DE3390113C2

DE3390113C2 -

Info

Publication number: DE3390113C2
Application number: DE3390113T
Authority: DE
Inventors: William Alvin Carter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-08-05
Filing date: 1983-08-04
Publication date: 1992-10-08
Also published as: GB2136815A; IL85882A0; GB2136815B; IT1168955B; GR78914B; BR8307474A; DK179484A; AU1889083A; AU561752B2; ES524744A0; IT8322460A0; DE3390113T1; GB8407964D0; GB2177702A; FR2531313A1; DK179484D0; WO1984000466A1; JPS59501495A; IL69382A; ES8406159A1

Description

Erfindungsbereich

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Pathogene bzw. gegen Viren. Es soll gegen Pflanzenvirusinfektionen vorgebeugt werden oder diese zum Stillstand gebracht werden.

Hintergrund der Erfindung

Die Ubiquität von Pflanzenviren trägt in kostenverursachender Weise zu dem globalen Problem der Nahrungsmittelversorgung bei. Keine Hemisphäre dieser Erde bleibt von den verheerenden Wirkungen der Pflanzenviren auf ihre Nahrungspflanzenkulturen und sogar ihre Zierpflanzen verschont.

Es ist beispielsweise zu beachten, daß virusinduzierte Pflanzenkrankheiten in der Lage sind, sowohl einen letalen Befall von Kokospalmen in den Tropen als auch die Vernichtung von Weizen, Gerste und anderem Getreide im Norden Kanadas zu verursachen. Gegenwärtig ist keine Therapie oder kein Heilmittel bekannt außer dem primitiven Verfahren der "Auslese", bei dem der Farmer oder Pfleger das infizierte Pflanzenmaterial beseitigt, bevor zuvor nicht-infizierte Pflanzen angesteckt werden. Berücksichtigt man die mikroskopische Natur der infizierenden Virusorganismen und die daher selbstverständliche Unmöglichkeit, die Infektion mit bloßem Auge zu erkennen, bevor es zum "Auslesen" zu spät ist, so wird sofort deutlich, daß ein grundsätzlich anderes Vorgehen notwendig ist.

Was gebraucht wird, ist (1) die Möglichkeit, pflanzliches Keimplasma in spezifischer Weise zu ändern, so daß die pflanzeneigene Resistenz gegenüber Viren gekräftigt wird und (2) die Möglichkeit, bereits infiziertem Pflanzenzellmaterial eine unschädliche Substanz oder Substanzen exogen zuzuführen, die den Pflanzenzellen auf breiter Ebene Schutz gegen ein ganzes Spektrum verschiedener Pflanzenviren vermitteln und so einem weiteren Ernteschaden vorbeugen und die kontinuierliche Ausbreitung der infektiösen Stoffe aufhalten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Erfordernisse, indem sie Verfahren schafft, mit denen Mitglieder des Pflanzenreiches mit den vorteilhaften physiologischen Wirkungen von IFN versehen werden können.

Untersuchungen im Hinblick auf die Übertragung von exogenem Human-Interferon (HuIFN) auf Pflanzen sind bereits durchgeführt worden, vgl. Orchansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2278, (1982). Eine entsprechende Studie ist ebenfalls im Hinblick auf die exogene Übertragung eines sogenannten intrazellulären Mittlers (2′-5′-Oligoadenylatsynthetase) auf Pflanzen durchgeführt worden, vgl. Devash et al., Science 216, 1415 (1982).

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung geht von der Feststellung des Erfinders aus, das bestimmte essentielle Aminosäuresequenzen oder biochemische Fragmente von Proteinen einer natürlich auftretenden Klasse, als Interferone (IFN) bezeichnet, in der Lage sind, das Wachstum von Pflanzenviren und die Zellschädigung bereits infizierter Pflanzen aufzuhalten und ferner der Ausbreitung verschiedener chronischer oder latenter Pflanzenviren auf normale nichtinfizierte Pflanzen vorzubeugen, d. h. der Infektion am Ausgangspunkt vorzubeugen. Diese doppelte Fähigkeit wird in den Ansprüchen als "Schutz" einer Pflanze gegen Viren bezeichnet.

Die oben genannten essentiellen Aminosäuresequenzen werden auch in der Beschreibung und in den Ansprüchen als "Ursequenzen" (ancestral sequences) bezeichnet. Eine Ursequenz ist eine solche Sequenz, die sich im Laufe der Evolution, d. h. über einen Zeitraum von mindestens Millionen und vermutlich sogar zehn oder hunderten von Millionen Jahren ohne Änderung erhalten hat. Im Sinne dieser Erfindung ist eine "Ursequenz" oder ein "Urfragment" als jegliche Aminosäuresequenz definiert, die per se normalerweise nicht frei in der Natur anzutreffen ist und die in sich selbst und aus sich selbst heraus die Fähigkeit besitzt, die Entwicklung einer Antivirus-Antwort bei Pflanzen zu bewirken. Der Erfinder hat festgestellt, daß Ursequenzen mindestens teilweise für die Verleihung von IFN-Eigenschaften an ganze Moleküle oder größere Fragmente, die die Ursequenz (oder Sequenzen) enthalten, verantwortlich sind.

Somit liegt dem erfindungsgemäßen Verfahren die Aufgabe zugrunde, den Abwehrmechanismus gegenüber pathogenen Einflüssen wirksam zu steuern.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 bzw. des nebengeordneten Anspruchs 20 gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 bzw. Anspruch 20 sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die Erfindung kann auf eine Vielzahl verschiedener Ausführungsweisen durchgeführt werden, die entweder auf der:

a) genetischen Ebene ansetzen, d. h. Inkorporation der genetischen Information, die die Biosynthese einer Ursequenz oder eines Moleküls (beispielsweise Gesamt- HuIFN) mit einem Gehalt an einer oder mehreren Ursequenzen in der Pflanzenzelle codiert (programmiert), oder
b) auf der mechanischen Ebene, d. h. der exogenes physikalisches Zuführen von IFN(en) oder deren Fragmenten, d. h. topisch zu bereits infiziertem Pflanzengewebe oder Pflanzengeweben, die dem unmittelbaren Risiko einer Virusinfektion ausgesetzt sind.

Zusätzlich können doppelsträngige Ribonucleinsäuren (dsRNSn) natürlichen (jeglicher phylogenetischer Herkunft) oder synthetischen Ursprungs den gleichen Effekt bewirken (vorausgesetzt, daß die pflanzlichen Zielzellen ein programmierbares genetisches IFN-Element enthalten) und sogar das therapeutische Ergebnis bei einer Vielzahl von Pflanzenzellen-Virus-Wechselwirkungen verstärken.

Eine der bedeutendsten Befunde im Hinblick auf die vorliegende Erfindung ist die Erkenntnis, daß weniger als das vollständige IFN-Molekül ausreicht, um eine Antivirus-Antwort hervorzurufen. Der Erfinder hat mit anderen Worten festgestellt, wie nachfolgend im einzelnen dargelegt wird, daß bestimmte Aminosäuresequenzen innerhalb eines IFN-Moleküls eine Antivirus-Antwort hervorrufen, die im wesentlichen derjenigen äquivalent ist, die durch das vollständige IFN-Molekül hervorgerufen werden würde. Der Erfinder hat ferner festgestellt, daß es sich um Ursequenzen handelt, die sich vermutlich, wie erwähnt, durch die Zeiten evolutioniert haben und die ferner übliche Bestandteile der Moleküle vieler pflanzlicher als auch tierischer Organismen sind.

Die Folge dieser Feststellung ist ganz einfach, daß die vorliegende Erfindung weit über den Rahmen vollständiger IFN-Moleküle hinaus anwendbar ist. Das heißt, daß jegliches Molekül, das eine Aminosäureursequenz enthält, wie nachfolgend im einzelnen ausgeführt wird, topisch zugeführt werden kann, um eine Antivirus-Antwort hervorzurufen. Ferner kann jede Pflanze, die ein Gen besitzt, das die Produktion einer Ursequenz oder ein eine Ursequenz enthaltendes Molekül codiert, so induziert werden, daß sie die Sequenz oder das Molekül bildet. Das heißt, einige Pflanzen können, ohne genetisch so verändert zu sein, daß sie IFN-Gesamtmoleküle bilden, doch so induziert werden, daß sie IFN-artig antworten, d. h. als ob die Pflanze genetisch zur Bildung von eigenem IFN programmiert worden wäre oder als ob sie topisch mit IFN-Gesamtmolekülen behandelt worden wäre. Der Ausdruck "IFN-artig" (IFN-like) soll in der Beschreibung und den Ansprüchen in diesem Sinne verstanden werden. Selbstverständlich kann eine Pflanze dann, wenn sie genetisch so geändert worden ist, daß sie ein IFN-Gesamtmoleküle codierendes Gen enthält, auch künstlich zur Bildung von Gesamt-IFN angeregt werden.

