DE3529732A1 - Die verwendung von leucylblasticidin s als schaedlingsbekaempfungsmittel - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung des bereits bekannten Nucleosids Leucylblasticidin S als Schädlingsbekämpfungsmittel, vorzugsweise als Mikrobizid und zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen, Schadpilzen, Bakterien und Unkräutern. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von Leucylblasticidin S auf im wesentlichen mikrobiologischem Wege.

Leucylblasticidin S ist als metabolisches Zwischenprodukt bei der mikrobiellen Biosynthese von Blasticidin S mit Streptomyces griseochromogenes beschrieben worden (vgl. H. Seto et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 32, No. 10, Seiten 1299 bis 1305 (Tokio, 1968).

Es wurde nun gefunden, daß Leucylblasticidin S zur Bekämpfung von Schädlingen (und Parasiten) bei Pflanzen (und Warmblütern) verwendet werden kann. Es weist insbesondere eine hohe Wirksamkeit gegen Arthropoden (wie Insekten und Spinnentiere), Pilze und Bakterien sowie herbizide Eigenschaften auf. Leucylblasticidin S und diese Verbindung enthaltende Mittel können aufgrund dieser Eigenschaften besonders vorteilhaft im Pflanzenschutz, Vorratsschutz, im Hygienebereich sowie in der Tierzucht und Tierhaltung eingesetzt werden.

Weiterhin wurde gefunden, daß Leucylblasticidin S erhalten werden kann, wenn man geeignete Mikroorganismen der Gattung Nocardioides (Ordnung Actinomycetales), in üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.

Bei Kenntnis der Eigenschaften des Leucylblasticidin S ist es mit Hilfe von üblichen chromatographischen, spektroskopischen oder mikrobiologischen (z. B. Hemmhoftest) Methoden leicht und rasch möglich, in Routineverfahren solche geeigneten Mikroorganismenstämme der Gattung Nocardioides auszusuchen, welche Leucylblasticidin S produzieren.

Für die mikrobiologische Herstellung von Leucylblasticidin S nach den erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Nocardioides albus-Stämme eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt werden hierbei die Nocardioides albus-Stämme VN 14 und VA 10 sowie die Varianten und Mutanten dieser Stämme, welche die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen.

Die Stämme VN 14 und VA 10 sind neu und wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland hinterlegt.

I. Stammbeschreibung VN 14 A) Allgemeine Angaben

Stamm VN 14 wurde als Nocardioides albus Prauser (1976) aufgrund seiner Morphologie, Physiologie und der Zellwandbestandteile (Chemotyp I nach Lechevalier & Lechevalier, 1970) bestimmt.

Stamm VN 14 wurde am 19. 11. 1979 aus einer Erdprobe mit Hilfe des Ausstrichverfahrens auf KEHE-Agar isoliert.

Herkunft der Erdprobe: UDSSR, Georgien, Südseite des Kaukasus, an der Grusinischen Heerestraße zwischen Tiflis und Ordschonikidse, unter Hainbuchen, 9. 9. 1979 (F. Vobis).

B) Morphologie

VN 14 wächst auf Agar-Medien mit Luft- und Substratmycel. Die stark verzweigten Hyphen im Substratmycel haben einen Durchmesser von 0,5 bis 0,8 µm. Die Hyphen können in stäbchenförmige oder coccoide Zellen (Sporen) zerfallen. Das Luftmycel besteht aus geraden bis unregelmäßig gebogenen, langen Hyphen. Verzweigungen sind spärlich, meist beim Austritt der Hyphen aus dem Substrat. Die Luftmycelhyphen zergliedern sich vollständig in zahlreiche Sporen, die in langen Ketten hintereinander liegen. Die Sporen sind stäbchenförmig und besitzen glatte Oberflächen. Die Größe der Sporen beträgt:
Länge 0,6 bis 0,9 µm, Breite 0,4 bis 0,6 µm.
Es wurden keine beweglichen Stadien beobachtet.

C) Physiologische Eigenschaften

1. Temperaturbereich des Wachstums

Getestet in Röhrchen auf E-Agar: Inkubationszeit: 8 Tage

Unter 1. verwendete Akürzungen:
W = Wachstum
SM = Substratmycel
SP = Substratverfärbendes Pigment
LM = Luftmycel
+ = gut entwickelt
(+) = schwach entwickelt
- = fehlt bzw. keine Entwicklung

2. Gelatine Verflüssigung

Test auf Glucose-Pepton-Gelatine-Medium in Röhrchen bei 20°C, Kontrolle nach 14 Tagen. Gelatine-Verflüssigung: stark

3. Stärke-Hydrolyse

Getestet auf Stärke-Agar und E-Agar in Petri-Schalen (⌀ 2 cm): Nachweis der Stärke mit Jodjodkalium-Lösung nach 8 Tagen: Wachstumstemperatur 20°C, Wachstum auf beiden Medien gut bis sehr gut.
Stärkeabbau: stark

