DE3402075A1

DE3402075A1 - Organisch-chemische verbindung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3402075A1
Application number: DE19843402075
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. 5600 Wuppertal Andrews; Angelika Baumgartner; Martin Dipl.-Chem. Deeg; Hans Georg Dr. 5600 Wuppertal Dellweg; Michael Dr. 5632 Wermelskirchen Dorgerloh; Hans-Paul Prof. Dr. Hagenmaier; Gerd Dipl.-Landw. Dr. 5090 Leverkusen Hänßler; Axel Dr. 5603 Wülfrath Kretschmer; Jürgen Dr. Kurz; Wilhelm Dr. 5600 Wuppertal Stendel; Gerhard Dr. 5090 Leverkusen Zoebelein; Hans Prof. Dr. 7400 Tübingen Zähner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1984-01-21
Filing date: 1984-01-21
Publication date: 1985-08-01

Description

Organisch-chemische Verbindung und Verfahren zu ihrer
Herstellung Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue organischchemische Verbindung, welche im folgenden kurz "Tubaymycin" genannt wird, Verfahren zu ihrer Herstellung auf im wesentlichen mikrobiologischem Wege und ihre Verwendung als Schädlings- und Parasitenbekämpfungsmittel.
Es wurden das neue Tubaymycin, für das aufgrund der vorliegenden spektroskopischen und sonstigen analytischen Ergebnisse die folgende Formel I vorgeschlagen wird, gefunden.
Weiterhin wurde gefunden, daß das neue Tubaymycin zur Bekämpfung von Schädlingen und Parasiten bei Pflanzen und Warmblütern verwendet werden kann. Es weist eine hohe Wirksamkeit gegen Arthropoden (wie Insekten und Spinnentiere), Fungi und Würmer (Helminthes) auf. Die neue Verbindung und diese Verbindung enthaltende Mittel können aufgrund dieser Eigenschaften besonders vorteilhaft im Pflanzenschutz, Vorratsschutz, im Hygienebereich, im Bereich der Parasitenbekämpfung beispielsweise in der Tierhaltung sowie im Materialschutz eingesetzt werden.
Die neue Verbindung der Formel I wird dadurch erhalten, daß man geeignete Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetales, vorzugsweise der Familie Streptomycetaceae, insbesondere der Gattung Streptomyces in üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.
Bei Kenntnis der Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen Verbindung ist es mit Hilfe von übliche chromatographischen, spektroskopischen and/oder mikrobiologischen (z.B. Hemmhoftest) Methoden leicht und rasch möglich, in Routineverfahren solche geeigneten Mikroorganismenstämme auszusuchen, welche das erfindungsgemäße Tubaymycin produzieren.
Für die mikrobiologische Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung werden bevorzugt Streptomyces griseus Stämme eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt wird hierbei der Streptomyces griseus Stamm Tü 2599 sowie die Varianten und Mutanten dieses Stamms, welche die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen.
Der Stamm Tü 2599 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland hinterlegt: Stammkurzbezeichnung Hinterlegung Aktenzeichen Datum Tü 2599 DSM 2610 7.3.83 Beschreibung des Stamms Tü 2599: Der Stamm Tü 2599 wurde aus einer Erdprobe aus Peru isoliert.
Die Bestimmung erfolgte nach: R. Hütter: Systematik der Streptomyceten, Karger Verlag, Basel 1967 T.G. Pridham and H.D. Tresner Streptomycetaceae, in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. 1974, Williams & Wilkins Comp.
Baltimore.
Beschreibung des Stamms: Sporenoberfläche: glatt Sporengrössen: 0,8 - 1,0 x 0,5 - 0,7 ß Farbe des Luftmycel: anfänglich weiß, später grünlichgrau (griseus).
Sporenketten-Morphologie: Sporenketten gerade bis leicht gewellt, keine Spiralen, keine Quirle.
Melaninbildung: keine Verwendung verschiedener C-Quellen: D-Glukose + 1-Arabinose -Sucrose -+ (-) D-Xylose + m-Inosit D-Mannit + D-Fructose + Rhamnose Raffinose + Cellulose Galactose + ("+" bedeutet Verwertung und "-" bedeutet keine Verwertung).
Der Stamm Tü 2599 ist als typischer Vertreter der Art Streptomyces griseus zu betrachten.
