EP1734928A2 - Serum-stable amphoteric liposomes - Google Patents

Serum-stable amphoteric liposomes

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Publication number
EP1734928A2
EP1734928A2 EP05740433A EP05740433A EP1734928A2 EP 1734928 A2 EP1734928 A2 EP 1734928A2 EP 05740433 A EP05740433 A EP 05740433A EP 05740433 A EP05740433 A EP 05740433A EP 1734928 A2 EP1734928 A2 EP 1734928A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
liposomal
formulation according
chol
molar composition
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05740433A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Gerold Endert
Yvonne Kerwitz
Monika Fellermeier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Marina Biotech Inc
Original Assignee
Novosom AG
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Filing date
Publication date
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Application filed by Novosom AG filed Critical Novosom AG
Publication of EP1734928A2 publication Critical patent/EP1734928A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S977/907—Liposome
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    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]

Definitions

  • the invention relates to amphoteric liposomal formulations which show particular serum stability and are suitable for the intracellular delivery of oligonucleotides.
  • RNA short interfering ribonucleic acids
  • Another approach is to use a carrier that protects the siRNA from attack by enzymes and can transport it to the site of action.
  • Liposomes have been used as pharmaceutical carriers for drugs for some time.
  • Vdrformed liposomes and nucleic acids are also produced for the above-mentioned applications.
  • the complex formation or the mostly not stable in serum Liposomal formulations mean that the stability of the oligonucleotides is not guaranteed over a long period of time.
  • Amphoteric liposomes are a new class of liposomes that offer advantageous properties over conventional liposomes and purely cationic systems for intracellular delivery. Negatively charged active ingredients, such as the Nucleic acids can be effectively packed inside these liposomes, although the total charge of the liposomes remains negative at physiological pH. By changing the ambient pH, as occurs in the endosomal uptake of liposomes in cells, from neutral to slightly acidic, the charge of the amphoteric liposomes also changes from anionic to slightly cationic and the advantages of a cationic transfection reagent are exploited. These liposomes are described for the first time in WO 02/66012 A2. WO 02/66490 and WO 02/66489 (WO 03/070220 and WO 03/070735) present pH-sensitive lipids which are suitable for the construction of amphoteric liposomes.
  • amphoteric liposomes which enclose small oligonucleotides, such as siRNA and / or antisense molecules, in their interior and do not or only release a small part under serum conditions and are therefore suitable for parenteral administration ,
  • the invention solves the problem comprehensively by providing liposomal formulations with an aqueous interior
  • amphoteric lipids with a proportion of 5-30 mol%, or mixtures of cationic and anionic lipids with a total proportion of at most 50 mol%, the formulation as an active ingredient in the aqueous interior comprising at least one oligonucleotide.
  • the oligonucleotides relevant for this embodiment of the invention are composed of 5-100, preferably 5-40 and particularly preferably 10-25 nucleotides or base pairs.
  • the oligonucleotides can be present as a single strand (e.g. antisense oligonucleotides), as a double strand (e.g. small-interfering RNA, decoy-oligonucleotides) or in complex folds (e.g. aptamers, Spiegelmers, ribozymes).
  • oligonucleotides relevant to this invention are made up of deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their chemically modified derivatives, such as phosphorothioate DNA (PS), 2'-O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE) , Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)).
  • PS phosphorothioate DNA
  • OMe 2'-O-methyl RNA
  • MOE 2'-O-methoxy-ethyl RNA
  • PNA Peptide nucleic acid
  • NP N3'-P5 'Phosphor
  • aptamers or Spiegelmers are included in the liposomes.
  • Aptamers are DNA or RNA-based oligonucleotides with a complex three-dimensional structure. Due to this structure, aptamers can bind to protein targets in a very specific and highly affine manner and thus have a therapeutic, usually extracellular, effect. Their functionality is almost identical to that of monoclonal antibodies.
  • Spiegelmers are made up of L-ribose and L-2'-deoxyribose units. Just like aptamers, these mirror-image nucleic acids bind specifically to protein targets. Due to the chiral inversion, Spiegelmers, in contrast to conventional D-oligonucleotides, have increased stability against enzymatic degradation.
  • the basic structure of the amphoteric liposomes according to the invention is formed by neutral framework lipids which have a membrane share of 5 to 65 mol%, preferably 10 to 60 mol%.
  • Suitable lipids are phosphatidylcholines, such as DMPC, DPPC, DSPC, DOPC and POPC, which can be of synthetic as well as natural or semi-synthetic origin.
  • the liposomes according to the invention preferably have a content of 30 to 50 mol%, preferably 35 to 45 mol%, of cholesterol in the membrane.
  • lipids that can be used as charge carriers for amphoteric liposomes are derived from the basic chemical structure of cholesterol (for example the compounds disclosed in WO 02/66490 and WO 02/6648). Surprisingly, it was found that these cholesterol derivatives in general, especially MoChol, HisChol, Chems, HistChol, do not have the stabilizing effect of native cholesterol, so it is advantageous if the sum of all sterol-based lipids does not exceed 60 mol%.
  • amphoteric charge behavior can be formed in two ways: by using amphoteric lipids or by suitable mixtures of pH-sensitive cationic and anionic lipids, as are disclosed in WO 02/066012. If amphoteric lipids are used, the membrane part is between 5 and 30 mol%, more preferably between 5 and 20 mol%, in the case of mixtures the total charge carrier fraction is preferably not more than 50 mol%, more preferably between 15 and 45 mol%. In a preferred embodiment of the invention, amphoteric formulations are composed as follows:
  • - Cholesterol with 35 - 45 mo_% - amphoteric lipid, selected from the group HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcamosin, HCChol with 5 - 20 mol%.
  • formulations are composed as follows: base lipid selected from the group DMPC, DPPC, DSPC with 10 to 50 mol%
  • cationic and anionic lipids of which at least one is pH-sensitive, selected from groups a) cationic: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC- Chol, DOTMA, DOGS, C (18) 2Gly + N, N-dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, and DOEPC with 5 to 40 mol%.
  • the formulation and its composition are selected from Table 3.
  • formulations according to the invention for use of the formulations according to the invention as a pharmaceutical carrier, it may be expedient to add substances which increase the shelf life and which serve to regulate the osmotic pressure.
  • the liposomes according to the invention can be produced by methods according to the prior art, such as, for example, extrusion through membranes of defined pore size, ethanol injection or high-pressure homogenization. Exemplary designs are given in the examples.
  • Active substance not included is separated off. Suitable separation processes are used for this, so that at least 90% of the active substance is enclosed in the liposome and less than 10% of the active substance is outside the liposome. Chromatographic methods, centrifugation, dialysis or ultrafiltration can be used for this.
  • the liposomal formulations according to the invention can be used for the therapeutic treatment of a mammal. They can also be used for the therapeutic treatment of people.
  • the liposomal formulations according to the invention are particularly suitable for parenteral administration, preferably for intravenous administration.
  • the invention accordingly also relates to a kit which optionally comprises the liposomal formulation according to the invention together with a suitable carrier, and to the use of the kit in diagnosis and therapy.
  • DOTMA 1-dioIeyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride
  • DOTAP (1,2-dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium salt
  • HistChol N-histidinyl cholesterol hemisuccinate HistChol N-histidinyl cholesterol hemisuccinate.
  • IsoHistSuccDG 1, 2 Dipalmitoylglycerol-O ⁇ -histidinyl-N ⁇ -hemisuccinate, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
  • Figure 2 Assignment of a 96-well microtiter plate for the serum stability test, the release of the fluorescent marker CF is measured
  • Figure 3 Fluorescence microscope image next to a phase contrast image for cell localization.
  • a mixture of the lipids named in Table 1 is dissolved in the molar ratios given in chloroform and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
  • the lipid film is mixed with 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 that a 100 mM
  • the liposomes are repeatedly passed through a membrane with a
  • Pore width of 400 nm extruded is 400 nm extruded.
  • Lipid film uses a solution of the dye, after: 500 mg CF in 130 ul 5
  • the CF which is not included, is separated off by gel filtration.
  • a lipid mixture of the following composition DMPC / MoChol / DG-Succ / Chol 40: 10: 10: 40 (mol%) is dissolved in chloroform at 50 ° C. and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200 nm or 400 nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400 nm).
  • a pH of 7.5 is adjusted by adding a 1 mol / L HEPES stock solution.
  • the fraction of the enclosed Cy5.5-anti-CD40-ODN (antisense oligonucleotide) is determined after separation of the freely available active ingredient by sedimentation three times in the ultracentrifuge at 60,000 x g for 45 min using fluorescence spectroscopy.
  • the inclusion efficiency of the oligonucleotide is seen by determining the lipid content and the fluorimetric Cy5.5 determination in relation to the material use of lipid and ODN and is 53% for the formulation.
  • Carboxyflourescein (CF) is used as a model drug, which like oligonucleotides is negatively charged at physiological pH.
  • the serum stability of the CF-filled liposomes is observed over a period of 24 h at 37 ° C.
  • the release of the CF from the liposomes is observed over time by fluorescence measurement.
  • Liposome formulations can be tested per 96-well plate. To determine the percentage of CF released, the sample incubated in buffer is measured both directly (base value) and after opening the liposomes by adding Triton (Triton value or 100% value).
  • Sterile-filtered serum and 1 mM liposomes are combined in a total volume of 500 ⁇ l.
  • the same approach is prepared as a control with buffer instead of serum.
  • a 96-well plate is prepared as follows before the respective sampling: In the wells of a row, columns 1, 3, 5, 7, 9 and 11, 5 ⁇ l buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 ) submitted. In columns 2, 4, 6, 8, 10 and 12 each 5 ⁇ l 10% Triton X-100.
  • the 96-well plate is loaded as shown in Figure 2.
  • Columns 1-6 each contain 5 ⁇ l of the liposomes incubated in buffer, columns 7-12 each in serum incubated.
  • 290 ⁇ l buffer are added to the 5 ⁇ l sample plus 5 ⁇ l buffer or Triton.
  • a base and a triton value are used again.
  • the times are as follows: zero, zero, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 24 hours.
  • a plate reader with 485/530 nm filters is used to measure the fluorescence.
  • the relative release values are calculated from the measured fluorescence data, in that the triton value corresponds to 100% release.
  • Table 1 shows a number of formulations tested. It can be seen that only compositions according to the invention have a high serum stability.
  • the antisense oligonucleotide (ODN) used is an 18-th phosphorothioate with a FITC label at the 5 'end (fluorescein isothiocyanate).
  • ODN antisense oligonucleotide
  • Liposomes with FITC-ODN were prepared: 0.5 ml of a 1 mM lipid solution with 9 ⁇ g ODN.
  • the liposomes were floated in a discontinuous sucrose gradient with 0, 0.8 and 1, 2 M sucrose in Hep 10 , NaCI 150 (10mM Hepes, 150mM NaCI).