4. Peptonisierung von Casein

Getestet auf halbkonzentriertem Magermilch-Agar (Ca/2) in Petrischalen (⌀ 2 cm): bebrütet bei 20°C: Wachstum gut: Kontrolle nach 8 TAgen: deutlich sichtbarer heller Hof um die Kolonien.
Casein-Peptonisierung: stark

5. Bildung von melanoidem Pigment

Test auf Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7), Tyrosin-Agar nach Gordon & Smith (1955) und Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP Nr. 6) in Röhrchen. Inkubiert bei 20°C, kontrolliert nach 14 Tagen.
Ergebnis: kein melanoides Pigment

6. Nitrat-Reduktion

Getestet auf Saccharose-Nitrat-Agar: bebrütet bei 20°C in Röhrchen: Nachweis des Nitrits nach Müller & Melchinger (1964).
Nitrat-Reduktion: stark

7. Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

Getestet mit Mineralsalz-Agar (Pridham-Gottlieb-Agar) unter Zugabe verschiedener C-Quellen bebrütet bei 28°C in Kulturröhrchen.

Hierbei bedeuten:
++: Wachstum gleich oder besser als auf Glucose
+: Wachstum schlechter als auf Glucose
-: Wachstum gleich oder schlechter als auf Mineralsalz- Agar

II. Stammbeschreibung VA 10 A) Allgemeine Angaben

Stamm VA 10 wurde als Nocardioides albus Prauser (1976) aufgrund seiner Morphologie, Physiologie und der Zellwandbestandteile (Chemotyp I nach Lechevalier & Lechevalier, 1970) bestimmt.

Stamm VA 10 wurde am 19. 11. 1979 aus einer Erdprobe mit Hilfe des Ausstrichverfahrens auf KEHE-Agar isoliert.

Herkunft der Erdprobe: UDSSR, Georgien, Südseite des Kaukasus, an der Grusinischen Heeresstraße zwischen Tiflis und Ordschonikidse, unter Hainbuchen, 9. 9. 1979 (F. Vobis).

B) Morphologie

VA 10 wächst auf Agar-Medien mit Luft- und Substratmycel. Die stark verzweigten Hyphen im Substratmycel haben einen Durchmesser von 0,5 bis 0,8 µm. Die Hyphen können in stäbchenförmige oder coccoide Zellen (Sporen) zerfallen. Das Luftmycel besteht aus geraden bis unregelmäßig gebogenen, langen Hyphen. Verzweigungen sind spärlich, meist beim Austritt der Hyphen aus dem Substrat. Die Luftmycelhyphen zergliedern sich vollständig in zahlreiche Sporen, die in langen Ketten hintereinander liegen. Die Sporen sind stäbchenförmig und besitzen glatte Oberflächen. Die Größe der Sporen von VA 10 beträgt:
Länge 0,8 bis 1,0 µm, Breite 0,4 bis 0,5 µm.
Es wurden keine beweglichen Stadien beobachtet.

C) Physiologische Eigenschaften

1. Temperaturbereich des Wachstums

Getestet in Röhrchen auf E-Agar; Inkubationszeit: 8 Tage

Abkürzungen vergleiche C1 bei Stamm VN 14 (oben)

2. Gelatine-Verflüssigung

Test auf Glucose-Pepton-Gelatine-Medium in Röhrchen bei 20°C, Kontrolle nach 14 Tagen.
Gelatine-Verflüssigung: stark

3. Stärke-Hydrolyse

Getestet auf Stärke-Agar und E-Agar in Petri-Schalen (⌀ 2 cm), Nachweis der Stärke mit Jodjodkalium-Lösung nach 8 Tagen, Wachstumstemperatur 20°C, Wachstum auf beiden Medien gut bis sehr gut.
Stärkeabbau: stark

4. Peptonisierung von Casein

Getestet auf halbkonzentriertem Magermilch-Agar (Ca/2) in Petrischalen (⌀ 2 cm): bebrütet bei 20°C; Wachstum gut: Kontrolle nach 8 Tagen: deutlich sichtbarer heller Hof um die Kolonien.
Casein-Peptonisierung: stark

5. Bildung von melanoidem Pigment

Test auf Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7), Tyrosin-Agar nach Gordon & Smith (1955) und Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP Nr. 6) in Röhrchen. Inkubiert bei 20°C, kontrolliert nach 14 Tagen.
Ergebnis: kein melanoides Pigment

6. Nitrat-Reduktion

Getestet auf Saccharose-Nitrat-Agar: bebrütet bei 20°C in Röhrchen: Nachweis des Nitrits nach Müller & Melchinger (1964).
Nitrat-Reduktion: stark

7. Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

Getestet mit Mineralsalz-Agar (Pridham-Gottlieb-Agar) unter Zugabe verschiedener C-Quellen bebrütet bei 28°C in Kulturröhrchen.

