DE3218079A1

DE3218079A1 - Einrichtung fuer die auftrennung von anhaeufungen biologischer zellen

Info

Publication number: DE3218079A1
Application number: DE19823218079
Authority: DE
Inventors: Marshall D. Framingham Mass. Graham; David J. Wellesley Mass. Zahniser
Original assignee: Coulter Electronics Inc 33010 Hialeah Fla; Coulter Electronics Inc
Current assignee: Foundation For Research And Development Of
Priority date: 1981-05-14
Filing date: 1982-05-13
Publication date: 1982-12-02
Also published as: JPS57194355A; FR2505870B3; CA1178183A; GB2100137A; NL8201972A; GB2100137B; FR2505870A1

Description

Patentanwälte ^Edö

K. Schieschke

40, MkM

COULTER ELECTRONICS, INC Hialeah/Florida U.S.A.

Einrichtung für die Auftrennung ' von Anhäufungen biologischer Zellen

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Einrichtungen für die Auftrennung von Zellsuspensionen, mit denen Proben für eine nachfolgende Analyse gewonnen werden können.

Die Auftrennung von Anhäufungen von Zellen aus Gewebeproben, Abschabungen und Körperflüssigkeiten wird oft für die visuelle Analyse benötigt und ist auch von größter Bedeutung für eine quantitative Analyse. Letzteres gilt insbesondere dann, wenn automatisch arbeitende Untersuchungseinrichtungen benutzt werden. Es sind bisher sowohl mechanische als auch chemische Trennverfahren benutzt worden, um Anhäufungen von biologischen Zellen aufzutrennen. Für bestimmte Anwendungsfälle, insbesondere bei Zellkulturen arbeiten die chemischen Methoden zufriedenstellend. Für eine Reihe von anderen Anwendungsfällen jedoch sind diese Verfahren zu aggressiv. Eine Reihe von mechanisch arbeitenden Auftrennverfahren, welche auf dem Prinzip des Schütteins und Umrührens, der erzwungenen Filtration, der Homogenisierung oder der Verarbeitung mit Spritzen bzw. mit

Ultraschall beruhen, werden in den nachfolgenden Literaturstellen beschrieben:

1) Garcia, 6.L., und Tolles, W.E., "Ultrasonic disaggregation of cell clusters", J. Histochem. Cytochem. _?25:508, 1977;

2) Mayall, B.H., "Monodisperse cell samples; the problem and possible solutions", in The Automation of Uterine Cancer Cytology, ed. by G.L. Wied, G.F. Bahr, and P.H. Bartels, Tutorials of Cytology, Chicago, 1976, p.6i;

3) Miller, F., "Cytopreparatory methods: collection smearing, staining, screening, reporting", Compendium of Cytopreparatory Techniques, ed. by C. M. Keebler, J.W. Reagan, and G.L. Wied, Tutorials of Cytology, Chicago, 1976,

P. 59;

k) Wheeless, L.L., Jr., und Onderdonk, M.Α., "Preparation of clinical gynecologic specimens for automated analysis: an overview", J. Histochem. Cytochem., 22:522, 197V, und

5) Rosenthal, D.L., Stern, E., McLatchie, C, Wu, Α.,Lagasse, L.D., Wall, R., und Castleman, K.R., "A f.imple Method of Producing a Monolayer of Cervical Cells for Digital Image Processing", Anal. Quant. Cytol., 1:8*+, 1979·

Von allen vorstehend beschriebenen möglichen Verfahren ist zweifelsohne die mit Spritzen arbeitende Methode die am meisten erfolgreiche bei der Auftrennung von Zellanhäufungen. Hierbei wird die Zellsuspension wiederholt unter Druck durch eine Spritzennadel hindurchgepreßt. Die S-cherungskräfte an der*Spitze dieser Nadel sind stark genug, um die Zellanhäufungen aufzubrechen.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Einrichtung für die Auftrennung von Anhäufungen biologischer Zellen in einer Probensuspension, die einen die Probensuspension enthaltenden Becher aufweist. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Rotor drehbar im Inneren des Bechers angeordnet ist, daß Antriebsmittel für die Drehung des Rotors vorgesehen sind,