Die Struktur der neuen erfindungsgemäßen Verbindung wurde anhand von umfangreichen analytischen, insbesondere spektroskopischen Untersuchungen ermittelt. Da jedoch bei kompliziert gebauten Stoffen Irrtümer in der Interpretation der analytischen Befunde nicht immer völlig ausgeschlossen werden können, soll Tubaymycin auch durch einige physikalisch-chemische Daten charakterisiert werden: Tubaymycin: Aussehen: farbloses, amorphes Pulver Fp.: 102-1070C (Zersetzung) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol leicht löslich in Chloroform schwer löslich in Wasser Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel): CHCl3 : CH2OH (9:1 Vol-Teile) Rf: 0,58 Ethylmethylketon: CHCl3 (1:1 Vol-Teile) Rf: 0,45 Ethylmethylketon: Rf: 0,86 Aceton: Rf: 0,91 Molgewicht: 604 Summenformel (Elementaranalyse): C35H5608 Spektren: UV Fig. 1 IR Fig. 2 H-NMR Fig. 3 13C-NMR Fig. 4 MS Fig. 5 Das neue Tubaymycin wird erfindungsgemäß durch die Fermentation geeigneter Mikroorganismenstämme, wie Tü 2599 oder deren Mutanten oder Varianten erzeugt.
Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.
Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z.B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.
Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z.B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z.B.
in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kulturen kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.
Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie sie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie Stärke oder Dextrine, Disaccharide, wie Maltose oder Rohrzucker, Monosaccharide, wie Glycose oder Xylose, Zuckeralkohole, wie Mannit oder Glycerin sowie natürlich vorkommende Gemische, wie Malzextrakt, Melasse oder Molkepulver genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Ornithin oder Serin, Nucleosidbasen, wie Cytosin oder Uracil sowie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z.B. NH4Cl, (NH4)2S04, Na NO3 und KNO3 aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z.B.
folgende Ionen: Mg , Nu+, K , Ca++, NH4 + , C1 , SO4 , PO4 und NO3 sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen. Im allgemeinen enthalten die Nährlösungen vorzugsweise etwa 0,5 bis 8 %, insbesondere 0,6 bis 6 % Kohlenstoffquellen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4 %, insbesondere 0,5 bis 2 % Stickstoffquellen und vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,5 %, insbesondere 0,003 bis 0,3 % Mineralsalze.
Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile zu verwenden und dann im Laufe der ersten 3 Kultivierungstage durch häufigere Zusätze diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösung dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern.
Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 5 und etwa 10, insbesondere zwischen 6,5 und 9,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereichen kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO3 vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z.B. H2SO4, oder sterile Lauge, z.B.
NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.
Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.
Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 15 und etwa 400C, vorzugsweise zwischen 20 und 350C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 280C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.
Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 10, vorzugsweise etwa 4 bis 7 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.
Das gewünschte Endprodukt der Fermentation kann mit Hilfe von dünnschichtchromatographischen und hochdruckflüssigkeitschromatographischen Untersuchungen oder im Plattendiffusionstest mit einem geeigneten Pilz als Teststamm bestimmt werden.
Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z.B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden, wobei die Temperaturen vorzugsweise bei 100 bis 1400C, insbesondere bei 120 bis 1300C liegen können.
Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z.B. flüssige Fette und öle, bl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen (z.B. in Mengen bis etwa 1 t) zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z.B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z.B.
gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Die isolierten Stoffe können mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da gegebenenfalls vorhandene geringfügige Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflußt. Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß pH-Werte nicht über eine längere Zeit im sauren Bereich liegen. Vorzugsweise werden pH-Werte zwischen 7 und 10 eingehalten. Zur Erniedrigung des pH-Wertes können anorganische und organische Basen verwendet werden, wie Alkalibasen z.B. NaOH, KOH oder organische Amine, wie Triethylamin.
Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster Konzentration bzw.
Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalischchemischen Methoden, z.B. Messen einer charakteristischen Bande im Spektrum oder der Rf-Werte, Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität usw. herangezogen werden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um in Routineverfahren geeignete Mikroorganismen aufzufinden.
Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann z.B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden: Nach seiner Anreicherung im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert (z.B.
Zentrifugation).
Aus dem Kulturfiltrat kann die erfindungsgemäße Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden. Mit gutem Erfolg läßt sich auch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) einsetzen. Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z.B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z.B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist. Bevorzugt werden Essigsäureethylester, Chloroform und Methanol oder ihre Gemische (beispielsweise Gemische aus Chloroform und Methanol oder aus Essigsäureethylester und Chloroform) eingesetzt. Tubaymycin sollte nur solange wie unbedingt erforderlich mit Methanol in Kontakt gebracht werden.
Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung Chromatographie-Verfahren verwendet, z.B.
unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel oder andererseits Geldiffusionschromatographie. Dies sind die von der Reinigung schlecht wasserlöslicher Naturstoffe her bekannten Methoden.
Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung nach den üblichen Methoden, z.B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das bei der aeroben Kultur der Stämme bei etwa 270C erhaltene Fermentationsgut (Kulturbrühe und Mycel) mit einem polaren Lösungsmittel, wie Essigsäureethylester mehrfach, vorzugsweise 3 mal extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel (vorzugsweise im Hochvakuum bei etwa OOC) abdestilliert.
Das Tubaymycin-Rohprodukt wird in Diethylether gelöst und 10 min bei 250C mit einem gleichen Volumen wäßriger 0,7 N NaOH gerührt. Nach der Phasentrennung wird die wäßrige Phase mit HCl neutralisiert, dreimal mit Diethylether extrahiert, und die vereinigten Diethyletherphasen werden mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.