Hierbei bedeuten:
++: Wachstum gleich oder besser als auf Glucose
+: Wachstum schlechter als auf Glucose
-: Wachstum gleich oder schlechter als auf Mineralsalz- Agar

Zusammensetzung verwendeter Nährmedien:

1. Saccharose-Nitrat-Agar
30 g Saccharose, 2 g NaNO₃, 1 g K₂HPO, 0,5 gMgSO₄ × 7 H₂O, 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO₄ × 7 H₂O, 10-20 g Agar, 1000 ml, destilliertes Wasser, pH 7,0-7,3

2. Stärke-Agar
Lösung 1: 10 g lösliche Stärke, anlösen mit wenig destilliertem Wasser zu einem Brei und verdünnen auf 500 ml.
Lösung 2: 1 g K₂HPO₄, 1 g MgSO₄ × 7 H₂0, 1 g NaCl, 2 g (NH₄)₂SO₄, 2 g CaCO₃, 500 ml destilliertes Wasser, 1 ml Spurenelementlösung (0,1 g FeSO₄ × 7 H₂O, 0,1 g MnCl₂ × 4 H₂O, 0,1 g ZnSO₄ × 7 H₂O, 100 ml destilliertes Wasser)
Lösung 1 und Lösung 2 werden gemischt und mit 15-20 g Agar versetzt.

3. Tyrosin-Agar
15 g Glycerin, 0,5 g L-Tyrosin, 1 g L-Asparagin, 0,5 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄ × 7 H₂O, 0,5 g NaCl, 0,01 g FeSO₄ × 7 H₂O, 1000 ml destilliertes Wasser, 1 ml Spurenelementlösung (0,1 g FeSO₄ × 7 H₂O, 0,1 g MnCl₂ × 4 H₂O, 0,1 g ZnSO₄ × 7 H₂O, 1000 ml destilliertes Wasser), pH 7,2-7,4, 15-20 g Agar

Weitere gemäß der vorliegenden Beschreibung eingesetzte Medien vergleiche D. Schäfer: "Beiträge zur Klassifizierung und Taxonomie der Actinoplanaceen", Dissertation, Universität Marburg, 1973.

Anhand von umfangreichen analytischen, insbesondere spektroskopischen Untersuchungen wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß herstellbare und verwendbare Verbindung mit dem vorbekannten Leucylblasticidin S identisch ist.

Wie bereits erläutert, wird Leucylblasticidin S erfindungsgemäß durch die Fermentation geeigneter Mikroorganismenstämme der Gattung Nocardioides, wie DSM 3176 oder DSM 3177 oder deren Mutanten oder Varianten erzeugt.

Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z. B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z. B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kulturen kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie sie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie Stärke oder Dextrine, Disaccharide, wie Maltose oder Rohrzucker, Monosaccharide, wie Glycose oder Xylose, Zuckeralkohole, wie Mannit oder Glycerin sowie natürlich vorkommende Gemische wie Malzextrakt, Melasse oder Molkepulver genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Ornithin oder Serin, Nucleosidbasen, wie Cytosin oder Uracil sowie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche, pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z. B. NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, Na NO₃ und KNO₃ aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z. B. folgende Ionen:

Mg⁺⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH, Cl^-, SO, PO und NO

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen. Im allgemeinen enthalten die Nährlösungen vorzugsweise etwa 0,5 bis 8%, insbesondere 0,6 bis 6% Kohlenstoffquellen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4%, insbesondere 0,5 bis 2% Stickstoffquellen und vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,5%, insbesondere 0,003 bis 0,3% Mineralsalze.

Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile zu verwenden und dann im Laufe der ersten 3 Kultivierungstage durch häufigere Zusätze diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösung dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 5 und etwa 10, insbesondere zwischen 6,5 und 9,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereichen kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z. B. H₂SO₄, oder sterile Lauge, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 15 und etwa 40°C, vorzugsweise zwischen 20 und 35°C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 28°C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 10, vorzugsweise etwa 4 bis 7 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht. Das gewünschte Endprodukt der Fermentation kann mit Hilfe von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen, im Plattendiffusionstest mit einem geeigneten Pilz als Teststamm oder anhand der insektiziden Wirksamkeit bestimmt werden.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z. B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden, wobei die Temperaturen vorzugsweise bei 100 bis 140°C, insbesondere bei 120 bis 130°C liegen können.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen (z. B. in Mengen bis etwa 1%) zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Die erfindungsgemäß erhältliche Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Der isolierte Stoff kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da gegebenenfalls vorhandene geringfügige Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflußt.

Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäß erhältliche Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch- chemischen Methoden, z. B. Messen einer charakteristischen Bande im Spektrum oder der R _f -Werte, Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität usw. herangezogen werden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um in Routineverfahren geeignete Mikroorganismen aufzufinden.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden:

Nach seiner Anreicherung im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert (z. B. Zentrifugation).

Aus dem Kulturfiltrat kann die erfindungsgemäß erhältliche Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden.

Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z. B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäß erhältliche Verbindung löslich ist. Bevorzugt werden Wasser, Ammoniaklösung, Chloroform und Methanol oder ihre Gemische (beispielsweise Gemische aus Chloroform, Methanol und wäßrigem NH₃ oder Methanol und Wasser) eingesetzt.

