DE3416978A1

DE3416978A1 - TRANSFORMATION OF EUKARYOTIC CELLS MEDIATED BY LIPOSOME

Info

Publication number: DE3416978A1
Application number: DE19843416978
Authority: DE
Inventors: Irvin Jacob El Sobrante Calif. Mettler
Original assignee: Stauffer Chemical Co
Current assignee: Stauffer Chemical Co
Priority date: 1983-05-12
Filing date: 1984-05-08
Publication date: 1984-12-06
Also published as: AU2793884A; FR2545837A1; JPS59213392A; KR840008816A; GB2140822A; GB8411838D0; IL71797A0

Description

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Beschreibung12th
description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkapselung bzw. Umhüllung biologisch aktiver Moleküle, z.B. Desoxyribonucleinsäure (DNA), in Lipidbläschen oder Liposomen und Verfahren zur Verwendung von derartig mit Lipid eingekapselter DNA zur Transformierung von Zellen, insbesondere von Pflanzenzellen.The invention relates to a method for encapsulating or enveloping biologically active molecules, e.g., deoxyribonucleic acid (DNA), in lipid vesicles or liposomes, and methods of using such with lipid encapsulated DNA for transforming cells, especially plant cells.

Die Transformation kann als allgemeines Verfahren für eine unidirektionale Übertragung oder einen unidirektionellen Transfer genetischer Informationen definiert werden, bei dem DNA, die aus einer Zelle stammt, von einer anderen Zelle aufgenommen und darin stabil gehalten wird. Solche DNA-Transfers können verschiedene Formen .annehmen. Zwischen Bakterien ist der natürlich vorkommende Informationstransfer bei Plasmiden die Konjugation. Virale DNA kann relativ stabil in das bakterielle Chromosom bei nicht-lysogenen Infektionen integriert werden, damit sie zu einem späteren Zeitpunkt im Ansprechen auf einen Derepressing-Stimulus wieder freigegeben wird.The transformation can be used as a general method for a unidirectional transmission or a unidirectional Transfer of genetic information can be defined as the process of DNA obtained from a cell being transferred from a another cell and is kept stable therein. Such DNA transfers can take several forms .accept. The naturally occurring transfer of information between bacteria in plasmids is conjugation. Viral DNA can be integrated relatively stably into the bacterial chromosome in non-lysogenic infections to be released at a later time in response to a derepressing stimulus will.

Die Transformation von Informationen in Form natürlich vorkommender oder künstlich aufgebauter DNA aus einer Ursprungsquelle in eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle liegt am Herzen der Gentechnologie. Diese Transformation kann nach einer Reihe von Wegen erfolgen. Üblicherweise werden Zellen, insbesondere Bakterienzellen, während einer bestimmten Zeit gepufferten, wäßrigen Lösungen zur Transformation von DNA, die einen auswählbaren Marker enthält, ausgesetzt. Die Zellen werden nach ihren charakteristischen Merkmalen, die sie durch den Marker erhalten haben, ausgewählt. Die antibiotisehe Resistenz ist ein oft verwendeter, auswählbarerThe transformation of information into shape of course occurring or artificially constructed DNA from an original source into a prokaryotic or eukaryotic one Cell is at the heart of genetic engineering. This transformation can be done in a number of ways. Usually cells, in particular bacterial cells, are aqueous, buffered for a certain period of time Solutions for transforming DNA containing a selectable marker exposed. The cells will selected according to their characteristic features that they have received from the marker. The antibiotic marriage Resistance is an often used, selectable one

Marker. Ein anderes Transformationsverfahren umfaßt die Inkubation der zu transformierenden Zellen in einer Polyethylenglykol (PEG) "bei Konzentrationen, die sich 50% nähern, enthaltenden, gepufferten Lösung und einer gepufferten, wäßrigen Lösung der Transformations-DNA. Die überlebenden Zellen werden entsprechend den Eigenschaften ausgewählt, die ihnen die Transformations-DNA verliehen hat.Marker. Another transformation method involves incubating the cells to be transformed in a Buffered solution containing polyethylene glycol (PEG) "at concentrations approaching 50% and a buffered, aqueous solution of the transformation DNA. The surviving cells will be according to the properties who gave them the transformation DNA.

Im allgemeinen werden die Zellen, bevor sie transformiert werden, vorbehandelt, um die Transformation eingehen zu können. Solche Vorbehandlungen ermöglichen den Zugang zu der zellularen Membran und den anschließenden Transfer der Transformations-DNA längs der Zellmembran. Bevor einige Bakterienzellen gemäß den oben kurz beschriebenen Verfahren transformiert werden können, werden die Bakterienzellen mit Enzymen oder Antibiotika behandelt, die digerieren oder die Bildung der Bakterienzellwand beeinflussen bzw. stören. Die Zellmembran wird somit freigesetzt und die Zellen werden osmotisch fragil bzw. osmotisch empfindlich. Bei anderen Bakterienzellen werden die Zellen durch Transformation zugänglich gemacht, indem man sie Calciumchlorid enthaltenden Puffern aussetzt. In general, before the cells are transformed, they are pretreated to undergo transformation can. Such pretreatments allow access to the cellular membrane and subsequent transfer the transformation DNA along the cell membrane. Before some bacterial cells according to the briefly described above The bacterial cells are treated with enzymes or antibiotics that can be transformed in the process digest or affect the formation of the bacterial cell wall or disturb. The cell membrane is thus released and the cells become osmotically fragile or osmotically sensitive. In other bacterial cells, the cells are made accessible through transformation, by exposing them to buffers containing calcium chloride.

Die Transformation eukaryotischer Zellen kann unter Verwendung ähnlicher Techniken erfolgen. Tierzellen besitzen im allgemeinen keine Zellwände und sind somit osmotisch fragil, ohne enzymatische oder antibiotische Vorbehandlung. Hefezellen werden im allgemeinen osmotisch fragil gemacht, indem man sie der Predigestion mit dem Enzym Zymolyse unterwirft. Der entstehende Sphäroplast, der die Hefezelle ist, dem die Zellwand fehlt, wird mit der Transformations-DNA mit oder ohne PEG inkubiert. Der Ausdruck "Transformations-DNA" entspricht dem angel-Transformation of eukaryotic cells can be done using similar techniques. Own animal cells generally no cell walls and are therefore osmotically fragile, without enzymatic or antibiotic pretreatment. Yeast cells are generally rendered osmotically fragile by exposing them to the preaching Subjecting enzyme to zymolysis. The resulting spheroplast, which is the yeast cell that lacks the cell wall, is with the transformation DNA is incubated with or without PEG. The expression "transformation DNA" corresponds to the angled

sächsischen Ausdruck "transforming DNA" und ist synonym mit dem Ausdruck "transformierende DNA". Die Pflanzenzellen werden im allgemeinen in osmotisch fragilen Zustand durch enzymatische Digestion der Pflanzenzellwand vor der Transformation nach einem der oben kurz beschriebenen Verfahren gebracht.Solche osmotisch fragilen Pflanzenzellen werden im allgemeinen als Pflanzenzeliprotoplasten bezeichnet.Saxon expression "transforming DNA" and is synonymous with the term "transforming DNA". The plant cells are generally in an osmotically fragile state due to enzymatic digestion of the plant cell wall brought before the transformation by one of the methods briefly described above. Such osmotically fragile plant cells are generally called plant cell protoplasts designated.

Forscher, die versuchen, Zellen zu transformieren, insbesondere osmotisch fragile Zellen, entweder prokaryotische oder eukaryotische und insbesondere Pflanzenzellen, begegnen zwei Hauptschwierigkeiten, die im Zusammenhang stehen, wenn sie versuchen, eine Transformation mit hoher Frequenz durchzuführen. Erstens nehmen die Zellen im allgemeinen die DNA durch die Zellmembran in sehr kleinen Frequenzen auf. Dieses Phänomen ist eine Manifestation einer allgemeineren Eigenschaft der Zellmembran. Sie ist im allgemeinen selektiv permeabel und erlaubt, daß kleine Moleküle durch sie hindurchgehen, verhindert jedoch den Durchgang großer Moleküle, z. B. Peptide oder Proteine, Saccharide und Polynucleotide, wie DNA oder Ribonucleinsäure (RNA)· Zweitens digerieren, zusätzlich zu der niedrigen Frequenz der DNA-Aufnahme, die degradativen Enzyme (Abbauenzyme), insbesondere Nucleasen, d.h. Enzyme, die die Nucleinsäuren DNA und RNA abbauen, die in den Präparationen von osmotisch empfindlichen Zellen einschließlich Pflanzenprotoplasten vorhanden sind, die Nucleinsäuren und zerstören die darin enthaltene Information, bevor sie von der Zelle aufgenommen werden kann.Researchers trying to transform cells, in particular osmotically fragile cells, either prokaryotic or eukaryotic and especially plant cells, encounter two main difficulties that are related when attempting a high transformation Frequency to perform. First, cells generally take in DNA across cell membranes small frequencies. This phenomenon is a manifestation of a more general property of the cell membrane. It is generally selectively permeable and prevents small molecules from passing through it however, the passage of large molecules, e.g. B. peptides or proteins, saccharides and polynucleotides such as DNA or ribonucleic acid (RNA) · Second, digest, in addition to the low frequency of DNA uptake that degradative enzymes (degradation enzymes), in particular nucleases, i.e. enzymes that break down the nucleic acids DNA and RNA, those present in the preparations of osmotically sensitive cells including plant protoplasts are the nucleic acids and destroy the information they contain before it is absorbed by the cell can be.