Das Tubaymycin-Rohprodukt wird anschließend einer präparativen fraktionierten Säulenchromatographie unterworfen. Als Chromatographiematerial wird hierbei Sephadex LH-20 bevorzugt. Bevorzugte Eluenten sind Chloroform oder Mischungen polarer Lösungsmittel. Die Fraktionen können leicht anhand dünnschichtchromatographischer Untersuchungen festgelegt werden. Auf diese Weise wird das Roh-Tubaymycin erhalten. Das Roh-Tubaymycin wird weiter säulenchromatographisch (vorzugsweise auf Kieselgel mit den bevorzugten Eluenten Chloroform/Methanol) weitergereinigt. Eine Feinreinigung des auf diese Weise erhaltenen (bereits recht reinen) Produktes erfolgt zweckmäßigerweise durch eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit üblichen Geräten, wobei als Füllmaterial vorzugsweise übliche "reversed phase" - Materialien, wie mit Paraffin modifiziertes Kieselgel und als Eluente vorzugsweise Methanol/Wasser-Mischungen dienen.
Der Wirkstoff eignet sich bei guter Pflanzenverträglichkeit und günstiger Warmblütertoxiiität zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen, insbesondere Insekten, Spinnentieren und Nematoden, die in der Landwirtschaft, in Forsten, im Vorrats- und Materialschutz sowie auf dem Hygienesektor vorkommen. Er ist gegen normal sensible und resistente Arten sowie gegen alle oder einzelne Entwicklungsstadien wirksam. Zu den oben erwähnten Schädlingen gehören: Aus der Ordnung der Isopoda z.B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.
Aus der Ordnung der Diplopoda z.B. Blaniulus guttulatus.
Aus der Ordnung der Chilopoda z.B. Geophilus carpophagus, Scutigera spec.
Aus der Ordnung der Symphyla z.B. Scutigerella immaculata.
Aus der Ordnung der Thysanura z.B. Lepisma saccharina.
Aus der Ordnung der Collembola z.B. Onychiurus armatus.
Aus der Ordnung der Orthoptera z.B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucophaea maderae, Blattella germanica, Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Melanoplus differentialis, Schistocerca gregaria.
Aus der Ordnung der Dermaptera z.B. Forficula auricularia.
Aus der Ordnung der Isoptera z.B. Reticulitermes spp..
Aus der Ordnung der Anoplura z.B. Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp.
Aus der Ordnung der Mallophaga z.B. Trichodectes spp., Damalinea spp.
Aus der Ordnung der Thysanoptera z.B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci.
Aus der Ordnung der Heteroptera z.B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.
Aus der Ordnung der Homoptera z.B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Doralis fabae, Doralis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp. Psylla spp.
Aus der Ordnung der Lepidoptera z.B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella inaculipennis, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp. Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Laphygma exigua, Mamestra brassicae, Panolis flammea, Prodenia litura, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana.
Aus der Ordnung der Coleoptera z.B. Anobium punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes bajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus sps., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica.
Aus der Ordnung der Hymenoptera z.B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.
Aus der Ordnung der Diptera z.B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae, Tipula paludosa.
Aus der Ordnung der Siphonaptera z.B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp..
Aus der Ordnung der Arachnida z.B. Scorpio maurus, Latrodectus mactans.
Aus der Ordnung der Acarina z.B. Acarus siro, Argas spp., Ornithodoros spp., Dermanyssus gallinae, Eriophyes ribis, Phyllocoptruta oleivora, Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Amblyomma spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp., Tarsonemus spp., Bryobia praetiosa, Panonychus spp., Tetranychus spp..
Zu den pflanzenparasitären Nematoden gehören Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp.t Longidorus spp., Xiphinema spp., Trichodorus spp..
Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist eine starke mikrobizide Wirkung auf und kann zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen eingesetzt werden. Der Wirkstoff ist für den Gebrauch als Pflanzenschutzmittel geeignet.
Fungizide Mittel im Pflanzenschutz werden eingesetzt zur Bekämpfung von Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Bsidiomycetes, Deuteromycetes.
Bakterizide Mittel werden im Pflanzenschutz zur Bekämpfung von Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae und Streptomycetaceae eingesetzt.
Die gute Pflanzenverträglichkeit des Wirkstoffes in den zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten notwendigen Konzentrationen erlaubt eine Behandlung von oberirdischen Pflanzenteilen, von Pflanz- und Saatgut, und des Bodens.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff eignet sich auch zur Bekämpfung von Ekto- und Endoparasiten bei Warmblütern, beispielsweise auf dem Gebiet der Tierhaltung und Viehzucht, wobei durch die Bekämpfung der Schädlinge bessere Ergebnisse, z.B. höhere Milchleistungen, höheres Gewicht, längere Lebensdauer usw. erreicht werden können.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Wirkstoffes geschieht auf diesen Gebieten in bekannter Weise, wie durch orale Anwendung in Form von beispielsweise Tabletten, Kapseln, Tränken, Granulaten, durch dermale Anwendung in Form beispielsweise des Tauchens (Dippen), Sprühen (Sprayen), Aufgießen (pour-on and spot-on) und des Einpuderns sowie durch parenterale Anwendung in Form beispielsweise der Injektion.