Der Erfinder hat ferner gefunden, daß die Pflanzen selbst Substanzen bilden, die Ursequenzen aufweisen, d. h. daß Pflanzen Pflanzeninterferon (P1IFN) bilden; ein Befund, der bisher noch unbekannt war. Demgemäß ist die genetische Änderung von pflanzlichem Keimplasma in der Weise, daß es ein funktionierendes Gas enthält, dessen Expression zu einem Pflanzeninterferon führt, erfindungsgemäß eingeschlossen, auch wenn das Gen pflanzlichen Ursprungs ist.

Die Erfindung schafft demgemäß ein Verfahren zum Aufhalten von oder Vorbeugen gegen Virusinfektionen bei Pflanzen, indem man die Pflanzen veranlaßt, eine IFN-artige Antwort hervorzubringen. Der Modus operandi um dieses Ziel zu erreichen kann auf drei verschiedenen Wegen verlaufen!

1. Genetische Änderung des pflanzlichen Keimplasmas, so daß dieses eine oder mehrere Kopien von IFN-Genen enthält und die Pflanze tatsächlich ihr eigenes IFN herstellt. Die implantierten Gene können entweder de novo aktiviert werden oder durch Verwendung induzierender Substanzen. Genetische Änderung ist insbesondere in solchen Pflanzen von Nutzen, die gar keine IFN-Gene oder nur defekte IFN-Gene besitzen.
2. Topisches Zuführen von Molekülen, die eine Ursequenz besitzen, zu der Pflanze.
3. Induktion der Bildung eines Moleküls, das eine Ursequenz besitzt, bei einer Pflanze, die nicht notwendigerweise genetisch geändert wurde. Dieses Verfahren aktiviert P1IFN-Gene (oder schaltet sie ein), die sonst latent oder repremiert sind.

Mittel zur externen Pflanzenbehandlung, die erfindungsgemäß als typische auftragbare Virenschutzmittel geeignet sind (d. h. geeignet, eine IFN-artige Antwort hervorzurufen) schließen demgemäß verschiedene Gesamtinterferone, deren molekulare Urfragmente (d. h. essentielle Fragmente), IFN-Induktoren (einschließlich aber nicht beschränkt auf doppelsträngige Ribonucleinsäuren) sowie spezifische Oliogonucleotidsubstanzen (Mittler) ein, die die molekularen Änderungen in der Pflanzenzelle hervorrufen können, die damit verbunden sind, daß Virusresistenz spezifisch durch das Vorhandensein von bioaktiven IFN-Urfragmenten in der Zelle bewirkt wird.

Die topische Applikation oder Behandlung kann auf Grund der biologischen Wirksamkeit dieser Mittel mit einer großen Vielzahl verschiedener Verfahrensweisen durchgeführt werden. Derartige Behandlungsmöglichkeiten schließen Tauchen der Pflanzen oder Samen, Sprühen oder Bestäuben der Pflanzenkultur ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

"IFN" schließt (a) alle natürlichen Formen von tierischem IFN, einschließlich menschlichem Interferon alpha, beta, oder gamma, (b) "synthetische" Formen von tierischem Interferon hergestellt in nicht-menschlichen Organismen, denen tierische (beispielsweise menschliche) Interferongene oder Abschnitte derselben (resultierend in Hybridgenen) zugeführt wurden und (c) chemische Derivate derartiger Interferone mit beispielsweise modifizierten Polypeptidketten oder modifizierten Glycosylgruppen ein.

Selbstverständlich kommt der Erfindung ein signifikanter und breiter Anwendungsbereich zu, wobei der unmittelbarste und ökonomisch wichtigste der Schutz der Hauptpflanzenkulturen auf nationaler oder sogar globaler Ebene ist. Durch Kräftigung des pflanzeneigenen Abwehrmechanismus erlaubt die Erfindung ferner beispielsweise sogar eine Umweltbelastung der Pflanzen, ohne daß diese Virusinfektionen unterliegen, was beispielsweise dann eine häufige Erscheinung ist, wenn der Farmer eine natürliche geographische Wachstumszone für Pflanzenzellmaterial ändert. Es ist zu berücksichtigen, daß viele tropische Pflanzen deshalb nicht in nicht-tropischen Bereichen gezogen werden können, weil der damit verbundene "Streß" die Anfälligkeit gegenüber Pathogenen, einschließlich Viren, offensichtlich steigert; so werden beispielsweise Papayapflanzen, die in den Tropen normalerweise verhältnismäßig virusfrei sind, nahezu regelmäßig von letalen Virusinfektionen befallen, wenn man versucht, sie in Kalifornien anzubauen. Die Erfindung ist demgemäß nicht nur von unmittelbarem Nutzen, sondern wird im Laufe der Zeit, wenn sie zunehmend angewendet wird, der Landwirtschaft zusätzliche Vorteile bieten, die auch für den geübten Beobachter landwirtschaftlicher Biotechnologien nicht offensichtlich sind.

Ferner werden andere pathogene Spezies als Viren, deren Lebenszyklus die Nutzung intrazellulärer Produkte der Pflanzenzelle einschließt, ebenfalls gemäß der Lehre der Erfindung durch IFN gehemmt. Die anderen pathogenen Spezies schließen bestimmte Bakterien und Protozon ein; vgl. "Selective Inhibitors of Viral Functions", W. A. Carter, Ed.; Chemical Rubber Company Press, Cleveland, Ohio, 1973, wo eine umfangreiche Diskussion der verschiedenen nicht-virösen pathogenen Agenzien enthalten ist, die der IFN-Wirkung unterliegen, insbesondere bei hohen IFN-Konzentrationen; diese Literatur ist erfindungsgemäß durch Bezugnahme eingeschlossen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Fig. 1a und 1b zeigen zum Vergleich die 3-dimensionalen Strukturen von menschlichem IFN β 1 (HuIFNβ1) und menschlichem IFNγ (HuIFN-γ).

Detaillierte Beschreibung I. Nachweis und therapeutische Nutzung der essentiellen bioaktiven IFN-Urbereiche und der resultierenden IFN-Urfragmente

Bestimmung der IFN-Strukturhomologie; d. h. des kann nachgewiesen werden, daß die meisten, wenn nicht alle Interferone über einen riesigen Evolutionszeitraum gemeinsame Strukturelemente in Form von Aminosäuresequenzen besitzen, wie die neue Konstruktion der 3-dimensionalen Modelle gemäß Fig. 1 zeigt. Diese Modelle weisen enge Übereinstimmungen in der Tertiärstruktur (3-dimensional) auf, die letzten Endes die Gemeinsamkeit derjenigen Bereiche (Regionen) zeigen, die das bioaktive Zentrum enthalten, d. h. des Teils des IFN-Moleküls, der die biologische Aktivität des gesamten Moleküls auf die Zielzelle überträgt, sei es eine Säugetierzelle oder eine Zelle pflanzlichen Ursprungs.

Fig. 1 ist eine zweidimensionale Wiedergabe der dreidimensionalen Modelle die unter Verwendung der nachfolgend in Tabelle 1 wiedergegebenen Daten entwickelt wurden:

Tabelle 1

Struktureigenschaften von IFN β 1 und γ

Es wurden jeweils vier (4) Aminosäuren gleichzeitig betrachtet und die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten bestimmter Konformationsstrukturen innerhalb des gesamten IFN-Moleküls wurde berechnet. Beispielsweise wurde das Auftreten von Umkehrpunkten nach den Formeln von Chou und Fasman (Annual Reviews of Biochemistry, 47, 251-276 (1978)) berechnet. Das Auftreten von Alpha-Helices und Beta-Faltblattstrukturen wurde durchschnittlich für Abschnitte von zehn (10) bis zwanzig (20) aufeinanderfolgenden Aminosäuren unter Verwendung der gleichen Formel abgeleitet. P_t bezeichnet die Wahrscheinlichkeit eines Umkehrpunktes, Pα bezeichnet die Wahrscheinlichkeit von Alpha-Helix-Bildung und Pβ bezeichnet die Wahrscheinlichkeit der Bildung einer Beta- Faltblattstruktur. Die Zahlen in der linken Spalte beziehen sich auf die relative Position der Aminosäurereste beginnend von dem die freie Aminogruppe tragenden Ende des IFN-Moleküls.