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung Chromatographie-Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel, Ionenaustauschchromatographie oder Geldiffusionschromatographie. Dies sind die von der Reinigung wasserlöslicher, geladener Naturstoffe her bekannten Methoden.

Aus ihren Lösungen kann das Leucylblasticidin S nach den üblichen Methoden, z. B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird aus dem bei der aeroben Kultur der Stämme bei etwa 28°C erhaltenen Fermentationsgut (Kulturbrühe und Mycel) durch Zentrifugation das Kulturfiltrat gewonnen.

Das Leucylblasticidin S kann auch aus dem Kulturfiltrat durch Adsorption an Aktivkohle bzw. an geeignete Harze isoliert werden. Als ökonomischste Methode erwies sich die Bindung dieses Stoffes an unspezifische Adsorberharze auf Polystyrolbasis (z. B. Amberlite XAD oder Lewatit OC 1031). Die Desorption des Stoffes wird fraktioniert, durch Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, insbesondere Wasser/Methanol vorgenommen. Die durch den Test gegen Plutella maculipennis ermittelten aktiven Fraktionen werden unter reduziertem Druck bis zur vollständigen Entfernung des organischen Lösungsmittels konzentriert und gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete Rohprodukt wird in Wasser aufgenommen und nach dem Abtrennen der unlöslichen Bestandteile durch übliche chromatographische Verfahren weiter gereinigt. Bevorzugt werden dabei eine erneute Bindung an Adsorberharze (z. B. Lewatit OC 1031), eine weitere Reinigung der aktiven Fraktionen durch Chromatographie an üblichen Kationenaustauschern (z. B. CM-Sephadex). Das Leucylblasticidin S wird schließlich durch übliche chromatographische Methoden, vorzugsweise durch Chromatographie an Kieselgel, rein dargestellt.

Aufgrund seiner günstigen biologischen Eigenschaften kann das Leucylblasticidin S als Schädlingsbekämpfungsmittel zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, Vorratsschädlingen und Materialschädlingen verwendet werden, wobei tierische Schädlinge, insbesondere Insekten, Spinnentiere und Nematoden sowie mikrobielle Schädlinge, insbesondere Pilze und Bakterien bekämpft werden können.

Darüber hinaus ist auch die Bekämpfung von Parasiten (Endo- und Ektoparasiten) bei Warmblütern, insbesondere in der Tierzucht und Tierhaltung durch Leucylblasticidin S möglich. Die Anwendungsbeispiele dieser Verbindung werden im folgenden erläutert:

Der Wirkstoff eignet sich bei guter Verträglichkeit zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen, insbesondere Insekten, Spinnentieren und Nematoden, die in der Landwirtschaft, in Forsten, im Vorrats- und Materialschutz sowie auf dem Hygienesektor vorkommen. Sie sind gegen normal sensible und resistente Arten sowie gegen alle oder einzelne Entwicklungsstadien wirksam. Zu den oben erwähnten Schädlingen gehören:

Aus der Ordnung der Isopoda z. B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.

Aus der Ordnung der Diplopoda z. B. Blaniulus guttulatus.

Aus der Ordnung der Chilopoda z. B. Geophilus carpophagus, Scutigera spec.

Aus der Ordnung der Symphyla z. B. Scutigerella immaculata.

Aus der Ordnung der Thysanura z. B. Lepisma saccharina.

Aus der Ordnung der Collembola z. B. Onychiurus armatus.

Aus der Ordnung der Orthoptera z. B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucaophaea maderae, Blattella germanica, Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Melanoplus differentialis, Schistocerca gregaria.

Aus der Ordnung der Dermaptera z. B. Forficula auricularia.

Aus der Ordnung der Isoptera z. B. Reticulitermes spp..

Aus der Ordnung der Anoplura z. B. Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp.

Aus der Ordnung der Mallophaga z. B. Trichodectes spp., Damalinea spp.

Aus der Ordnung der Thysanoptera z. B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci.

Aus der Ordnung der Heteroptera z. B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.

Aus der Ordnung der Homoptera z. B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Doralis fabae, Doralis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp. Psylla spp.

Aus der Ordnung der Lepidoptera z. B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella maculipennis, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp. Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Laphygma exigua, Mamestra brassicae, Panolis flammea, Prodenia litura, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana.

Aus der Ordnung der Coleoptera z. B. Anobium punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes bajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica.

Aus der Ordnung der Hymenoptera z. B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.

Aus der Ordnung der Diptera z. B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae, Tipula paludosa.

Aus der Ordnung der Siphonaptera z. B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp..

Aus der Ordnung der Arachnida z. B. Scorpio maurus, Latrodectus mactans.

Aus der Ordnung der Acarina z. B. Acarus siro, Argas spp., Ornithodoros spp., Dermanyssus gallinae, Eriophyes ribis, Phyllocoptruta oleivora, Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Amblyomma spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp., Tarsonemus spp., Bryobia praetiosa, Panonychus spp., Tetranychus spp..