Eine Zahl von Techniken bzw. Verfahren ist allgemein verfügbar, um die Effizienz bei der Aufnahme der DNA durch die Zellen zu erhöhen. Unter diesen Techniken ist dieA number of techniques or procedures are commonly available to increase the efficiency in uptake of the DNA to increase the cells. Among these techniques is the

Einkapselung wäßriger Lösungen der durch die Zelle aufzunehmenden Substanz in Lipidbläschen, welche Umhüllungen für die Lipid-Bischichten sind, welche eine kontinuierliche Membran bilden, die einen wäßrigen Raum umschließt. Die Lipidbläschen oder Liposome werden dann mit der osmotisch fragilen Zelle unter solchen Bedingungen inkubiert, bei denen, wie man annimmt, die Lipidmembran des Liposome mit der Zellmembran der zu transformierenden Zelle verschmilzt. Wenn die Lipidmembran des Liposome mit der Zellmembran verschmolzen ist, werden, so nimmt man an, die wäßrigen Gehalte der Liposome in das wäßrige Cytosol abgegeben, welches die wäßrige Phase des Inneren der Zelle darstellt.Encapsulation of aqueous solutions to be taken up by the cell Substance in lipid vesicles, which are envelopes for the lipid bi-layers, which are a continuous Form a membrane that encloses an aqueous space. The lipid vesicles or liposomes are then incubated with the osmotically fragile cell under conditions which are believed to affect the lipid membrane of the liposome fuses with the cell membrane of the cell to be transformed. When the lipid membrane of the liposome is fused with the cell membrane, it is assumed that the aqueous contents of the liposomes in the aqueous cytosol is released, which is the aqueous phase of the interior of the cell.

Verschiedene Faktoren beeinflussen die Wirksamkeit der durch Liposom vermittelten Abgabe der wäßrigen Substanzen in das Innere der Zelle. Insbesondere bezüglich der Liposom-vermittelten Abgabe von Makromolekülen, wie Polynucleinsäuren, z.B. DNA und RNA, Proteinen und PoIysacchariden, beeinflussen die Wirksamkeit bzw. Ausbeute, mit der die wäßrige Substanz in das Liposom eingekapselt ist, die Stabilität der einzukapselnden Substanzen während der Liposombildung und die Variabilität in der Aufnahme von Liposomen durch unterschiedliche Zellen alle die Abgabegeschwindigkeit der wäßrigen Substanzen in die Zelle.Various factors influence the effectiveness of the liposome-mediated delivery of the aqueous substances inside the cell. In particular with regard to the liposome-mediated delivery of macromolecules such as Polynucleic acids, e.g. DNA and RNA, proteins and polysaccharides, affect the effectiveness or yield with which the aqueous substance is encapsulated in the liposome is the stability of the substances to be encapsulated during liposome formation and the variability in uptake of liposomes through different cells all the rate of release of the aqueous substances in the cell.

Eine ausgezeichnete Zusammenfassung über die die Einkapselung beeinflussenden Faktoren und über das Liposomgebiet im allgemeinen ist "Liposomes: Preparation and Characterization" von S.Szoka und D.Papahadjopoulos im Kapitel 5 von Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1981), Herausgeber Knight.An excellent summary of the factors affecting encapsulation and the liposome area in general, "Liposomes: Preparation and Characterization" by S.Szoka and D.Papahadjopoulos im Chapter 5 of Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications, Elsevier / North Holland Biomedical Press (1981), Knight editors.

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ι Kurz zusammengefaßt, werden derzeit die folgenden Verfahren angewandt. Die am einfachsten gebildeten Liposome sind multilamellare Bläschen (MLV). MLV werden durch Abscheidung eines dünnen Lipidfilms auf der Wand eines Kolbens oder Rohrs oder Röhrchens und durch Zugabe einer wäßrigen Phase und langsames Schütteln des Behälters gebildet. Die so gebildeten MLV besitzen mehrere Lipidschichten oder Lamellen. Der Hauptnachteil der MLV ist ihre niedrige, wäßrige Einkapselung, bedingt durch die Bildung der vielen Lipidschichten; Bangham et al.,(1965), J.Mol.Biol., 22, 238-252.Briefly, the following procedures are currently in use. The most easily formed liposomes are multilamellar vesicles (MLV). MLV are formed by depositing a thin film of lipid on the wall of a flask or tube or tube and adding an aqueous phase and slowly shaking the container. The MLV formed in this way have several lipid layers or lamellae. The main disadvantage of the MLV is its low, aqueous encapsulation, due to the formation of the many lipid layers; Bangham et al., (1965) J.Mol.Biol., 22, 238-252.

Wenn MLV der Beschallung bei inerter Atmosphäre, wie Stickstoff, unterworfen werden, bildet sich eine homogene Population kleiner, unilamellarer Bläschen (SUV) mit einem Durchmesser unter 100 Nanometer (nm). Die kleine Größe der SUV beschränkt sowohl die Einkapselung des wäßrigen Raums/Mol Lipid und die Größe der Makromoleküle, die eingekapselt werden können, auf eine Größe, die im allgemeinen kleiner ist als 40 000 Dalton (d); D.When MLVs are subjected to sonication in an inert atmosphere such as nitrogen, a homogeneous one forms Population of small, unilamellar vesicles (SUV) less than 100 nanometers (nm) in diameter. The little one The size of the SUV limits both the encapsulation of the aqueous space / mole of lipid and the size of the macromolecules, which can be encapsulated to a size generally less than 40,000 daltons (d); D.

Paphadjopoulos und N. Miller (1967), Biochim.Biophys. Acta, 1*£_t 624-638; G.Adrian und L.Huang (1979), Biochemistry» 1j3, 5610-5614.Paphadjopoulos and N. Miller (1967), Biochim.Biophys. Acta, 1 * £ _t 624-638; G. Adrian and L. Huang (1979), Biochemistry »1j3, 5610-5614.

Es wurden verschiedene Verfahren zur Herstellung unilamellarer Bläschen (LUV) entwickelt, welche Lipidbläschen sind und einen Durchmesser über 100 nm aufweisen. Die Lösungsmittelinjektion, welche die Bildung von Bläschen durch Infusion organischer Lösungsmittel, die Phospholipide enthalten, in ein vergleichsweise großes Volumen einer wäßrigen Phase bewirkt, wurde verwendet, aber die Einkapselungsausbeute des Plasmids pBR322 DNA beträgt nur etwa 3%; D.W.Deamer und A.D.Bangham, (1976), Biochem.Biophys. Acta, 443« 629-634; R.T.Fraley et al., (1979), P.N.A.S., 76, 3348-3352. Ferner wird das Verfah-Various methods have been developed to produce unilamellar vesicles (LUV), which are lipid vesicles and are greater than 100 nm in diameter. Solvent injection, which causes vesicle formation by infusion of organic solvents containing phospholipids into a comparatively large volume of an aqueous phase, was used, but the encapsulation yield of plasmid pBR322 DNA is only about 3%; DWDeamer and ADBangham, (1976), Biochem.Biophys. Acta, 443, "629-634; RT Fraley et al., (1979) PNAS, 76, 3348-3352. Furthermore, the procedure

ren bei etwa 60°C durchgeführt, einer Temperatur, die für die Erhaltung der Integrität der meisten biologischen Moleküle relativ hoch ist.ren at about 60 ° C, a temperature that is relatively high for maintaining the integrity of most biological molecules.

Ein weiteres Verfahren, das die Entfernung nach verschiedenen Wegen von einem Detergens aus Detergens/Phospholipid-Mischungen umfaßt, wurde verwendet, aber die Einkapselungsausbeuten liegen nur bei etwa 6 bis etwa 12%; H.G.Enoch und P.Strittmatter (1979), P.N.A.S., £6, 145-149. Weiterhin kann restliches Detergens, welches mit dem Liposom assoziiert ist, die Zellüberlebung beeinflussen, wenn das nach diesem Verfahren gebildete Liposom zur Abgabe der Gehalte des wäßrigen Raums in das Zellinnere verwendet wird.Another method which involves the removal of a detergent by various routes from detergent / phospholipid mixtures was used, but the encapsulation yields are only about 6 to about 12%; H.G.Enoch and P.Strittmatter (1979), P.N.A.S., £ 6, 145-149. Furthermore, residual detergent associated with the liposome can affect cell survival, when the liposome formed by this process is used to deliver the contents of the aqueous space into the interior of the cell is used.

Zur Bildung von LUV wurden ebenfalls die Calcium-induzierte Fusion verwendet; Papahadjopoulos et al., (1975), Biochem.Biophys.Acta, 394, 483-491. Bei diesem Verfahren werden vorgebildete SUV, die saure Phospholipide enthalten, mit Calcium und Ethylendiamino-tetraessigsäure (EDTA) behandelt, wobei große, geschlossene, unilameHare Bläschen gebildet werden. Die Einkapselungsausbeute für Teilchen, wie Viren und Makromoleküle, wie Messenger RNA und DNA, beträgt nur etwa 10% unter Verwendung dieses Verfahrens; für kleinere Moleküle, wie Saccharose, wird eine Einkapselungsausbeute von etwa 15% beobachtet. Zusätzlich ist das Verfahren durch die Größe der Moleküle beschränkt, die anfänglich in den bei diesem Verfahren verwendeten SUV eingekapselt sind.Calcium-induced fusion was also used to form LUV; Papahadjopoulos et al., (1975) Biochem. Biophys. Acta, 394, 483-491. In this procedure, preformed SUVs that contain acidic phospholipids are treated with calcium and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), forming large, closed, unilame-hair vesicles. The encapsulation yield for particles such as viruses and macromolecules such as messenger RNA and DNA is only about 10% using this method; for smaller molecules, such as sucrose, an encapsulation yield of about 15% is observed. In addition, the process is limited by the size of the molecules that are initially encapsulated in the SUV used in this process.