Die alles einschließende und weitreichende Ableitung der IFN-Strukturhomologie ist zuvor nicht dargestellt oder publiziert worden, da sie mit der kreativen Zusammenschau bestimmter bekannter Einzeltatsachen mit der zusätzlichen Einsicht, die sich aus dem neuen Vorgehen des Erfinders ergibt, verbunden ist. Dieses Vorgehen, bei dem Vergleichsdaten hinsichtlich der Nucleotidsequenz, Vergleichsdaten hinsichtlich der Proteinsequenz, Mutationsfrequenzen, Konformationsdaten und die Markov- Kettenanalyse (jeweils für verschiedene IFN-Formen) verwendet wurden, führte zur Bestimmung der primordialen Ursequenzen von IFN, die in der Lage sind, in allen gegenwärtigen Lebensformen, einschließlich unterschiedlicher Pflanzenspezies, Antivirenaktivität hervorzurufen. Innerhalb dieser Ursequenzen sind ferner die Aminosäurebestandteile bestimmt worden. Es soll nochmals betont werden, daß diese Ursequenzen, die sich innerhalb größerer Moleküle finden, nicht isoliert in der Natur angetroffen werden und daß sie in sich und aus sich selbst heraus Bioaktivität entwickeln und Virusresistenz auf Pflanzen übertragen, d. h. Resistenz gegenüber der Virusvermehrung. Der Erfinder hat festgestellt, daß die Tertiärstruktur der Sequenzen bestehen bleibt, auch wenn bestimmte Aminosäuren gegenüber dem Ur- oder Stamm-IFN-Molekül mutiert sind, das selbstverständlich in der Natur nicht mehr existiert, da es vor Millionen Jahren hinwegmutiert ist. Es existieren nur die Rudimente in Form der bioaktiven essentiellen Aminosäuresequenzen in dem heutigen Pflanzen- und Tierreich, einschließlich im Menschen.

Die gewünschten molekularen Zentren (d. h. die bioaktiven Aminosäuresequenzen) der Interferone können mit einer Reihe vorhandener Techniken leicht isoliert werden und die Sequenzen entweder auf dem Genon (J. Bresser und D. Gillespie, Analytical Biochemistry, 129, 357 (1983)) oder in Form des das Genprodukt bildenden Proteins auf Nitrocellulosepapier (Bresser et al., Proceedings National Academy Science, U.S., 80, 6523-6527 (1983)), DNA, 2, 243-254 (1983)) analysiert werden. Anschließend können eine Reihe zur Verfügung stehender Abwandlungen der Festphasensynthese von Peptiden benutzt werden, um die aktiven IFN-Fragmente mit dem hier beschriebenen therapeutischen Wert herzustellen. Demgemäß ist die synthetische Produktion nach jeglichem Verfahren (Festphasensynthese oder DNS-Rekombinationsverfahren mit Bakterien, Hefe oder tierischen Zellen) von derartigen Aminosäuresequenzen zum Zwecke der günstigen Beeinflussung der Pflanzenzellfunktion und dem Aufhalten von Viruserkrankungen erfindungsgemäß eingeschlossen.

Die essentiellen Aminosäuresequenzen bilden im typischen Falle etwa 10 bis 15% der normalen Moleküllänge der Interferone, wobei sie eher eine Länge von etwa 25-45 Aminosäuren aufweisen als die gewöhnliche Anzahl von etwa 162 Aminosäurekomponenten. Die Bestimmung dieser essentiellen Aminosäureabschnitte (Peptide) wurde durch die Schlußfolgerungen des Erfinders und durch Computeranalysen von tausenden der theoretisch möglichen Sequenzen bestimmter Bereiche oder Regionen vieler verschiedener Interferone ermöglicht, die während der Vertebratenevolution erhalten geblieben sind. Die absolute Position dieser Regionen variiert von IFN-Molekül zu IFN-Molekül, da einige Interferone (beispielsweise menschliches Interferon γ) um etwa 10-15% ihrer Länge verkürzt sind. Wichtig im Hinblick auf die aktiven Fragmente ist deren 3-dimensionale Aktivität und nicht ihre relative Position zum Aminoende des intakten Moleküls.

Zusätzlich zu den wünschenswerten physiko-chemischen Eigenschaften sind die IFN-Abschnitte oder Sequenzen auch vom Gesichtspunkt der Kosteneffektivität nützlich, da ihre geringe Größe eine Produktion im großen Maßstab zu einem Bruchteil der Kosten für vollständige IFN-Moleküle erlaubt und sie durch eine Vielfalt von Herstellungsverfahren, wie DNS-Rekombinationsmethoden, Festphasensynthese etc., wie oben beschrieben erhältlich sind.

Selbstverständlich kann die Erfindung auch mit jeglichen natürlich auftretenden oder synthetischen (DNS- Rekombinationsverfahren mit Bakterien, Hefe oder Tierzellen) vollständigen IFN-Molekülen durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß diese die notwendigen bioaktiven Regionen enthalten und im übrigen frei von irgendwelchen molekularen Anhängseln sind (gewöhnlich Zucker oder Kohlenhydratgruppen), die das bioaktive Zentrum gegenüber der Oberfläche der Pflanzenzelle verdecken oder auf andere Weise, beispielsweise durch Konformationsänderung, den Bereich des bioaktiven Zentrums auf dem Pflanzenzellmaterial teilweise oder vollständig unwirksam machen. Gewöhnlich wird die Gegenwart voluminöser Seitenketten aus inneren oder peripheren Oligosaccharidgruppen eine Transspezies-Expression der IFN- Aktivität durch einen derartigen direkten oder über die Konformation wirkenden Mechanismus verhindern (vgl. beispielsweise W. Carter, Life Sciences, 25, 717-728 (1979) und ferner Veröffentlichungen in Pharmacology und Therapeutics, 8, 359-355 (1980).

II. Aktive Interferonbereiche

Interferoncodierende Gene sind bereits geklont worden (beispielsweise Derynk et al., Nature, 285, 542-547 (1980)). Die Sequenz dieser Gene ist bestimmt worden, vgl. Goeddel et al., Nature, 290, 20-26 (1980) und Derynk et al., Nature, 285, 542-547 (1980) und es wurde die Primärstruktur von neun verschiedenen Interferonen bestimmt. Unter Verwendung von Computerprogrammen hat der Erfinder für bestimmte biologische Eigenschaften erforderliche Bereiche des Interferonsystems festgestellt (vgl. P. Came und W. A. Carter, Springer Verlag 1984, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, insbesondere Seiten 45 bis 63 von D. Gillespie, E. Pequinot, W. A. Carter "Evolution of Interferon Genes").

Die Aminosäuresequenzen des Interferons, die die Antivirus- Antwort hervorrufen, schließen die Sequenzen 25-40 und 115-141 ein. Durch Analyse der publizierten Gensequenzen (Derynk et al. und Goeddel et al., a.a.O.) es es möglich, die Existenz von mindestens diesen beiden Ursequenzen in jedem menschlichen Interferon nachzuweisen und die gleichen Analysen wie oben angegeben sind auf andere tierische Interferone anwendbar.

Der als essentiell für die Bindung an spezifische Zellrezeptoren nachgewiesene Interferonbereich schließt die Aminosäuren 115-141 ein (Gillespie und Carter, 1982). Die Bestimmung der Position dieses Bereiches wird teilweise anhand der Homologie mit einer Region der B-Untereinheit von Choleratoxin (Lai, Journal Biol. Chem., 252, 7249-7256 (1977)) durchgeführt oder erleichtert, einer Substanz, die mit Interferon im Hinblick auf die Bindung an Zellrezeptoren konkurriert.

Es ist zu betonen, daß andere Urfragmente, unterschiedlich von den oben beschriebenen, in der Natur existieren, und die Erfindung soll nicht nur auf die erfindungsgemäß beschriebenen Urfragmente beschränkt sein. Das erfinderische Konzept besteht in der Behandlung von Pflanzen mit Molekülen, die Urfragmente enthalten oder mit den Fragmenten selbst. Identifizierung weiterer Fragmente liegt im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmannes.

III. Herstellung von Interferonabschnitten mit ausgewählten Bereichen

Interferonabschnitte können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Zur Erläuterung wird ein geeignetes Verfahren anschließend beschrieben. Weitere Möglichkeiten, wie die chemische Modifikation von natürlichem Interferon oder die chemische Modifikation von geklontem (synthetischem) Gesamtinterferon, Interferoninduktoren etc. sind ebenfalls leicht zugänglich und sind erfindungsgemäß eingeschlossen.