Zu den pflanzenparasitären Nematoden gehören Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp., Longidorus spp., Xiphinema spp., Trichodorus spp..

Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist eine starke mikrobizide Wirkung auf und kann zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen praktisch eingesetzt werden. Die Wirkstoffe sind insbesondere für den Gebrauch als Pflanzenschutzmittel geeignet.

Fungizide Mittel im Pflanzenschutz werden eingesetzt zur Bekämpfung von Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.

Bakterizide Mittel werden im Pflanzenschutz zur Bekämpfung von Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae und Streptomycetaceae eingesetzt.

Beispielhaft aber nicht begrenzend seien einige Erreger von pilzlichen und bakteriellen Erkrankungen, die unter die oben aufgezählten Oberbegriffe fallen, genannt:
Xanthomonas-Arten, wie beispielsweise Xanthomonas campestris pv. oryzae;
Pseudomonas-Arten, wie beispielsweise Pseudomonas syringae pv. lachrymans;
Erwinia-Arten, wie beispielsweise Erwinia amylovora;
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum;
Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phytophthora infestans;
Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubense;
Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola;
Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae;
Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis;
Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea;
Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha;
Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis;
Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea;
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus;
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus;
Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita;
Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries;
Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae;
Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii;
Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae;
Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum;
Botrytis-Arten, wie beispielsweise Botrytis cinerea;
Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum;
Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum;
Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens;
Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae;
Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Der Wirkstoff erlaubt in den zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten notwendigen Konzentrationen eine Behandlung von oberirdischen Pflanzenteilen, von Pflanz- und Saatgut, und des Bodens.

Weiterhin eignet sich Leucylblasticidin S auch zur Bekämpfung von Ekto- und Endoparasiten bei Warmblütern, beispielsweise auf dem Gebiet der Tierhaltung und Viehzucht, wobei durch die Bekämpfung der Schädlinge bessere Ergebnisse, z. B. höhere Milchleistungen, höheres Gewicht, längere Lebensdauer usw. erreicht werden können.

Die Anwendung dieses Wirkstoffes geschieht auf diesen Gebieten in bekannter Weise, wie durch orale Anwendung in Form von beispielsweise Tabletten, Kapseln, Tränken, Granulaten, durch dermale Anwendung in Form beispielsweise des Tauchens (Dippen), Sprühen (Sprayen), Aufgießen (pour-on und spot-on) und des Einpuderns sowie durch parenterale Anwendung in Form beispielsweise der Injektion.

Es werden auf diesen Gebieten z. B. auch Zecken und solche Arthropoden erfaßt, bei welchen Teile ihrer Entwicklung im Tier ablaufen. Darüber hinaus ist Leucylblasticidin S auch zur Bekämpfung von Würmern - insbesondere solche der Klasse Nematoda - geeignet, die Parasiten von Warmblütern sind. Außerdem kann die erfindungsgemäße Verbindung zur Bekämpfung von dermalen Pilzinfektionen bei Warmblütern verwendet werden.

Der Wirkstoff kann in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Wirkstoff- imprägnierte Natur- und synthetische Stoffe, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, ferner in Formulierungen mit Brennsätzen, wie Räucherpatronen, -dosen, -spiralen u. ä., sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.

Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch Vermischen des Wirkstoffs mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z. B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol, oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z. B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z. B. Aerosol-Treibgas, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid; als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z. B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate; als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z. B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel; als Emulgier und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z. B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen- Fettalkohol-Ether, z. B. Alkylarylpolyglykol-Ether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate; als Dispergiermittel kommen in Frage: z. B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.

Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z. B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.

Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90%.

Der erfindungsgemäße erhältliche Wirkstoff kann in seinen handelsüblichen Formulierungen sowie in den aus diesen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen in Mischung mit anderen Wirkstoffen, wie Insektiziden, Lockstoffen, Sterilantien, Akariziden, Nematiziden, Fungiziden, wachstumsregulierenden Stoffen oder Herbiziden vorliegen. Zu den Insektiziden zählen beispielsweise Phosphorsäureester, Carbamate, Carbonsäureester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Phenylharnstoffe, durch Mikroorganismen hergestellte Stoffe u. a.

Der Wirkstoff kann ferner in seinen handelsüblichen Formulierungen sowie in den aus diesen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen in Mischung mit Synergisten vorliegen. Synergisten sind Verbindungen, durch die die Wirkung der Wirkstoffe gesteigert wird, ohne daß der zugesetzte Synergist selbst aktiv wirksam sein muß.

Der Wirkstoffgehalt der aus den handelsüblichen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen kann in weiten Bereichen variieren. Die Wirkstoffkonzentration der Anwendungsformen kann von 0,0000001 bis zu 95 Gew.-% Wirkstoff, vorzugweise zwischen 0,0001 und 1 Gew.-% liegen.