Es werden auf diesen Gebieten z.B. auch Zecken und solche Arthropoden erfaßt, bei welchen Teile ihrer Entwicklung im Tier ablaufen. Darüber hinaus ist die erfindungsgemäße Verbindung auch zur Bekämpfung von Würmern - insbesondere solche der Klasse Nematoda - geeignet, die Parasiten von Warmblütern sind. Außerdem kann die erfindungsgemäße Verbindung zur Bekämpfung von dermalen Pilzinfektionen bei Warmblütern verwendet werden.
Der Wirkstoff kann in die üblichen Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Wirkstoff-imprägnierte Natur- und synthetische Stoffe, Feinverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, ferner in Formulierungen mit Brennsätzen, wie Räucherpatronen, -dosen, -spiralen u.ä., sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.
Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Vermischen des Wirkstoffes mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol, oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Acetone, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z.B. Aerosol-Treibgas, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid; als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z.B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapúlgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate; als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengeln; als Emulgier- und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, z.B. Alkylarylpolyglykol-Ether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate; als Dispergiermittel kommen in Frage: z.B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.
Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat.
Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B.
Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.
Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gew.-% Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann in seinen handelsüblichen Formulierungen sowie in den aus diesen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen in Mischung mit anderen Wirkstoffen, wie Insektiziden, Lockstoffen, Steriliantien, Akariziden, Nematoziden, Fungiziden, wachstumsregulierenden Stoffen oder Herbiziden vorliegen. Zu den Insektiziden zählen beispielsweise Phosphorsäureester, Carbamate, Carbonsäureester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Phenylharnstoffe, durch Mikroorganismen hergestellte Stoffe u.a.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann ferner in seinen handelsüblichen Formulierungen sowie in den aus diesen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen in Mischung mit Synergisten vorliegen. Synergisten sind Verbindungen, durch die die Wirkung der Wirkstoffe gesteigert wird, ohne daß der zugesetzte Synergist selbst aktiv wirksam sein muß.
Der Wirkstoffgehalt der aus den handelsüblichen Formulierungen bereiteten Anwendungsformen kann in weiten Bereichen variieren. Die Wirkstoffkonzentration der Anwendungsformen kann von 0,0000001 bis zu 95 Gew.-% Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,0001 und 1 Gew.-% liegen.
Die Anwendung geschieht in einer der Anwendungsformen angepaßten üblichen Weise.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden. Wo nicht anders gegeben, bezeihen sich alle %-Angaben auf Gewichtsprozente. Essigester bedeutet Essigsäureethylester.
I. Beispiel für die Fermentation des Stammes Tü 2599 1. Fermentation des Stammes Tü 2599 Der Stamm Tü 2599 wird bei etwa 40C im Kühlraum auf einem Schrägagarröhrchen gehalten.
Der hierzu verwendete HA-Agar enthält je Liter 4 g Hefeextrakt, 10 g Malz, 4 g Dextrose und 15 g Agar (Rest: Wasser) und hat einen pH-Wert von 7,3. Sporenlösungen des Stammes Tü 2599 werden bei -200C aufbewahrt.
Für die Fermentation wird eine Nährlösung eingesetzt, welche, außer Leitungswasser, 2 % Sojamehl und 2 % Mannit enthält und einen pH-Wert von 7,5 aufweist.
a) Durchführung im Kolbenmaßstab 1000 ml Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung enthalten, werden aus einer Schrägagarkultur beimpft und auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 280 rpm (Umdrehungen pro Minute) und 27"C für 4 Tage inkubiert.
Als Vorkultur für den 30 l-Fermenter dient eine 48 h alte Kultur.
b) Durchführung im 30 l-Fermenter Die Fermentation wird in einem 30 l-Fermenter durchgeführt, der X0 1 Nährlösung mit 400 g Nurupan (vollfettes Sojamehl), 400 g Mannit und 4 ml Desmophen 3900 (Polyglykol) enthält. Die Sterilisation erfolgt für 30 min bei 1210C. Bei 270C Inkubationstemperatur und 200 rpm des Rührers werden 20 1 Luft pro Minute in die Kulturflüssigkeit eingeleitet. Die Impfmaterialmenge beträgt 10 % der unter a) beschriebenen Kultur.
Die Ernte erfolgt nach ca. 50 Stunden.