Geklonte Interferongene können an spezifischen Orten mit spezifischen Restriktionsendonucleasen gespalten werden. Das resultierende Interferonfragment, das einen Interferonpolypeptidabschnitt codiert, kann mit einem Expressionsvector, der einen RNA-Polymerasepromotor enthält, einer Ribosomen-Bindungsstelle, einem Initiationscodon und weiteren gegebenenfalls notwendigen Signalen fusioniert werden. Diese rekombinante DNS kann in geeignete Wirtszellen eingeschleust werden, um die Synthese der Interferonabschnitte zu bewirken.

Beispielsweise kann das folgende Verfahren zur Expression eines HuIFN-Genfragments in einem Wirt durchgeführt werden. 5 µg des Gens für menschliches Interferon β mit Poly A.dT-Enden (tailed) und in pBR322 kloniert, wurden bei 37°C 2 Stunden lang mit 50 Einheiten EndoR^·P 1 in 20 mM tris, pH 7,4 mit 10mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄ und 100 mg/ml Rinderserumalbumin inkubiert, um die Interferongene zu spalten, wobei ein Einzelstrangende von den Basen 203/206 erhalten wurde. Die DNS wurde in Kaliumacetat auf 0,3 M eingestellt und aus Ethanol ausgefällt. Die DNS wurde gelöst in 100 ml 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4 mit 6,7 mM MgCl₂, 1 mM Mercaptoethanol, 35 mM Desoxyadenosin und Desoxycytidin und 25 Einheiten des Klenow-Fragmentendes der DNS-Polymerase von Escherichia coli. Die DNS wurde in Kaliumacetat auf 0,3 mM eingestellt und aus Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde gelöst in 100 ml 30 mM Natriumacetat, pH 4,6 mit 50 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 5% Glycerin und 25 Einheiten S1-Nuclease und 1 Stunde lang bei 37° inkubiert. Auf diese Weise wurde ein Interferongenfragment mit einem glatten Ende vollständig bis zu Nucleotid 204 erhalten mit dem ersten Leucin-Basencodon in Position 45. Natriumacetat wurde bis zu 0,3 M hinzugegeben und die DNS aus Ethanol gefällt.

5 µg des Gens für menschliches Interferon β (mit Poly dA^·Enden (tailed) und in pBR322 kloniert wurden getrennt bei 37° 2 Stunden lang mit 50 Einheiten Endo R MboII in 10 mM tris, pH 7,9 mit 6 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit und 100 mg/ml Rinderserumalbumin inkubiert. Die DNS wurde aus Ethanol gefällt und mit S1- Nuclease wie oben beschrieben behandelt. Das aus 288 Basenpaaren bestehende, mit glatten Enden versehene Fragment, das die Nucleotide 401-688 des Interferongens enthielt, wurde durch Elektrophorese auf 3%iger Agarose gereinigt. Eine 0,25 mg Teilmenge dieses Fragments wurde mit 5 µg Pst1-behandelter, DNS-Polymerase-behandelter und S1-Nuclease-behandelter DNS inkorporiert.

Die so gebildete rekombinante DNS enthielt ein Interferongen ohne die Nucleotide 205-400, welches ein Interferonpolypeptid ohne die Aminosäuren 46-111 codiert.

Diese rekombinante Interferonfragment kann nach herkömmlichen Verfahren zur Expression in Bakterien- oder Säugetierzellen in eine Vielzahl geeigneter Vectoren eingeschleust werden. Interferon oder Abschnitte von Interferon können nach Standardverfahren gereinigt werden, obgleich die Erfindung mit Interferonen einer Reinheit von weniger als 1% ausgeführt werden kann, vorausgesetzt, daß keine ansonsten schädlichen Substanzen vorhanden sind. Beispielsweise werden Proteine in Interferon enthaltenden Lösungen an Cibachrom-Blau-Sepharose in Abwesenheit von Ethylen- oder Propylenglykol gebunden. Die Säule wird mit unterschiedlichen Lösungen gewaschen, die die meisten Proteine außer dem Interferon beseitigen und das Interferon wird mit ethylen- oder propylenglykolhaltigen Lösungen oder anderen geeigneten Elutionsmitteln eluiert (Carter et al., Pharmacology and Therapeutics, 8, 359-377 (1980)). Gewünschtenfalls kann eine weitere Reinigung der Cibachrom-Blau-Fraktionen oder anderer Materialien dadurch erreicht werden, daß man die Interferon enthaltenden Lösungen über Säulenfüllungen schickt, die Anti-Interferon-Antikörper enthalten und herkömmliche Bindungs- und Elutionsbedingungen wählt.

Die oben beschriebene rekombinante DNS kann hergestellt werden, indem man einige oder alle gleichen Enzyme unter verschiedenen Bedingungen oder in verschiedener Reihenfolge oder Varianten oder oben angegebenen Enzyme oder der Interferongene verwendet. Andere geeignete rekombinante DNS können unter Verwendung anderer Enzyme und anderer Verfahrensweise gebildet werden. Schließlich ist die Verwendung von rekombinanter DNS zur Schaffung von Interferonabschnitten lediglich ein Beispiel für ein Mittel zur Gewinnung eines Interferonabschnittes. Andere Mittel, wie Festphasensynthese, proteolytische Spaltung intakten Materials oder genetisch kloniertes Interferon aus Bakterien und Hefe können gleichfalls verwendet werden.

IV. Änderung von pflanzlichem Keimplasma zum Erhalt einer Pflanze mit vererbbarer Resistenz gegen Virusinfektionen

Der Erfinder hat festgestellt, daß Pflanzen, die erhöhte Mengen sowohl an pflanzlichem als auch an menschlichem Interferon produzieren, resistent gegen ein breites Spektrum von Pathogenen sind. Es wird demzufolge ein Verfahren zur Schaffung einer derartigen Pflanze zur Verfügung gestellt. Die nach dem folgenden Verfahren geschaffene neue Pflanze ist genetisch neu.

Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

A. Klonieren von menschlichem oder pflanzlichen Interferongenen in Rekombinante DNS,
B. Einschleusen der rekombinanten DNS in Protoplasten und Isolieren von Zellen, die erhöhte Mengen von Pflanzen- und Humaninterferon synthetisieren und
C. Anziehen einer reifen Pflanze aus den Protoplasten.

Die Tabakpflanze Nicotiana ist als ein Beispiel verwendet worden und wird nachfolgend als Prototyp beschrieben.

A. Klonieren von Human- und Pflanzeninterferon

Wie zuvor angegeben, sind Humaninterferongene bereits kloniert worden (beispielsweise Derynk et al., a.a.O.). Es können eine Reihe herkömmlicher Verfahren verwendet werden, um auf die gleiche Weise Pflanzeninterferongene zu klonieren; was gebraucht wird ist ein geeignetes Nachweismittel zum Auffinden der rekombinanten DNS. Ein zu diesem Zweck verwendbares Nachweismittel ist der in hohem Maße konservierte Abschnitt des Humaninterferons oder Gens, der sich innerhalb der Nucleotide 345-423 befindet, jedoch nicht auf diese beschränkt ist (Gillespie et al. in Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, 1984, a.a.O.). Ferner ist es möglich, daß weitere geeignete Nachweismittel existieren. Wichtig ist, daß die Erfindung nicht auf der Auswahl der verwendeten Verfahren zum Klonieren der Pflanzeninterferongene beruht, sondern eher auf der genetischen Besonderheit und Verbesserung der endgültigen Pflanze.

B. Inkorporieren der rekombinanten DNS in Nicotianaprotoplasten und Isolieren von Zellen, die erhöhte Mengen Pflanzen- und Humaninterferon synthetisieren

Durch die hier beschriebenen analytischen Verfahren für HuIFN können leicht vergleichbare Ursequenzen in verschiedenen Tier- oder Pflanzeninterferonen bestimmt werden. Die hier beschriebenen Verfahren zur Isolierung von Genfragmenten und die resultierende Inkorporierung und Expression wird unter Verwendung vergleichbarer und in einigen Fällen identischer Verfahren erreicht, wie sie für Ursequenzen in HuIFN α und β beschrieben wurden. Es können nach herkömmlichen Verfahren Protoplasten gebildet und DNS in diese eingeschleust werden (Bourgin et al., Physiol. Plant. 45, 288-292 (1979), Caboche, M. Planta, 149, 7-18 (1980), Cocking et al., Nature, 239, 265-270 (1981)). Die Schwierigkeit besteht darin, daß wenig rekombinante DNS sich in Pflanzenchromosomen integrieren, d. h. sie werden kein stabiler Bestandteil des genetischen Materials der Pflanze. Das Ti-DNS-Plasmid von Agrobacter (Davey et al. Pl. Sci. Lett., 18, 307-313 (1980), Wullems et al., in Adv. Protoplast Res. Proc. Sth. Symp. 407-424 (1979)) bildet in diesem Zusammenhang eine Ausnahme, aber dieses DNS-Plasmid besitzt verschiedene nachteilige Eigenschaften. Eins der Probleme besteht darin, daß die Ti-Plasmid-DNS zu groß ist, in dieses Plasmid inkorporierte DNSn bringen nicht die richtigen Proteine zur Expression und die mit dem Plasmid infizierten Zellen entwickeln sich nicht gut. Das Ri-DNS-Plasmid von Agrobacter erlaubt zwar ein gutes Pflanzenwachstum, behält jedoch die übrigen unerwünschten Eigenschaften.