Die Anwendung geschieht in einer den Anwendungsformen angepaßten üblichen Weise.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Leucylblasticidin S soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden.

Beispiele für die Fermentation der Stämme VA 10 und VN 14

1. Fermentation des Stammes VA 10

Der Stamm VA 10 wurde bei etwa 4°C im Kühlschrank auf einem Schrägagarröhrchen gehalten. Der hierzu verwendete HA-Agar enthielt 4 g Hefeextrakt, 10 g Malz, 4 g Dextrose und 15 g Agar in 1 l Leitungswasser; der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt. Submerskulturen wurden entweder bei -20°C oder in flüssigem Stickstoff gelagert.

Für die Fermentation wurde eine Nährlösung eingesetzt, welche 40 g Mannit, 5 g Arginin, 2 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g KH₂PO₄, 1 g NaCl, 0,5 g Bacto-Hefeextrakt und 2 ml Spurenelementlösung SL 4 in 1 l Leitungswasser enthielt; der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Die Spurenelementlösung SL 4 enthielt 5 g EDTA, 2 g FeSO₄ · 7 H₂O, 0,1 g ZnSO₄ · 7 H₂O, 30 mg MnCl₂ · 4 H₂O, 0,3 g H₃BO₃, 0,2 g CoCl₂ · 6 H₂O, 10 mg CuCl₂ · 2 H₂O, 20 mg NiCl₂ · 6 H₂O, 30 mg Na₂MoO₄ · 2 H₂O in 1 l destilliertem Wasser; der pH-Wert wurde auf 0,3 eingestellt.

a) Durchführung im Kolbenmaßstab

1000 ml Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung enthielten, wurden aus einer Schrägagarkultur beimpft und auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 280 Upm und einem Schüttelkreis von 5 cm bei 28°C 6 Tage inkubiert. Als Vorkultur für einen 200 l-Fermenter diente eine 48 h alte Kultur.

b) Durchführung in 200 l-Maßstab

Die Fermentation wurde im 200 l-Fermenter durchgeführt, der 200 l der unter a) beschriebenen Nährlösung enthielt; zusätzlich wurden 40 ml Polyglykol (Desmophen 3900) zugegeben. Die Sterilisation erfolgte für 30 min bei 121°C. Bei 28°C Inkubationstemperatur und 200 Upm des Rührers wurden 200 l Luft pro Minute in die Kulturflüssigkeit eingeleitet. Die Impfmaterialmenge betrug 1% der unter a) beschriebenen Kultur.
Die Ernte erfolgte nach 96 h.

2. Fermentation des Stammes VN 14

Der Stamm VN 14 wurde bei etwa 4°C im Kühlraum auf einem Schrägagarröhrchen gehalten. Der hierzu verwendete HA-Agar enthielt je Liter 4 g Hefeextrakt, 10 g Malz, 4 g Dextrose und 15 g Agar (Rest: Wasser) und hat einen pH-Wert von 7,3. Sporenlösungen des Stammes VN 14 wurden bei -20°C aufbewahrt, Submerskulturen in flüssigem Stickstoff.

Für die Fermentation wurde eine Nährlösung eingesetzt, welche, außer Leitungswasser, 2% Haferflocken, 2% Tomatenmark und 1% Tri-Na-Citrat- 2-hydrat enthielt und einen pH-Wert von 6,0 aufwies.

a) Durchführung im Kolbenmaßstab

1000 ml Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung (vgl. 1 oben) enthielten, wurden aus einer Schrägagarkultur beimpft und auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 280 Upm (Umdrehungen pro Minute) und 28°C für 5 Tage inkubiert. Als Vorkultur für den 200 l-Fermenter diente eine 48 h alte Kultur.

b) Durchführung im 200 l-Fermenter

Die Fermentation wurde in einem 200 l-Fermenter durchgeführt, der 200 l Nährlösung. Die Nährlösung bestand aus 4000 g Haferflocken, 4000 g Tomatenmark, 2000 g Tri-Na-Citrat-2-hydrat und 40 ml Polyglykol (Desmophen 3900) gelöst in Leitungswasser. Die Sterilisation erfolgte für 30 min bei 121°C. Bei 28°C Inkubationstemperatur und 200 Upm des Rührers wurden 200 l Luft pro Minute in die Kulturflüssigkeit eingeleitet. Die Impfmaterialmenge betrug 1% der unter a) beschriebenen Kultur.
Die Ernte erfolgte nach 113 Stunden.

II) Beispiele für die Aufarbeitung der gemäß I erhaltenen Kulturbrühen

1. Herstellung des Rohproduktes von I

Die gemäß Beispiel 1a erhaltene Kulturbrühe einer 200 l-Fermentation wurde mit 200-250 l/h in einem Westfalia-Separator separiert. Der Überstand wurde über eine mit 50 l eines hydrophoben Trägerharzes auf Polystyrolbasis (Lewatit OC 1031) beschickte Säule von 30 cm Durchmesser gegeben. Es wurde mit 500 l entmineralisiertem Wasser nachgewaschen und mit 300 l technischem Methanol desorbiert. Das Desorbat wurde unter reduziertem Druck bis zu einer wäßrigen Suspension konzentriert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 24,8 g Rohprodukt erhalten.