Ein anderes Verfahren, die Umkehrphasenverdampfung (reverse Phasenverdampfung), wurde zur Einkapselung von in einer wäßrigen Phase gelösten Substanzen verwendet. In Abhängigkeit von der ionischen Stärke des wäßrigen Puffers, können 20 bis etwa 60% der wäßrigen Phase unter Verwen-Another technique, reverse phase evaporation, has been used to encapsulate in a aqueous phase used dissolved substances. Depending on the ionic strength of the aqueous buffer, can use 20 to about 60% of the aqueous phase

dung dieses Verfahrens eingekapselt werden; S.Szoka und D.Papahadjopoulos (1978), Ann.Rev.Biophys., Bioeng., <?, 467-508; Fraley et al. (1980), J.Bio.Chem, 2££, 10431-10438. Bei diesem Verfahren werden die Lipide in organischen Lösungsmitteln oder niedrigsiedenden Fluorkohlenwasserstoffen gelöst. Das wäßrige Material wird direkt zu dem Lipid/Lösungsmittel-Gemisch gegeben und die Präparation wird dann unter Bildung einer homogenen Emulsion beschallt. Die Beschallungsstufe ist für die hohen Einkapselungsgeschwindigkeiten wesentlich. Die Lösungsmittel werden dann durch Verdampfen entfernt, und während dieser Stufe bilden sich die Liposome.encapsulated using this process; S.Szoka and D.Papahadjopoulos (1978), Ann.Rev.Biophys., Bioeng., <?, 467-508; Fraley et al. (1980), J.Bio.Chem, £ 2, 10431-10438. In this process, the lipids are dissolved in organic solvents or low-boiling fluorocarbons solved. The aqueous material is added directly to the lipid / solvent mixture and the The preparation is then sonicated to form a homogeneous emulsion. The PA level is for the high Encapsulation speeds are essential. The solvents are then removed by evaporation, and during at this stage the liposomes are formed.

Die Anmelderin hat versucht, die Umkehrphasenverdampfung zur Herstellung von Liposomen, welche DNA für die Transformation von Pflanzenprotoplasten und anderen osmotisch fragilen Zellen enthalten, zu verwenden. Sie hat gefunden, daß die in der Literatur beschriebene Beschallungsstufe selbst während kurzer Zeiten wesentlich die DNA, die in den Liposomen enthalten ist und die schließlich in die Zellen, die transformiert werden sollen, übertragen werden soll, wesentlich zerstört und abbaut. Als Ergebnis ist, obgleich die Einkapselungsausbeute unter Verwendung des UmkehrphasenverdampfungsVerfahrens hoch ist, die Transformationsfrequenz niedrig.The applicant has attempted reverse phase evaporation to produce liposomes, which contain DNA for transformation of plant protoplasts and others osmotically fragile cells contain, use. She has found that the sound level described in the literature even during short periods of time, the DNA that is contained in the liposomes and that will ultimately be essential into the cells that are to be transformed, to be transferred, substantially destroyed and degraded. As a result, although the encapsulation yield is using the reverse phase evaporation method is high, the transformation frequency is low.

Die Anmelderin hat weiterhin gefunden, daß ein starkes Schütteln der Lipid-Lösungsmittel-wäßrigen Präparation Liposome mit hoher Einkapselungsausbeute ergibt, ohne daß die Makromoleküle, insbesondere DNA, die innerhalb des wäßrigen Raums des Liposome vorhanden ist, zerstört oder anderweitig abgebaut werden.The applicant has also found that vigorous shaking of the lipid-solvent-aqueous preparation Liposomes with high encapsulation yield results without the macromolecules, especially DNA, residing within of the aqueous space of the liposome is present, destroyed or otherwise degraded.

Insbesondere wurde gefunden, daß Liposome, die durch Umkehrphasenverdampfung hergestellt worden sind, wobei dieIn particular, it has been found that liposomes produced by reverse phase evaporation have been produced, the

Beschallungsstufe ausgelassen wurde und eine Vortexstufe dafür durchgeführt wurde, um die Llpid-Lösungsmittel-wäßrige Präparation, die verschiedene Plasmide enthält, zu emulgieren, zur Transformation von Pflanzenzellen mit hoher Frequenz verwendet werden können. Es wurde weiterhin gefunden, daß Plasmide im wesentlichen intakt in Pflanzenprotoplasten unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten Liposome abgegeben werden können. Insbesondere wurde gefunden, daß mit Liposom eingekapseltes Plasmid pBR327 in hoher Frequenz in Pflanzenzellenprotoplasten transferiert werden kann, wo es unerwartet stabil erhalten und reproduziert wird. Es wurde weiterhin gefunden, daß pBR327 stabil in Pflanzenzellen erhaltenbleibt und sich reproduziert.Sonication stage was omitted and a vortex stage for this was carried out to the Llpid-Solvent-aqueous To emulsify preparation containing various plasmids for transformation of plant cells can be used at high frequency. It was also found that plasmids essentially can be delivered intact in plant protoplasts using the liposomes produced in this way. In particular, it was found that liposome-encapsulated plasmid pBR327 occurs at high frequency in plant cell protoplasts can be transferred where it is unexpectedly stably obtained and reproduced. It was also found that pBR327 is stably maintained and reproduced in plant cells.

Bei dem Verfahren wird ein geeignetes Gemisch aus Lipiden zur Herstellung der Liposome verwendet. Solche Lipide können beispielsweise Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylcholin (PC), Dipalmitidy1-phosphatidylcholin, Cholesterin (CH), Stearylamin (SA) und Dicetylphosphat (DCP) umfassen. a-Tocopheral kann ebenfalls zu dem Geraisch zugegeben werden.In the method, a suitable mixture of lipids is used to prepare the liposomes. Such lipids for example phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC), dipalmitidy1-phosphatidylcholine, Include cholesterol (CH), stearylamine (SA) and dicetyl phosphate (DCP). a-Tocopheral can also be added to the Geraisch be admitted.

Die Verhältnisse der verschiedenen Lipide können variieren, aber im allgemeinen wird der Bereich innerhalb der folgenden Molverhältnisse liegen:The proportions of the various lipids can vary, but in general the range will be within the following molar ratios are:

0-10 PS : 0-9 PC : 0-5 CH : 0-1 SA : 0-1 DCP0-10 PS: 0-9 PC: 0-5 CH: 0-1 SA: 0-1 DCP

Obgleich es möglich ist, Liposome nur aus PS oder nur aus PC zu bilden, werden im allgemeinen Gemische aus Lipiden verwendet.Although it is possible to form liposomes from PS only or PC only, mixtures will generally be made Lipids used.

Im allgemeinen kann das Verhältnis der verschiedenen Lipide für die Bildung der Liposome, die entweder eine positive, eine neutrale oder eine negative NettoladungIn general, the ratio of the various lipids used to form the liposomes that either have one positive, a neutral or a negative net charge

besitzen, variiert werden. Beispielsweise ergibt 1 PS : 4 PC : 5 CH Liposome mit negativer Nettoladung; 1 PC : 1 CH Liposome mit neutraler Nettoladung; und 1 SA : 4 PC : 5 CH Liposome mit positiver Nettoladung. Liposome mit negativer Nettoladung sind bevorzugt.own, be varied. For example, 1 PS gives: 4 PC: 5 CH liposomes with net negative charge; 1 PC: 1 CH liposomes with neutral net charge; and 1 Saturday: 4 PC: 5 CH liposomes with net positive charge. Liposomes with a net negative charge are preferred.

Wenn die verschiedenen Lipide in einem Lösungsmittel, z.B. Chloroform, geliefert oder zugeführt werden, werden die Lipide in dem Lösungsmittel in dem gewünschten Verhältnis in einem Behälter vermischt, das Lösungsmittel wird verdampft und die Lipide verbleiben im Behälter. Ein organisches Lösungsmittel, wie Diethylether oder Diisopropylether, oder ein Gemisch organischer Lösungsmittel, z.B. Diisopropylether und Chloroform oder niedrigsiedenden Fluorkohlenwasserstoffen, wird zu dem Lipidgemisch gegeben. Bevorzugt wird Diethylether eingesetzt.When the various lipids are supplied in a solvent such as chloroform the lipids mixed in the solvent in the desired ratio in a container, the solvent is evaporated and the lipids remain in the container. An organic solvent, such as diethyl ether or diisopropyl ether, or a mixture of organic solvents, e.g. diisopropyl ether and chloroform or low boiling points Fluorocarbons, is added to the lipid mixture. Diethyl ether is preferably used.

Eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt der in den Liposomen einzukapselnden Substanz wird hergestellt. Im allgemeinen wird die wäßrige Lösung die einzukapselnde Substanz, z.B. ein Makromolekül, wie DNA, RNA, Protein, Polysaccharid, Glykoprotein oder dergl., oder ein Plasmid in einem geeigneten Puffer enthalten. Wenn beispielsweise DNA eingekapselt werden soll, wird 10 millimolares (mM) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) und 0,1 bis 1,0 mM EDTA bei pH 8,0 oder 0,4 molar (M) Mannitpuffer bei dem gleichen pH-Wert verwendet. Die wäßrige Lösung wird zu dem Lipid-Lösungsmittel-Gemisch unter Bildung einer Lipid-LÖsungsmittel-wäßrigen Präparation zugesetzt.An aqueous solution containing that in the liposomes substance to be encapsulated is produced. In general, the aqueous solution is the substance to be encapsulated, e.g. a macromolecule such as DNA, RNA, protein, polysaccharide, glycoprotein or the like, or a plasmid contained in a suitable buffer. For example, if DNA is to be encapsulated, it becomes 10 millimolar (mM) tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) and 0.1 bis 1.0 mM EDTA at pH 8.0 or 0.4 molar (M) mannitol buffer used at the same pH. The aqueous solution becomes the lipid-solvent mixture with formation added to a lipid-solvent-aqueous preparation.

Die Lipid-Lösungsmittel-wäßrige Präparation wird dann heftig bewegt bzw. gerührt, und zwar mittels Maßnahmen, die im wesentlichen die Integrität der einzuarbeitenden Substanz nicht stören, d.h. die Substanz nicht zerstören und abbauen. Solche Mittel bzw. Verfahren umfassen imThe lipid-solvent-aqueous preparation is then violently agitated or agitated, by means of measures that essentially the integrity of the incorporated Do not disturb the substance, i.e. do not destroy and degrade the substance. Such means and methods include im

allgemeinen eine schnelle, simultane Rotation und ein Schütteln der Präparation während einer Zeit, die ausreicht, daß eine wesentliche Emulgierung des Lipids, des Lösungsmittels und der wäßrigen Phasen der Präparation stattfindet. Ein heftiges, schnelles Schütteln allein und eine schnelle, heftige Rotation allein können für diesen Zweck ebenfalls geeignet sein. Eine Vorrichtung, die für die erforderliche heftige Bewegung (starkes Rühren) erforderlich ist, ist ein Vortexmischer. Die Behandlung in dem Vortexmischer während einer Zeit im Bereich zwischen ungefähr 30 Sekunden bis 10 Minuten ergibt eine ausreichende Emulgierung der Lipid/Lösungsmittel/wäßrige Präparation. Die Behandlung in einem Vortexmischer während 3 min wird routinemäßig verwendet.in general, rapid, simultaneous rotation and shaking of the preparation for a time sufficient that a substantial emulsification of the lipid, the solvent and the aqueous phases of the preparation takes place. A violent, rapid shake alone and a rapid, violent rotation alone can also be suitable for this purpose. A device that is used for the required violent movement (strong Stirring) is a vortex mixer. the Vortex treatment for a time ranging between about 30 seconds to 10 minutes adequate emulsification of the lipid / solvent / aqueous preparation. The treatment in one Vortex mixer for 3 minutes is used routinely.

Die Beschallung ist nicht geeignet, da sie einen Abbau der Struktur vieler Makromoleküle, insbesondere von PoIynucleotiden, wie DNA und RNA, und Polypeptiden, wie Protein, verursacht.Sonication is not suitable because it leads to a breakdown of the structure of many macromolecules, especially polynucleotides, such as DNA and RNA, and polypeptides such as protein.

Nach der geeigneten Bewegung zur Emulgierung der Präparation wird das Lösungsmittel aus der Präparation, bevorzugt bei physiologischen Temperaturen, die 37⁰C nicht überschreiten, entfernt. Obgleich 37°C bevorzugt sind, da bei dieser Temperatur kein wesentlicher Abbau der meisten biologischen Moleküle, wie DNA, RNA, Polysaccharide und Polypeptide, auftritt, kann die Temperatur in Abhängigkeit von der Resistenz der einzuarbeitenden Moleküle gegenüber Wärme erhöht werden oder sie kann in Abhängigkeit von der Viskosität des Lipidgemisches, dem Phasenübergangsoptimum für die verwendeten Lipide und der optimalen Temperatur für die Liposomaufnähme der Zellen erniedrigt werden. Optimal wird das Lösungsmittel bei negativem Druck, bevorzugt etwa 30,48 cm (-12 inches) Quecksilber (Hg) (304 mmHg) unter einem Inertgascarrier, wie Stickstoff, entfernt.After the suitable movement for emulsifying the preparation, the solvent is removed from the preparation, preferably at physiological temperatures which do not exceed ^{37 ° C.} Although 37 ° C is preferred, since at this temperature no substantial degradation of most biological molecules such as DNA, RNA, polysaccharides and polypeptides occurs, the temperature can be increased depending on the resistance of the molecules to be incorporated to heat or it can depending on be lowered by the viscosity of the lipid mixture, the phase transition optimum for the lipids used and the optimum temperature for the liposome uptake of the cells. Optimally, the solvent is removed at negative pressure, preferably about 30.48 cm (-12 inches) of mercury (Hg) (304 mmHg) under an inert gas carrier such as nitrogen.

Wie oben erläutert, können die Liposome direkt zur Transformation osmotisch fragiler Zellen, wie Pflanzenprotoplasten, verwendet werden oder die Liposome können einer Reinigungsstufe unterzogen werden. Im allgemeinen kann die Reinigung durch analytisches Zentrifugieren, chromatographische oder Dialyse-Verfahren erfolgen. Die Liposome können durch elektrophoretische Mittel nach ihrer Ladung ausgewählt werden. Die Reinigung kann z.B. erfolgen, indem man die Liposompräparation als Schicht auslegt oder mit linearer Saccharose oder einem Saccharose-Osmotikum-Gradienten in ein Zentrifugenrohr gibt und die Liposompräpration bei geeigneter Geschwindigkeit und geeigneter Dauer in einer Zentrifuge spinnt, um eine Selektion der gewünschten Liposomfraktion zu< erhalten.As explained above, the liposomes can be used directly to transform osmotically fragile cells, such as plant protoplasts, can be used or the liposomes can be subjected to a purification step. In general purification can be carried out by analytical centrifugation, chromatographic or dialysis methods. the Liposomes can be postulated by electrophoretic means their cargo can be selected. The cleaning can be done, for example, by applying the liposome preparation as a layer or with linear sucrose or a sucrose-osmotic gradient in a centrifuge tube and the liposome preparation at a suitable speed spinning in a centrifuge for a suitable time to allow selection of the desired liposome fraction obtain.

Ein mit beachtlichem Erfolg verwendetes Verfahren wurde zur Resuspension der Liposome in Saccharoselösung bei einer Konzentration zwischen etwa 0,4 und etwa 0,8 M am Boden eines Zentrifugenrohrs verwendet. Eine Schicht aus Saccharose in einer Konzentration im Bereich zwischen etwa 0,2 und etwa 0,4 M und Osmotikum, bevorzugt Mannit, in einer Konzentration im Bereich zwischen etwa 0,1 und 0,4 M wird über die resuspendierten Liposome gegeben. Bevorzugt enthält die Saccharose-Osmotikum-Lösung 0,3 M Saccharose und 0,1 M Mannit. Das Rohr wird bei etwa der 100 OOOfachen Schwere (x g) während ungefähr 40 Minuten zentrifugiert, wobei gegen Ende dieser Zeit die Liposome an die Oberfläche des Rohrs flotieren und gesammelt werden. One method used with considerable success has been to resuspend the liposomes in sucrose solution at a concentration between about 0.4 and about 0.8 M at the bottom of a centrifuge tube. One layer off Sucrose in a concentration in the range between about 0.2 and about 0.4 M and osmotic, preferably mannitol, at a concentration in the range between about 0.1 and 0.4 M is given over the resuspended liposomes. The sucrose osmotic solution preferably contains 0.3 M sucrose and 0.1 M mannitol. The pipe will be at about the 100,000 times the weight (x g) for about 40 minutes centrifuged, at the end of which time the liposomes float to the surface of the tube and are collected.

Andere Verfahren zur Identifizierung von Liposomen mit besonderen Eigenschaften und andere Isolationsverfahren für die identifizierten Liposome können verwendet werden. Beispielsweise können die Exklusionschromatographie an großporigen Gelen und die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Agaroseperlen, die gut bekannte Ver-Other methods of identifying liposomes with unique properties and other isolation methods for the identified liposomes can be used. For example, exclusion chromatography on large-pore gels and thin-layer chromatography using agarose beads, the well-known method

fahren zur Bestimmung der Teilchengrößenverteilung von Liposompräprationen sind, verwendet werden; van Renswoude et al. (1980), Biochem.Biophys.Acta., 595. 150-156.drives for determining the particle size distribution of liposome preparations are used; van Renswoude et al. (1980) Biochem. Biophys. Acta., 595 . 150-156.

