DE3401178C2

DE3401178C2 -

Info

Publication number: DE3401178C2
Application number: DE3401178A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. 3440 Eschwege De Walker; Karl Heinrich Prof. Durban Za Pegel
Original assignee: Roecar Holdings (netherlands Antilles) Nv Willemstad Curacao Niederlaendische Antillen Nl
Current assignee: HOYER GMBH & CO KG, 41469 NEUSS, DE
Priority date: 1984-01-14
Filing date: 1984-01-14
Publication date: 1991-10-10
Also published as: JPS61112094A; DE3569469D1; EP0151385A2; EP0151385B1; ATE42201T1; EP0151385A3; US4929603A; DE3401178A1; JPH0564614B2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Phytosterolglykosiden oder deren Ester zur Reduzierung erhöhter endogener 5(6)α-Epoxicholesterolspiegel.

Cholesterol ist das wichtigste Zoosterin und ubiquitär im Tierreich verbreitet. Es sei wesentlicher Strukturbestandteil der Membranen tierischer Zellen und der Mitochondrien. Zur Biosynthese von Cholesterol sind praktisch alle Körperzellen befähigt, bei Menschen wird allerdings der überwiegende Teil in der Leber synthetisiert, in der das gesamte Cholesterol synthetisierende Enzymsystem im partikelfreien Zytoplasma vorhanden ist. Insgesamt werden vom erwachsenen Menschen etwa 1-2 g Cholesterol täglich gebildet. Der Mensch nimmt jedoch auch, sofern er nicht streng vegetarisch lebt, Cholesterol mit der Nahrung auf, das mit Hilfe von Galle und Pankreassaft aus dem Darm resorbiert wird. Allgemein beträgt die Resorption etwa 0,5 g täglich.

Bis vor kurzem ist man davon ausgegangen, daß der Umfang der endogenen Biosynthese vom Cholesterolgehalt der Nahrung abhängt. Man nehme an, daß dieser Effekt damit zusammenhängt, daß exogenes, aber auch endogenes Cholesterol die weitere Cholesterolsynthese auf dem Weg der Rückkopplungshemmung zum Stillstand bringt. Es ist aber auch bekannt, daß zahlreiche Hormone den Cholesterolstoffwechsel beeinflussen, so ist beispielsweise bei Insulinmangel die Cholesterolbiosynthese vermehrt und der Blutcholesterolspiegel erhöht. Schilddrüsenhormone senken dem Blutcholesterolspiegel, das gleiche gilt für Östrogene. Erst vor einiger Zeit hat man festgestellt, daß der früher angenommene Rückkopplungsmechanismus nicht für den gesamten Körper zutrifft, sondern daß es Organe oder Cholesterol synthetisierende Zellbereiche gibt, die keinem Rückkopplungsmechanismus unterworfen sind.

Da seit langem bekannt ist, daß Beziehungen zwischen der Entwicklung einer Arteriosklerose und damit zusammenhängenden koronaren Herzerkrankungen bestehen, wenn auch über die Art des Zusammenhanges und die genauen Wirkmechanismen bis heute keine völlige Klarheit herrscht, ist bereits seit geraumer Zeit versucht worden, Substanzen zu finden, die den Cholesterolgehalt im Körper reduzieren. Zu diesem Zweck werden zur Zeit rechtsdrehende Isomere der Schilddrüsenhormone, bestimmte Aryloxialkansäuren, wie Clofibrat und auch das Phytosterin Sitosterol eingesetzt. Obgleich die Wirkungsmechanismen verschieden zu sein scheinen - das in Mengen von täglich 20-25 g eingesetzte Sitosterol führt zu einer Interferenz bei der Cholesterolabsorption im Darm - hat sich herausgestellt, daß durch Gabe dieser Lipidsenker nur eine Beeinflussung des Cholesterolspiegels insoweit möglich ist, als sich dieser aus exogen zugeführten Cholesterol und dem in der Leber synthetisierten zusammensetzt, während der Cholesterolspiegel in anderen Organen oder Zellen auf diese Art und Weise nicht beeinflußt werden kann. Zur Verringerung des Blutcholesterolspiegels ist auch bereits Sitosterolglukosid vorgeschlagen worden, wie sich aus der DT-OS 21 12 215 ergibt.