II. Beispiele für die Aufarbeitung der gemäß I erhaltenen Kulturbrühen 1. Herstellung der Tubaymycin-Rohextraktlösung Das Fermentationsgut wird mit gleichen Volumen Aceton versetzt und intensiv gerührt. Anschlie-Bend wird das gebildete Mycel mit Hilfe einer Filterpresse abgetrennt. Das Mycel kann direkt verworfen werden oder aber vorzugsweise zwecks einer Tubaymycin-Ausbeuteerhöhung zuvor extrahiert werden. Hierzu wird als Extraktionsmittel eine Mischung aus Methanol und Aceton (1:1 Vol.-Teile) verwendet. Man setzt auf 1 kg Mycel insgesamt etwa 2000 ml des Lösungsmittelgemisches ein. Das Mycel wird mit dem Lösungsmittelgemisch 3 mal extrahiert und anschlie-Bend verworfen. Von der Lösung wird das Lösungsmittelgemisch im Hochvakuum bei OOC abdestilliert. Der Rückstand wird mit Essigester (etwa 50 ml Essigester je 1 g Rückstand) aufgenommen und zur Abtrennung fester Bestandteile filtriert.
Die vom Mycel befreite Kulturbrühe wird zur wäßrigen Phase eingeengt mit 20 % Aceton versetzt und über das Adsorberharz Lewatit E23/83 (Säulenbettvolumen 1/4 des Volumens der Kulturbrühe) gegeben. Durchlauf und Waschwasser werden verworfen, das Acetondesorbat wird eingeengt und die verbleibende wäßrige Phase dreimal mit gleichem Volumen Essigester extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2 SO4 getrocknet und zum Tubaymycin-Rohextrakt eingeengt.
2. Grobreinigung des Tubaymycin-Rohextraktes 36 g von dem nach 1b erhaltenen Rohextrakt werden in 0,5 1 Diethylether gelöst und 10 min mit 0,5 1 wäßriger 1 N NaOH bei 250C gerührt.
Anschließend wird der Ansatz mit 1 N HCl neutralisiert und die wäßrige Phase zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten, getrockneten organischen Phasen enthalten 24 g Rohextrakt mit einem Gehalt von 1,6 g Tubaymycin.
Diese 24 g Rohextrakt wurden in drei Portionen von 8 g an Sephadex LH-20 (Säule 50 x 1000 mm) mit Chloroform chromatographiert.
Aufgrund der DC-Kontrolle wurden folgende Fraktionen (Fr.) vereinigt und das Lösungsmittel abdestilliert: Fr. 1-34 (1,5 Bettvolumen) 3,9 g Lipophile Begleitsubstanzen Fr. 35-37 (0,1 Bettvolumen) 0,8 g Tubaymycin (Rohprodukt) Fr. 38-42 (0,2 Bettvolumen) 1,5 g einheitliche Begleitsubstanz ab Fr. 43 1,7 g polare Begleitsubstanzen.
3. Feinreinigung des Tubaymycin 0,8 g Tubaymycin Rohprodukt aus II 2. werden in 4,0 ml Chloroform gelöst und an Kieselgel 60 (LiChroprep Si 60, 40-63 leim, Lobar Fertigsäule GröBe c, Fa. E. Merck, Darmstadt) mit Chloroform chromatographiert: Fr. 1-22 (2 Bettvolumen) 0,3 g lipophile Begleitsubstanzen Fr. 23-28 (1/4 Bettvolumen) 0,3 g Tubaymycin ab Fr. 29 0,1 g polare Begleitsubstanzen.
Bei der Rechromatographie des Tubaymycin aus Fr. 23-28 werden 0,2 g chromatographisch und spektroskopisch einheitliches Tubaymycin in Form eines farblosen (weißen) amorphen Pulvers gewonnen.
Die dünnschichtchromatographische Kontrolle (DC-Kontrolle) erfolgt auf MERCK DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F 254, Schichtdicke 0,25 mm, im Laufmittelsystem CHCl3/CH3OH 9:1 (Vol.-Teile).
Das Tubaymycin kann durch UV (254 nm), Besprühen mit a) konz. HCl/CH30H (30/70 Vol.-Teile) (Gelborange färbung) und b) Jodsprühreagenz (0,2 g Jod + 0,4 g KJ in 50 ml Wasser und 50 ml Ethanol) charakterisiert werden.
Hauptkomponenten Rf-Wert einheitliche Begleit- 0,51 substanz Tubaymycin 0,58 lipophile Begleit- 0,7-0,9 substanzen Erläuterung der Figuren 1 bis 5: 1. Allgemeine Erläuterungen 1. UV-Spektrum Abzisse: Wellenlänge (nm) Ordinate: Extinktion (molarer Extinktionskoeffizient Maxima: & = 282,0 und 242,2 nm 2. IR-Spetrum: (in KBr): Abzisse: Wellenlänge (m) bzw. Wellenzahl (cm ) Ordinate: Durchlässigkeit (%) 3. 1H-NMR-Spektrum: aufgenommen bei 250 MHz Interner Standard: Tetramethylsilan (TMS) Chemical shift in ppm Konzentration: 75 mg/ml CDCl3 4. 13C-NMR Spektrum: aufgenommen bei 50,32 MHz Interner Standard: CDCl3 Chemical shift in ppm Konzentration: 75 mg/ml CDCl3 5. Massenspektrum: Elektronenionisation Abzisse: m/e-Verhältnis Ordinate: Intensität Erläuterung einiger aufgeführter Firmennamen und Warenzeichen MERCK bedeutet Fa. E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland Sephadex LH-20 bedeutet Hydroxypropyldextran, Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden Lewatit-Adsorber E 23/83 ist ein hochporöses Styroldivinylbenzolharz der Fa. Bayer AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland.