Die Liposompräparation wird dann, gereinigt oder ungereinigt, in Kontakt mit den zu transformierenden Zellen gebracht. Im allgemeinen kann man irgendwelche osmotisch fragilen Zellen oder Zellen, die für die Transformation zubereitet wurden, bei dieser Stufe verwenden, aber in der Praxis wird die zu transformierende Zelle entsprechend dem besonderen Zweck und dem Komplex von Eigenschaften ausgewählt. Beispielsweise kann man Tierzellen auswählen. Zur Bildung von Sphäroplasten können enzymatisch oder antibiotisch modifizierte Hefezellen behandelt werden, wenn beispielsweise die transformierten Zellen in einem Fermentations-, Brau- oder Klonierungsverfahren verwendet werden sollen. Bakterienprotoplasten oder Bakterienzellen, die mit Calciumchloridlösungen oder mittels anderer Verfahren vorbehandelt wurden, durch die die Bakterienzellen befähigt werden, eine Transformation zu erleiden, können für eine Vielzahl von Zwecken, z. B. für die Aminosäureproduktion, die Hormonproduktion, die Klonierung und dergl., verwendet werden.The liposome preparation is then, cleaned or unpurified, brought into contact with the cells to be transformed. Generally one can do any osmotic use fragile cells or cells prepared for transformation at this stage, but in In practice, the cell to be transformed is determined according to the particular purpose and the complex of properties selected. For example, one can choose animal cells. For the formation of spheroplasts can enzymatically or antibiotic modified yeast cells are treated if, for example, the transformed cells in a fermentation, brewing or cloning process should be used. Bacterial protoplasts or bacterial cells that are produced with calcium chloride solutions or by means of other methods have been pretreated by which the bacterial cells are enabled to undergo transformation to suffer can be used for a variety of purposes, e.g. B. for amino acid production, hormone production, the Cloning and the like.

Pflanzenzellenprotoplasten, die nach einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt wurden, wurden wiederholt transformiert, wobei Liposome, die exogene DNA enthalten und auf die oben beschriebene Weise hergestellt wurden, verwendet wurden. Die Bedingungen für die Transformation von Pflanzenzellenprotoplasten variieren, aber im allgemeinen werden die Pflanzenzellenprotoplasten in einem geeigneten Puffer gehalten, der so ausgebildet ist, daß das osmotische Gleichgewicht der Pflanzenzellenprotoplasten erhaltenbleibt. Solche Puffer sind auf dem Gebiet der Pflanzenzellkultüren gutPlant cell protoplasts produced by a variety of methods familiar to those skilled in the art were transformed repeatedly, using liposomes containing exogenous DNA and based on the above-described Manner made were used. The conditions for the transformation of plant cell protoplasts vary, but generally the plant cell protoplasts are kept in a suitable buffer, which is designed in such a way that the osmotic equilibrium of the plant cell protoplasts is maintained. Such Buffers are good in the field of plant cell culture

bekannt. Ein Beispiel eines solchen Puffers ist 5 mM Tris einschließlich eines Osmotikums, z.B.Mannit, im Bereich von 0,4 bis 0,8 M und Calciumchlorid in einem Bereich von mehr als etwa 1 bis etwa 50 mM bei einem pH im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 8,0. Für die Transformation ist ein pH von etwa 6,5 bevorzugt.known. An example of such a buffer is 5 mM Tris including an osmotic, e.g. Mannit, im Range from 0.4 to 0.8 M and calcium chloride in a range from greater than about 1 to about 50 mM at pH ranging from about 5.0 to about 8.0. A pH of about 6.5 is preferred for the transformation.

Die Transformation unter Verwendung von Liposomen wird durch Zugabe zu der Pufferprobe und den Pflanzenzellenprotoplasten von PEG mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 1000 bis etwa 20 000 d und einer Konzentration im Bereich von etwa 10 bis etwa 40% (Vol/Vol), bezogen auf die gesamte Probe, erleichtert. PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 6000 d ist besonders geeignet und PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 d in einer Konzentration von etwa 20% (Vol/Vol), bezogen auf die gesamte Probe, ist optimal. Unter Verwendung des oben beschriebenen Liposom-Transformationssystems ist es möglich, in die Pflanzenprotoplasten eine Vielzahl von Plasmiden prokaryotischen, eukaryotischen oder gemischten prokaryotischen und eukaryotischen Ursprungs abzugeben. Plasmide, die in die Pflanzenprotoplasten unter Verwendung der oben erläuterten Verfahren abgegeben worden sind, sind YeP-13LT5, Escherichia coli pBR322 und pBR327 und Teile von SV40 Genom, Jedoch werden nicht all diese Plasmide stabil gehalten bzw. bleiben stabil. Überraschenderweise wurde gefunden, daß pBR327 in der Pflanzenzelle stabil verbleibt und stabil darin reproduziert wird.Transformation using liposomes is accomplished by adding to the buffer sample and the plant cell protoplasts of PEG having a molecular weight in the range of about 1,000 to about 20,000 d and a concentration in the range from about 10 to about 40% (vol / vol), based on the entire sample, relieved. Is PEG having a molecular weight of about 1000 to about 6000 d particularly suitable and PEG with a molecular weight of about 4000 d in a concentration of about 20% (Vol / Vol), based on the entire sample, is optimal. Using the liposome transformation system described above it is possible to convert a multitude of plasmids prokaryotic into the plant protoplasts, eukaryotic or mixed prokaryotic and eukaryotic origin. Plasmids that are in the plant protoplasts using those discussed above Methods submitted are YeP-13LT5, Escherichia coli pBR322 and pBR327 and parts of SV40 genome, however, not all of these plasmids are held or remain stable. Surprisingly it was found that pBR327 stably remains in the plant cell and is stably reproduced therein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die chemischen Konzentrationen, die Temperaturen, die Behandlungsdauer, die Zellart und ähnliche Parameter variiert werden kön-The following examples illustrate the invention. It is obvious to the person skilled in the art that the chemical concentrations, the temperatures, the duration of the treatment, the cell type and similar parameters can be varied

^nen· ^nen ·

Be i* spiel 1Example 1

Einfluß der Beschallung oder der mechanischen Vortexbehandlung auf die Ausbeute der DNA-Einkapselung durch negativ geladene Liposome Influence of sonication or mechanical vortex treatment on the yield of DNA encapsulation by negatively charged liposomes

Ein Lipldgemisch mit einem Gehalt an 1 /uM Fhosphatidylserin, 4/um Phosphatidylcholin und 5/um Cholesterin wird in 0,5 ml Ether unter Bildung eines Lipid-Lösungsmittelgemisches gelöst. Eine gepufferte, wäßrige Lösung, die 32 Phosphat( p)-markierte DNA enthält, wird aus dem Plasmid BAMH/29, eingesetzt in pBR322, in einer Konzentration von 10/Ug/ml in 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat und 0,1 mM EDTA bei pH 6,5 hergestellt. 0,15 ml dieser Lösung werden zu dem Lipid-Lösungsmittelgemisch unter Bildung einer Lipid-Lösungsmittel-wäßrigen Präparation gegeben. Die Lipid-Lösungsmittel-wäßrige Präparation wird durch Beschallung während einer Zeit von 5, 20 oder 120 see in einem Bad-Typ Sonikator (Beschallungsgerät) oder durch mechanische Behandlung in einem Vortexmischer während 30, 120 oder 600 see emulgiert.A lipid mixture with a content of 1 / uM phosphatidylserine, 4 / um phosphatidylcholine and 5 / um cholesterol in 0.5 ml of ether to form a lipid-solvent mixture solved. A buffered, aqueous solution containing 32 phosphate (p) -labeled DNA is made from the Plasmid BAMH / 29, used in pBR322, at a concentration of 10 / Ug / ml in 10 mM potassium chloride, 10 mM potassium phosphate and 0.1 mM EDTA at pH 6.5. 0.15 ml of this solution is added to the lipid-solvent mixture given to form a lipid-solvent-aqueous preparation. The lipid-solvent-aqueous preparation is controlled by sonication for a period of 5, 20 or 120 seconds in a bath-type sonicator (sonication device) or emulsified by mechanical treatment in a vortex mixer for 30, 120 or 600 seconds.

Nach der Emulgierung werden die Liposome durch Entfernung des Ethers unter Partialvakuum von etwa 304 mmHg (-12 inches Hg) in einer inerten Stickstoffatmosphäre gebildet. Die erhaltenen Liposome werden durch Zentrifugieren wie folgt gereinigt: etwa 0,15 ml der Liposome werden mit etwa 0,85 ml 0,4 M Saccharose vermischt.After emulsification, the liposomes are removed by removing the ether under a partial vacuum of about 304 mmHg (-12 inches Hg) in an inert nitrogen atmosphere. The resulting liposomes are purified by centrifugation as follows: about 0.15 ml of the liposomes are mixed with about 0.85 ml of 0.4 M sucrose.

2,85 ml einer Saccharose-Osmotikum-Lösung aus 0,3 M Saccharose und 0,1 M Mannit werden über die 0,4 M Saccharose-Liposomschicht geschichtet und das Rohr etwa 40 min bei etwa 100000 χ g gesponnen bzw. zentrifugiert. Die gereinigten Liposome flotieren zur Oberfläche des Rohrs, wo sie gesammelt werden.2.85 ml of a sucrose-osmotic solution of 0.3 M sucrose and 0.1 M mannitol are over the 0.4 M sucrose-liposome layer layered and the tube spun or centrifuged for about 40 min at about 100,000 χ g. The cleaned ones Liposomes float to the surface of the tube where they are collected.