  • siRNA anti GFP
  • amphoteric liposomes 5: 1 to 10: 1 is chosen as the charge ratio of cationic lipid to anionic siRNA.
  • the siRNA in 10mM Hepes, 10mM NaCl pH 7.2
  • the hydration buffer (10mM NaAcetate, 10mM NaCl, 280mM sucrose, pH 4.5) and applied to the lipid film so that a 5-10 mM lipid suspension is formed.
  • the lipids are detached from the piston wall by ultrasound treatment (max. 10 min). It is hydrated for 15 min at room temperature (PO PC as carrier lipid) or at 50 ° C (with DMPC, DPPC as carrier lipid).
  • the liposome fractions are mixed with the same volume of 2.4 M sucrose in H 2 O (ie a 1.2 M solution is formed).
  • the gradient is layered with buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5), including 0.8 M sucrose in buffer and below the liposomes in 1.2 M sucrose in H 2 O.
  • the volume of the gradient is maximal 4.5 ml.
  • the flotation is carried out at room temperature for 45 min at 50,000 rpm in an ultracentrifuge.
  • the liposomes, which are located between the 0.8 M sucrose and the buffer layer, are removed.
  • the assay is carried out in a final volume of 200 ⁇ l.
  • a calibration series of the siRNA is made between 1 ng and 10 ng (10-100 ⁇ l 100 ng / ml siRNA).
  • the Ribo Green is diluted 1: 2000 in TE buffer. 100 ⁇ l of Ribo Green are added to each batch, then incubated for 5 min at room temperature and the fluorescence is measured at 485/520 nm.
  • the batches are mixed with 4 ⁇ l of 10% Triton (final concentration 0.2 mM). This calibration curve will later be used to determine the amount of siRNA enclosed in liposomes. After about 15 minutes, the fluorescence is measured again.
  • the results are entered graphically in a diagram (one curve each with and without Triton) and calibration lines with the corresponding equations are generated from the values.
  • the liposomes are diluted in two different concentrations (e.g. 1:50 and 1: 100) and 2-3 different volumes of the dilutions are measured (e.g. 5, 10 and 15 ⁇ l of the dilutions to 100 ⁇ l TE plus 100 ⁇ l Ribo Green reagent ) without and with Triton.
  • concentration of the siRNA of a formulation must roughly match in the different measurements. If this is not the case, the siRNA amount was outside the calibration curves and these values should not be included in the calculation of the concentration.
  • the efficiency with which the siRNA could be included in various formulations is shown in Table 2.
  • Unmodified siRNA is broken down very quickly in the serum.
  • the concentration of the included siRNA is determined before the serum test. Liposomes with 4 ⁇ g siRNA per time are used for each time to be tested. Tested times: zero, 1 h, 2 h and 4 h.
  • the liposomes with 4 ⁇ g siRNA inside are diluted to a volume of 60 ⁇ l with the buffer in which the liposomes are located (usually 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5). 60 ⁇ l of serum are added to the batches and up to the incubated at 37 ° C at appropriate times. The zero time is determined separately.
  • a phenol / chloroform extraction is carried out with PLG-Eppis (phase lock gel Eppendor tubes) for a good separation of the serum components and the lipids from the siRNA.
  • the PLG-Eppis are centrifuged for 1 min at 13,000 rpm and placed on ice (in the following, work is carried out at max. 4 ° C). 280 ⁇ l of buffer (as above) and 45 ⁇ l of 5 M NaCI are added to the PLG-Eppis.
  • the liposomes in the serum (120 ⁇ l) are added to this solution. Immediately afterwards, 300 ⁇ l phenol / chloroform mixture is added. For the zero value, 60 ⁇ l serum is also added to the buffer with NaCI in the PLG-Eppi. Everything is mixed immediately. Centrifugation for 10 min at 13,000 rpm and 4 ° C follows. the aqueous phase contains the free siRNA. A further 300 ⁇ l of chloroform are added to the gradient and mixed briefly. After a further centrifugation as above, the aqueous phase is clear and can be removed as completely as possible. The siRNA is now precipitated from the aqueous phase.
  • the quality of the siRNA is checked in the denaturing and possibly also in the native acrylamide gel.
  • siRNA The quality of siRNA is determined over the full length of the single strands and the
  • Double-strandedness defined. Using a native acrylamide gel, you can
  • the gel must be pre-run with TBE buffer for 30 min (80 V, 100 mA) to achieve the required
  • a maximum of 2 ⁇ g siRNA per slot should be applied, otherwise the gel will be overloaded.
  • the samples are taken up in a total volume of 9 ⁇ l. Then add 1 ⁇ l of Blue Juice loading buffer. The samples are applied to the previous gel and separated for 1 h at 100 mA.
  • Staining the gel The gel is removed from the apparatus after electrophoresis. Approx. 200 ml Stains All working solution (20 ml stock solution, 180 ml formamide, 200 ml water) are added to the gel. The gel is stained in the dark for 30-60 min in the Stains All solution. The solution is then removed from the gel and the gel is decolorized under the influence of light in the water (approx. 30 min-2 h depending on the light intensity) . The siRNA remains colored, whereas the background is completely decolored again.
  • HepG2 cells are sown in 96-well plates 2 days before the transfection, so that they show a cell density of 60-80% on the day of the transfection (0.02-0.2 x 10 5 in 100 ⁇ l, usually 1 x 10 4 ) , Two plates (centrifugation and control incubation) are prepared, which are otherwise treated identically.
  • liposome dilutions with and without cargo
  • transfection mix of commercial control transfection reagents (e.g. Lipofectamine 2000, oligofecate mine, siPort amine, siPort lipid) on a 96-well plate with serum-free medium (approx. 160 ng antisense / well).
  • the liposome dilution will be added to the cells in a volume of 25-50 ⁇ l.
  • the cells are washed with serum-free medium (1x) and mixed with serum-containing or serum-free medium, e.g. 75 ⁇ l per well if the liposome dilutions were prepared in such a way that the corresponding amount of antisense / well is contained in 25 ⁇ l.
  • a multiwell plate is centrifuged at 1,500 rpm (342 g), 1 h, 37 ° C., the control plate is incubated for 1 h (37 ° C., 5% CO 2 ). Then both plates are incubated for 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ). Remove medium from all wells completely, wash 1 x with PBS, 2 x with serum-containing medium; Add serum-containing medium to all wells, microscopic control for vitality, then incubate both plates overnight (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • Figure 3 shows a fluorescence image next to a phase contrast image for cell localization.
  • Example 7 Determination of the serum stability of amphoteric liposomes with and without cholesterol and / or matrix lipid
  • E1 DC-Chol / DOPA (66/34) E2 DC-Chol / DOPA / Chol (40/20/40) E3 DMPC / DC-Chol / DOPA (60/27/13) E4 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (20/27/13/40) E5 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (30/20/10/40) E6 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (40/13/7/40)
  • the liposomes were floated after extrusion to separate the outside FITC dextran.
  • the following data were measured on the Zetasizer at pH 3.9 (10 mM Hepes 150 NaCI HAc) or pH 9.0 (10 mM Tris 150 mM NaCI):
  • ⁇ 1 mM liposomes were incubated for 3 hours at 37 ° C. in human serum and then floated.
  • the fluorescence was determined both in the non-floated sample and in the lower layer (serum layer) of the floated sample and the cargo release was calculated therefrom.
  • the proportion outside FITC-dextran at the start of the test was determined in the same way by appropriate dilution in buffer pH 3.9 and subsequent flotation.

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Abstract

The invention relates to amphoteric liposomal formulations which are provided with great serum stability and are suitable for the intracellular delivery of oligonucleotides.

Description

Serumstabile amphotere LiposomenSerum stable amphoteric liposomes
Die Erfindung betrifft amphotere liposomale Formulierungen, die besondere Serumstabilität zeigen und sich zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden eignen.The invention relates to amphoteric liposomal formulations which show particular serum stability and are suitable for the intracellular delivery of oligonucleotides.
Eine recht neue Klasse von potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen stellen die so genannten kurzen interferierenden Ribonukleinsäuren (siRNA) dar, die als Doppelstrang eingesetzt werden, um einzelne Gene gezielt in ihrer Aktivität herunterzuregeln oder auszuschalten. Ihr großes Potential in Therapie und Diagnostik ist leider mit dem Nachteil der starken Instabilität gegenüber Körperflüssigkeiten verbunden. Insbesondere im Blut werden kleine Nukleinsäuren sehr rasch abgebaut. Durch chemische Modifizierung der Nukleinsäuren wird versucht die Empfindlichkeit dieser Moleküle herabzusetzen, was als Nachteil oft eine verringerte bis fehlende biologische Aktivität zur Folge haben kann.The so-called short interfering ribonucleic acids (siRNA) represent a quite new class of potential pharmaceutical active ingredients, which are used as a double strand to selectively down-regulate or switch off the activity of individual genes. Unfortunately, their great potential in therapy and diagnostics is associated with the disadvantage of strong instability towards body fluids. Small nucleic acids are broken down very quickly, especially in the blood. Chemical modification of the nucleic acids attempts to reduce the sensitivity of these molecules, which, as a disadvantage, can often result in reduced or no biological activity.
Ein anderer Ansatz ist die Verwendung eines Trägers, der die siRNA vor Angriffen von Enzymen schützt und zum Wirkort transportieren kann. Liposomen werden schon seit einiger Zeit als pharmazeutische Träger für Arzneistoffe eingesetzt.Another approach is to use a carrier that protects the siRNA from attack by enzymes and can transport it to the site of action. Liposomes have been used as pharmaceutical carriers for drugs for some time.
Zahlreiche Publikationen beschäftigen sich mit der Anwendung von meist kationischen liposomalen Systemen zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden in vivo (z.B. Molecular Membrane Biology, 16, 129-140, (1999); BBA 1464, 251-261, (2000); Reviews in Biology and Biotechnology, 1(2), 27-33, (2001). All diesen Systemen gemein ist jedoch die Tatsache, dass die verwendeten Lipid-Mischungen aus ungesättigten und kationischen Lipiden wie z.B. DOTAP und/oder DOPE aufgebaut sind und aus diesem Grund nicht serumstabil sind. Dadurch bedingt setzen diese Liposomen eingeschlossenen Wirkstoff sehr schnell nach einer parenteralen Applikation frei. Häufig werden für die oben genannten Anwendungen auch Komplexe aus vdrgeformten Liposomen und Nukleinsäuren hergestellt (z.B. Lipoplexe). Die Komple>!bildung bzw. die meist nicht im Serum stabilen liposomalen Formulierungen führen dazu, dass die Stabilität der Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum nicht gewährleistet ist.Numerous publications deal with the use of mostly cationic liposomal systems for the intracellular delivery of oligonucleotides in vivo (e.g. Molecular Membrane Biology, 16, 129-140, (1999); BBA 1464, 251-261, (2000); Reviews in Biology and Biotechnology, 1 (2), 27-33, (2001) However, all these systems have in common the fact that the lipid mixtures used are composed of unsaturated and cationic lipids such as DOTAP and / or DOPE and are therefore not serum stable As a result, these liposomes release enclosed active ingredient very quickly after parenteral administration. Often complexes of Vdrformed liposomes and nucleic acids (eg lipoplexes) are also produced for the above-mentioned applications. The complex formation or the mostly not stable in serum Liposomal formulations mean that the stability of the oligonucleotides is not guaranteed over a long period of time.