Die biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden: Beispiel A Phaedon-Test Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen Kohlpflanzen (Brassica oleracea) werden durch Sprühen mit der Wirkstoffzubereitung der gewünschten Konzentration behandelt. Nach Antrocknen der Spritzbrühe wird von der behandelten Pflanze ein Blatt entnommen, in eine Plastikdose gelegt und mit Larven des Meerettichkäfers (Phaedon cochleariae) besetzt. Nach 2 bis 4 Tagen wird jeweils ein weiteres Blatt von derselben Pflanze für die Nachfütterung verwendet.
Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100 %, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0 % bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.
Bei diesem Test zeigt z.B. bei einer Konzentration von 0,1 % nach 14 Tagen das Tubaymycin eine Abtötung von 100 %.
Beispiel B Plutella-Test Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.
Kohlpflanzen (Brassica oleracea) werden durch Sprühen mit der Wirkstoff zubereitung der gewünschten Konzentration behandelt. Nach Antrocknen der Spritzbrühe wird von der behandelten Pflanze ein Blatt entnommen, in eine Plastikdose gelegt und mit Raupen der Kohlschabe (Plutella maculipennis) besetzt. Nach 2 bis 4 Tagen wird jeweils ein weiteres Blatt von derselben Pflanze für die Nachfütterung verwendet.
Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100 %, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0 % bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden Bei diesem Test zeigt z.B. bei einer Konzentration von 0,004 nach 14 Tagen das Tubaymycin eine Abtötung von 100 %.
Beispiel C Entwicklungshemmtest mit Dysdercus intermedius (Baumwollkapselwanze) Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoff zubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gegewünschten Konzentrationen.
In Plastikdosen werden je 10 Nymphen der Baumwollkapselwanze einige Baumwollsamen und ein mit der Wirkstoffzubereitung getränktes Watteröllchen angeboten. Nach der gewünschten Zeit wird die Abtötung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100 %, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0 % bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.
Bei diesem Test zeigt z.B. bei einer Konzentration von 0,1 % nach 14 Tagen das Tubaymycin eine Abtötung von 100 %.
Beispiel D Entwicklungshemmtest mit Ceratitis capitata (Mittelmeerfruchtfliege) Lösungsmittel: 3 Gewichtsteile Aceton Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoff zubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit der angegebenen Menge Lösungsmittel und der angegebenen Menge Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschten Konzentrationen.
Je 20 Eier der Mittelmeerfruchtfliege werden auf Kunstfutterbrei in ein Döschen gelegt. Das Futter ist mit Wirkstoff in der angegebenen Konzentration behandelt.
Die Summe der abgetöteten Eier, Larven, Puppen und Imagines bezogen auf die Zahl eingesetzter Eier ergibt die Abtötung in t.
Dabei bedeutet 100 %, daß alle Tiere abgetötet wurden; 0 z bedeutet, daß keine Tiere abgetötet wurden.
Bei diesem Test zeigt z.B. bei einer Konzentration von 0,1 % nach 21 Tagen das Tubaymycin eine Abtötung von 100 %.
Beispiel E Test mit Psoroptes cuniculi Lösungsmittel: 35 Gewichtsteile Ethylenglykolmonomethylether 35 Gewichtsteile Nonylphenolpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoff zubereitung vermischt man 3 Gew. -Teile Wirkstoff mit 7 Gew.-Teilen des oben angegebenen Lösungsmittel-Gemisches und verdünnt das so erhaltene Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
Etwa 10-25 Psoroptes cuniculi werden in 1 ml der zu testenden Wirkstoffzubereitung gebracht, die in Tablettennester einer Tiefziehverpackung pipettiert wurden. Nach 24 Stunden wird der Abtötungsgrad bestimmt.
Bei diesem Test zeigte bei einer Konzentration von 80 ppm das Tubaymycin eine Abtötung von 100 %.
Beispiel F Test mit Lucilia cuprina resO-Larven Emulgator: 35 Gewichtsteile Ethylenglykolmonomethylether 35 Gewichtsteile Nonylphenolpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 3 Gew.-Teile Wirkstoff mit 7 Gew.-Teilen des oben angegebenen Lösungsmittel-Gemisches und verdünnt das so erhaltene Konzentrat mit Wasser auf die jeweils gewünschte Konzentration.