Der Prozentgehalt an DNA-Einkapselung wird durch MessungThe percentage of DNA encapsulation is determined by measurement

•zn• zn

der p-markierten DNA in einem Flüssigkeits-Szintilla-the p-labeled DNA in a liquid scintilla

32 tionszähler, der so eingestellt ist, daß er ^ ρ abliest,32 tion counter set to read ^ ρ,

bestimmt. Die Einkapselungsausbeute der verschiedenen Behandlungen 1st in Tabelle I angegeben. Die Einkapselungsausbeuten unter Verwendung des Vortexmischers betragen etwa 65% derjenigen, die man durch Beschallung während der gleichen Zeit (120 see) erreicht. Eine Erhöhung der Behandlung im Vortexmischer auf 600 see ergibt eine DNA-Einkapselungsgeschwindigkeit bzw. -rate, die gleich etwa 71% der maximalen Rate ist, die man bei Verwendung der Beschallung beobachtet.certainly. The encapsulation yield of the various Treatments are given in Table I. The encapsulation yields using the vortex mixer are about 65% of those reached by sonication during the same time (120 seconds). An increase the treatment in the vortex mixer at 600 seconds results in a DNA encapsulation speed or rate, which is equal to about 71% of the maximum rate that one can get observed when using the sonication.

Table I.

Behandlungszeit % Einkapselung der Behandlungszeit im Vortexmischer, 32p-markierten DNA bei der Beschal-(sec) lung (sec) Treatment time% encapsulation of the treatment time in the vortex mixer, 32p-labeled DNA when scalding (sec) lung (sec)

30 19 31 530 19 31 5

120 24 38 20120 24 38 20

600 27 37 120600 27 37 120

Example 2

Einfluß der Vortexbehandlung oder der Beschallung auf die Integrität der in Liposom eingekapselten DNA Liposome werden gemäß Beispiel 1 hergestellt. Nachdem die Liposome gebildet worden sind, werden aliquote Teile von jeweils etwa 30/Ul der gereinigten Liposompräpatation in 0,25 ml Micofuge-Rohre gegeben. 0,1 ml Phenol wird zugesetzt und dann wird gut mit dem Liposom-Aliquot vermischt und anschließend 30 see zentrifugiert. 20/ul der nach der Phenolextraktion verbleibenden, wäßrigen Suspension werden für die Gelelektrophorese an einem 1,4%igen Agarosegel in 10 mM Tris, 1 mM EDTA-Puffer bei pH 8 entfernt. Die Proben werden etwa 2,5 h bei 150 V laufengelassen. Die Probenfront wird mit einem blauen Tracerfarbstoff in 50% Glycerin bestimmt, der in jede Probenvertiefung des Gels gegeben wird. DNA-Fraktionen werden durch Behandlung mit Ethidiumbromid unter Ultraviolett(UV)-Licht visualisiert. Nichtbehandelte DNA undInfluence of the vortex treatment or the sonication on the integrity of the liposome-encapsulated DNA. Liposomes are produced according to Example 1. After the liposomes have been formed, about 30 / ul aliquots of the purified liposome preparation are placed in 0.25 ml micofuge tubes. 0.1 ml of phenol is added and then mixed well with the liposome aliquot and then centrifuged for 30 seconds. 20 μl of the aqueous suspension remaining after phenol extraction are removed for gel electrophoresis on a 1.4% agarose gel in 10 mM Tris, 1 mM EDTA buffer at pH 8. The samples are run at 150 volts for approximately 2.5 hours. The front of the sample is determined with a blue tracer dye in 50% glycerol, which is added to each sample well of the gel. DNA fractions are visualized by treatment with ethidium bromide under ultraviolet (UV) light. Untreated DNA and

DNA-Größenstandards werden gleichzeitig auf dem Gel laufengelassen. Man beobachtet keine bemerkenswerten Unterschiede zwischen den der Vortexbehandlung unterworfenen Proben und unbehandelter Plasmid-DNA. Ein extensives Brechen der DNA aller beschallter Proben in Fragmente mit unterschiedlichen Längen wurde durch lange DNA-Schlieren ohne erkennbare Migrationspeaks nachgewiesen.DNA size standards are run simultaneously on the gel. No notable differences are observed between those subjected to the vortex treatment Samples and untreated plasmid DNA. Extensive breaking of the DNA of all sonicated samples into fragments using different lengths were detected by long streaks of DNA without recognizable migration peaks.

Example 3

Die durch Liposome vermittelte Abgabe von Plasmid pBR327 an Maisprotoplasten Liposome-mediated delivery of plasmid pBR327 to maize protoplasts

Maisprotoplasten werden wie folgt hergestellt. Suspendierte Maiszellen werden in 0,2 M Mannit, 0,08 M CaCl₂, 6% (Gew/Vol) Cellulysin (CaI Biochem), 2,5% Pectinase (Sigma) und 1,25% Driselase (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) 4 bis 6 h bei 16°C in Kolben auf einem Rotationsinkubator bei 70 U/min inkubiert. Die Maisprotoplasten werden durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit 2 min in einer Klinikzentrifuge gesammelt. Die Maispro top las ten werden zweimal mit 0,4 M Mannit, 10 mM KCl und 1OmM 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES)-Tris bei pH 6,5 gewaschen und erneut mit 1 χ 10 Protoplasten/ml in 0,4 M Mannitpuffer suspendiert. Corn protoplasts are made as follows. Suspended corn cells are dissolved in 0.2 M mannitol, 0.08 M CaCl ₂ , 6% (w / v) cellulysin (CaI Biochem), 2.5% pectinase (Sigma) and 1.25% Driselase (Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd., Tokyo, Japan) incubated for 4 to 6 hours at 16 ° C in flasks on a rotary incubator at 70 rpm. The corn protoplasts are collected by centrifugation at low speed for 2 minutes in a clinical centrifuge. The maize protoplasts are washed twice with 0.4 M mannitol, 10 mM KCl and 10 mM 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) tris at pH 6.5 and again with 1 × 10 protoplasts / ml in 0 , 4 M mannitol buffer suspended.

Die Liposome werden wie folgt gebildet. 0,81 mg PS, 3,1 mg PC, 1,9 mg CH und 25/Ug oc-Tocophenol werden in Chloroform vermischt und das Chloroform wird durch Verdampfen im Vakuum entfernt. 0,5 ml Ether werden zu den Lipiden bis zu einem Endvolumen von etwa 0,5 ml zugegeben, DNA aus Plasmid pBR327, entweder markiert mit ρ durch Nick-Translation oder unmarkiert, wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem Gehalt an 10 mM Tris, 1 mM EDTA bei pH 8,0 suspendiert. 25 All der DNA enthaltenden, wäßrigen Puffer-The liposomes are formed as follows. 0.81 mg PS, 3.1 mg PC, 1.9 mg CH and 25 / Ug oc-tocophenol are mixed in chloroform and the chloroform is removed by evaporation in vacuo. 0.5 ml of ether are added to the lipids up to a final volume of about 0.5 ml, DNA from plasmid pBR327, either marked with ρ by nick translation or unmarked, is in a concentration of 1 mg / ml in an aqueous buffer solution suspended with a content of 10 mM Tris, 1 mM EDTA at pH 8.0. 25 All of the DNA-containing, aqueous buffer

lösung werden zu dem Lipid-Ethergemisch gegeben. Wasser und Sorbit werden zu diesem Gemisch bis zu einer End-Sorbitkonzentration von 0,4 M mit einem End-Wasservolumen von 0,15 ml zugegeben, wobei man eine Lipid-Lösungsmittel-wäßrige Präparation erhält. Die Lipid-Lösungsmittel-wäßrige Präparation wird ungefähr 3 min der Vortexbehandlung unterworfen. Nach der Vortexbehandlung wird der Ether in einem Rotationsverdampfer bei etwa -12» (304,8 mmHg) unter Stickstoffatmosphäre bei 37⁰C verdampft. Die Liposome bilden sich während der Ether-Verdampfungsstufe. 0,15 ml rohe Liposome werden durch Suspension in 0,85 ml 0,4M Saccharose in einem Zentrifugenrohr bei einem Endvolumen von 1 ml gereinigt. Das Liposom-Saccharose-Gemisch wird mit 2,85 ml 0,3 M Saccharose und 0,1 M Mannit überschichtet. Das Rohr wird 40 min bei 20°C und etwa 100 000 χ g gesponnen bzw. zentrifugiert. Die Liposome fIotieren an die Oberfläche und ergeben eine gereinigte Liposompräparation, die für die Inkubation mit den Maisprotoplasten entfernt wird.solution are added to the lipid-ether mixture. Water and sorbitol are added to this mixture to a final sorbitol concentration of 0.4 M with a final water volume of 0.15 ml, a lipid-solvent-aqueous preparation being obtained. The lipid-solvent-aqueous preparation is vortexed for about 3 minutes. After vortexing, the ether is evaporated in a rotary evaporator at about -12 "(304.8 mmHg) under a nitrogen atmosphere at 37 ⁰ C. The liposomes form during the ether evaporation stage. 0.15 ml of crude liposomes are purified by suspension in 0.85 ml of 0.4M sucrose in a centrifuge tube at a final volume of 1 ml. The liposome-sucrose mixture is covered with a layer of 2.85 ml of 0.3 M sucrose and 0.1 M mannitol. The tube is spun or centrifuged for 40 min at 20 ° C. and about 100,000 g. The liposomes float to the surface, yielding a purified liposome preparation that is removed for incubation with the corn protoplasts.