durch die Scherkräfte zur Auftrennung der Anhäufung der Zellen erzeugt werden, welche sich in der Probensuspension zwischen dem Rotor und dem Becher befinden.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung kann ein konzentrisch angeordneter innerer Behälter am Boden des Bechers zwischen dem Eotor und der inneren Wandung des Bechers angeordnet werden, um so eine Sammlung von Bereichen mit unterschiedlichen Dichten zu ermöglichen. Bei einer anderen Äusführungsform der Erfindung ist eine innere Aushöhlung im Rotor vorgesehen, von der aus eine Anzahl von öffnungen sich durch den Rotor nach außen erstrecken, um so zentrifugal wirkende Kräfte zu erzeugen, welche die Flüssigkeit aus der Aushöhlung durch die öffnungen hindurchdrücken. Eine andere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß dor Rotor mit einer schraubenlinienförmig verlaufenden, ..•■■rmartig ausgebildeten äußeren Oberfläche versehen ist und "i m Inneren einer Buchse angeordnet ist, die eine Anzahl von Löchern mit großem Durchmesser im oberen Bereich und eine Anzahl von Löchern mit kleinem Durchmesser im unteren Bereich aufweist.

Durch die Ausführungsformen der Erfindung lassen sich hohe Anteile von vereinzelten Zellen erreichen, ohne daß es zu einer ins Gewicht fallenden Zerstörung der Zellen infolge der angewandten Technik kommt. Diese Verfahren können in Zeitbereichen durchgeführt werden, welche viel kürzer sind als jene, welche mit Einrichtungen des bekannten Standes der Technik realisierbar sind.

Die Erfindung und ihre Weiterbildungen werden nachfolgend an Hand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 in perspektivischer Darstellung eine erste Ausführungsform einer Einrichtung gemäß der Erfindung,

Fig. 2 einen Teilausschnitt in perspektivischer Darstellung als Abwandlung der Einrichtung nach Fig. 1,

• · ♦ ·

Fig. 3 im Querschnitt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Abwandlung der Einrichtung nach Fig. 1, wobei die Schnittlinie entlang der Linien 3-3 in Fig. 4 verläuft,

Fig. 4 in Draufsicht eine Darstellung der Ausführungsform nach Fig. 3 und zwar geschnitten entlang der Linien 4-4 und

Fig, 5 in Seitenansicht eine weitere Abwandlung der Einrichtung nach Fig. 1.

In Fig. 1 ist die Einrichtung zur Auftrennung der Teilchen mit 10 bezeichnet. Sie ist insbesondere geeignet -für die Auftrennung oder Separierung von Anhäufungen von Zellen aus Zellgewebeproben, aus Abschabungen und aus Körperflüssigkeiten. Die so vereinzelten Zellen können nachfolgend für eine Anzahl von allgemein gebräuchlichen Untersuchungen benutzt werden. Beispielsweise können die Zellen auf mikroskopischen Objektträgern für eine nachfolgende visuelle Untersuchung mittels des Mikroskopes herangezogen werden. Es ist auch möglich, mit automatisch arbeitenden Untersuchungssystemen zu arbeiten oder Durchflußsysteme anzuwenden. Die Auftrenneinrichtung 10 enthält einen trommeiförmig ausgebildeten Rotor 12, welcher innerhalb eines Bechers 14 oder eines ähnlichen Behälters rotieren kann. Der Rotor 12 und der Becher 14 haben beide bevorzugt zylindrische Gestalt. Es ist aber auch möglich, eine andere Formgebung anzuwenden, beispielsweise eine konische Konfiguration. Der Becher 14 dient dazu, die Zellproben in einer flüssigen Suspension 16 aufzunehmen. Der Rotor 12 ist fest an einem elektrischen Motor 18 über eine Welle 20 angekoppelt, Der elektrische Motor ist seinerseits elektrisch an eine nicht dargestellte Spannungsquelle angeschlossen, von der die elektrische Energie für die Drehung des Rotors 12 geliefert wird. Der elektrische Motor 18 hat ein Gehäuse 22 mit einem Ansatz 24, welcher sich von dem unteren Ende des Gehäuses aus nach unten erstreckt. Der Ansatz ist so ausge-

legt, daß er gleitend in den oberen Teil des Bechers 1 if hineinpaßt, so daß das Gehäuse 22 auf dem Becher 14 aufliegt und von diesem getragen wird. Es ist zweckmäßig aber nicht immer notwendig, eine oder mehrere Scheiben oder Ränder 23 im oberen Bereich des Rotors 12 anzubringen, um so zu verhindern, daß die Suspension an der Innenwand des Bechers hochsteigt.