Amphotere Liposomen sind eine neue Klasse von Liposomen, die vorteilhafte Eigenschaften gegenüber konventionellen Liposomen und rein kationischen Systemen für ein intrazelluläres Delivery bieten. Negativ geladene Wirkstoffe, wie die Nukleinsäuren lassen sich effektiv in das Innere dieser Liposomen verpacken, obwohl die Gesamtladung der Liposomen bei physiologischem pH negativ bleibt. Durch Änderung des Umgebungs-pH, wie er bei der endosomalen Aufnahme von Liposomen in Zellen vorkommt, von neutral nach leicht sauer, ändert sich auch die Ladung der amphoteren Liposomen von anionisch nach leicht kationisch und die Vorteile eines kationischen Transfektionsreagenzes werden ausgenutzt. In der WO 02/66012 A2 sind diese Liposomen erstmals beschrieben. Die WO 02/66490 und WO 02/66489 (WO 03/070220 und WO 03/070735) stellen pH-sensitive Lipide vor, die sich zum Aufbau von amphoteren Liposomen eignen.Amphoteric liposomes are a new class of liposomes that offer advantageous properties over conventional liposomes and purely cationic systems for intracellular delivery. Negatively charged active ingredients, such as the Nucleic acids can be effectively packed inside these liposomes, although the total charge of the liposomes remains negative at physiological pH. By changing the ambient pH, as occurs in the endosomal uptake of liposomes in cells, from neutral to slightly acidic, the charge of the amphoteric liposomes also changes from anionic to slightly cationic and the advantages of a cationic transfection reagent are exploited. These liposomes are described for the first time in WO 02/66012 A2. WO 02/66490 and WO 02/66489 (WO 03/070220 and WO 03/070735) present pH-sensitive lipids which are suitable for the construction of amphoteric liposomes.
Hafez et al. (Biophysical Journal 2000 (79), 1438-46) und Shi et al. (Journal of Controlled Release 2002 (80), 309-319) beschreiben die Herstellung pH-sensitiver Liposomen, die ohne Neutrallipid formuliert werden. Diese Liposomen sind bei physiologischen pH-Werten negativ geladen und enthalten pH-sensitive Komponenten, welche schwach anionische oder schwach kationische Amphiphile enthalten. Die Lipide bilden stabile Liposomen bei neutralem oder basischem pH. Im sauren Milieu werden die anionischen bzw. kationischen Lipide protoniert und dadurch entladen bzw. umgeladen. Durch die elektrostatische Destabilisierung aggregieren die Liposomen schneller, was die Membranfusion fördert. Jedoch sind Liposomen, die ausschließlich aus geladenen Komponenten bestehen aufgrund ihrer geringen Stabilität im Serum nicht für in vivo Anwendungen geeignet.Hafez et al. (Biophysical Journal 2000 (79), 1438-46) and Shi et al. (Journal of Controlled Release 2002 (80), 309-319) describe the production of pH-sensitive liposomes that are formulated without a neutral lipid. These liposomes are negatively charged at physiological pH values and contain pH-sensitive components that contain weakly anionic or weakly cationic amphiphiles. The lipids form stable liposomes at neutral or basic pH. The anionic or cationic lipids are protonated in the acidic environment and thereby discharged or reloaded. Due to the electrostatic destabilization, the liposomes aggregate faster, which promotes membrane fusion. However, liposomes that consist exclusively of charged components are not suitable for in vivo applications because of their low stability in the serum.
Bei systemischer Applikation ist neben den üblichen Bedingungen für parenterale Applikation, wie Sterilität, Isoosmolarität, Reinheits- und Toxizitätsanforderungen, die Stabilität und Aggregationsfreiheit einer liposomalen Formulierung in humanem Serum eine Vorraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung. So sehen auch die Richtlinien der US-amerikanischen Aufsichtsbehörde FDA für liposomale Formulierungen (http://www.fda.gov/cder/guigance/index.htm, Liposome Drug Products) besondere Prüfungen vor. Dabei wird verlangt, dass das Verhältnis verkapselter zu freiem Arzneistoff in vitro, sowie in vivo über den Zeitraum der Zirkulation zu bestimmen ist. Serumkomponenten können die liposomale Membran permeabilisieren und Wirkstoff freisetzen. Ob ein Wirkstoff schnell, langsam oder nicht freigesetzt wird, hängt auch von den molekularen Dimensionen des Wirkstoffes ab. So verbleibt ein Plasmid mit mehreren tausend Basenpaaren eher im Liposom als kleine Oligonucleotide. Für ein intrazelluläres Delivery ist es wesentlich, dass die Freisetzung möglichst gering ist. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die in der WO 02/66012 A2 offenbarten amphoteren Liposomen sich stark in ihrer Serumstabilität bei Verwendung von kleinen Oligonukleotiden unterscheiden. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Formulierungen von amphoteren Liposomen bereitzustellen, die kleine Oligonukleotide, wie siRNA und/oder Antisense-Moleküle, in ihren Innenraum einschließen und unter Serumbedingung nicht, oder nur zu einem kleinen Teil freisetzen und sich somit zur parenteralen Gabe eignen.In the case of systemic administration, in addition to the usual conditions for parenteral administration, such as sterility, isoosmolarity, purity and toxicity requirements, the stability and freedom from aggregation of a liposomal formulation in human serum is a prerequisite for successful use. The guidelines of the US regulatory authority FDA for liposomal formulations (http://www.fda.gov/cder/guigance/index.htm, Liposome Drug Products) also provide for special tests. It is required that the ratio of encapsulated to free drug is determined in vitro and in vivo over the period of circulation. Serum components can permeabilize the liposomal membrane and release active ingredient. Whether an active ingredient is released quickly, slowly or not also depends on the molecular dimensions of the active ingredient. A plasmid with several thousand base pairs remains in the liposome rather than small oligonucleotides. For an intracellular delivery, it is essential that the release is as low as possible. Surprisingly, it was found that the amphoteric liposomes disclosed in WO 02/66012 A2 differ greatly in their serum stability when using small oligonucleotides. The aim of the present invention is therefore to provide formulations of amphoteric liposomes which enclose small oligonucleotides, such as siRNA and / or antisense molecules, in their interior and do not or only release a small part under serum conditions and are therefore suitable for parenteral administration ,
Die Erfindung löst die Aufgabe durch Bereitstellung von liposomalen Formulierungen mit einem wässrigen Innenraum umfassendThe invention solves the problem comprehensively by providing liposomal formulations with an aqueous interior
- neutrale Lipide mit einem Membrananteil von 10 - 60 mol%,- neutral lipids with a membrane content of 10 - 60 mol%,
- Cholesterol mit einem Anteil von 30 - 50 mol%, als ladungstragende Lipide entweder- Cholesterol with a content of 30 - 50 mol%, as charge-bearing lipids either
- amphotere Lipide mit einem Anteil von 5 - 30mol%, oder Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden mit einem Gesamtanteil von höchstens 50 mol%, wobei die Formulierung als einen Wirkstoff im wässrigen Innenraum mindestens ein Oligonukleotid umfasst.amphoteric lipids with a proportion of 5-30 mol%, or mixtures of cationic and anionic lipids with a total proportion of at most 50 mol%, the formulation as an active ingredient in the aqueous interior comprising at least one oligonucleotide.
Die für diese Ausführung der Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Nukleotiden oder Basenpaaren aufgebaut. Darüber hinaus können die Oligonukleotide als Einzelstrang (z.B. Antisense-Oligonukleotide), als Doppelstrang (z.B. small-interfering RNA, Decoy- Oligonukleotide) oder in komplexer Faltung (z.B. Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme) vorliegen. Alle für diese Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus Desoxyribonukleotiden oder aus Ribonukleotiden sowie aus deren chemischmodifizierten Derivaten aufgebaut, wie beispielsweise Phosphorothioate DNA (PS), 2'- O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE), Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5' Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)). Darüber können Copolymere und Block-Copolymere verschiedener Nukleotide und sogenannte Gapmere in die Liposomen eingeschlossen werden-.The oligonucleotides relevant for this embodiment of the invention are composed of 5-100, preferably 5-40 and particularly preferably 10-25 nucleotides or base pairs. In addition, the oligonucleotides can be present as a single strand (e.g. antisense oligonucleotides), as a double strand (e.g. small-interfering RNA, decoy-oligonucleotides) or in complex folds (e.g. aptamers, Spiegelmers, ribozymes). All oligonucleotides relevant to this invention are made up of deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their chemically modified derivatives, such as phosphorothioate DNA (PS), 2'-O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE) , Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)). In addition, copolymers and block copolymers of different nucleotides and so-called gapmers can be included in the liposomes.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Aptamere oder Spiegelmere in die Liposomen eingeschlossen. Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotide mit komplexer dreidimensionaler Struktur. Aufgrund dieser Struktur können Aptamere sehr spezifisch und hochaffin an Proteintargets binden und wirken somit therapeutisch, meist extrazellulär. Ihre Funktionalität ist nahezu identisch zu monoklonalen Antikörpern. Spiegelmere sind im Gegensatz zu D-Oligonukleotiden aus L-Ribose- und L-2'- Desoxyribose-Einheiten aufgebaut. Genau wie Aptamere binden diese spiegelbildlichen Nukleinsäuren spezifisch an Proteintargets. Aufgrund der chiralen Inversion besitzen Spiegelmere im Gegensatz zu herkömmlichen D-Oligonukleotiden eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau.In an advantageous embodiment of the invention, aptamers or Spiegelmers are included in the liposomes. Aptamers are DNA or RNA-based oligonucleotides with a complex three-dimensional structure. Due to this structure, aptamers can bind to protein targets in a very specific and highly affine manner and thus have a therapeutic, usually extracellular, effect. Their functionality is almost identical to that of monoclonal antibodies. In contrast to D-oligonucleotides, Spiegelmers are made up of L-ribose and L-2'-deoxyribose units. Just like aptamers, these mirror-image nucleic acids bind specifically to protein targets. Due to the chiral inversion, Spiegelmers, in contrast to conventional D-oligonucleotides, have increased stability against enzymatic degradation.