Zum Integrieren fremder DNS in Nicotiana-Chromosomen können die folgenden Plasmide verwendet werden: Das pBR322-Plasmid von E. coli kann so geändert werden, daß es zwei invertierte Tandemkopien einer kurzen, eingestreuten repetitiven Nicotiana-DNS aufweist. Dieses Plasmid enthält nur einen Eco R1-Ort: lokalisiert an der Verbindung zwischen den beiden repititiven Nicotiana- Sequenzen. Das Plasmid wird mit Eco R1 geöffnet und anschließend können Pflanzen- und/oder Humaninterferongene in das Plasmid inkorporiert werden. Alternativ kann ein pBR322 verwendet werden, das andere Pflanzensequenzen oder andere Vectoren wie Ti- oder Ri-Plasmide von Rhizobium enthält.

Viele Kopien des ein Pflanzeninterferongen enthaltenden Plasmids können durch Mikroinjektion, Calciumphosphatausfällung, Infektion mit Agrobacter, Protoplastenfusion etc. in Nicotiana-Protoplasten übertragen werden. Transformierte Protoplasten können als Pflanzenzellen vermehrt werden und durch in situ Molekularhybridisierung mit Chromosomen-DNS mit einem pBR322-Nachweismittel identifiziert werden. Derartige mit Poly I:C induzierte Zellen können hinsichtlich gesteigerter Produktion von Pflanzeninterferon-mRNS durch in situ Hybridisierung untersucht werden, indem ein Pflanzeninterferongen als Nachweismittel verwendet wird. Derartige Zellen, die erhöhte Mengen Pflanzen-mRNS produzieren, können hinsichtlich einer gesteigerten Pflanzeninterferonsynthese nach herkömmlichen biologischen Testverfahren für Antiviren-Wachstumsfaktor untersucht werden.

Nicotiana-Zellen, die erhöhte Pflanzeninterferonmengen produzieren, können in Protoplasten rekonvertiert und mit den oben genannten Vectoren transformiert werden, die nun Humaninterferongene enthalten.

Transformierte Protoplasten können als Pflanzenzellen vermehrt werden und hinsichtlich gesteigerter Mengen an Pflanzeninterferon- plus Humaninterferon-mRNS und Protein anhand in situ Molekularhybridisierung bzw. des biologischen Nachweises von Antivirus-Wachstumsfaktor untersucht werden. Diese transformierten Protoplasten können dann zu reifen Tabakpflanzen kultiviert werden.

Im einzelnen kann das Verfahren wie folgt durchgeführt werden:

Protoplasten können nach Chupeau et al., (C.R. Acad. Sci. Ser. D. (Paris), 278, 1565-1568 (1974)) von Nicotiana spp. isoliert werden. Sterilisierte Blätter können enthäutet und in T_o-Medium inkubiert werden (10,3 mM NH₄NO₃, 9,4 und mM KNO₃, 1,5 mM CaCl₂ · 7 H₂O, 0,75 mM MgSO₄ · 7 H₂O, 0,62 mM KH₂PO₄, 0,1 mM FeSO₄ · 7 H₂O, 0,1 mM Na₂EDTA, 16 mM H₃BO₃, 0,6 mM MnSO₄ · H₂O, 3,5 mM ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,2 mM CuSO₄ · 5 H₂O, 0,22 mM AlCl₃, 0,13 mM NiCl₂ · 6 H₂O, 8 µM Nicotinsäure, 2 µM Ca-Panthothenat, 0,04 mM Biotin, 16,1 µM Naphthalenessigsäure, 4,4 µM 6- Benzyladenin, 58 mM Sucrose, 440 mM Mannit) ohne Sucrose und einem Gehalt an 0,02% Macerozym R10, 0,1% Cellulase Onozuka R10 und 0,05% Driselase. Die freigesetzten Protoplasten können durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit in T_o-Medium gewaschen werden. Andere Verfahren zur Protoplastenisolierung können statt dessen verwendet werden, so lange lebensfähige Einzelzellen ohne wesentliche Zellwandanteile isoliert werden können.

Nicotiana spp.-Protoplasten können mit transformierender Vector-DNS, die Interferongene trägt oder mit Bakterien inkubiert werden, die derartige DNS enthalten, indem man jegliches einer Anzahl von Standardtransformationsverfahren verwendet (Davey et al., Pl. Sci. Lett. 18, 307-313 (1980), Willems et al., in Adv. Protoplast Res. Proc. 5th, symp., 407-424 (1979)). Derartige Vector- DNS kann das E. coli-Plasmid sein, das repetitive Pflanzensequenzen wie oben angegeben enthält oder jegliche andere Vector-DNS, die in Mikroorganismen vermehrt und in Protoplastenchromosomen integriert werden kann.

Transformierte Protoplasten können in T_o-Medium bei 25° im dunklen vier Tage lang kultiviert werden und anschließend unter Fluoreszenzlampen (2500 lx, 16 h täglich) gebracht werden. Nachdem 30-60% der Protoplasten sich einmal geteilt haben, können sie durch Zentrifugieren gesammelt und einmal in AG-Medium gewaschen werden (10 mM KNO₃, 3 mM CaCl₂ · 2 H₂O, 3 mM MgSO₄ · 7 H₂O, 1 mM KH₂PO₄, 0,1 mM FeSO₄ · 7 H₂O, 0,1 mM Na₂EDTA, 49 mM H₃BO₃, 1,8 mM MnSO₄ · H₂O, 10,4 mM ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,04 mM CoCl₂ · 6 H₂O, 0,36 µM CuSO₄ · 5 H₂O, 0,41µM NaMoO₄ · 2 H₂O, 0,66 µM AlCl₃, 0,40 mM NiCl₂ · 6 H₂O, 0,18 µM KI, Vitamine wie im T_o-Medium, 0,53 µM Naphthalenessigsäure, 4,4 µM 6-Benzyladenin, 58 mM Sucrose, 440 mM Mannit, 1 mM Glutamin). Die Zellen können auf Petrischalen in AG-Medium plattiert werden (Caboche, Planta 149, 7-18 (1980)). Die Schalen können anschließend bei Standardlichtbedingungen bei 25° in fest geschlossenen, transparenten Kästen inkubiert werden; bei diesen Bedingungen bilden die transformierten Protoplasten Kolonien.

Die einzelnen Kolonien können dann aufgenommen werden, zu Einzelprotoplastensuspensionen rekonvertiert und in AG-Medium auf Petriplatten als Mehrfachversuche ausgesät werden. Die Mehrfachversuchsplatten können hinsichtlich der Vector- oder Rekombinanten-Interferon-Genexpression durch folgende Nachweise ausgewertet werden: 1) Vorhandensein spezifischer DNS-Sequenzen durch Molekularhybridisierung (Robins et al., J. Molec. Appl. Gen. 1, 191-203 (1981)), 2) Vorhandensein spezifischer RNS- Transcripte durch molekulare Hybridisierung (Brahic und Haase, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75, 6125-6129 (1978)) und/oder 3) Vorhandensein eines Interferonprotein- Überschusses durch immunologische oder biologische Nachweise (Sela. 1982, Interferon Sci. Memo., Memo Nummer Iall34, Januar). Andere Nachweise für die Produktion eines Interferonüberschusses können ebenfalls geeignet sein.