Es ist vorteilhaft, aber nicht zwingend, den Becher 14 und den Rotor 12 aus Plastik herzustellen, während die Welle 20 aus Metall besteht und das Gehäuse 22 samt dem Ansatz ebenfalls aus Plastik aufgebaut sind. Als Hinweise für die Auslegung der Anordnung können folgende Zahlenangaben dienen: Die Oberfläche des Rotors 12 ist von der Innenwand des Bechers um etwa 4 Millimeter entfernt. Der Durchmesser des Rotors kann beispielsweise 17 Millimeter betragen und der Innendruchmesser des Bechers bei 25 mm liegen. Der Rotor ist vom Boden des Bechers 14 einen Millimeter entfernt und die vertikale Höhe des Rotors 12 beträgt 14,5 mm bis zu den Scheiben 23₅ wobei die beiden Scheiben 23 weitere 5 mm der Höhe hinzufügen. Der Durchmesser der Scheiben 23 beträgt 20 mm. Typischerweise umfaßt die Suspension 16 9 Milliliter, so daß der Flüssigkeitsspiegel sich über den Rotor 12 um 3 mm hinaus erstreckt. Diese Zahlenwerte sollen nur der Krläuterung dienen und können je nach Anwendungsfall mehr oder weniger abgewandelt werden. Beispielsweise sind Abstände in der Größenordnung eines Zentimeters zwischen dem Rotor 12 und dem Becher 14 benutzt worden, und zwar abhängig davon, wie die gewünschte Auftrennung der Zellen sein soll. Im Betrieb dreht sich der Rotor 12 sehr schnell und mit einer ausreichend großen Geschwindigkeit, durch die Scherkräfte zwischen der Außenwand des Rotors 12 und der Innenwand des Bechers 14 erzeugt werden. Diese Scherkräfte sind ausreichend, um die Zellanhäufungen auseinanderzu- . brechen, ohne daß die Zellen selbst unerwünschterweise beschädigt werden. Es wird angenommen, daß die Scherkräfte

im Bereich unmittelbar benachbart der Außenwand des Rotors 12 entstehen. Der Rotor 12 kann beispielsweise mit 2000 bis 6000 Umdrehungen pro Minute betrieben werden. Im allgemeinen gilt, daß die Ergebnisse urn so besser werden, je höher die Umdrehungszahlen liegen. Dabei gilt, daß Umdrehungszahlen unter 2000 Umdrehungen pro Minute im allgemeinen nicht mehr akzeptierbar sind. Untersuchungen der erfindungsgemäßen Einrichtung haben ergeben, daß sich eine signifikante Verkürzung der Zeit erreichen läßt, welche benötigt ist, um die Zellanhäufungen aufzutrennen, und zwar im Vergleich zu der herkömmlichen "Spritzenauftrennung" einer Zellsuspension. Bei der Anwendung der Auftrenneinrichtung 10 für Proben aus dem Halsbereich konnten Ergebnisse mit 80 bis 90 °/o vereinzelten Zellen erreicht werden, und zwar ohne Beschädigung von Zellen. Diese Ergebnisse wurden mit einer Rotordrehung über einen Zeitbereich von 30 Sekunden erreicht. Ähnliche Ergebnisse mittels des Spritzenverfahrens erfordern eine Zeit von 10 bis 15 Minuten. Die Einrichtung 10 ist auch gut geeignet für die Benutzung innerhalb eines automatisch arbeitenden Untersuchungsgerätes. Der Rotor 12 läßt sich leicht reinigen und zwar einfach durch eine Drehung in einem Bad von fließendem Wasser.

Obwohl im vorliegenden Beispiel ein elektrischer Motor 18 als bevorzugte Ausführungsform angegeben ist, können auch andere Antriebseinrichtungen für den Rotor 12 vorgesehen werden. Beispielsweise kann ein kompakter Luftturbinenantrieb benutzt werden, der dann an die Stelle des kleinen elektrischen Motors 18 tritt.

Fig. 2 zeigt eine Anpassung der Auftrenneinrichtung 10 dahingehend, daß es möglich ist, eine Sammlung von Bereichen mit unterschiedlichen Dichten durchzuführen. Der Becher 1^ ist hierzu so abgewandelt, daß er einen doppelwandigen Aufbau aufweist, und zwar dadurch, daß er einen konzentrischen inneren Behälter 26 enthält. Dieser innere Behälter 26 kann

sich Ms zu einer Position erstrecken, welche oberhalb oder unterhalb des Bodens des Rotors 12 liegt. Vorzugsweise ist das obere Ende des inneren Bechers 26 geringfügig unterhalb dem Boden des Rotors 12 angeordnet. Durch entsprechende Auswahl der Anordnung der Zwischenwand und durch die Höhe des Behälters 26 ist es möglich, von der Suspension Komponenten zu gewinnen,- welche unterschiedliche Dichten aufweisen, und zwar entsprechend der zentrifugierenden Funktion des Rotors 12. Weiterhin ist davon auszugehen, daß mit einer Vielzahl von konzentrisch angeordneten inneren Bechern 26 es möglich ist, die einzelnen Proben in mehr als zwei Teilbereichen auszusondern. Hierzu werden die mehrfach vorgesehenen Behälter 26 entlang des Bodens des Bechers 14 angeordnet.