Das Grundgerüst der erfindungsgemäßen amphoteren Liposomen wird von neutralen Gerüstlipiden gebildet, die einen Anteil an der Membran von 5 bis 65 mol%, bevorzugt von 10 bis 60 mol% besitzen. Geeignete Lipide sind Phoshatidylcholine, wie DMPC, DPPC, DSPC, DOPC und POPC, die sowohl synthetischen als auch natürlichen oder halbsynthetischen Ursprungs sein können.The basic structure of the amphoteric liposomes according to the invention is formed by neutral framework lipids which have a membrane share of 5 to 65 mol%, preferably 10 to 60 mol%. Suitable lipids are phosphatidylcholines, such as DMPC, DPPC, DSPC, DOPC and POPC, which can be of synthetic as well as natural or semi-synthetic origin.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich die Serumstabilität von Liposomen durch Zusatz von Cholesterol in der Membran erhöhen lässt. Dies wurde auch für amphotere Liposomen gefunden. Die erfindungsgemäßen Liposomen besitzen vorzugsweise einen Gehalt von 30 bis 50 mol%, bevorzugt von 35 - 45 mol% Cholesterol in der Membran.It is known to the person skilled in the art that the serum stability of liposomes can be increased by adding cholesterol in the membrane. This was also found for amphoteric liposomes. The liposomes according to the invention preferably have a content of 30 to 50 mol%, preferably 35 to 45 mol%, of cholesterol in the membrane.
Viele Lipide, die als Ladungsträger für amphotere Liposomen verwendet werden können, leiten sich von der chemischen Grundstruktur des Cholesterol ab (beispielsweise die offenbarten Verbindungen in WO 02/66490 und WO 02/6648). Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Cholesterolderivate im Allgemeinen, besonders MoChol, HisChol, Chems, HistChol nicht die stabilisierende Wirkung des nativen Cholesterols besitzen, daher ist es von Vorteil, wenn die Summe aller sterolbasierenden Lipide 60 mol% nicht übersteigt.Many lipids that can be used as charge carriers for amphoteric liposomes are derived from the basic chemical structure of cholesterol (for example the compounds disclosed in WO 02/66490 and WO 02/6648). Surprisingly, it was found that these cholesterol derivatives in general, especially MoChol, HisChol, Chems, HistChol, do not have the stabilizing effect of native cholesterol, so it is advantageous if the sum of all sterol-based lipids does not exceed 60 mol%.
Das amphotere Ladungsverhalten kann auf zwei Weisen gebildet werden: durch Verwendung von amphoteren Lipiden oder durch geeignete Mischungen von pH- sensitiven kationischen und anionischen Lipiden, wie sie in der WO 02/066012 offenbart werden. Werden amphotere Lipide verwendet, so beträgt der Membranteil zwischen 5 und 30 mol%, weiter bevorzugt zwischen 5 und 20 mol%, bei Mischungen beträgt der Gesamtladungsträgeranteil bevorzugt nicht mehr als 50 mol%, weiter bevorzugt zwischen 15 und 45 mol%. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden amphotere Formulierungen wie folgt zusammengesetzt:The amphoteric charge behavior can be formed in two ways: by using amphoteric lipids or by suitable mixtures of pH-sensitive cationic and anionic lipids, as are disclosed in WO 02/066012. If amphoteric lipids are used, the membrane part is between 5 and 30 mol%, more preferably between 5 and 20 mol%, in the case of mixtures the total charge carrier fraction is preferably not more than 50 mol%, more preferably between 15 and 45 mol%. In a preferred embodiment of the invention, amphoteric formulations are composed as follows:
- Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 10 bis 60 mol%- Basic lipid selected from the group DMPC, DPPC, DSPC with 10 to 60 mol%
- Cholesterol, mit 35 - 45 mo_% - amphoteres Lipid, ausgewählt aus der Gruppe HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcamosin, HCChol mit 5 - 20 mol%.- Cholesterol, with 35 - 45 mo_% - amphoteric lipid, selected from the group HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcamosin, HCChol with 5 - 20 mol%.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen wie folgt zusammengesetzt: - Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 10 bis 50 mol%In a further preferred embodiment of the invention, formulations are composed as follows: base lipid selected from the group DMPC, DPPC, DSPC with 10 to 50 mol%
- Cholesterol, mit 35 - 45 mol%- cholesterol, with 35 - 45 mol%
- Mischung kationischer und anionischer Lipide, davon mindestens eines pH-sensitiv, ausgewählt aus den Gruppen a) kationisch: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, C(18)2Gly+N,N- dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, und DOEPC mit 5 bis 40 mol%. b) anionisch: DGSucc, DMPS, DPPS.DOPS.POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA.DOPA, POPA, Chems und CetylP mit 5 bis 40 mol% mit einem Anteil an der liposomalen Membran von insgesamt 15-45 mol%.Mixture of cationic and anionic lipids, of which at least one is pH-sensitive, selected from groups a) cationic: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC- Chol, DOTMA, DOGS, C (18) 2Gly + N, N-dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, and DOEPC with 5 to 40 mol%. b) anionic: DGSucc, DMPS, DPPS.DOPS.POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA.DOPA, POPA, Chems and CetylP with 5 to 40 mol% with a share in the liposomal membrane of 15- 45 mol%.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Formulierung und ihre Zusammensetzung ausgewählt aus Tabelle 3.In a particularly preferred embodiment of the invention, the formulation and its composition are selected from Table 3.
Für eine Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen als Arzneimittelträger kann es zweckmäßig sein, Substanzen, die die Haltbarkeit erhöhen, die zur Regulierung des osmotischen Drucks dienen, zuzusetzen.For use of the formulations according to the invention as a pharmaceutical carrier, it may be expedient to add substances which increase the shelf life and which serve to regulate the osmotic pressure.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen kann durch Verfahren nach dem Stand der Technik erfolgen, wie beispielsweise Extrusion durch Membranen definierter Porengröße, Ethanolinjektion oder Hochdruckhomogenisation. Beispielhafte Ausführungen sind in den Beispielen gegeben.The liposomes according to the invention can be produced by methods according to the prior art, such as, for example, extrusion through membranes of defined pore size, ethanol injection or high-pressure homogenization. Exemplary designs are given in the examples.
Nicht eingeschlossener Wirkstoff wird abgetrennt. Dazu werden geeignete Trennverfahren verwendet, so dass der Wirkstoff zu mindestens 90% im Liposom eingeschlossen ist und weniger als 10% des Wirkstoffes sich ausserhalb des Liposoms befinden. Hierfür können chromatographische Verfahren, Zentrifugation, Dialyse oder Ultrafiltration verwendet werden. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen können zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres verwendet werden. Auch zur therapeutischen Behandlung von Menschen können sie verwendet werden.Active substance not included is separated off. Suitable separation processes are used for this, so that at least 90% of the active substance is enclosed in the liposome and less than 10% of the active substance is outside the liposome. Chromatographic methods, centrifugation, dialysis or ultrafiltration can be used for this. The liposomal formulations according to the invention can be used for the therapeutic treatment of a mammal. They can also be used for the therapeutic treatment of people.
Insbesondere zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation sind die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen geeignet. Die Erfindung betrifft demgemäß auch einen Kit, der die erfindungsgemäße liposomale Formulierung gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger umfasst, sowie die Verwendung des Kits in Diagnose und Therapie. The liposomal formulations according to the invention are particularly suitable for parenteral administration, preferably for intravenous administration. The invention accordingly also relates to a kit which optionally comprises the liposomal formulation according to the invention together with a suitable carrier, and to the use of the kit in diagnosis and therapy.
Tabelle 1Table 1
m 73m 73
>>
H N 00H N 00
73 m O m r σ>73 m O m r σ>
Tabelle 3Table 3
Anschließend wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert, ohne auf diese Beispiele begrenzt zu sein.The invention is then further explained using examples, without being limited to these examples.
Abkürzungen:Abbreviations:
DMPC DimyristoylphosphatidylcholinDMPC dimyristoylphosphatidylcholine
DPPC DipalmitoylphosphatidylcholinDPPC Dipalmitoylphosphatidylcholine
DSPC DistearoylphosphatidylcholinDSPC distearoylphosphatidylcholine
POPC Palmitoyl-oleoylphosphatidylcholinPOPC palmitoyl oleoylphosphatidylcholine
DOPC DioleoylphosphatidylcholinDOPC dioleoylphosphatidylcholine
DOPG DioleoylphosphatidylglycerolDOPG dioleoylphosphatidylglycerol
POPG Palmitoyl-oleoylphosphatidylglycerolPOPG palmitoyl oleoylphosphatidylglycerol
DMPG DimyristoylphosphatidylglycerolDMPG dimyristoylphosphatidylglycerol
DPPG DipalmitoylphosphatidylglycerolDPPG Dipalmitoylphosphatidylglycerol
DMPS DimyristoylphosphatidylserinDMPS dimyristoylphosphatidylserine
DPPS DipalmitoylphosphatidylserinDPPS Dipalmitoylphosphatidylserine
DOPS DioleoylphosphatidylserinDOPS dioleoylphosphatidylserine
POPS Palmitoyl-oleoylphosphatidylserinPOPS palmitoyl oleoylphosphatidylserine
DMPA Dimyristoylphosphatidic acidDMPA Dimyristoylphosphatidic acid
DPPA Dipalmitoylphosphatidic acidDPPA Dipalmitoylphosphatidic acid
DOPA Dioleoylphosphatidic acidDOPA Dioleoylphosphatidic acid
POPA Palmitoyl-oleoylphosphatidic acidPOPA palmitoyl oleoylphosphatidic acid
DOPE DioleoylphosphatidylethanolaminDOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
Chems CholesterolhemisuccinatChem's cholesterol hemisuccinate
DC-Chol 3-ß-[N-(N',N'-dimethylethane) carbamoyljcholesterolTLC-Chol 3-ß- [N- (N ', N'-dimethylethane) carbamoyl cholesterol
CetylP CetylphosphatCetylP cetyl phosphate
DODAP (1 ,2)-dioleoyloxypropyl)-N,N-dimethylammonium ChlorideDODAP (1, 2) -dioleoyloxypropyl) -N, N-dimethylammonium chloride
DOEPC 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin DAC-Chol 3-ß-[N-(N,N'-dimethylethane) carbamoyljcholesterolDOEPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine DAC-Chol 3-ß- [N- (N, N'-dimethylethane) carbamoyl cholesterol
TC-Chol 3-ß-[N-(N',N', N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterolTC-Chol 3-ß- [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol
DOTMA (1 ,2-dioIeyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Lipofectin®)DOTMA (1, 2-dioIeyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride) (Lipofectin®)
DOGS ((C18)2GlySper3+) N,N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam®)DOGS ((C18) 2 GlySper3 + ) N, N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam®)
CTAB Cetyl-trimethylammoniumbromid,CTAB cetyltrimethylammonium bromide,
CPyC Cetyl-pyridiniumchloridCPyC cetyl pyridinium chloride
DOTAP (1 ,2-dioleoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium SalzDOTAP (1,2-dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium salt
DMTAP (1 ,2-dimyristoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium SalzDMTAP (1, 2-dimyristoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium salt
DPTAP (1 ,2-dipalmitoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium SalzDPTAP (1,2-dipalmitoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium salt
DOTMA (1 ,2-dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium chlorid)DOTMA (1, 2-dioleyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride)
DORIE (1 ,2-dioleyloxypropyl)-3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromid)DORIE (1,2-dioleyloxypropyl) -3 dimethylhydroxyethyl ammonium bromide)
DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromidDDAB dimethyldioctadecylammonium bromide
DPIM Dipalmitoyl-oxypropyl-methylimidazolDPIM dipalmitoyl-oxypropyl-methylimidazole
CHIM Histaminyl-CholesterolcarbamatCHIM histaminyl cholesterol carbamate
MoChol 4-(2-Aminoethyl)-Morpholino-CholesterolhemisuccinatMoChol 4- (2-aminoethyl) morpholino cholesterol hemisuccinate
HisChol Histaminyl-CholesterolhemisuccinatHisChol histaminyl cholesterol hemisuccinate
HCChol Nά-Histidinyl-CholesterolcarbamatHCChol N-histidinyl cholesterol carbamate
HistChol Nά-Histidinyl-Cholesterol-hemisuccinat.HistChol N-histidinyl cholesterol hemisuccinate.