Etwa 1 ml der Maisprotoplasten in 0,4 M Mannitpuffer mit einem Gehalt von 1 χ 10 Maisprotoplasten/ml wird mit 0,1 ml gereinigter Liposompräparation, welche etwa 0,97 mg/ml Lipid enthält, Inkubiert. PEG 4000 wird zu diesem Gemisch bis zu einer Endkonzentration von etwa 20% zugegeben. Das Liposom-Protoplast-PEG-Gemisch wird etwa 15 min bei 25⁰C inkubiert.About 1 ml of the maize protoplasts in 0.4 M mannitol buffer with a content of 1 × 10 maize protoplasts / ml is incubated with 0.1 ml of purified liposome preparation which contains about 0.97 mg / ml lipid. PEG 4000 is added to this mixture to a final concentration of about 20%. The liposome-protoplast-PEG mixture is incubated ^{at 25 ° C. for about 15 min.}

Das Liposom-Protoplast-PEG-Gemisch wird langsam stufenweise mit 0,4 M Mannitpuffer bis zu einem Endvolumen von etwa 10 ml verdünnt. Die verdünnte Präparation wird 2 min bei etwa 100 χ g mit einer klinischen Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Maisprotoplasben werden erneut in 8 ml 0,4 M Mannitpuffer suspendiert, erneut wieThe liposome-protoplast-PEG mixture is slowly added in increments of 0.4 M mannitol buffer to a final volume diluted by about 10 ml. The diluted preparation is 2 min at about 100 χ g with a clinical centrifuge centrifuged at low speed. The supernatant is removed and the corn protoplasms are reassembled suspended in 8 ml of 0.4 M mannitol buffer, again as

oben zentrifugiert und erneut in Wachstumsmedien suspendiert. 1 1 Wachstumsmedium enthält die folgenden Bestandteile: 170 mg monobasisches Kaliumphosphat, 1600 mg Ammoniumnitrat, 1900 mg Kaliumnitrat, 440 mg Calciumchloriddihydrat, 370 mg Magnesiumsulfat.7-hydrat, 16,9 mg Mangansulfat-monohydrat, 10,3 mg Zinksulfat-monohydrat, 6,2 mg Borsäure, 3_fS3 mg Kaliumiodid, 0,25 mg Natriummolybdat, 0,025 mg Kupfer(II)-sulfat, 0,025 mg Kobaltchlorid, 5 mg Nicotinsäure, 10 mg Thiaminhydroclilo rid, 10 mg Pyridoxinhydrochlorid, 100 mg i-Inosit, 2,0 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 20 g Saccharose, 250 mg Glucose, 64 g Mannit und 0,1% Agar. Der pH des Mediums wird auf 5_f0 eingestellt. Konditioniertes Medium enthält das oben beschriebene Medium, in dem die Maisprotoplasten zuerst während 2 bis 4 Tagen gezüchtet und dann entfernt werden. Es wird zu dem Wachstumsmedium bis zu einer Endkonzentration von etwa 20% zugegeben. Die Maisprotoplasten werden in Platten, welche das oben beschriebene Medium enthalten, bei 28 bis 30⁰C in der Dunkelheit während einer Zeit, die ausreicht, ein ausreichendes Wachstum zu ergeben, gezüchtet.centrifuged above and resuspended in growth media. 1 1 growth medium contains the following components: 170 mg monobasic potassium phosphate, 1600 mg ammonium nitrate, 1900 mg potassium nitrate, 440 mg calcium chloride dihydrate, 370 mg magnesium sulfate 7-hydrate, 16.9 mg manganese sulfate monohydrate, 10.3 mg zinc sulfate monohydrate, 6 , 2 mg boric acid, 3 _f S3 mg potassium iodide, 0.25 mg sodium molybdate, 0.025 mg copper (II) sulfate, 0.025 mg cobalt chloride, 5 mg nicotinic acid, 10 mg thiamine hydrochloride, 10 mg pyridoxine hydrochloride, 100 mg i-inositol, 2 , 0 mg 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 20 g sucrose, 250 mg glucose, 64 g mannitol and 0.1% agar. The pH of the medium is _{adjusted to 5 f} 0. Conditioned medium contains the medium described above in which the maize protoplasts are first grown for 2 to 4 days and then removed. It is added to the growth medium to a final concentration of about 20%. The maize protoplasts are grown in plates containing the medium described above, at 28 to 30 ⁰ C in the dark for a time sufficient to result in sufficient growth.

Plasmid-DNA wird aus den Zellen bei unterschiedlichen Zeiten während eines Wachstums von 26 Tagen isoliert.Plasmid DNA is obtained from cells at different levels Times isolated during a 26 day growth.

Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und dasThe cells are collected by centrifugation and the

4 überstehende Wachstumsmediem wird verworfen. 10 bis 10^ Zellen werden etwa 4 h bei Raumtemperatur in 0,2 ml Extraktionspuffer bei pH 8,0 resuspendiert, der 1% Sarkosyl, 20 mM EDTA, 50 mM NaCl, 250 mM Saccharose, 50 mM Tris enthält. Der Extraktionspuffer wird zweimal mit 0,5 ml Phenol, gesättigt mit 50 mM Tris, 50 mM Natriumchlorid, 2 ml EDTA und 1 raM ß-Mercaptoethanol, bei pH 7,5 gewaschen. DNA wird mit Ethanol präzipitiert und über Nacht bei -20°C gelagert. Die DNA-Pellets werden gewaschen und in 95%igem Ethanol resuspendiert, an der4 supernatant growth media is discarded. 10 to 10 ^ Cells are resuspended for about 4 h at room temperature in 0.2 ml extraction buffer at pH 8.0, which contains 1% Sarkosyl, Contains 20 mM EDTA, 50 mM NaCl, 250 mM sucrose, 50 mM Tris. The extraction buffer is used twice 0.5 ml phenol, saturated with 50 mM Tris, 50 mM sodium chloride, 2 ml EDTA and 1 raM ß-mercaptoethanol, at pH 7.5 washed. DNA is precipitated with ethanol and stored at -20 ° C. overnight. The DNA pellets are washed and resuspended in 95% ethanol on the

Luft getrocknet und schließlich erneut in 0,1 Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer gelöst.Air dried and finally redissolved in 0.1 sodium chloride-sodium citrate buffer.

Aliquote Teile dieser gereinigten DNA-Präparation werden zur Transformierung von Ξ. coli unter Verwendung dem Fachmann geläufiger Verfahren eingesetzt. Nach dieser Transformation und dem anschließenden Wachstum der transformierten E.coli-Zellen werden die Plasmide aus den gezüchteten E.coli-Zellen reisoliert. Das reisolierte Plasmid DNA wird mit Restriktionsenzymen digeriert und längs der zuvor aus den Pflanzenzellen isolierten Plasmid-DNA für Vergleichszwecke der Elektrophorese unterworfen. Aliquots of this purified DNA preparation are used to transform Ξ. coli using the Techniques familiar to those skilled in the art are used. After this transformation and the subsequent growth of the transformed E. coli cells, the plasmids are reisolated from the cultured E. coli cells. That re-isolated Plasmid DNA is digested with restriction enzymes and electrophoresed along the plasmid DNA previously isolated from the plant cells for comparison.

Die aus den Pflanzenzellen isolierte DNA wird durch Elektrophorese auf 1,496 Agarosegel gespalten bzw. aufgelöst. Die DNA wird auf Nitrocellulose unter Verwendung des Southern blot-Verfahrens als Flecken aufgetragen und gegenüber einer 32P-markierten DNA-Probe von pBR327 hybridisiert. Der entstehende Filter wird auf einem Kodak X-omat Film autoradiographiert. Man stellt zwischen der aus den Pflanzenprotoplasten oder E. coli isolierten pBR 327-DNA und den pBR327-Standards keinen Unterschied fest. Signifikant ist es, daß die pBR327 DNA-Bande an Intensität bei der Erhöhung in der Zeit der Maisprotoplastenkultür zunimmt, was anzeigt, daß sich das pBR327 Plasmid innerhalb der Maiszellkulturen reproduziert. The DNA isolated from the plant cells is cleaved or resolved by electrophoresis on 1.496 agarose gels. The DNA is blotted onto nitrocellulose using the Southern blot method and versus a 32P-labeled DNA sample from pBR327 hybridized. The resulting filter is autoradiographed on Kodak X-omat film. One puts between those isolated from the plant protoplasts or E. coli pBR 327 DNA and the pBR327 standards found no difference. It is significant that the pBR327 DNA band increases in intensity with the increase in the period of maize protoplast culture, indicating that the pBR327 plasmid reproduced within the maize cell cultures.

Claims

KRAUS WEISEfRT & PARTNER 34 ^ 973

PATE NTAN WALTE

AND APPROVED REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR. WALTER KRAUS DIPLOMAL CHEMIST · DR.-INS. DIPL.-ING. ANNEKÄTE WEISERT · DIPL.-PHYS. JOHN SPIES

IRMSAROSTRASSE 15 D-8OOO MUNICH 71 TELEPHONE 089/797077 TELEGRAM KRAUSPATENT TELEX 5-212156 kpat d TELEFAX (O89) 7 9182 33

4445 AW / My

STAUFFER CHEMICAL COMPANY Westport, Connecticut 06881, USA

Liposome-mediated transformation to eukaryotic

Cells

Claims

i~i ~

\ 1.! Method for delivering a substance along the ^ • cell membrane of a cell, characterized in that one

(a) uses or produces a suitable lipid mixture;

(b) the lipid mixture dissolves in a water-miscible solvent;

(c) a lipid-solvent-aqueous preparation by adding to the dissolved lipid-solvent mixture forms an aqueous solution from the substance;

(d) the dissolved lipid-solvent-aqueous

Mixes preparation intimately by means that do not destroy the substance;

(e) removing the solvent to form liposomes; and

(g) treating the cell with the liposomes in a suitable buffer.