Die Fig. 3 ^un£i h zeigen eine andere Aus führungsform des Ausführungsbeispiels nach Fig. 1. Der Rotor hat hier eine zentrale Aushöhlung 28, welche in seinem Inneren gebildet ist, wobei eine Mehrzahl von öffnungen 30 vorgesehen ist, die sich von der Aushöhlung 28 zu der Außenwand 32 des Rotors erstrecken. Jede dieser öffnungen 30 hat einen zylin-

"drischen Teil 34 und einen sich erweiternden, als Kegelaus gebildet en
stumpf/Teil 36. Auch hier ist die Außenwand 32 des Rotors von der Innenwand des Bechers 14 durch einen ähnlichen Abstand abgesetzt,wie im Zusammenhang mit Fig. 2 erläutert. Die einzelnen Öffnungen 30 sind so angeordnet, daß ihre Achsen die Tangente an einen gedachten Kreis bilden,' welcher konzentrisch zu der Welle 20 verläuft, wie dies näher aus Fig. 4 ersichtlich ist. Die voneinander zu trennenden Zellen werden aus der Höhlung 28 durch die Öffnungen 30 infolge der Zentrifugalkräfte bei der Drehung des Rotors nach außen gezogen. Anders ausgedrückt arbeitet diese Anordnung als Zentrifugalpumpe. Neben der bereits beschriebenen Scherkraft,, die zwischen der Außenwand 32 des Rotors 12 und der Innenwand des Bechers 14 auftritt, wird hierbei eine zusätzliche Scherkraft dadurch erzeugt, daß das Zellmaterial in Form

eines Düsenstroms durch die Öffnungen 30 hindurchbewegt wird. Somit bringt die Bewegung der Zellen durch die Öffnungen 30 eine Erhöhung der gegenseitigen Auftrennung der Zellen mit sich, welche durch die Scherkräfte zwischen den Wänden hervorgerufen wird.

Fig. 5 zeigt eine andere Ausführung der Auftrenneinrichtung 10, wobei der Rotor 12 einen schraubenlinienförmig verlaufenden Ausschnitt 38 aufweist, welcher eine wurmförmige äußere Gestalt ergibt. Der Becher 1 if ist mit einem größeren Querschnitt verglichen mit den vorangehend beschriebenen Ausführungsbeispielen versehen. Zwischen dem Rotor 12 und dem Becher 1 i+ ist eine geschlossene Buchse kO vorgesehen. Im einzelnen liegt jetzt der Motor Ik auf dem oberen Rand der Buchse i+0. Die Buchse ifO weist ein geschlossenes unteres Ende k2. auf, welches auf dem Boden des Bechers Ik aufliegt. Im unteren Teil der Buchse kk ist eine Anzahl von Löchern kk kleinen Durchmessers vorgesehen, wobei diese im unteren Bereich bezogen auf das untere Ende des Rotors 12 liegen. Dagegen ist eine Anzahl von Löchern Z+6 größeren Durchmessers in der Buchse ^O vorgesehen, welche im Bereich des oberen Endes des Rotors 12 angeordnet sind. Es ist zweckmäßig, aber nicht immer notwendig, daß eine Abdeckscheibe k7 in einer Höhe vorgesehen ist, in welcher sich die Oberfläche der Probensuspension befindet, um so zu verhindern, daß sich die Flüssigkeit entlang der Wände nach oben bewegt. Infolge der Richtung der auf der Außenfläche angebrachten,schraubenlinienförmig verlaufenden Ausschnitte 38 nach Fig. 5 ergibt eine von unten her gesehen im Uhrzeigersinn verlaufende Drehung des Rotors 12 eine Kraft, welche die Flüssigkeit nach unten in Richtung zum Boden der Buchse ^O bewegt. Als Folge dieser Anordnung wird Flüssigkeit aus dem Becher Ik durch die mit großem Durchmesser versehenen Löcher 46 hindurchbewegt, dann nach unten in Richtung auf den Boden der Kappe kO umgeleitet und schließlich nach außen durch die kleinen Löcher kk hinausgedrückt. Zusätzlich zu der Scher-

