Im qxiasistationären Zustand wurden stündlich 0,44 g
Ethanol aus 1,6 g zudosierter Xylose erhalten, was einer Ausbeute von 54 % der Theorie
entspricht.
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Beispiel 3: Xylosefermentation Die Fermentation von Xylose mit der
Hefe Pichia stipitis wurde bei einem Gasdurchsatz von ca. 1 Nm3 pro Stunde in einen
Fermenter mit 3,6 L Nutzinalt und einem ständigen geringen Stickstoffüberdruck durchgeführt.
Die Versuchszeit betrug 96 Stunden. Im Fermenter befand sich eine wässrige Lösung
aus 0,1 % Diammoniumhydrogenphosphat, 0,2 % Citronensäure, 0,2 % Hefeextrakt und
0,03 % Antischaum. Die Einsaat an Hefetrockensubstanz betrug 2 g/l, die nach 70
h um weitere 2 g erhöht wurde. Im Fermenter hielt man eine Temperatur von 32 c und
ein pH von 4 aufrecht.
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Nach einer Inkubationszeit von 19 h wurde der Kompressor eingeschaltet.
Die Ethanolkonzentration im Fermenter betrug ca. 0,3 Gew. % und die Xylosekonzentration
zwischen 1 und 15 g/l. Insgesamt sind 132 g Xylose umgesetzt worden. Das gewonnene
Kondensat enthielt 45,5 g Ethanol und im Fermenter waren bei Versuchsende noch 9,9
g vorhanden. Dies entspricht einer Ausbeute von 0,42 g Ethanol pro g umgesetzter
Xylose oder 82% der Theorie.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung geht gegenüber dem bisher bekannten
Vorgehen wesentlich stärker auf die besonderen Bedürfnisse bei der Cellulose- und
Hemicellulosefermentation ein und ermöglicht daher optimale Umsatzverhältnisse.
Dabei sind zum einen aufwendige Einrichtungen zur Erzeugung von Vakuum bzw. zur
Konditionierung und Regelung eines Gasstroms für den Aufbau einer Wirbelschicht
sowie zum Einbringen von Substrat, insbesondere durch Aufsprühen, nicht erforderlich
und zum anderen können Mikroorganismen verwendet werden, die einem Unterdruck nicht
standhalten würden (Gefahr des Zerplatzens), ohne daß die Abtreibung des Alkohols
in einem Teilstrom des Fermenters erfolgen muß. Auperdem wird die Einrichtung zur
Durchmischung des Fermenterinhalts weit weniger aufwendig, weil der Trägergasstrom
zum Alkoholabtrieb selbst für die Umwälzung des Fermenterinhalts sorgt.