Das Interesse der Forschung am Cholesterolmetabolismus war bislang wesentlich dadurch bedingt, daß Cholesterol eine Rolle bei der Ausbildung einer Arteriosklerose oder Koronarerkrankungen spielt. Erst in jüngster Zeit hat man herausgefunden, daß einige Metaboliten des Cholesterols allem Anschein nach eine wichtige Rolle als Auslöser von neoplatischen Erkrankungen spielen, denn es hat sich gezeigt, daß in einem normalen gesunden Gewebe Cholesterol unter Enzymeinfluß leicht zu 5(6)α-Expoxicholesterol und 5(6)β-Expoxicholesterol oxidiert wird, wobei die letztere Verbindung gemäß dem α-Isomeren aber regelmäßig in einem 3-4fachen Überschuß vorliegt. Durch Untersuchungen von Blackburn et al, Chem. Commun., 420-421, 1979; Imai et al, Science, 207, 651-653, 1980; Kelsey, Cancer Lett., 6, 143-140, 1979 und Parson et al in Aust. J. Exp. Biol. Med., 56; 287-296, 1978 ist bekannt geworden, daß in cancerösem oder präcancerösem Gewebe sich das Verhältnis von α- zu β-Isomeren des Epoxicholesterols völlig verändert, denn hier liegt ein Überschuß des α-Isomeren über das β Isomere im Verhältnis von 8-12 zu 1 vor. Expoxicholesterol gilt als ausgeprägtes Cancerogen und als cytotoxische Verbindung und wird von Kelsey et al mit dem bekannten potenten Karzinogen 3-Methylcholantren verglichen.

Völlig überrascht wurde jetzt festgestellt, daß Phytosterolglykoside oder deren Ester in der Lage sind, in Organflüssigkeiten und -geweben mit einem erhöhten Gehalt 5(6)α-Epoxicholesterol diesen signifikant zu senken.

Zwar ist beispielsweise Sitosterolglukosid in der DT-OS 21 13 215 zur Senkung des Blutcholesterolspiegels vorgeschlagen worden und der freie Alkohol wird auch für diesen Zweck eingesetzt; wie aber bereits oben ausgeführt, werden eine ganze Reihe Substanzen heute zur Senkung eines erhöhten Cholesterolspiegels im Blut verwendet und es hätte vermutet werden können, daß sozusagen bei einer Verringerung des Substratangebotes auch der Spiegel an dem 5(6)α-Isomeren als Metaboliten in anderen Geweben fallen würde, wenn derartige Cholesterolsenker eingesetzt werden. Vergleichsversuche haben allerdings gezeigt, daß weder Clofibrat und entsprechende Analoga oder Sitosterol als freier Alkohol trotz ihrer sicherlich auf verschiedenen Wirkungsmechanismen beruhenden Fähigkeit zur Senkung des Blutcholesterolspiegels keinerlei Änderungen des Cholesterolspiegels in anderen Organflüssigkeiten oder -geweben und keine Verringerung des Gehaltes an 5(6)α-Epoxicholesterol bewirken. Der genaue Wirkungsmechanismus, der bei Gabe von Phytosterolglykosiden oder deren Estern zu einer Verringerung dieses Metaboliten führt, ist bisher nicht bekannt. Beide Epoxicholesterole sind scheinbar normale endogene Zwischenprodukte in der Transformation von Cholesterol zum Cholestan-3β,5α,6β-triol in der Leber und wahrscheinlich auch in anderen Geweben, um dann mittels der enterohepatischen Zirkulation via Faeces eliminiert zu werden. Eine Blockierung oder Degeneration der enzymatischen Überführung der 5(6)-Epoxicholesterole in das Cholestan-3β,5α,3β-triol führt dann zu einer Akkumulation von Cholesterol und den Epoxiden mit darauf folgender Hyperplasie der betroffenen Gewebe, die schließlich in Neoplasie und Krebs ausarten kann. Es hat nun erstaunlicherweise gezeigt, daß Steroline die Anreicherung von 5(6)α-Epoxicholesterol und seines β-Isomers reduzieren oder verhindern und damit auch die Cholesterolakkumulation verhindern oder reduzieren. Es wird angenommen, daß hierbei eine Regenerierung oder Normalisierung des Enzymsystems eine Rolle spielt, das für die Umwandlung der Epoxide zum Triol verantwortlich ist.