kraft, welche durch die wurmförmig gestaltete Oberfläche des Rotors 12 und die Innenwand des Bechers Ii+ erzeugt wird, ergeben sich weitere Scherkräfte dadurch, daß die Flüssigkeit durch die mit kleinem Durchmesser versehenen Löcher kk hinausgespritzt wird. Weiterhin gibt, verglichen mit der Ausführungsform nach Fig. 3 und ^, die Rotation der schraubenlinienförmig verlaufenden Ausschnitte 38 die Möglichkeit, wesentlich größere Drücke anzuwenden, um die Zellen durch die Löcher l+k hindurchzubewegen. Genauer gesagt, liefert die Kombination der Schwerkraft des Rotors 12 und der Löcher l\l\. in der Buchse i±O eine ausgezeichnete Auftrennung (Disaggregation) mit einer Verbesserung bis zu 10 °/o gegenüber der Grundausführungsform des Rotors nach Fig. 1. Dieser hinzugefügte Druck kann auch d.ifür nützlich sein, das Zytoplasma vom Zellkern abzustreifen.

Patantanwäite

Dipl.-Ing. E. Eder

Dipl.-!ng. K. Schieschke

8000 Mönchen 40, Elisabetnstr. 34

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Leerseite

Claims

Dipl.-Ing. E. Eder
Dipl.-Ing. K.Schieschke

8000 München 40, Ellsabethstr. 34

COULTER ELECTRONICS, INC, Hialeah/Florida U.S.A.

Einrichtung für die Auftrennung von Anhäufungen biologischer Zellen

Patentansprüche

/ 1../Einrichtung (10) für die Auftrennung von Anhäufungen biologischer Zellen in einer Probensuspension (16), die einen die Probensuspension enthaltenden Becher (Ή) aufweist,

dadurch gekennzeichnet,

daß ein Rotor (12) drehbar im Inneren des Bechers angeordnet ist,

daß Antriebsmittel (18, 20) für die Drehung des Rotors vorgesehen sind, durch die Scherkräfte zur Auftrennung der Anhäufung der Zellen erzeugt werden, welche sich in der Probensuspension zwischen dem Rotor und dem Becher befinden.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Oberfläche des Rotors (12) und die Innenwand des Bechers (Ii₄.) jeweils einen kreisförmigen Querschnitt aufweisen.
3· Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rotor (12) ein unteres Ende aufweist, welches gegenüber dem Boden des Bechers (H) abgesetzt angeordnet ist.

• ·

• ft · «
4. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,

daß ein innerer Behälter (26) zwischen dem Rotor und dem Becher vorgesehen ist und auf dem Boden des Bechers aufliegt.
5· Einrichtung nach Anspruch 4_S dadurch gekennzeichnet, daß der im Inneren angeordnete Becher (26) einen kreisförmigen Querschnitt und/in einer konzentrischen Anordnung in Bezug auf den Becher (14) und den Rotor (12) positioniert ist und daß dieser innere Behälter eine Höhe aufweist, welche sich nach oben bis etwa in die Nähe des unteren Endes des Rotors erstreckt.
6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet,

daß der Rotor (12) eine Aushöhlung (28) in seinem Inneren enthält,

daß eine Anzahl Öffnungen (30) durch den Rotor hindurchgehen und

daß diese Öffnungen sich von der Aushöhlung zu der äußeren Oberfläche des Rotors erstrecken, wobei die Drehung des Rotors eine zentrifugale Kraft erzeugt, welche die Proben von der Aushöhlung aus durch die Öffnungen bewegt.
7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet,

daß eine Buchse (40) im Inneren des Bechers (14) angeordnet ist,

daß die Buchse eine Anzahl von Löchern (44) Mit relativ kleinem Durchmesser und eine Anzahl von Löchern (46) mit relativ großem Durohmesser aufweist, welche in beiden Fällen durch die Wandung der Buchse hindurchtreten, wobei die Löcher (46) mit dem großen Durchmesser oberhalb der Löcher (44) mit dem kleinen Durchmesser angeordnet sind, und

LO'^:..^:.:·· 321^079

daß der Rotor an seiner Oberfläche schraubenlinienförmig verlaufende Ausschnitte (38) aufweist, wodurch bei einer Drehung des Rotors die Probensuspension durch die Löcher mit dem großen Durchmesser hindurchgezogen werden und •die Probensuspension im Inneren der Buchse nach unten bewegt wird, so daß die Probensuspension durch die Löcher mit dem kleinen Durchmesser nach außen gedrückt werden.
8. Einrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Löcher mit dem großen Durchmesser (4-6) in einem Bereich.angeordnet sind, der bei oder oberhalb des oberen Teils des Rotors liegt, und

daß die Löcher mit dem kleinen Durchmesser (44) in dem Bereich des unteren Endes des Rotors liegen.

Patentanwälte

Dipl.-!naE.Eder

DipL-Ing^Schieschke

8000 MDncMtfP. EUsabirthstr. 34