AC Acylcarnosin, Stearyl- & Palmitoylcarnosin HistSuccDG 1 ,2 — Dipalmitoylglycerol-hemisuccinat-Nα-Histidinyl-hemisuccinat, & Distearoyl- .Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivativesAC Acylcarnosine, Stearyl- & Palmitoylcarnosine HistSuccDG 1, 2 - Dipalmitoylglycerol-hemisuccinate-Nα-Histidinyl-Hemisuccinate, & Distearoyl- .Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
IsoHistSuccDG 1 ,2 — Dipalmitoylglycerol-Oα-Histidinyl-Nα-hemisuccinat, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivativesIsoHistSuccDG 1, 2 - Dipalmitoylglycerol-Oα-histidinyl-Nα-hemisuccinate, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
DGSucc 1 ,2 — Dipalmitoyglycerol-3-hemisuccinat & Distearoyl-, dimyristoyl-DGSucc 1, 2 - Dipalmitoyglycerol-3-hemisuccinate & Distearoyl-, dimyristoyl-
Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivativesDioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
Abbildungenpictures
Abbildung 1 : Chemische Formeln von LipidenFigure 1: Chemical formulas of lipids
Abbildung 2: Belegung einer 96-well Mikrotiterplatte für den Serumsstabilitätstest, gemessen wird die Freisetzung des Floureszenzmarkers CF Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung.Figure 2: Assignment of a 96-well microtiter plate for the serum stability test, the release of the fluorescent marker CF is measured Figure 3: Fluorescence microscope image next to a phase contrast image for cell localization.
Beispiel 1example 1
Herstellung von amphoteren LiposomenProduction of amphoteric liposomes
Ein Gemisch aus den in Tabelle 1 benannten Lipiden wird in den angegebenen molaren Verhältnissen in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.A mixture of the lipids named in Table 1 is dissolved in the molar ratios given in chloroform and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
Der Lipidfilm wird mit 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7.5 versetzt, dass eine 100 mMThe lipid film is mixed with 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 that a 100 mM
Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten imSuspension arises. Then this suspension is in for 45 minutes
Wasserbad bei 50°C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten imHydrated water bath at 50 ° C while rotating and in for another 5 minutes
Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren.Ultrasound bath treated. The solution is then frozen.
Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einerAfter thawing, the liposomes are repeatedly passed through a membrane with a
Porenweite von 400 nm extrudiert.Pore width of 400 nm extruded.
CF - (Carboxyfluorescein) - gefüllte LiposomenCF - (carboxyfluorescein) filled liposomes
Die Herstellung erfolgt analog dem Voranstehenden, nur wird zur Hydratation desThe production is carried out analogously to the above, only for the hydration of the
Lipidfilms eine Lösung des Farbstoffes verwendet, nach: 500 mg CF werden in 130 μl 5Lipid film uses a solution of the dye, after: 500 mg CF in 130 ul 5
M NaCI , 12,5 ml 10 mM Hepes pH 7,5 und 630 μl 5 N NaOH gelöst. Der pH-Wert wird kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt (auf pH 7,5).M NaCI, 12.5 ml of 10 mM Hepes pH 7.5 and 630 μl of 5 N NaOH dissolved. The pH is checked and adjusted if necessary (to pH 7.5).
Die Abtrennung des nicht eingeschlossenen CF erfolgt über Gelfiltration.The CF, which is not included, is separated off by gel filtration.
Beispiel 2:Example 2:
Einschluss von Cy5.5 anti CD40 ODN (floereszenzmarkiertes Antisense-Inclusion of Cy5.5 anti CD40 ODN (fluorescence labeled antisense
Oligonukleotid) in amphotere LiposomenOligonucleotide) in amphoteric liposomes
Eine Lipidmischung folgender Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG-Succ/Chol 40:10:10:40 (mol%) wird bei 50°C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.A lipid mixture of the following composition DMPC / MoChol / DG-Succ / Chol 40: 10: 10: 40 (mol%) is dissolved in chloroform at 50 ° C. and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
Der Lipidfilm wird mit soviel Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) (150 μg/ml in 10 mM NaAcetat, 300 mM Sucrose, pH 4,5) versetzt, dass eine 15 mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5-minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt.Sufficient Cy5.5-anti-CD40-ODN (antisense oligonucleotide) (150 μg / ml in 10 mM Na acetate, 300 mM sucrose, pH 4.5) is added to the lipid film to form a 15 mM suspension. This suspension is then hydrated for 45 minutes in a water bath at 50 ° C. while swirling and treated in an ultrasound bath for a further 5 minutes. The suspension is then frozen. There follow 3 Freezing and thawing processes, with a 5-minute treatment in an ultrasonic bath after thawing.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200 nm oder 400 nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm). Nach der Extrusion wird durch Zugabe einer 1 mol/L HEPES-Stammlösung ein pH von 7,5 eingestellt. Der Anteil des eingeschlossenen Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) wird nach Abtrennung des frei vorliegenden Wirkstoffes durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000 x g über 45 min fluoreszenzspektroskopisch ermittelt.After the last thawing, the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200 nm or 400 nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400 nm). After the extrusion, a pH of 7.5 is adjusted by adding a 1 mol / L HEPES stock solution. The fraction of the enclosed Cy5.5-anti-CD40-ODN (antisense oligonucleotide) is determined after separation of the freely available active ingredient by sedimentation three times in the ultracentrifuge at 60,000 x g for 45 min using fluorescence spectroscopy.
Die Einschlusseffizienz des Oligonukleotids wird durch Bestimmung des Lipidgehaltes und der fluorimetrischen Cy5.5-Bestimmung im Verhältnis zu zum Materialeinsatz von Lipid und ODN gesehen und beträgt für die Formulierung 53%.The inclusion efficiency of the oligonucleotide is seen by determining the lipid content and the fluorimetric Cy5.5 determination in relation to the material use of lipid and ODN and is 53% for the formulation.
Beispiel 3Example 3
Bestimmung der SerumstabilitätDetermination of serum stability
Als Modellwirkstoff wird Carboxyflourescein (CF) eingesetzt, der wie Oligonukleotide bei physiologischem pH negativ geladen ist. Die Serumstabilität der CF-gefüllten Liposomen wird über den Zeitraum von insgesamt 24 h bei 37°C beobachtet. Es wird dabei die Freisetzung des CF aus den Liposomen über die Zeit per Fluoreszenzmessung beobachtet. Es können 3 verschiedeneCarboxyflourescein (CF) is used as a model drug, which like oligonucleotides is negatively charged at physiological pH. The serum stability of the CF-filled liposomes is observed over a period of 24 h at 37 ° C. The release of the CF from the liposomes is observed over time by fluorescence measurement. There can be 3 different ones
Liposomenformulierungen pro 96-well-Platte getestet werden. Zur Bestimmung der prozentual freigesetzten Menge an CF wird die in Puffer inkubierte Probe sowohl direkt vermessen (Basiswert) als auch nach Öffnung der Liposomen durch Zugabe von Triton (Tritonwert oder 100%-Wert).Liposome formulations can be tested per 96-well plate. To determine the percentage of CF released, the sample incubated in buffer is measured both directly (base value) and after opening the liposomes by adding Triton (Triton value or 100% value).
In einem Gesamtvolumen von 500 μl werden sterilfiltriertes Serum und 1 mM Liposomen zusammengegeben. Derselbe Ansatz wird als Kontrolle mit Puffer anstelle des Serums vorbereitet.Sterile-filtered serum and 1 mM liposomes are combined in a total volume of 500 μl. The same approach is prepared as a control with buffer instead of serum.
Eine 96-well-Platte wird folgendermaßen vor den jeweiligen Probennahmen vorbereitet: in die Wells einer Zeile, Spalten 1, 3, 5, 7, 9 und 11 werden jeweils 5 μl Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5) vorgelegt. In die Spalten 2, 4, 6, 8, 10 und 12 jeweils 5 μl 10 % Triton X-100.A 96-well plate is prepared as follows before the respective sampling: In the wells of a row, columns 1, 3, 5, 7, 9 and 11, 5 μl buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 ) submitted. In columns 2, 4, 6, 8, 10 and 12 each 5 μl 10% Triton X-100.
Die 96-well-Platte wird wie in Figur 2 dargestellt belegt. In die Spalten 1-6 werden je 5 μl der in Puffer inkubierten Liposomen gegeben, in die Spalten 7-12 die in Serum inkubierten. Zu den 5 μl Probe plus 5 μl Puffer bzw. Triton werden 290 μl Puffer gegeben. Es wird jeweils wieder ein Basis- und ein Triton-Wert genommen. Auf diese Weise kann man drei Formulierungen über 8 Zeitpunkte pro Platte testen. Die Zeitpunkte sind die folgenden: null, null, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 5 h, 24 h. Für die Messungen der Fluoreszenz wird ein Plattenreader mit 485/530 nm Filtern verwendet. Aus den gemessenen Floureszenzdaten werden die reltiven Freisetzungswerte errechnet, indem der Tritonwert 100% Freisetzung entspricht. Tabelle 1 zeigt eine Reihe von getesteten Formulierungen. Es zeigt sich, dass nur erfindungsgemäße Zusammensetzungen eine hohe Serumstabilität besitzen.The 96-well plate is loaded as shown in Figure 2. Columns 1-6 each contain 5 μl of the liposomes incubated in buffer, columns 7-12 each in serum incubated. 290 μl buffer are added to the 5 μl sample plus 5 μl buffer or Triton. A base and a triton value are used again. In this way one can test three formulations over 8 times per plate. The times are as follows: zero, zero, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 24 hours. A plate reader with 485/530 nm filters is used to measure the fluorescence. The relative release values are calculated from the measured fluorescence data, in that the triton value corresponds to 100% release. Table 1 shows a number of formulations tested. It can be seen that only compositions according to the invention have a high serum stability.