Erfindungsgemäß wird daher vorgeschlagen, Phytosterolglykoside und/ oder deren 6′-O-Acylester zur Behandlung eines erhöhten endogenen 5(6)α-Epoxicholesterolspiegels und somit zur Prophylaxe bzw. Therapie von malignen Entartungen des Gewebes einzusetzen.

Phytosterolglykoside, auch Steroline genannt, und deren 6′-O-Acylester mit Fettsäuren sind in Pflanzen natürlich vorkommende Substanzen, die auch, wie beispielsweise in der DT-OS 23 12 285 angeben, synthetisiert werden können. Typische Phytosterole sind Campesterol, Sitosterol, Stigmasterol, Spinasterol und auch die 5α-5,6-Dihydrosterole. Zu den Sterolinen gehören nicht nur die in der Natur vorkommenden Glukoside, sondern auch andere Glykoside, in denen Monosaccharide wie Galaktose, Manose, Arabenose usw. die Glukose ersetzen.

Unter Steroline werden aber auch Triterpenoidabkömmlinge eingeordnet, bei denen der Alkohol Lanosterol, Cycloartenol, Optusifoliol oder Lophenol oder ähnliche Verbindungen darstellt und die ebenfalls in Form der Glykoside bzw. ihrer Ester in der Natur vorkommen. Außer den natürlich vorkommenden Estern können auch synthetisch dargestellte Ester eingesetzt werden, wie beispielsweise Hemiester von Dicarbonsäuren wie sie in der europäischen Patentanmeldung 7 747 beschrieben sind.

Die hier in Frage kommenden Verbindungen entsprechen der folgenden allgemeinen Formel

in der Z einen gegebenenfalls veresterten Zuckerrest, R eine gegebenenfalls ungesättigte Seitenkette mit 6-8 C-Atomen bedeuten und in der an dem C-Atomen 4,5, und 14α- oder β-Konfiguration vorliegen kann. Außerdem können im Sterangrundgerüst Doppelbindungen oder Methylenbrücken auftreten.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Die Herstellung der Sterolglykoside erfolgt nach an sich bekannten Verfahren wie der Königs-Knorr-Synthese zur Herstellung von Glukosiden unter Verwendung der entsprechenden Aglykone und eines am C₁ bromierten Zucker-acetates unter Zugabe von Silber- oder Cadminumsalzen als Katalysator.

Die in den pharmakologischen und klinischen Untersuchungen verwendeten Sterolglukoside wurden nach dem in der DT-OS 27 59 171 in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren herge stellt.

In gleicher Weise können unterschiedliche Glykoside des Sitosterols hergestellt werden; durch Austausch des Aglykons können außer Sitosterol auch Derivate der übrigen Phytosterole wie beispielsweise Campesterol, Stigmasterol, Lanosterol oder Cycloartenol erzeugt werden.

Die Herstellung synthetischer Glykosidester erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise durch Veresterung der freien OH-Gruppen oder durch Umesterung der Acetate oder wie in der Europa-Anmeldung 7 747 beschrieben.

Beispiel 2

Die Senkung des 5(6)α-Expoxicholesterolspiegels wurde mit Prostataexprimat durchgeführt, da bekannt ist, daß Epoxicholesterol in der menschlichen Prostata vorliegt, und zwar bei Patienten, die an Prostatahyperplasie oder Prostatakarzinom leiden, wie dieses in der Dissertation von David Reinhold Brill, State University of New Jersey, New Jersey, Mai 1981 angegeben wurde.