2. Herstellung eines angereicherten Präparates

24,8 g des gefriergetrockneten Rohprodukts wurden in 600 ml Wasser fein suspendiert. Nach dem Abfiltrieren des unlöslichen Rückstandes wurde das Filtrat an einer Säule (50 × 150 mm) mit einem hydrophoben Trägerharz auf Polystyrolbasis (Lewatit OC 1031) adsorbiert. Die Säule wurde mit 1 l entionisiertem Wasser gewaschen und stufenweise nacheinander mit je 600 ml 10, 20, 30, 50 und 70%igem wäßrigem Methanol desorbiert. Die erhaltenen Desorbate wurden unter reduziertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet.

Die höchste insektizide Aktivität wurde im Lyophilisat von Durchlauf und Waschwasser gefunden (zusammen 16,96 g).

10 g dieses Lyophilisats wurden in 800 ml entionisiertem Wasser gelöst und über eine Säule (25 × 300 mm) mit einem carbomethoxyliertem Polysaccharid (CM-Sephadex) in der NH-Form gegeben.

Die Säule wurde mit einem Gradienten von 0 bis 25 mmol/l NH₃ und 2 l Gesamtvolumen fraktioniert eluiert (9 ml/min), Fraktionsgröße: 10 ml.

Die insektiziden Fraktionen (Fraktionen 121 bis 200) erhielten nach Gefriertrocknung 104 g angereichertes Präparat.

3. Reindarstellung des Leucylblasticidin S

300 mg des angereicherten Präparates wurden in 3 ml einer Mischung von CHCl₃, MeOH und 25% NH₃wässr. (4+4+2 Teile v/v) gelöst und an Kieselgel 60 (LiChroprep Si 60, 40-63 µm, Lobar Fertigsäule C), mit Chloroform, MeOH und 25% wäßriger NH₃ (4+4+2 Teile v/v) chromatographiert. Nacheinander wurden dabei 2 Substanzen eluiert (Fraktionsgröße: 10 ml), die durch ihre Absorption bei 254 nm detektiert wurden. Durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel (Merck Nr. 5729) mit dem Fließmittel CHCl₃, CH₃OH, 25% wäßriger NH₃ (4+4+2 Teile, v/v) wurde in den Fraktionen 43-48 eine Substanz mit dem R _f -Wert 0,49 in den Fraktionen 53-65 eine Substanz mit dem R _f -Wert 0,42 und in den Fraktionen 49-52 eine Mischung beider Substanzen nachgewiesen. Beide Substanzen fallen durch ihre Fluoreszenzlösung und die positive Reaktion mit einem Fluoreszenzindikator für Aminogruppen (Fluram) auf.

Die in den Fraktionen 43-48 enthaltene Substanz wurde als "Leucyl blasticidin S" identifiziert.

Aus diesen Franktionen wurden durch Gefriertrocknen 40 mg Leucylblasticidin S gewonnen. Die übrigen Fraktionen wurden verworfen.

Entsprechend kann Leucylblasticidin S auch aus der Fermentationsbrühe gemäß 1b isoliert werden.

Die biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindung soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden:

Beispiel A

Phaedon-Test
Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether

Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.Teil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.

Kohlpflanzen (Brassica oleracea) werden durch Sprühen mit der Wirkstoffzubereitung der gewünschten Konzentration behandelt. Nach Antrocknen der Spritzbrühe wird von der behandelten Pflanze ein Blatt entnommen, in eine Plastikdose gelegt und mit Larven des Meerettichkäfers (Phaedon cochleariae) besetzt. Nach 2 bis 4 Tagen wird jeweils ein weiteres Blatt von derselben Pflanze für die Nachfütterung verwendet.

Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100%, daß alle Tiere abgetötet wurde; 0% bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.

Bei diesem Test zeigte z. B. bei einer Konzentration von 0,02% nach 14 Tagen das Leucylblasticidin S eine Abtötung von 100%.

Beispiel B

Plutella-Test
Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether

Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.

Kohlpflanzen (Brassica oleracea) werden durch Sprühen mit der Wirkstoffzubereitung der gewünschten Konzentration behandelt. Nach Antrocknen der Spritzbrühe wird von der behandelten Pflanze ein Blatt entnommen, in eine Plastikdose gelegt und mit Raupen der Kohlschabe (Plutella maculipennis) besetzt. Nach 2 bis 4 Tagen wird jeweils ein weiteres Blatt von derselben Pflanze für die Nachfütterung verwendet.

Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100%, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0% bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.

Bei diesem Test zeigte z. B. bei einer Konzentration von 0,0002% nach 14 Tagen das Leucylblasticidin S eine Abtötung von 100%.