Beispiel 4Example 4
Einschluß von FITC-ODN (fluoreszenzmarkierte Antisense-DNA)Inclusion of FITC-ODN (fluorescence-labeled antisense DNA)
Das verwendete Antisense-Oligonukleotid (ODN) ist ein 18-rner Phosphorothioat mit einer FITC-Markierung am 5'-Ende (Fluorescein-isothiocyanat). Liposomen mit FITC- ODN wurden hergestellt: 0,5 ml einer 1 mM Lipidlösung mit 9 μg ODN. Zwei Ansätze mit unterschiedlichem molaren Verhältnis der kationischen Lipid-Ladungen zu anionischen ODN-Ladungen 3:1 und 4,5:1The antisense oligonucleotide (ODN) used is an 18-th phosphorothioate with a FITC label at the 5 'end (fluorescein isothiocyanate). Liposomes with FITC-ODN were prepared: 0.5 ml of a 1 mM lipid solution with 9 μg ODN. Two approaches with different molar ratios of the cationic lipid charges to anionic ODN charges 3: 1 and 4.5: 1
- Jeweils DPPC/DOTAP/DG-Succ/Chol 20/10/30/40- DPPC / DOTAP / DG-Succ / Chol 20/10/30/40 each
- Hydratisierungs- bzw. ODN-Lösung: 10 mM NaAc pH 4,5, 300 mM Sucrose- Hydration or ODN solution: 10 mM NaAc pH 4.5, 300 mM sucrose
- Zur Abtrennung nicht eingeschlossenen ODNs wurden die Liposomen in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten mit 0, 0,8 und 1 ,2 M Sucrose in Hep10, NaCI150 flotiert (10mM Hepes, 150 mM NaCI).- To separate non-included ODNs, the liposomes were floated in a discontinuous sucrose gradient with 0, 0.8 and 1, 2 M sucrose in Hep 10 , NaCI 150 (10mM Hepes, 150mM NaCI).
Bestimmung des Einbaus an FITC-ODN aus der Summe der gemessenen FITC-ODN - Fluoreszenzen (100 %) bzw. des Input und daraus abgeleitet dem Verhältnis von freier zu eingebauter Fluoreszenz:Determination of the installation of FITC-ODN from the sum of the measured FITC-ODN fluorescence (100%) or the input and derived from this the ratio of free to built-in fluorescence:
% Liposomen Lipo-Reste Puffer/Sucr. freie ODN gesamt 3:1 43,3 14,7 5,4 36,6 100,0 4,5:1 46,3 10,7 4,5 38,5 100,0% Liposomes lipo residues buffer / sucr. Total free ODN 3: 1 43.3 14.7 5.4 36.6 100.0 4.5: 1 46.3 10.7 4.5 38.5 100.0
Beispiel 5Example 5
Einschluß von siRNA (anti GFP) in amphotere Liposomen Als Ladungsverhältnis von kationischem Lipid zu anionischer siRNA wird 5:1 bis 10:1 gewählt. Die siRNA (in 10 mM Hepes, 10 mM NaCI pH 7,2) wird mit dem Hydratisierungspuffer (10 mM NaAcetat, 10 mM NaCI, 280 mM Sucrose, pH 4,5) vermischt und auf den Lipidfilm gegeben, sodass eine 5-10 mM Lipidsuspension entsteht. Die Lipide werden durch Ultraschallbehandlung von der Kolbenwand gelöst (max. 10 min). Hydratisiert wird für 15 min bei Raumtemperatur (PO PC als Trägerlipid) bzw. bei 50 °C (bei DMPC, DPPC als Trägerlipid). Es folgt ein mindestens dreimaliges Einfrieren bei -70 °C (10 min für 1 ml Volumen, 30 min für Volumina bis 15 ml) und wieder Auftauen im Wasserbad (Temperatur wie beim Hydratisieren). Der Kolben wird aufgetaut und bei größeren Volumina werden 3 ml der Lösung entnommen (in 8 ml Glasröhrchen). Der restliche Ansatz wird wieder bei -70 °C eingefroren. Die Extrusion erfolgt durch 100 nm-Filter. Anschließend wird der pH Wert mit 1/10 Volumen 1 M Hepes auf pH 8,0 eingestellt. Flotation der Liposomen:Inclusion of siRNA (anti GFP) in amphoteric liposomes 5: 1 to 10: 1 is chosen as the charge ratio of cationic lipid to anionic siRNA. The siRNA (in 10mM Hepes, 10mM NaCl pH 7.2) is mixed with the hydration buffer (10mM NaAcetate, 10mM NaCl, 280mM sucrose, pH 4.5) and applied to the lipid film so that a 5-10 mM lipid suspension is formed. The lipids are detached from the piston wall by ultrasound treatment (max. 10 min). It is hydrated for 15 min at room temperature (PO PC as carrier lipid) or at 50 ° C (with DMPC, DPPC as carrier lipid). This is followed by freezing at least three times at -70 ° C (10 min for 1 ml volume, 30 min for volumes up to 15 ml) and thawing again in a water bath (temperature as for hydration). The flask is thawed and, for larger volumes, 3 ml of the solution are removed (in 8 ml glass tubes). The rest of the mixture is frozen again at -70 ° C. The extrusion takes place through 100 nm filters. The pH is then adjusted to pH 8.0 with 1/10 volume of 1 M Hepes. Flotation of the liposomes:
Die Liposomen Fraktionen werden mit dem selben Volumen 2,4 M Sucrose in H2O versetzt (d.h. es entsteht eine 1 ,2 M Lösung). Den Gradienten schichtet man mit Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5), darunter 0,8 M Sucrose in Puffer und zuunterst die Liposomen in 1 ,2 M Sucrose in H2O. Das Volumen des Gradienten beträgt maximal 4,5 ml. Die Flotation erfolgt bei Raumtemperatur für 45 min bei 50.000 rpm in einer Ultrazentrifuge. Die Liposomen, welche sich zwischen der 0,8 M Sucrose- und der Pufferschicht befinden, werden abgenommen.The liposome fractions are mixed with the same volume of 2.4 M sucrose in H 2 O (ie a 1.2 M solution is formed). The gradient is layered with buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5), including 0.8 M sucrose in buffer and below the liposomes in 1.2 M sucrose in H 2 O. The volume of the gradient is maximal 4.5 ml. The flotation is carried out at room temperature for 45 min at 50,000 rpm in an ultracentrifuge. The liposomes, which are located between the 0.8 M sucrose and the buffer layer, are removed.
RNA-Mengenbestimmung mit Ribo Green RNA Quantitation ReagentDetermination of RNA quantity with Ribo Green RNA Quantitation Reagent
Der Assay wird im Endvolumen von 200 μl durchgeführt. Zuerst fertigt man eine Eichreihe der siRNA zwischen 1 ng und 10 ng an (10-100 μl 100 ng/ml siRNA). Das Ribo Green verdünnt man 1 :2000 in TE-Puffer. Zu jedem Ansatz werden 100 μl Ribo Green zugegeben, dann inkubiert man 5 min bei Raumtemperatur und misst die Fluoreszenz bei 485/520 nm. Die Ansätze werden mit je 4 μl 10 % Triton (Endkonzentration 0,2 mM) versetzt. Diese Eichkurve dient später für die Bestimmung der in Liposomen eingeschlossenen Menge an siRNA. Nach ca. 15 min misst man noch einmal die Fluoreszenz. Die Ergebnisse werden graphisch in ein Diagramm eingetragen (je eine Kurve mit und ohne Triton) und Eichgeraden mit den dazu gehörigen Gleichungen aus den Werten generiert.The assay is carried out in a final volume of 200 μl. First, a calibration series of the siRNA is made between 1 ng and 10 ng (10-100 μl 100 ng / ml siRNA). The Ribo Green is diluted 1: 2000 in TE buffer. 100 μl of Ribo Green are added to each batch, then incubated for 5 min at room temperature and the fluorescence is measured at 485/520 nm. The batches are mixed with 4 μl of 10% Triton (final concentration 0.2 mM). This calibration curve will later be used to determine the amount of siRNA enclosed in liposomes. After about 15 minutes, the fluorescence is measured again. The results are entered graphically in a diagram (one curve each with and without Triton) and calibration lines with the corresponding equations are generated from the values.
Die Liposomen verdünnt man in zwei verschiedenen Konzentrationen (z.B. 1 :50 und 1 :100) und misst 2-3 verschiedene Volumina der Verdünnungen (z. B. 5, 10 und 15 μl der Verdünnungen ad 100 μl TE plus 100 μl Ribo Green Reagenz) ohne und mit Triton. Die errechnete Konzentration der siRNA einer Formulierung muss bei den verschiedenen Messungen in etwa übereinstimmen. Ist dies nicht der Fall, lag man mit der siRNA-Menge außerhalb der Eichkurven und sollte diese Werte nicht in die Berechnung der Konzentration einfließen lassen. Die Effizienz, mit der die siRNA in verschiedene Formulierungen eingeschlossen werden konnte zeigt die Tabelle 2.The liposomes are diluted in two different concentrations (e.g. 1:50 and 1: 100) and 2-3 different volumes of the dilutions are measured (e.g. 5, 10 and 15 μl of the dilutions to 100 μl TE plus 100 μl Ribo Green reagent ) without and with Triton. The calculated concentration of the siRNA of a formulation must roughly match in the different measurements. If this is not the case, the siRNA amount was outside the calibration curves and these values should not be included in the calculation of the concentration. The efficiency with which the siRNA could be included in various formulations is shown in Table 2.
Tabelle 2: Einschluss siRNA antiGFP in amphotere LiposomenTable 2: Inclusion of siRNA antiGFP in amphoteric liposomes
Test von siRNA-haltigen Liposomen im SerumTest of siRNA-containing liposomes in serum
Unmodifizierte siRNA wird im Serum sehr schnell abgebaut. Um den schützenden Effekt der Liposomen auf die siRNA zu untersuchen, wird wie im Folgenden dargestellt vorgegangen. Die Konzentration der eingeschlossenen siRNA wird vor dem Serumtest bestimmt. Für jeden zu testenden Zeitpunkt werden Liposomen mit je 4 μg siRNA pro Zeitpunkt eingesetzt. Getestete Zeitenpunkte: Null, 1 h, 2 h und 4 h. Die Liposomen mit 4 μg siRNA im Innern werden auf 60 μl Volumen ver ünnt mit dem Puffer, in welchem sich die Liposomen befinden (üblicherweise 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5). Zu den Ansätzen werden 60 μl Serum zugegeben und bis zu den entsprechenden Zeitpunkten bei 37 °C inkubiert. Der Nullzeitpunkt wird separat bestimmt.Unmodified siRNA is broken down very quickly in the serum. In order to investigate the protective effect of the liposomes on the siRNA, the procedure is as shown below. The concentration of the included siRNA is determined before the serum test. Liposomes with 4 μg siRNA per time are used for each time to be tested. Tested times: zero, 1 h, 2 h and 4 h. The liposomes with 4 μg siRNA inside are diluted to a volume of 60 μl with the buffer in which the liposomes are located (usually 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5). 60 μl of serum are added to the batches and up to the incubated at 37 ° C at appropriate times. The zero time is determined separately.