Etwa 20 Lucilia cuprina res. -Larven werden in ein Teströhrchen gebracht, welches ca. 1 cm2 Pferdefleisch und 0,5 ml der Wirkstoffzubereitung enthält. Nach 24 Stunden wird der Abtötungsgrad bestimmt.
Bei diesem Test zeigten z.B. bei einer Konzentration von 80 ppm das Tubaymycin eine abtötende Wirkung von etwa 95 %.
Beispiel G Test mit Boophilus microplus resistent Lösungsmittel: 35 Gewichtsteile Ethylenglykolmonomethylether 35 Gewichtsteile Nonylphenolpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 3 Gewichtsteile Wirkstoff mit 7 Gew.-Teilen des oben angegebenen Lösungsmittel-Gemisches und verdünnt das so erhaltene Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
10 adulte Boophilus microplus res. werden in die zu testende Wirkstoff zubereitung 1 Minute getaucht. Nach Uberführung in Plastikbecher und Aufbewahrung in einem klimatisierten Raum wird der Abtötungsgrad bestimmt.
Bei diesem Test zeigte Tubaymycin bei einer Konzentration von 80 ppm eine Abtötung von etwa 50 %.
Beispiel H Puccinia recondita-Test (Weizen) / protektiv Lösungsmittel: 100 Gewichtsteile Dimethylformamid Emulgator: 0,25 Gewichtsteile Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit den angegebenen Mengen Lösungsmittel und Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit besprüht man junge Pflanzen mit der Wirkstoff zubereitung taufeucht.
Nach Antrocknen des Spritzbelages werden die Pflanzen mit einer Konidiensuspension von Puccinia recondita besprüht. Die Pflanzen verbleiben 48 Stunden bei 200C und 100 % rel. Luftfeuchtigkeit in einer Inkubationskabine.
Die Pflanzen werden in einem Gewächshaus bei einer Temperatur von ca. 200C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von ca. 80 % aufgestellt.
7 Tage nach der Inokulation erfolgt die Auswertung.
Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (100 % Befall) ergab die Behandlung mit Tubaymycin einen Befall von nur 10 % bei einer Wirkstoffkonzentration von 0,025 %.
Beispiel I Venturia inaequalis-Test (Apfel) / protektiv Lösungsmittel: 100 Gewichtsteile Dimethylformamid Emulgator: 0,25 Gewichtsteile Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gew.-Teil Wirkstoff mit den angegebenen Mengen Lösungsmittel und Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit besprüht man junge Pflanzen mit der Wirkstoffzubereitung taufeucht.
Nach Antrocknen des Spritzbelages werden die Pflanzen mit einer Konidiensuspension von Venturia inaequalis besprüht. Die Pflanzen verbleiben 48 Stunden bei 200C und 100 % rel. Luftfeuchtigkeit in einer Inkubationskabine.
Die Pflanzen werden in einem Gewächshaus bei einer Temperatur von ca. 200C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von ca. 80 % aufgestellt.
7 Tage nach der Inokulation erfolgt die Auswertung.
Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (100 % Befall) ergaben die Behandlungen mit Tubaymycin nur einen Befall von 30 % (Wirkstoffkonzentrationen 0,025 %).
Beispiel K Botrytis-Test (Paprika)/ protektiv Lösungsmittel: 100 Gewichtsteile Dimethylformamid Emulgator: 0,25 Gewichtsteile Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit den angegebenen Mengen Lösungsmittel und Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit bespritzt man junge Pflanzen mit der Wirkstoffzubereitung bis zur Tropfnässe. Nach Antrocknen des Spritzbelages werden auf jedes Blatt 2 kleine mit Botrytis cinerea bewachsene Agarstückchen aufgelegt. Die inokulierten Pflanzen werden in einer abgedunkelten, feuchten Kammer bei 200C aufgestellt. 3 Tage nach der Inokulation wird die Größe der Befallsflecken auf den BlÄttern ausgewertet.
Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (100 % Befall) ergaben Behandlungen mit Tubaymycin nur einem Befall von 30 % bei Wirkstoffkonzentrationen von 250 ppm.
Beispiel L Phytophthora-Test (Tomate) /protektiv Lösungsmittel: 100 Gewichtsteile Dimethylformamid Emulgator: 0,25 Gewichtsteile Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit den angegebenen Mengen Lösungsmittel und Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit bespritzt man junge Pflanzen mit der Wirkstoffzubereitung bis zur Tropfnässe. Nach Antrocknen des Spritzbelages werden die Pflanzen mit einer wäßrigen Sporensuspension von Phytophthora infestans inokuliert.
Die Pflanzen werden in einer Inkubationskabine mit 100 % relativer Luftfeuchtigkeit und ca. 20 OC aufgestellt.
3 Tage nach der Inokulation erfolgt die Auswertung.
Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (90 % Befall) ergab bei einer Wirkstoffkonzentration von 250 ppm die Behandlung mit Tubaymycin nur einen Befall von 10 %.
Das erfindungsgemäße Tubaymycin zeigte außerdem in Tests mit Pyricularia oryzae an Reis gute Wirksamkeiten.