C. Produktion reifer Tabakpflanzen aus gentechnologisch beeinflußten Pflanzenzellen

Kolonien, die das Vorhandensein und die Expression neuer Interferongene zeigen, können in AG-Medium 1 bis 2 Monate lang kultiviert werden und anschließend zur Knospenregeneration auf festes R4-Medium plattiert werden (Bourgin et al., Physiol. Plant., 45, 288-292 (1979)). Die gebildeten Knospen können zur Bildung von Pflänzchen auf Wurzelmedium B übertragen werden (Bourgin et al., Physiol. Plant., 45, 288-392 (1979)). Bewurzelte Pflänzchen können eingetopft und bis zur Reife im Gewächshaus angezogen werden. Andere Verfahren zur Umwandlung einzelner, transformierter Pflanzenzellen in reife Pflänzchen können statt dessen verwendet werden.

Die Pflänzchen können dann hinsichtlich ihrer Interferonproduktion und Resistenz gegenüber Tabakmosaikvirus (Sela. Adv. Vir. Res., 26, 201-234 (1981)) oder gegenüber anderen fremden Agenzien unter Verwendung von Standardnachweisverfahren untersucht werden. Krankheitsresistente Stämme mit hoher Interferonproduktion können selektiert und nach einem geeigneten und wirkungsvollen Verfahren sexuell vermehrt werden.

Die oben angegebene Verfahrensweise dient lediglich zur Erläuterung der Durchführbarkeit des Verfahrens zur Schaffung dieser genetisch neuen Pflanze mit wünschenswerten Eigenschaften. Es ist offensichtlich, daß bei den schnellen Änderungen in diesem Bereich vermutlich eine Vielzahl von Modifikationen dieses Verfahrens zum Erfolg führen wird, ohne daß damit der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

V. Topische Applikation

Wie bereits erwähnt, können die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel nach zahllosen Verfahren, angefangen von einfachen (beispielsweise mit Hilfe einer Gießkanne in einem Gewächshaus) bis zu den hoch entwickelten (beispielsweise Bestäuben der Pflanzenkultur über hunderte oder tausende von Hektar) topisch appliziert werden.

Die jeweils bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist von den biologischen sowie den mechanischen Faktoren zum Zeitpunkt der gewünschten Pflanzenbehandlung abhängig; zum Beispiel wird ein permanenter Schutz von Samenpflanzen vorzugsweise durch Keimplasmaänderung über eine gesteigerte Zahl der IFN-Kopien (Pflanzen und/oder tierische IFN-Gene) erzielt werden. Alternativ wird zum Schutz bereits auf dem Feld befindlicher Pflanzen, die große Hektarbereiche decken, die bevorzugte Ausführungsform ein Bestäuben des Pflanzengutes sein. In diesem Falle sind beispielsweise spezielle topologische Bedingungen zu berücksichtigen (man beachte die molekulare Stabilität, den Windschereffekt etc. wenn IFN-Urkomponenten von tief fliegenden Flugzeugen abgegeben werden), ebenso wie biochemische Faktoren (man beachte die Aufnahmeeffizienz junger gegenüber derjenigen reifer oder alter Blattzellenstrukturen). In solchen Fällen wird eine Ausführungsform bevorzugt sein, bei der Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht eingesetzt werden, da diese im allgemeinen eine größere thermische und physikalische Stabilität und verbesserte zelluläre Aufnahme/Rezeptorbildung aufweisen. Die von IFN abgeleiteten Uroligonucleotide und IFN-Peptidfragmente sind Beispiele für verhältnismäßig temperatur- und wirbelfeste aktive Einheiten, die sich von dem Grundgedanken der Erfindung herleiten.

Für die topische Applikation wird mindestens eine IFN- oder andere Substanz mit einem Gehalt an einer Ursequenz (oder einem Induktor) in einem geeigneten, landwirtschaftlich akzeptablen Vehikel oder Träger wie Wasser dispergiert, d. h. es wird eine Lösung appliziert. Die Konzentration kann von etwa 0,0001 bis 100 000 IRU (Internationale Referenz-Einheiten) pro ml Lösung betragen. Wenn IFN als trockenes Pulver zum Zwecke der Applikation durch Stäuben verteilt werden soll, so ist eine Gewichtskonzentration von etwa 1 ppm (part per million) bis etwa 1 Teil pro 10¹⁵-10¹⁶ Teile wirksam, wenn das Interferon einem trockenen, landwirtschaftlich akzeptablen Träger zugesetzt wird. Geeignete Träger sind in der Pflanzenbestäubungstechnik bekannt. Das Interferon kann mit anderen Pflanzenbehandlungsmitteln wie Pesticiden, Herbiciden, Fertilisierungsmitteln etc. vermischt oder kombiniert werden, vorausgesetzt, daß keines der zusätzlichen Mittel die Bioaktivität der Ursequenz angreift.

Die Endkonzentration von IFN oder anderen Ursubstanzen hängt davon ab, welche Pflanzenkulturen geschützt werden sollen, gegen welchen Virus sich der Schutz richtet und wie die Feldbedingungen sind. Die Endkonzentration kann auch in Abhängigkeit von der molekularen Fraktion (d. h. der Fraktion des Moleküls) variieren, die nicht primordial ist. Beispielsweise würde in dem synthetischen IFN-Fragment, das im wesentlichen nur aus der Aminosäuresequenz 115-141 besteht, die nicht aus Urmaterial bestehende molekulare Fraktion sich nahe an Null befinden. Demgegenüber ist die molekulare Fraktion aus Nicht-Urmaterial in IFN-Gesamtmolekülen etwa 0,6, d. h. etwa 60% eines vollständigen IFN-Moleküls (beispielsweise HuIFN) ist nicht primordial.

In einer typischen Applikationsform von IFN bei Pflanzenkulturen beträgt beispielsweise die Konzentration ein Teil pro Billion (ppb, man beachte, daß bei HuIFN 1 mg etwa 10⁸ IRU entsprechen). Für Oberflächenapplikation (die ungefähr 100 Liter pro Quadratkilometer, d. h. 100 Gallonen pro Acre, erfordert) würden weniger als 1/2 mg Gesamt HuIFN pro 4 km² (1 Acre) benötigt. Bei Bestäuben der Pflanzenkulturen, wobei im typischen Falle ein Fünftel bis ein Zehntel des bei der Oberflächenapplikation erforderlichen Volumens eingesetzt werden, würden vergleichbare Interferonmengen benötigt werden oder möglicherweise auch weniger, abhängig von der Wirksamkeit der topischen Applikation.

Unter gewissen Umständen kann es jedoch wünschenswert sein, das IFN oder seine Urfragmente zusätzlich zu stabilisieren, so daß es gegenüber den Beanspruchungen der Applikation und einer möglichen verlängerten Exposition an Umgebungseinflüsse widerstandsfähiger wird. Dies wird nachfolgend beschrieben.

Interferon ist wie andere Proteine eine verhältnismäßig labile chemische Substanz. Es ist im Hinblick auf seine Löslichkeit in wäßrigen Lösungen und seine biologische Aktivität abhängig von einer sehr speziellen dreidimensionalen Orientierung seiner verschiedenen linear angeordneten Aminosäuren (vgl. Fig. 1). Insbesondere müssen diejenigen Bereiche des Interferonmoleküls, die für die Bindung an die Zellen und für die Auslösung der komplexen biologischen Antworten verantwortlich sind, in der richtigen Weise exponiert und ausgerichtet sein. Ebenso ist jedoch eine beträchtliche Menge anderer nicht funktioneller Orientierungen möglich, und diese können sich frei bilden. Diese alternativen Zustandsformen werden durch Wärme, bestimmte von außen wirkende Chemikalien und verlängerte Lagerzeiten begünstigt.

Eine Möglichkeit zur Vorbeugung gegen die Bildung inaktiver alternativer Zustandsformen ist die Schaffung von Molekülen, die IFN-Aktivität entwickeln aber die nur eine begrenzte Anzahl alternativer Zustandsformen besitzen, wie die oben beschriebenen Interferon-Fragmente. Eine andere von dem Erfinder entwickelte Möglichkeit ist das Unterbinden der Bildung alternativer Zustandsformen durch Immobilisieren des Interferons auf einem Trägermolekül oder einer Trägerstruktur.