Eine Phenol/Chloroform-Extraktion wird mit PLG-Eppis (Phase-Lock-Gel- Eppendorfröhrchen) durchgeführt für eine gute Trennung der Serumbestandteile und der Lipide von der siRNA. Die PLG-Eppis werden für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert und auf Eis gestellt (im folgenden wird bei max. 4 °C gearbeitet). In die PLG-Eppis gibt man 280 μl Puffer (wie oben) und 45 μl 5 M NaCI.A phenol / chloroform extraction is carried out with PLG-Eppis (phase lock gel Eppendor tubes) for a good separation of the serum components and the lipids from the siRNA. The PLG-Eppis are centrifuged for 1 min at 13,000 rpm and placed on ice (in the following, work is carried out at max. 4 ° C). 280 μl of buffer (as above) and 45 μl of 5 M NaCI are added to the PLG-Eppis.
In diese Lösung kommt der Ansatz der Liposomen im Serum (120 μl). Sofort danach erfolgt die Zugabe von 300 μl Phenol/Chloroform-Gemisch. Für den Nullwert gibt man zum Puffer mit NaCI in das PLG-Eppi auch 60 μl Serum. Alles wird sofort gemischt. Es folgt eine Zentrifugation für 10 min bei 13 000 rpm und 4 °C. die wässrige Phase enthält die freie siRNA. Auf den Gradienten werden weitere 300 μl Chloroform gegeben und kurz gemischt. Nach einer weiteren Zentrifugation wie oben ist die wässrige Phase klar und kann möglichst vollständig abgenommen werden. Die siRNA wird nun aus der wässrigen Phase gefällt. Zur siRNA-Lösung gibt man 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2 und 2,5 Volumenteile Ethanol. Die Lösung wird gut durchmischt und die siRNA 1 h bei -70 °C ausgefällt. Eine weitere Zentrifugation bei 4°C, 13 000 rpm für 10 min folgt. Dabei pelletiert die siRNA. Der Überstand wird vollständig abgenommen und das Pellet wird mit 200 μl 70 % Ethanol gewaschen und für ca. 10 min getrocknet. Die siRNA wird in 5 μl Wasser wieder gelöst.The liposomes in the serum (120 μl) are added to this solution. Immediately afterwards, 300 μl phenol / chloroform mixture is added. For the zero value, 60 μl serum is also added to the buffer with NaCI in the PLG-Eppi. Everything is mixed immediately. Centrifugation for 10 min at 13,000 rpm and 4 ° C follows. the aqueous phase contains the free siRNA. A further 300 μl of chloroform are added to the gradient and mixed briefly. After a further centrifugation as above, the aqueous phase is clear and can be removed as completely as possible. The siRNA is now precipitated from the aqueous phase. 1/10 volume of 3 M NaOAc, pH 5.2 and 2.5 parts by volume of ethanol are added to the siRNA solution. The solution is mixed well and the siRNA is precipitated for 1 h at -70 ° C. Another centrifugation at 4 ° C, 13,000 rpm for 10 min follows. The siRNA pellets. The supernatant is removed completely and the pellet is washed with 200 μl 70% ethanol and dried for approx. 10 min. The siRNA is redissolved in 5 μl of water.
Die Qualität der siRNA wird im denaturierenden und möglicherweise auch im nativen Acrylamidgel überprüft.The quality of the siRNA is checked in the denaturing and possibly also in the native acrylamide gel.
Nachweis der Doppelsträngigkeit von siRNA im nativen AcrylamidgelEvidence of the double strandedness of siRNA in the native acrylamide gel
Die Qualität von siRNA wird über die vollständige Länge der Einzelstränge und dieThe quality of siRNA is determined over the full length of the single strands and the
Doppelsträngigkeit definiert. Mittels eines nativen Acrylamidgels kann man dieDouble-strandedness defined. Using a native acrylamide gel, you can
Doppelsträngigkeit einer siRNA überprüfen, da sich doppelsträngige siRNA langsamer im nativen Gel bewegt, als die Einzelstränge.Check double-strandedness of an siRNA, since double-stranded siRNA moves more slowly in the native gel than the single-stranded.
Das Gel muss mit TBE-Puffer 30 min vorlaufen (80 V, 100 mA), um die erforderlicheThe gel must be pre-run with TBE buffer for 30 min (80 V, 100 mA) to achieve the required
Temperatur zu bekommen.To get temperature.
Es werden höchstens 2 μg siRNA pro Slot aufzutragen, da sonst das Gel überladen wird. Die Proben werden in einem Gesamtvolumen von 9 μl aufgenommen. Darauf gibt man 1 μl Blue Juice-Ladepuffer. Die Proben werden auf das vorgelaufene Gel aufgetragen und für 1 h bei 100 mA aufgetrennt.A maximum of 2 μg siRNA per slot should be applied, otherwise the gel will be overloaded. The samples are taken up in a total volume of 9 μl. Then add 1 μl of Blue Juice loading buffer. The samples are applied to the previous gel and separated for 1 h at 100 mA.
Färben des Gels: Das Gel wird nach der Elektrophorese aus der Apparatur entnommen. Auf das Gel werden ca. 200 ml Stains All Gebrauchslösung (20 ml Stammlösung, 180 ml Formamid, 200 ml Wasser gegeben. Das Gel wird im Dunklen für 30 -60 min in der Stains All-Lösung gefärbt. Danach wird die Lösung vom Gel genommen und das Gel wird unter Lichtzutritt im Wasser entfärbt (ca. 30 min-2 h je nach Lichtintensität). Die siRNA bleibt gefärbt, wohingegen der Hintergrund wieder völlig entfärbt wird.Staining the gel: The gel is removed from the apparatus after electrophoresis. Approx. 200 ml Stains All working solution (20 ml stock solution, 180 ml formamide, 200 ml water) are added to the gel. The gel is stained in the dark for 30-60 min in the Stains All solution. The solution is then removed from the gel and the gel is decolorized under the influence of light in the water (approx. 30 min-2 h depending on the light intensity) .The siRNA remains colored, whereas the background is completely decolored again.
Beispiel 6Example 6
In vitro Aufnahme von amphoteren Liposomen mit Cy3-BCL2-Antisense inIn vitro uptake of amphoteric liposomes with Cy3-BCL2 antisense in
HepG2 ZellenHepG2 cells
HepG2 Zellen werden 2 Tage vor der Transfektion in 96-Wellplatten ausgesät, so dass sie am Tag der Transfektion eine Zelldichte von 60 - 80% zeigen (0,02-0,2 x 10 5 in 100 μl, i.d.R. 1 x 10 4). Es werden 2 Platten (Zentrifugation u. Kontrollinkubation) vorbereitet, die ansonsten identisch behandelt werden.HepG2 cells are sown in 96-well plates 2 days before the transfection, so that they show a cell density of 60-80% on the day of the transfection (0.02-0.2 x 10 5 in 100 μl, usually 1 x 10 4 ) , Two plates (centrifugation and control incubation) are prepared, which are otherwise treated identically.
Transfektion:transfection:
Vortemperierung der Zentrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus), Rotor # 3048 für Mikrotiterplatten. Cy3-Bcl2-Antisense-haltige Liposomen werden auf eine einheitliche Konzentration mit 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7.5 (HBS) eingestellt (Cy-3 ist ein rot floureszierender Marker).Pre-heating of the centrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus), rotor # 3048 for microtiter plates. Liposomes containing Cy3-Bcl2 antisense are adjusted to a uniform concentration with 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 (HBS) (Cy-3 is a red fluorescent marker).
Herstellung der Liposomenverdünnungen (mit und ohne Cargo) sowie Transfektionsmix von kommerziellen Kontrolltransfektionsreagenzien (z.B. Lipofectamine 2000, Oligofecatmine, siPort Amine, siPort Lipid) auf 96-Well Platte mit serumfreiem Medium (ca. 160 ng Antisense/well). Die Liposomenverdünnung wird in einem Volumen von 25 - 50 μl zu den Zellen gegeben werden.Production of liposome dilutions (with and without cargo) and transfection mix of commercial control transfection reagents (e.g. Lipofectamine 2000, oligofecate mine, siPort amine, siPort lipid) on a 96-well plate with serum-free medium (approx. 160 ng antisense / well). The liposome dilution will be added to the cells in a volume of 25-50 μl.
Die Zellen werden mit serumfreien Medium gewaschen (1x) und mit serumhaltigen oder serumfreien Medium versetzt, z.B. je Well 75 μl, wenn die Liposomenverdünnungen so hergestellt wurden, dass die entsprechende Menge antisense/Well in 25 μl enthalten ist.The cells are washed with serum-free medium (1x) and mixed with serum-containing or serum-free medium, e.g. 75 μl per well if the liposome dilutions were prepared in such a way that the corresponding amount of antisense / well is contained in 25 μl.
Eine Multiwellplatte wird bei 1 ,500 rpm (342 g), 1 h, 37°C zentrifugiert, die Kontrollplatte 1 h inkubiert (37°C, 5% CO2). Anschließend werden beide Platten 3 h inkubiert (37°C, 5% CO2). Medium aller Wells komplett entfernen, 1 x mit PBS waschen, 2 x mit serumhaltigen Medium; Zusatz von serumhaltigen Medium zu allen Wells, mikroskopische Kontrolle auf Vitalität, anschließend beide Platten über Nacht inkubieren (37°C, 5% CO2).A multiwell plate is centrifuged at 1,500 rpm (342 g), 1 h, 37 ° C., the control plate is incubated for 1 h (37 ° C., 5% CO 2 ). Then both plates are incubated for 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ). Remove medium from all wells completely, wash 1 x with PBS, 2 x with serum-containing medium; Add serum-containing medium to all wells, microscopic control for vitality, then incubate both plates overnight (37 ° C, 5% CO 2 ).
Am Tag nach der Transfektion wird die Aufnahme von Liposomen in die Zellen floureszenzmikroskopisch untersucht. In Abbildung 3 wird Fluoreszenz-aufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung gezeigt.The day after the transfection, the uptake of liposomes into the cells is examined by fluorescence microscopy. Figure 3 shows a fluorescence image next to a phase contrast image for cell localization.
Beispiel 7 Bestimmung der Serumstabilität von amphoteren Liposomen ohne und mit Cholesterol und/oder MatrixlipidExample 7 Determination of the serum stability of amphoteric liposomes with and without cholesterol and / or matrix lipid
Einschluß von FITC-Dextran in amphotere LiposomenInclusion of FITC-dextran in amphoteric liposomes
Folgende Formulierungen wurden mit 15 mg/ml FITC-Dextran hergestellt (in 10 mM Hepes, 150 mM NaCI pH 3.9 (HAc) wie bei Hafez IM, Ansell S, Cullis PR: Tunable pH- sensitive liposomes composed of mixtures of cationic and anionic lipids. Biophys J. 2000 Sep;79(3):1438-46.).The following formulations were prepared with 15 mg / ml FITC-dextran (in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 3.9 (HAc) as in Hafez IM, Ansell S, Cullis PR: Tunable pH-sensitive liposomes composed of mixtures of cationic and anionic lipids Biophys J. 2000 Sep; 79 (3): 1438-46.).
