DE3538310A1 - Verwendung von glutamin in form seiner di- und tripeptide im naehrmedium fuer zellkulturen - Google Patents

Verwendung von glutamin in form seiner di- und tripeptide im naehrmedium fuer zellkulturen

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Description

Die in vitro-Kultivierung von tierischen und pflanzlichen Zellen ist ein wichtiges Instrument in der biologischen Forschung geworden. So werden in zunehmendem Maße Zellkulturen meist als biologische Modelle verwendet, um z.B. pharmakologische Wirkungen neuer chemischer Substanzen zu testen, wodurch bisher notwendige Tierversuche bei der Untersuchung derartiger Substanzen zum Teil ersetzt werden können. Auch ist es möglich geworden, bestimmte Stoffe, z.B. monoklonale Antikörper in derartigen Zellkulturen im industriellen Maßstab herzustellen. Ferner werden auch Zellkulturen im großen Maße bei der Tumorforschung eingesetzt. Auch in Verbindung mit der extrakorporalen Be­ fruchtung zur Überwindung der Sterilität wird die isolierte Eizelle in Nährlösungen mit den Spermien in Kontakt gebracht und dann das befruchtete Ei bis zum Stadium des Vier- oder Achtzell-Embryos 48-60 Stunden inkubiert bevor der Transfer in den Uterus erfolgt. Vgl. Arch. Gynerol 231, 171-176 und 321-323 (1982) sowie Dtsch. med. Wschr. Bd. 109, 547-552 (1984).
Bei der künstlichen Züchtung der Zellen tierischer Gewebe hat sich das Glutamin schon vor vielen Jahren als wertvoller Wachstumfaktor für die Zellentwicklung erwiesen, weshalb es in den Kulturmedien bis zu einer 20fachen größeren Konzentration als andere Aminosäure zugesetzt wird; vgl. H. Eagle, Nature 1955, Seiten 501-504. Glutamin wurde inzwischen auch neben Glukose als die wichtigste Energiequelle für das Wachstum von isolierten Säugetierzellen und auch Krebszellen erkannt. vgl. H. R. Zielke et al., Federation proceedings, Bl. 43, Nr.1, Seiten 121 bis 125, 1984 bzw. L. J. Reitzer et al., Journ. Biol. Chem., Seiten 2669 bis 2676, 1979.
Die notwendigen Kulturmedien zur Züchtung von isolierten Zellen werden bereits industriell hergestellt und kommerziell verwertet. Allerdings ist die Herstellung glutaminhaltiger Kulturmedien vom technologischen und vertriebstechnischen Standpunkt aus gesehen sehr schwierig, da Glutamin eine relativ instabile Verbindung ist. Deshalb werden die Kulturmedien meist im wesentlichen glutaminfrei geliefert und die Anwender müssen dann das Glutamin unter erhöhtem Aufwand steril zusetzen, was nicht immer durchführbar ist, u.a. wegen des Kontaminationsrisikos.
Der Grund für die Instabilität des Glutamins ist seine Neigung zur intramolekularen Cyclisierung insbesondere bei der thermischen Sterilisierung der glutaminhaltigen Lösungen. Dieses cyclische Produkt besitzt jedoch toxische Eigenschaften auch gegenüber isolierten Zellen.
Bei Infusionslösungen für die künstliche Ernährung von Patienten hat man bereits maskiertes Glutamin in Form des α-N acylierten Glutamins bzw. Di- und Tri-peptide des Glutamins eingesetzt, da dieses acylierte Glutamin bzw. diese Peptide bei der Hitze­ sterilisierung der betreffenden Lösungen stabil bleiben, jedoch dann im Organismus z.B. durch die im Blut oder Serum vorhandenen Hydrolasen, aufgespalten werden. vgl. Europäische Patentschrift 87 750.
Gegen die Verwendung eines in dieser Weise maskierten Glutamins, sprach bisher die Tatsache, daß in einem Kulturmedium, das für die künstliche Züchtung von Gewebszellen verwendet wird, die betreffenden Substrate in einer von den Zellen unmittelbar metabolisierbaren Form vorliegen müssen, da die Auffassung besteht, daß anders als z.B. die Mikroorganismen, wie Bakterien, Schimmelpilze, die Säugetierzellen keine Exoenzyme an die Kulturlösungen abgeben, die dann die Spaltung derartig maskierter Verbindungen bewirken können. Daher enthalten die Nährlösungen für Zellkulturen anders als diejenigen für das Züchten von Mikroorganismen nur freie Aminosäuren, also keine Oligopeptide oder diese enthaltenden Abbauprodukte von Proteinen oder Disacchariden und dgl. aufzuspaltende Substrate.
Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß bestimmte Di-/Tripeptide des Glutamins doch von den Zellen, insbeson­ dere von den Säugetierzellen, als Glutaminquelle verwertet werden können. Dies ist deshalb besonders überraschend, weil z.B. das an der α-Aminosäuregruppe acyliertes Glutamin (Acetylglutamin) von den Zellkulturen nicht oder nur sehr schlecht verwertet wird. Die niederen Peptide sind dagegen universell verwertbar, auch bei Zellen der verschiedensten Gewebe.
Erfindungsgemäß wird daher bei den Kulturmedien für das Wachs­ tum von Säugetierzellen bzw. pflanzlichen Zellen das Glutamin in Form der bestimmten Di- und/oder Tripeptide, wie sie im Patentanspruch genannt sind, verwendet, wodurch nunmehr die wäßrigen Kulturmedien hinsichtlich der Aminosäuren- und Peptid­ komponenten ohne Schwierigkeiten hitzesterilisierbar sind. Diese neuen Kultur­ medien sind dann auch bei längerer Lagerung ausreichend stabil.
Die erfindungsgemäß verwendeten niederen Peptide des Glutamins zeigen - wie aus beigefügten Figuren mit den Diagrammen der Ergebnisse von Wachstumstests isolierter Säuretierzellen er­ sichtlich - ein sehr gutes Wachstum der Zellen, während mit dem glutaminfreien Medium oder bei Verwendung des an der α-Aminogruppe acetylierten Glutamins nur ein langsames bzw. ein verspätet einsetzendes Wachstum der Zellen festzustellen ist.
Auch als Kulturmedien für die Entwicklung der Eizelle zum mehrzelligen Embryo bei der extrakorporalen Befruchtung eignen sich die unter Verwendung der Glutaminpeptide hergestellten Nährlösungen besonders gut. Die Zellentwicklung und -teilung setzt bereits kurz nach der künstlichen Befruchtung der Eizelle ein, so daß dann der entstandene Zellhaufen schon bald in den Uterus implantiert werden kann.
Aber auch zur Entwicklung pflanzlicher Zellen bei der Kultur von pflanzlichen Protoplasten oder pflanzlicher Gewebe und spezieller Organe sowie bei Meristemkulturen für die vegetative Vermehrung können diese Kulturmedien vorteilhaft verwendet werden.
Nachfolgend wird eine für die Kulturen verschiedener Zellen geeignete Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums angegeben.
Beispiel
Bei den nachfolgend beschriebenen Tests mit Zellkulturen von drei verschiedenen Zellinien (K-562, Fibroblasten: Flow 4000; HELA 1L Passage) wurde untersucht, inwieweit die Di­ peptide Alanyl-Glutamin oder Glycyl-Alanin das Glutamin als Wachstumsfaktor ersetzen können. Die Zellen wurden in glutamin­ freiem RPMI 1640 (5% CO2-Inkubator) gezüchtet. Ein Liter Medium enthielt 900 ml RPMI-1640, 100 ml fötales Kälberserum (über Nacht gegen PBS dialysiert) und 2 ml Gentamycinlösung. Dem Medium wurden 10 ml einer Lösung, die 200 mmol an Glutamin oder an ALA-GLN, GLY-GLN oder Acetylglutamin enthielt, zugesetzt (Sterilfiltration mit Acro Disc 200 µm Filter). Die K-562 Zellen wurden dreimal in der Woche auf 1/3, die HELA-Zellen dreimal auf 1/5 und die Fibroblasten zweimal auf 1/3 gespalten. Die Spaltung der HELA-Zellen und Fibroblasten erfolgte mittels Trypsin nach einmaliger Waschung mit PBS. Die Zellzahl wurde mit einem Sysmex-Microcell-Counter CC-10 ermittelt und nach jeder Spaltung hochgerechnet. Die Diagramme der Fig 1-3 zeigen die Zellentwicklung mit und ohne Zugabe von Glutamin (GLN) und der jeweiligen Dipeptide bzw. des Acetylglutamins (Acet. GLN).
Wie hieraus ersichtlich, ist die Wachstumsgeschwindigkeit der einzelnen Zellinien bei Supplimentation des Mediums mit Glutamin oder den Dipeptiden: Alanyl-Glutamin und Glycyl- Glutamin annähernd gleich, während das Acetylglutamin eine wesentlich eingeschränkte Wachstumsgeschwindigkeit bewirkt.

Claims (4)

1. Verwendung von Di- und/oder Tripeptiden des Glutamins in Aminosäuren, Glucose und Mineralsalze enthaltenden Zell­ kulturmedien zur Züchtung isolierter Gewebszellen.
2. Verwendung der Dipeptide Glycyl-Glutamin und Alanyl- Glutamin in Zellkulturmedien nach Anspruch 1.
3. Verwendung der Di- und/oder Tripeptide des Glutamins nach Anspruch 1 oder 2 in Zellkulturmedien für die extra­ korporale Insemination.
4. Verwendung der Di- und/oder Tripeptide des Glutamins nach Anspruch 1-3 in Zellkulturmedien für die Herstellung monoklonaler Antikörper.
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