Aktive Enzyme werden häufig als Teil komplexer Strukturen, angeheftet an Zellmembranen, Nucleinsäuren, Proteine etc. gefunden und die Enzyme sind gewöhnlich in dem komplexen Zustand stabiler. Zur Untersuchung der Durchführbarkeit eines solchen Vorhabens konstruierte der Erfinder verschiedene Säulenmatrices mit einem Gehalt an unterschiedlichen Liganden, die als effektive Stabilisatoren in Betracht kommen (vgl. Fig. 2, Carter et al., Pharmac. Ther. 8, 359-377 (1980)). Die Säule wurde mit anhaftendem Albumin charakterisiert. 100 ml einer nicht-dialysierten Interferonzubereitung mit einem Gehalt an 11 500 Einheiten und 0,99 mg Protein pro ml wurde mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/cm² auf eine Säule aufgetragen. Die Albuminsäule wurde mit 0,02 M Natriumphosphat (ph 7,4) mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl equilibriert. Das Säuleneluat wurde mit einer Stromtrennvorrichtung im Verhältnis von 1 : 9 aufgeteilt. Der 10% betragende Eluatanteil wurde in 1 ml einer 1%igen Rinderserumalbuminlösung mit einem Gehalt an 0,02 M Natriumphosphat und 0,15 M Natriumchlorid gesammelt und zur Bestimmung der Interferonaktivität verwendet. Der 90% betragende Eluatanteil wurde zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet. Die Frontfraktionen enthielten etwa 98% des aufgetragenen Proteins und weniger als 1% der aufgetragenen Interferonaktivität. Die weitere Elution der Säule wurde mit 50% (V/V) Ethylenglykol und 50% 0,04 M Phosphat (pH 7,4) und 0,30 M NaCl durchgeführt. Die restliche Interferonaktivität (86%) wurde mit sehr wenig (weniger als 2%) des ursprünglichen Proteins wiedergewonnen. Einige dieser Versuche sind kürzlich veröffentlicht worden (Carter, W. A., Methods in Enzymology, 78, 576-582 (1981)).

Der oben beschriebene Versuch zeigte, daß Interferon mit Serumalbumin gekoppelt werden konnte während dies bei den meisten anderen Zellproteinen nicht der Fall war. Versuche mit anderen immobilisierten Proteinen wie mit Cytochrom C zeigten, daß Interferon generell die Eigenschaft besitzt, sich an Proteine zu binden. Der Erfinder hatte vermutet, daß die stark hydrophobe Natur des Interferons Wechselwirkungen mit normalerweise maskierten hydrophoben Hohlräumen anderer Proteine erzwingt, und dieser Versuch ließ auf die Richtigkeit dieser Hypothese schließen. Wie auch immer der Mechanismus geartet sein mag, so unterstützte das Ergebnis des obigen Versuches die Entwicklung von Komplexen mit Proteinen zur Stabilisierung von Interferon.

Zu diesem Zweck wurde von dem Erfinder das folgende Verfahren entwickelt. Humaninterferon kann nach jeglichem herkömmlichen Verfahren aus jeglicher biologischen Quelle - aus Humanzellen, aus rekombinanten Mikroorganismen etc. - hergestellt werden. Nach der Reinigung können Humanserumalbumin oder andere proteinartige Träger im Überschuß zugegeben werden, gewöhnlich bis 3 mg/ml. Die Lösung kann gegen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung oder einen anderen geeigneten Puffer dialysiert werden und das Material kann dann gefriergetrocknet werden. In einem typischen Beispiel wurden 1 Million Einheiten gereinigtes Interferon mit 3,46 mg Natriumphosphat gefriergetrocknet.

In diesem sich schnell ändernden Bereich sind verschiedene Abweichungen von diesem Verfahren zu akzeptieren. Andere Trägerproteine als Albumin oder Cytochrom C sind akzeptierbar. Es mögen auch andere Trägermoleküle oder Strukturen wie Lipide, kleine hydrophobe Liganden, Membranfragmente oder sogar feste Partikel akzeptierbar sein. Andere Haftungsmechanismen wie ionische oder covalente Bindungen können ebenfalls geeignet sein. Andere Salze oder Puffer oder andere Salz- oder Pufferkonzentrationen (einschließlich kein Salz oder Puffer) können auch akzeptierbar sein. Es ist jedoch deutlich, daß das Verfahren IFN gegenüber von außen bewirkten Konformationsänderungen schützt, einschließlich Denaturieren durch Einwirkung von beispielsweise Windscherkräften und Umgebungseinflüssen. Die topische Applikation von HuIFN bei Pflanzen ist im allgemeinen bei der Bekämpfung der Ausbreitung von Viren von einer Pflanze zur anderen wirksam. Um dies zu zeigen wurden junge Kartoffelblätter systemisch mit Kartoffelvirus N oder Tabak- Blattroll-Virus infiziert. Es wurden Scheiben aus den Blättern gestochen und 7-10 Tage bei 25° in Nährmedium ohne oder mit Humaninterferon α kultiviert. Im Anschluß an diese Inkubation wurden die Blätter in 1% Brÿ 35 zermahlen und das teilchenförmige Material durch Zentrifugieren entfernt. Virenproteine wurden durch einen Immunassay (ELISA) quantifiziert, wobei die optische Dichte als Virusmaß verwendet wurde. Hohe optische Dichtewerte entsprechen gesteigerten Virusmengen. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 wiedergegeben:

Tabelle 2

Hemmung der Kartoffel-Virus-Ausbreitung duch HuIFN-α

Wie den Ergebnissen zu entnehmen ist, zeigt IFN in Pflanzen einen deutlichen Antiviruseffekt, obgleich der Virus-Hemmeffekt anscheinend ein Plateau bildet, d. h. über den untersuchten Bereich steigt die Virushemmung nicht linear mit steigender Interferonkonzentration an. Darüber hinaus fällt jedoch, obgleich durch topische Applikation das Viruswachstum dramatisch verlangsamt wird, die Wirkung mit der Zeit etwas ab, ein Hinweis darauf, daß möglicherweise wiederholte Applikationen in gleichmäßigen Zeitabständen notwendig sind, beispielsweise alle 10 bis 15 Tage. Der Erfinder hat die wichtige Feststellung gemacht, daß periodische Interferonapplikation bei virusinfizierten Pflanzen die Virusausbreitung in diesen Pflanzen verhindert und ebenfalls die Virenübertragung von diesen Pflanzen auf nicht infizierte Pflanzen verhindert. Der Erfinder hat während der oben beschriebenen HuIFN-Versuche Photoserien der Blätter angefertigt und festgestellt, daß die Blätter zur gleichen Zeit wuchsen und gediehen wie der Lebenszyklus des Virus zum Stillstand gebracht wurde.

In Anbetracht der gesteigerten Erntemengen auf Grund der topischen Applikation in Verbindung mit der Tatsache, daß eine sehr geringe Reinheit des IFN ausreicht (d. h. es sind keine teuren Reinigungsverfahren erforderlich), sind wiederholte Applikationen sehr ökonomisch machbar. Auf Grund seiner Versuche schätzt der Erfinder beispielsweise, daß ein Gewächshaus einer Größe von etwa 9 m² (100 Quadratfuß) bei den augenblicklichen Preisen für etwa 10 Dollar monatlich geschützt werden kann. Es kann IFN jeglichen Reinheitsgrades verabreicht werden, vorausgesetzt, daß es dem Kriterium entspricht, keine verunreinigenden lebenden Organismen (Bakterien etc.) oder inaktive Viren zu enthalten, die Zellerkrankungen der Pflanzen oder Erkrankungen der Endverbraucher seien es Tiere oder Menschen auslösen könnten. Nach geeigneten Reinigungsverfahren wie Abfiltrieren lebender Organismen könnten auch solche IFN-Chargen erfindungsgemäß geeignet sein, die für humanklinische Applikationen nicht in Frage kämen.

Ferner schließt die Bezeichnung "topische Applikation" die Applikation von Substanzen ein, die als "Induktoren" bezeichnet werden und die, obgleich sie selbst nicht IFN-Moleküle sind, die Eigenschaft besitzen, als biologische Auslöser zu dienen, um IFN-produzierende Organismen zur Bildung ihrer eigenen IFN innerhalb eines Zeitraumes zu veranlassen, der im Verhältnis zu demjenigen, der in Abwesenheit des verabreichten Induktors gebraucht würde, kurz ist. Unter diesen sind die sogenannten "mismatched dsRNS" von hauptsächlicher Bedeutung, bei denen es sich um wirksame IFN-Induktoren handelt, die aber bei Menschen wenig toxische Nebenwirkungen zeigen. Die biologische Wirkungsweise dieser Substanzen zusammen mit einer Liste derselben ist vollständig in der US-PS 41 30 641 angegeben.

dsRNSn sind in Mitgliedern des Pflanzenreiches ebenfalls wirksam und können in der gleichen Weise appliziert werden, wie oben für IFN-Moleküle oder bioaktive Fragmente derselben beschrieben. Die Pflanze muß nicht notwendigerweise gentechnologisch behandelt worden sein. Es ist lediglich erforderlich, daß irgendeine besondere dsRNS die Bildung eines Moleküls induziert, das eine essentielle bioaktive (Aminosäuren) Sequenz besitzt, die eine Interferon-artige Antwort hervorruft. Wie zuvor erwähnt, bedeutet dieses Erfordernis, daß die Pflanze eine Polynucleotidsequenz besitzen muß, die eine bioaktive Aminosäuresequenz codiert. Ob irgendeine besondere Pflanzenspezies dieses Kriterium erfüllt, kann mit Hilfe einfacher Versuche bestimmt werden, d. h. durch topische Applikation einer oder mehrerer dsRNSn an interessierende Pflanzen und Durchführung von bekannten Untersuchungen im Hinblick auf Antivirus-Wachstumsfaktor. Alternativ kann ein IFN-Induzierbarkeitstest durchgeführt werden, indem man das In-Situ-Hybridisierungsverfahren benutzt, das der Erfinder oben anhand von Nicotiana erläutert hat.