Die Bestimmung wurde an Exprimatproben von verschiedenen Männern verschiedenen Alters durchgeführt, wobei die erste Exprimatprobe vor einer Behandlung mit Phystosterolglukosiden entnommen und die zweite Exprimatprobe nach einer sechsmonatigen Behandlung mit Sitosterolglukosid in Mengen von 0,45 mg/Tag untersucht wurde.

Die Behandlung wurde mit einem Gemisch natürlicher Steroline durchgeführt, das in den Alkoholanteilen aus etwa 80% Sitosterol, 7% Campesterol, 7% Stigmasterol und 6% 5α-Dihydrosterole bestand.

Eposicholesterol wird als Trimethylsilyläther mittels GC/ms identifiziert. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch Integration der Peakflächen mit Cholesterolmethyläther als innerem Standard.

Zu 50 µl Exprimat wurden in einem 5 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß 10 µg innerer Standard zugesetzt und die Probe gefriergetrocknet. Der Gefriertrockenrückstand wurde mit 2 ml Chloroform/Methanol 2/1 gevortext und mit Ultraschall behandelt, 5 Min. bei 2000 rpm zentrifugiert und der Überstand in ein zweites Röhrchen überführt. Die Extraktion wurde noch 2mal wiederholt, die vereinigten Extrakte mit 1 ml physiolog. Kochsalzlösung gewaschen und die wäßrige Phase verworfen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und im Stickstoffstrom bei ca. 50°C im Sandbad zur Trockne gebracht. Zum Rückstand wurden 0,1 ml Silylierungsreagenz pipettiert, bestehend aus 5 ml Pyridin trocken, 3 ml Hexanmethyldisilazan und 1 ml Chlortrimethylsilan. Der Ansatz blieb für eine Stunde bei 60°C im Sandbad, wurde im Stickstoffstrom zur Trockne gebracht, in 0,5 ml Hexan aufgenommen, mit Ultraschall behandelt und bei 2000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Spitzröhrchen überführt und auf ein Endvolumen von 30 µl eingeengt und zur Analyse bereitgestellt. (Die Derivate sind nicht lange haltbar und können gegebenenfalls nachsilyliert werden. Versuche haben ergeben, daß die Analyse auch ohne Derivatisierung durchgeführt werden kann). Für die Eichkurve wurden Ansätze zubereitet, die die 3 Komponenten in steigenden Mengen in folgenden Konzentrationen enthielten:

Cholesterol
0-75 µg/50 µl
Cholesterolepoxid	0-3 µg/50 µl
Cholesterolmethylether konstant	10 µg/50 µl

Diese Eichwerte wurden wie die Proben bearbeitet.

Gaschromatographische Bedingungen
Gerät
Carlo Erba Fracto vap 4160
Trägergas
Stickstoff, 0,9 bar Vordruck
Trennkapillare	25 m Glas, 025 µm SE 52
Temp.-Prog.	180° (3 Min) - 10°/Min - 280° (30 Min)
Injektion	2 µl on column bei 40°

Massenspektrometrische Bedingungen
Gerät
MS 30 computerisiert, Fa. Kratos
Ionisierung bei 70 eV, EI
Scangeschwindigkeit	6 sek/Spektrum
Massenbereich	30-650 m/e

Die Auswertung der Epoxicholesterolmengen in µg/ml ergab, daß bei einem anfänglich geringen Gehalt zwischen etwa 5-10 µg/ml eine Absenkung auf 0, bei der zweiten Messung nach 6 Monaten erfolgte. Besonders überraschend war aber die Reduktion anfänglich hoher Meßwerte, so ergaben Untersuchungen eine Absenkung von 50 µg/ml auf 6, von 109 auf 67 und von 111 auf 0 µg/ml.

Tabelle

Claims

Verwendung von Phytosterolglykosiden und/oder deren 6′-O-Acylester zur Reduzierung erhöhter endogener 5(6)α-Epoxicholesterolspiegel bei der Prophylaxe oder Behandlung von malignen Entartungen des Gewebes.