Beispiel M Antifungische Wirkung im Agar-Plattentest Zur Prüfung wurden Sporen oder Keime von durchschnittlich 5 x 103 bis 104 Keime/ml der unten angegebenen Fungi in einem Agar folgender Zusammensetzung: 4 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Malzextrakt, 4 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 10 ppm Tubaymycin, pH = 7,3 suspendiert, in Petrischalen gegossen und anschließend 24 bis 96 Stunden bei 22"C inkubiert.
Eine vollständige Wachstumsinhibierung bei Gegenwart von 10 ppm Tubaymycin wurde bei Fusarium culmorum, Phialophora cinerescens, Pythium ultimum, Sclerotinia sclerotiorum, Pellicularia sasakii, Fusarium livane, Mycosphaerella musae, Colletotrichum coffeanum, und Pyricularia oryzae festgestellt.
Beispiel N Antimykotische in-vitro-Wirksamkeit Versuchsbeschreibung: Die in-vitro-Prüfungen wurden im Reihenverdünnungstest mit Keiminokula von durchschnittlich 5 x 103 bis 104 Keimen/ml Substrat durchgeführt. Als Nährmedium dienten a) für Dermatophyten und Schimmelpilze: Sabourand's milieu d'épreuve b) für Hefen: Fleischextrakt-Traubenzucker-Bouillon.
Die Bebrütungstemperatur betrug 28 bis 370C, die Bebrütungsdauer lag bei 24 bis 95 Stunden bei Hefen und 96 Stunden bei Dermatophyten und Schimmelpilzen.
In diesem Test zeigte die erfindungsgemäße Verbindung Tubaymycin eine gute Wirkung.
Beispiel O Nematoden in vitro Test Geprüft wird die Abtötung und Hemmung der Vermehrung des Nematoden Caenorhabditis elegans in flüssigem Medium in Gegenwart von Bakterien, die den Nematoden als Nahrung dienen.
In diesem Test hemmte das Tubaymycin die Vermehrung von C.elegans in einer Konzentration von 25 g/ml um mehr als 90 %.

Claims

Patentansprüche Die organisch-chemische Verbindung der Formel I ("Tubaymycin") 2. Tubaymycin mit folgenden Eigenschaften: Aussehen: farbloses, amorphes Pulver Fp.: 102-1070C (Zersetzung) Löslichkeit: leicht löslich in Chloroform schwer löslich in Wasser Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel): CHC13 : CH3OH (9 : 1 Vol.-Teile) Rf: 0,58 Ethylmethylketon: CHCl3 (1:1 Vol.-Teile) Rf: 0,45 Ethylmethylketon: Rf: 0,86 Aceton: Rf: 0,91 Molgewicht: 604 Summenformel (Elementaranalyse): C35H56O8 Spektren: UV Fig. 1 IR Fig.
2 NMR Fig. 3 und Fig. 4 MS Fig. 5
3. Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 erhältlich durch die Fermentation des Stammes Tü 2599 (DSM 2610) oder seiner Mutanten und Varianten.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I ("Tubaymycin") dadurch gekennzeichnet, daß man geeignete Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetfales, vorzugsweise der Familie Streptomycetaceae, insbesondere der Gattung Streptomyces in Üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung nach ueblichen Methoden isoliert.
5. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man geeignete Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetales, vorzugsweise der Familie Streptomycetaceae, insbesondere der Gattung Streptomyces und ganz besonders bevorzugt Stämme der Art Streptomyces griseus in üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daS man für die Kultivierng den Stamm Tü 2599 (DSM 2610) oder die Mutanten und Varianten dieses Stammes einsetzt.
7. Schädlingsbekäpfungsmittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung der Formel I gemäß den Ansprechen 1 oder 4 oder an der Verbindung gemäß dem Anspr-'chen 2 und 3.
8. Verwendung der Verbindung der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 oder 4 oder der Verbindung gemäß den Ansprüchen 2 und 3 zur Bekämpfung von Schädlingen und Parasiten, insbesondere Arthropoden (wie Insekten und Spinnentieren), Pilzen oder Würmern.
9. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen und Parasiten, dadurch gekennzeichnet, daS man die Verbindung der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 oder 4 oder die Verbindung gemaß den Ansprüchen 2 und 3 auf die Schädlinge, vorzugsweise Arthropoden (wie Insekten oder Spinnentiere), Pilze oder Würmer oder ihren Lebensraum einwirken läßt.
10. Verfahren zur Herstellung von Schädlings- und Parasitenbekämpfungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel I gemäß den Ans rüchen 1 oder 4 oder die Verbindungen gemäß den Ansprüchen 2 und 3 mit Streckmitteln und/oder oberflächenaktiven Mitteln vermischt.
11. Mikroorganismus Tü 2599 (als' 2610) und dessen Mutanten und Varianten.
12. Organisch-~hemische Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Bekämpfung von Erkrankungen.