Beispiel C

Myzus-Test
Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether

Die zweckmäßige Wirkstoffzubereitung erfolgt durch Mischung von 1 Teil Wirkstoff mit den angegebenen Mengen Aceton und Emulgator sowie anschließende Verdünnung mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.

Die Blattläuse (Myzus persicae) werden auf einen Bohnentrieb aufgesetzt und durch kurzes Eintauchen in die jeweilige Konzentration behandelt. Die Auswertung auf den Grad der Abtötung in % erfolgt nach 10 Tagen.

Bei diesem Test erzielte Leucylblasticidin S bei einer Verdünnung von 0,02% nach 10 Tagen eine Abtötung von 100%.

Beispiel D

Entwicklungshemmtest mit Dysdercus intermedius (Baumwollkapselwanze)
Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether

Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.

In Plastikdosen werden je 10 Nymphen der Baumwollkapselwanze einige Baumwollsamen und ein mit der Wirkstoffzubereitung getränktes Watteröllchen angeboten. Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100%, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0% bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.

Bei diesem Test zeigte z. B. bei einer Konzentration von 0,0008% nach 14 Tagen das Leucylblasticidin S eine Abtötung von 100%.

Beispiel E

Tetranychus-Test (resistent)
Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether

Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.

Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris), die stark von allen Entwicklungsstadien der gemeinen Spinnmilbe oder Bohnenspinnmilbe (Tetranychus urticae) befallen sind, werden mit einer Wirkstoffzubereitung der gewünschten Konzentration behandelt.

Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100%, daß alle, und 0%, daß keine Spinnmilben abgetötet wurden.

Bei diesem Test zeigte das Leucylblasticidin S z. B. bei einer Konzentration von 0,003% nach 14 Tagen 100% Wirkung.

Beispiel F

Antifungische Wirkung im Agarplatten-Test

Sporen oder Keime wurden in einer Endkonzentration von etwa 5 10⁶ ml^-1 in Potato-Dextrose-Agar suspendiert. Der Agar wurde in einer Schichtdicke von 0,3 cm gegossen. In den Agar wurden runde Löcher im Durchmesser von 0,9 cm gestanzt, in die 0,1 ml Testlösung eingefüllt wurden. Die Testplatten wurden bei 24°C inkubiert und nach 24 h oder 72 h ausgewertet.

Leucylblasticidin S zeigte in einer Konzentration von 0,2 mg/ml eine deutliche Hemmung der Luftmycel und Sporenbildung von Aspergillus niger DSM 1988.

Im vorstehenden Text bedeuten Mengenangaben, wo nichts anderes angegeben wird Volumenteile. Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozente.

Erläuterung einiger verwendeter Produktnamen:

AMBERLITE XAD (Warenzeichen der Fa. Rohm und Haas, Philadelphia, USA)
ist ein unspezifisches hydrophobes Absorberharz auf Polystyrolbasis.

CM SEPHHADEX (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden)
ist ein carboxymethyliertes Polysaccharid.

DESMOPHEN 3900 (Warenzeichen der Fa. Bayer AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland)
ist ein Polyglykol.

FLURAM (Warenzeichen der Fa. Hoffmann La Roche, Basel, Schweiz)
ist ein Fluoreszenzreagenz für Aminogruppen.

LEWATIT OC 1031 (Warenzeichen der Fa. Bayer AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland)
ist ein unspezifisches hydrophobes Absorberharz auf Polystyrolbasis.

LOBAR Fertigsäulen

LI CHROPREP Si (Warenzeichen der Fa. E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland)
ist eine mit Kieselgel gefüllte Fertigsäule.

Claims (9)

1. Schädlingsbekämpfungsmittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Leucylblasticidin S.

2. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, dadurch gekennzeichnet, daß man Leucylblasticidin S auf die Schädlinge oder ihren Lebensraum einwirken läßt.

3. Verwendung von Leucylblasticidin S oder von Schädlingsbekämpfungsmitteln, die Leucylblasticidin S enthalten zur Bekämpfung von Schädlingen.

4. Herstellung von Leucylblasticidin S enthaltenden Schädlingsbekämpfungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man Leucylblasticidin S mit Streckmitteln und/oder oberflächenaktiven Mitteln vermischt.

5. Verfahren zur Herstellung von Leucylblasticidin S, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Mikroorganismen der Gattung Nocardioides (Ordnung Actinomycetales), welche Leucylblasticidin S erzeugen nach üblichen Methoden auswählt und in einem Nährmedium, welches assimilierbare C- und N-Quellen sowie Mineralsalze enthält unter aeroben Bedingungen kultiviert und Leucylblasticidin S nach üblichen Methoden isoliert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Nocardioides-Stämme einsetzt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nocardioides albus-Stämme VA 10 oder VN 14 (entsprechend DSM 3176 und DSM 3177) oder ihre Mutanten und Varianten einsetzt.

8. Leucylblasticidin S erhalten nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 bis 7.

9. Leucylblasticidin S zur Bekämpfung von Erkrankungen, welche durch Mikroben und Parasiten verursacht werden.