Es gibt zusätzlich eine Reihe von Substanzen, die als intrazelluläre Mittler bezeichnet werden und durch 2′,5′-Oligoadenylsäure und/oder ein funktionell aktives Derivat derselben gekennzeichnet sind, und die ebenfalls als Mittel zur topischen Applikation geeignet sind. Der genaue biochemische Mechanismus, nach dem diese Verbindungen wirken, ist nicht bekannt, es ist jedoch bekannt, daß sie den IFN-Effekt simulieren, der durch Virusexposition hervorgebracht wird und damit im wesentlichen den IFN-Bedarf ersetzen. Der Erfinder hat festgestellt, daß diese Art von Mimikry auf Pflanzen ausdehnbar ist. Es können auch Analoge einschließlich Kern (dephosphorylierte)-2′-5′-Oligonadenylate, Kern-3′- 5′-Oligoadenylate und Kern-2′-5′-Oligoadenylat-cordecypin (3′-Desoxyadenosin) verwendet werden.

Das bei der Applikation von dsRNSn anwendbare Konzentrationsbereich (wie beispielsweise Ampligen, ein Warenzeichen von HEM Research, Rockville, Maryland oder Poly I^·Poly C) liegt zwischen etwa 0,01 µg/ml und 1000 µg/ml in wäßriger Lösung. Bei der Applikation intrazellulärer Mittler liegt der anwendbare Konzentrationsbereich zwischen etwa 0,01 und 100 000 nM/ml in wäßriger Lösung.

Eine bevorzugte Ausführungsform im Hinblick auf die topische Applikation beruht auf der Kombination - im allgemeinen als physikalische Mischung, obgleich getrennte Applikationen auch genügen - eines Interferons oder eines essentiellen Fragmentes oder Induktors desselben mit einer Substanz, die Insekten, insbesondere Blattläuse daran hindert, sich auf der Pflanze niederzulassen und als Vector zu dienen, der den Virus ausbreitet. Das heißt, Insekten wie Blattläuse bilden vermutlich einen der Hauptübertrager für Viren, da sie innerhalb verhältnismäßig kurzer Zeitspannen an vielen Pflanzen fressen und infiziertes Material mit gesundem Pflanzengewebe vertauschen, das wiederum durch die Blattlaus infiziert und mit anderen gesunden Pflanzen vertauscht wird und so weiter in einem sich selbst schließenden Kreis. Durch Kombination einer Substanz, die eine IFN- artige Antwort hervorruft mit einer Substanz, die Insekten blockiert (d. h. fernhält), kann wirksam eine doppelgleisige Bekämpfung der Virenausbreitung durchgeführt werden. Das heißt, die Bekämpfung auf dem ersten Gleis dient dazu, die Insekten abzuhalten, die behandelte Pflanze auszuwählen. Geht dieser Weg fehl, so wird der Wirkung des virusinfizierten Pflanzenmaterials, das durch das Insekt mit einer gesunden Pflanze in Verbindung gebracht wird, durch die eine HuIFN-Antwort hervorrufende Substanz entgegengewirkt.

Substanzen, die insbesondere wirksam sind zur Blockierung von Insektenvectoren (und insbesondere Blattläusen) und die chemisch mit Interferonen kompatibel sind, sind insbesondere die als Pyrethrum und Pheromone bezeichneten Hormonsubstanzen. Pyrethrum sind bekannte natürliche Substanzen, die beispielsweise aus Chrysanthemen erhältlich sind. Pheromone sind ebenfalls natürliche Substanzen, die aus wilden Kartoffeln erhältlich sind.

Interferon vermischt mit oder getrennt, aber gleichzeitig aufgetragen mit einer oder beider dieser natürlichen Hormonsubstanzen bildet eine Kombination, die entweder die Insekten bereits in der ersten Phase wirksam blockiert oder die Ausbreitung der Viren durch irgendwelche Insekten, die trotz der blockierenden Substanz mit gesunden Pflanzen in Kontakt kommen, verhindert. Das Blockierungsmittel und das Antivirusmittel verstärken sich demgemäß gegenseitig auf biochemischer Ebene und hinterlassen, wenn sie schließlich biologisch abgebaut werden, keine schädlichen Umgebungsrückstände oder Verunreinigungen.

Interferon kann in Kombination in den zuvor angegebenen Mengen verabreicht werden (beispielsweise 0,0001- 100 000 IRU/ml Lösung). Pyrethrume und/oder Pheromone werden gewöhnlich in Mengen in der Größenordnung von 0,0005 bis 1 kg/km² (0,005-10 pounds per acre) aufgebracht. Demgemäß besteht ein Verfahren darin, daß man einfach die gewünschten Mengen von IFN (oder Fragment, Induktor etc.) mit dem Pyrethrum oder Pheromon und einem geeigneten Träger (beispielsweise Wasser oder einem trockenen landwirtschaftlich akzeptablen Träger) kombiniert und sie als Lösung aufbringt.

Claims

1. Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß man die Pflanzen veranlaßt, eine IFN-artige Antwort hervorzubringen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Pathogen ein Virus ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort dadurch hervorgerufen wird, daß man die Pflanzen genetisch so verändert, daß sie mindestens eine Substanz bilden, die eine IFN-artige Antwort hervorbringt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ausgewählt ist aus vollständigen IFN-Molekülen und Molekülfragmenten, die Aminosäureursequenzen enthalten.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Änderung dadurch bewirkt wird, daß man ein menschliches Gen in Pflanzenzellen einführt, welches die Produktion mindestens einer Verbindung zum Hervorrufen einer IFN-artigen Antwort codiert, die mindestens eine Aminosäureursequenz enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt, daß man in die Pflanzenzellen ein pflanzliches Gen einführt, das die Produktion von Pflanzeninterferon oder eines Moleküls mit einem Gehalt an mindestens einer Aminosäureursequenz codiert.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antwort hervorruft, indem man Pflanzen eine Substanz topisch appliziert, die mindestens eine Verbindung mit einem Gehalt an einer Aminosäureursequenz enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eine mindestens vorhandene Verbindung gegen Denaturieren stabilisiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die als Substanz bezeichnete Verbindung vollständige IFN-Moleküle enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die als Substanz bezeichnete Verbindung einen Abschnitt eines HuIFN-Moleküls enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz als Lösung und in Konzentrationen appliziert wird, die 0,0001 bis 100 000 internationale Referenz-Einheiten (IRU) ml entsprechen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung wäßrig ist.

13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort dadurch hervorgerufen wird, daß man den Pflanzen eine Substanz topisch appliziert, die mindestens eine Verbindung enthält, die nicht IFN ist und die in der Lage ist, die Antwort zu induzieren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Produktion einer zweiten Verbindung induziert, die eine Aminosäureursequenz enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die induzierende Verbindung eine dsRNS ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Verbindung vollständiges HuIFN ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Verbindung ein HuIFN-Fragment ist.

18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein intrazellulärer Mittler ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Mittler eine 2′,5′-Oligoadenylsäure oder ein Derivat derselben ist.

20. Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Verbindung, die die Pflanze veranlaßt, eine IFN-artige Antwort hervorzubringen, und eine zweite Verbindung, die Virusvectoren blockiert, in Kombination topisch appliziert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dsRNSn und intrazellulären Mittlern.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pyrethrum-Verbindungen und Pheromonen.

23. Stoffzusammensetzung, gekennzeichnet aus einer ersten Verbindung, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus dsRNS und intrazellulären Mittlern, vermischt mit einer zweiten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyrethrum-Verbindungen und Pheromonen.

24. Pflanze, geschützt gegen Pathogene durch Behandlung nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.

25. Pflanze, geschützt gegen Pathogene durch Behandlung nach dem Verfahren gemäß Anspruch 20.