2. The method according to claim 1, characterized in that the solvent is a polar, organic solvent which is vaporized under conditions that are not destructive to the substance can.

3. The method according to claim 1, characterized in that that ethyl ether is used as the solvent.

4. The method according to claim 1, characterized in that in the removal ^{step an evaporation takes place at about 37 0} C and -12 "(-304.9% mm) Hg under a suitable gas carrier.

5. The method according to claim 1, characterized in that the stage in which the intimate mixing is carried out, a Includes mixing with the exception of sonication.

6. The method according to claim 5, characterized in that the mixing stage comprises vortex mixing.

7. The method according to claim 1, characterized in that that the suitable lipid mixture is selected from the group of lipids, the PhosphatidyIserin, Phos-

phatidylcholine, dipalmityl-phosphatidylcholine, cholesterol, Contains stearylamine and dicetyl phosphate.

8. The method according to claim 7 »characterized in that the lipids additionally comprise a-tocophoral.

9. The method according to claim 7, characterized in that the molar ratios of the lipids in the range of
0 to 10: 0 to 9: 0 to 5: 0 to 1 for phosphatidylserine, phosphatidylcholine ^ holesterim stearylamine ^ iacetylphosphate.

10. The method according to claim 9 »characterized in that that the molar ratio 1: 4: 5 for phosphatidylserine, Phosphatidylcholine or cholesterol is.

11. The method according to claim 9, characterized in that the molar ratio 1: 1 for phosphatidylcholine
or cholesterol.

12. The method according to claim 9, characterized in that that the molar ratio 1: 4: 5 for stearylamine, phosphatidylcholine or cholesterol.

13. The method according to claim 1, characterized in that the liposomes have a negative net charge.

14. The method according to claim 1, characterized in that that the liposomes have a neutral net charge.

15. The method according to claim 1, characterized in that the liposomes have a positive net charge.

16. The method according to claim 1, characterized in, that the substance to be delivered is a saccharide.

17. The method according to claim 1, characterized in that the substance to be delivered is a peptide.

18. The method according to claim 1, characterized in, that the substance to be delivered is a nucleic acid.

19. The method according to claim 1, characterized in that the substance to be dispensed is a macromolecule.

20. The method according to claim 19, characterized in that that the macromolecule is a polysaccharide.

21. The method according to claim 19, characterized in that that the macromolecule is a polypeptide.

22. The method according to claim 19, characterized in that that the macromolecule is a polynucleic acid.

2Y. Method according to claim 22, characterized in that that the polynucleic acid is RNA.

24. The method according to claim 22, characterized in that the polynucleic acid is DNA.

25. The method according to claim 22, characterized in that the polynucleic acid is a plasmid.

26. The method according to claim 25, characterized in that the plasmid is Yep13 LT5.

27. The method according to claim 25, characterized in that the plasmid is pBR322.

28. The method according to claim 25, characterized in that the plasmid is pBR327.

29. The method according to claim 28, characterized in that the plasmid is copied or multiplied in the cell.

30. The method according to claim 22, characterized in that the nucleic acid is a vector.

31. The method according to claim 22, characterized in that the vector is yEP13LT5.

32. The method according to claim 22, characterized in that the vector is pBR322.

33. The method according to claim 22, characterized in that the vector is pBR327.

34. The method according to claim 33, characterized in that the vector is in the to be transformed
Cell copied or duplicated.

35. The method according to claim 1, characterized in that that the cells to be treated are prokaryotic cells are.

36. The method according to claim 35, characterized in that the cells to be treated are osmotically fragile

or are competent, prokaryotic cells.

37. The method according to claim 1, characterized in that the cells to be treated are osmotically fragile,
are eukaryotic cells.

38. The method according to claim 37, characterized in that the cells to be treated are plant protoplasts are.

39 · The method according to claim 37, characterized in that the cells to be treated are yeast spheroplasts are.

40. The method according to claim 37, characterized in that that the cells to be treated are animal cells.

41. The method according to claim 1, characterized in that that the treatment stage further comprises the following stages:

(i) suspension of the cells to be treated in a suitable buffer;

(ii) adding the liposomes to the suspended cells;

(iii) incubating the suspended cells and liposomes together at a suitable temperature;

(iv) adding polyethylene glycol to the incubated, suspended cells and liposomes;

(v) Incubation of the liposomes and the suspended cells for a time sufficient for a Allow fusion of liposomes and cells.

42. The method according to claim 41, characterized in that that the cells to be treated are prokaryotic cells.

43. The method according to claim 41, characterized in that that the cells to be treated are osmotically fragile or competent prokaryotic cells.

44. The method according to claim 41, characterized in that that the cells to be treated are osmotically fragile, eukaryotic cells.

45. The method according to claim 44, characterized in that the cells to be treated are plant protoplasts are.

46. The method according to claim 44, characterized in that the cells to be treated are yeast spheroplasts are.

47. The method according to claim 44, characterized in that the cells to be treated are animal cells.

48. The method according to claim 41, characterized in that that the incubation step is carried out for about 5 minutes to 60 minutes at about 16 to 28 ° C.

49. The method according to claim 41, characterized in that the incubation stage lasts for about 20 minutes is carried out at about 25 ° C.

50. The method according to claim 41, characterized in that that the polyethylene glycol has a molecular weight in the range of about 1,000 to about 20,000 Daltons and that its concentration is about 10 to about 40%, based on the total solution.

51. The method according to claim 41, characterized in that that the polyethylene glycol has a molecular weight in the range of about 1000 to about 6000 Daltons and that its final concentration is about 20%, based on the total solution.

52. The method according to claim 41, characterized in that that the polyethylene glycol has a molecular weight of about 4,000.

53. The method according to claim 41, characterized in that a suitable buffer calcium chloride in a Concentration in the range from about more than 1 mM to about 50 mM, an osmotic at a concentration in the range from about 0.4 M to about 0.8 molar, Tris.HCl at a concentration of about 5 mM and a pH in the range of about 5 »0 to 8.0.

54. The method according to claim 41, characterized in that the suitable buffer is about 10 mM calcium chloride, contains about 0.4 molar mannitol and about 5 mM Tris.HCl and has a pH of about 6.5.

55. The method according to claim 1, characterized in that that the solvent is a polar, organic solvent, which under conditions where the Substance is not destroyed, can be vaporized.

56. The method according to claim 55, characterized in that the cleaning stage further comprises the following stages includes:

(i) resuspending the liposomes in a volume of sucrose solution;

(ii) layering the sucrose solution with a volume of sucrose osmotic solution; (iü) centrifuging the resuspended liposomes for a time sufficient to remove substances are not contained in the liposomes, to be separated therefrom;

(iv) collecting the liposomes after they float on the surface of the sucrose-osmotic solution; and

(ν) Resuspension of the liposomes in a buffer.

57. The method according to claim 56, characterized in that the sucrose solution in the range of about 0.4 to about 0.8 molar and that the sucrose osmotic solution is sucrose in an amount in the range of about 0.2 up to about 0.4 molar and mannitol in an amount ranging from about 0.1 to about 0.4 molar.

58. The method according to claim 56, characterized in that the sucrose in an amount accordingly 0.4 molar is present and that the sucrose-mannitol solution is 0.3 molar in sucrose and 0.1 molar in mannitol is.

59. The method according to claim 56, characterized in that the sucrose and the sucrose-mannitol solution in a volume-to-volume ratio of about 1: 3 available.

60. The method according to claim 56, characterized in that the purified liposomes about 2 / µmol of liposomal Lipid / 10 of the cells to be treated contain.

61. Process for transforming plant cells, characterized in that one

(a) generate plant cell protoplasts; and

(b) transforming the plant cell protoplasts with DNA.

62. The method according to claim 61, characterized in that that the DNA is a plasmid.

63. The method according to claim 62, characterized in that that the plasmid is pBR327.

ι

64. The method according to claim 61, characterized in that that the DNA is encapsulated in a liposome.

65 · The method according to claim 64, characterized in that the DNA has been encapsulated by the following steps is:

(a) generation of a suitable lipid mixture;

(b) dissolving the lipid mixture in a water-miscible solvent;

(c) Formation of a lipid-solvent-aqueous preparation by adding to the dissolved lipid-solvent mixture the DNA in an aqueous solution;

(d) intimate mixing of the dissolved lipid-solvent-aqueous preparation by means of measures, the DNA do not destroy; and

(e) Removal of the solvent to form the liposomes.

66. The method according to claim 65, characterized in that that the DNA is a plasmid.

67. The method according to claim 66, characterized in that that the plasmid is pBR327.

68. Plant cells, characterized in that they have been transformed according to the method of claim 61 are.

69. Plant cells according to claim 68, characterized in that that the DNA is a plasmid.

70. Plant cells according to claim 69, characterized in that the plasmid is pBR327.

71 · Plant cells according to claim 68, characterized in that that the DNA is encapsulated in a liposome.

72. Plant cells according to claim 71, characterized in that the DNA is encapsulated by the following steps has been:

(a) preparation of a suitable lipid mixture;

(b) dissolving the lipid mixture in a water-miscible solvent;

(d) intimate mixing of the dissolved lipid-solvent-aqueous preparation by means of measures by which the DNA is not destroyed; and

(e) Removal of the solvent to form liposomes.

73 · Plant cells according to claim 72, characterized in that the DNA is a plasmid.

74. Plant cells according to claim 73, characterized in that the plasmid is pBR327.