E1 DC-Chol / DOPA (66/34) E2 DC-Chol / DOPA / Chol (40/20/40) E3 DMPC / DC-Chol / DOPA (60/27/13) E4 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (20/27/13/40) E5 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (30/20/10/40) E6 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (40/13/7/40)E1 DC-Chol / DOPA (66/34) E2 DC-Chol / DOPA / Chol (40/20/40) E3 DMPC / DC-Chol / DOPA (60/27/13) E4 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (20/27/13/40) E5 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (30/20/10/40) E6 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (40/13/7/40)
Die Liposomen wurden nach der Extrusion flotiert, um das outside FITC-Dextran abzutrennen. Am Zetasizer wurden bei pH 3,9 (10 mM Hepes 150 NaCI HAc) bzw. pH 9.0 (10 mM Tris 150 mM NaCI) folgende Daten gemessen:The liposomes were floated after extrusion to separate the outside FITC dextran. The following data were measured on the Zetasizer at pH 3.9 (10 mM Hepes 150 NaCI HAc) or pH 9.0 (10 mM Tris 150 mM NaCI):
Test der FITC-Dextran haltigen Liposomen im SerumTest of liposomes containing FITC-dextran in serum
Zum Test der Stabilität dieser Formulierungen in Humanserum wurden ~ 1 mM Liposomen 3 Stunden bei 37°C in Humanserum inkubiert und danach flotiert. Sowohl in der nicht flotierten Probe als auch in der unteren Schicht (Serum-Schicht) der flotierten Probe wurde die Fluoreszenz bestimmt und daraus das cargo release berechnet. Der Anteil outside FITC-Dextran zu Testbeginn wurde durch entsprechende Verdünnung in Puffer pH 3.9 und anschließende Flotation auf die gleiche Weise bestimmt.To test the stability of these formulations in human serum, ~ 1 mM liposomes were incubated for 3 hours at 37 ° C. in human serum and then floated. The fluorescence was determined both in the non-floated sample and in the lower layer (serum layer) of the floated sample and the cargo release was calculated therefrom. The proportion outside FITC-dextran at the start of the test was determined in the same way by appropriate dilution in buffer pH 3.9 and subsequent flotation.
% outside bei % release nach Serum- Testbeginn Inkubation E1 13,2 ± 1 ,2 37,0 ± 5,4 E2 25,2 + 1 ,1 52,2 ± 4,2 E3 8,6 40,4 ± 1 ,6 E4 12,0 18,1 ± 0,3 E5 12,0 21 ,2 + 1 ,6 E6 7,6 20,0 ± 0,6% outside at% release after serum test start Incubation E1 13.2 ± 1, 2 37.0 ± 5.4 E2 25.2 + 1, 1 52.2 ± 4.2 E3 8.6 40.4 ± 1, 6 E4 12.0 18.1 ± 0.3 E5 12.0 21, 2 + 1, 6 E6 7.6 20.0 ± 0.6
Alle Formulierungen, die sowohl 40% Cholesterol als auch Matrix-Lipid enthalten (E4, E5, E6) sind stabiler als die Formulierungen, die nur Cholesterol (E2) oder nur Matrix- Lipid (E3) oder keines von beiden (E1) enthalten. All formulations containing both 40% cholesterol and matrix lipid (E4, E5, E6) are more stable than the formulations containing only cholesterol (E2) or only matrix lipid (E3) or neither of them (E1).

Claims

Patentansprüche claims
1. Serumstabile amphotere liposomale Formulierungen mit mindestens einem Wirkstoff im wässrigen Innenraum, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen - neutrale Lipide mit einem Membrananteil von 10 - 60 rnol% umfassen, - Cholesterol mit einem Anteil von 30 - 50 mol%, als ladungstragende Lipide entweder - amphotere Lipide mit einem Anteil von 5 - 30mol%, oder - Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden mit einem Gesamtanteil von höchstens 50 mol%, umfassen und der Wirkstoff mindestens ein Oligonukleotid umfasst.1. Serum-stable amphoteric liposomal formulations with at least one active ingredient in the aqueous interior, characterized in that the liposomes comprise neutral lipids with a membrane fraction of 10-60 mol%, cholesterol with a fraction of 30-50 mol%, as charge-carrying lipids either - Amphoteric lipids with a proportion of 5-30 mol%, or - Mixtures of cationic and anionic lipids with a total proportion of at most 50 mol%, and the active substance comprises at least one oligonucleotide.
2. Liposomale Formulierung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Cholesterol einen Anteil von 35 - 45 mol%, die amphoteren Lipide einen Anteil von 5 - 20 mol% und/oder die Mischungen einen Anteil von 15 - 45 mol% aufweisen.2. Liposomal formulation according to claim 1, characterized in that the cholesterol has a share of 35-45 mol%, the amphoteric lipids have a share of 5-20 mol% and / or the mixtures have a share of 15-45 mol%.
3. Liposomalen Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut sind.3. Liposomal formulation according to claim 1 or 2, characterized in that the oligonucleotides are composed of 5-100, preferably 5-40 and particularly preferably 10-25 deoxyribonucleotides, ribonucleotides or their chemically modified derivatives.
4. Liposomalen Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide als Einzelstrang, als Doppelstrang oder in komplexer Faltung vorliegen.4. Liposomal formulation according to one of claims 1 to 3, characterized in that the oligonucleotides are present as a single strand, as a double strand or in complex folding.
5. Liposomale Formulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelstränge als Antisense-Oligonukleotide, die Doppelstränge als small- interfering RNA und/oder Decoy-Oligonukleotide und/oder die komplexen Faltungen als Aptamere und/oder Spiegelmere vorliegen.5. Liposomal formulation according to claim 4, characterized in that the single strands are present as antisense oligonucleotides, the double strands as small-interfering RNA and / or decoy oligonucleotides and / or the complex folds as aptamers and / or Spiegelmers.
6. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein Aptameres ist.6. Liposomal formulation according to one of claims 1 to 5, characterized in that the oligonucleotide is an aptamer.
7. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, Hg SS das Oligonukleotid ein Spiegelmeres ist.7. Liposomal formulation according to one of claims 1-6, characterized in Hg SS the oligonucleotide is a Spiegelmer.
8. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DMPS/Chol 40:10:10:40 hat.8. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MoChol / DMPS / Chol 40: 10: 10: 40.
9. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/AC/Chol 50:10:40 hat.9. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / AC / Chol 50:10:40.
10. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DPPS/Chol 35:10:15:40 hat.10. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / HisChol / DPPS / Chol 35: 10: 15: 40.
11. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/lsohistsuccDG/Chol 50:10:40 hat.11. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / lsohistsuccDG / Chol 50:10:40.
12. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MOChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.12. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MOChol / DGSucc / Chol 35: 10: 15: 40.
13. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DGSucc/Chol 40: 10: 10:40 hat.13. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MoChol / DGSucc / Chol 40: 10: 10:40.
14. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.14. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / MoChol / DGSucc / Chol 35: 10: 15: 40.
15. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HistSuccDG/Chol 50:10:40 hat.15. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / HistSuccDG / Chol 50:10:40.
16. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DPPS/Chol 40: 10: 10:40 hat. 16. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / MoChol / DPPS / Chol 40: 10: 10:40.
17. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/DOTAP/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.17. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / DOTAP / DG-Succ / Chol 20: 10: 30: 40.
18. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:10:40 hat.18. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HistChol / Chol 50:10:40.
19. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSuccDG/Chol 40:20:40 hat.19. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HistSuccDG / Chol 40:20:40.
20. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.20. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / MoChol / DG-Succ / Chol 20: 10: 30: 40.
21. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.21. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / HcChol / Chol 50:15:35.
22. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.22. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HcChol / Chol 50:15:35.
23. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.23. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / HistPS / Chol 50:15:35.
24. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.24. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HistPS / Chol 50:15:35.
25. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/AC/Chol 50:15:35 hat.25. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / AC / Chol 50:15:35.
26. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/AC/Chol 50:15:35 26. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / AC / Chol 50:15:35
27. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.27. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HistChol / Chol 50:15:35.
28. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 -5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.28. Liposomal formulation according to one of claims 1 -5, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / HistChol / Chol 50:15:35.
29. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.29. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MoChol / DG-Succ / Chol 20: 10: 30: 40.
30. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.30. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / HistSuccDG / Chol 50:15:35.
31. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/lsoHistSuccDG/Chol 50: 15:35 hat.31. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / lsoHistSuccDG / Chol 50: 15:35.
32. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.32. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DPPC / HistSuccDG / Chol 50:15:35.
33. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/lsoHistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.33. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / lsoHistSuccDG / Chol 50:15:35.
34. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20: 10:30:40 hat.34. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MoChol / DG-Succ / Chol 20: 10:30:40.
35. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat. 35. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / MoChol / Chems / Chol 40: 10: 10: 40.
36. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HistChol/Chol 50:10:40 hat.36. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / HistChol / Chol 50:10:40.
5 37. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/DOTAP/Chems/Chol 30:10:20:40 hat.37. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / DOTAP / Chems / Chol 30: 10: 20: 40.
38. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, 0 dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DGSucc/Chol 40:10:10:40 hat.38. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / HisChol / DGSucc / Chol 40: 10: 10: 40.
39. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung39. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition
5 POPC/HisChol/Chems/Chol 40: 10: 10:40 hat.5 POPC / HisChol / Chems / Chol 40: 10: 10:40.
40. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat. o40. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition DMPC / MoChol / Chems / Chol 40: 10: 10: 40. O
41. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 30:20:10:40 hat.41. Liposomal formulation according to one of claims 1-7, characterized in that the liposomal membrane has the molar composition POPC / MoChol / DGSucc / Chol 30: 20: 10: 40.
5 42. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres.5 42. Use of a liposomal formulation according to any one of the preceding claims for the manufacture of a medicament for the therapeutic treatment of a mammal.
43. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach dem vorhergehenden Anspruch, 0 dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Mensch ist.43. Use of a liposomal formulation according to the preceding claim, 0 characterized in that the mammal is a human.
44. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach Anspruch 42 oder 43 zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation.44. Use of a liposomal formulation according to claim 42 or 43 for parenteral administration, preferably for intravenous administration.
5 45. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere Wirkstoffe enthält. 5 45. Liposomal formulation according to one of claims 1 to 41, characterized in that it contains one or more active ingredients.
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