DE3000521A1

DE3000521A1 - SUBSTANCE WITH INTERFERON INDUCING ACTIVITY AND METHOD FOR THEIR PRODUCTION

Info

Publication number: DE3000521A1
Application number: DE19803000521
Authority: DE
Inventors: Takashi Hashimoto; Yasuhiko Kojima; Seishi Konno; Sadao Tamamura
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1979-01-10
Filing date: 1980-01-09
Publication date: 1980-07-24
Also published as: FR2446110B1; FR2446110A1; GB2042555A; GB2042555B

Description

Andrejewski, Honke & PartnerAndrejewski, Honke & Partner PatentanwdPatent attorney

3Q.00523Q.0052

walteexercise

Diplom-PhysikerPhysicist

Dr. Walter AndrejewskiDr. Walter Andrejewski

Diplom-IngenieurGraduate engineer

Dr.-Ing. Manfred HonkeDr.-Ing. Manfred Honke

Diplom-PhysikerPhysicist

Dr. Karl Gerhard MaschDr. Karl Gerhard Masch

Anwaltsakte:Lawyer file:

8l6/to+th.8l6 / to + th.

4300 Essen 1, Theaterplatz 3, Postf. 1002544300 Essen 1, Theaterplatz 3, Postf. 100254

7. Januar 1980January 7, 1980

Patentanmeldung KITASATO KENKYUSHO (The Kitasato Institute) 9-1t Shirokane 5-chome, Minato-ku, Tokyo-to, Japan Patent application KITASATO KENKYUSHO (The Kitasato Institute) 9-1 t Shirokane 5-chome, Minato-ku, Tokyo-to, Japan

Substanz mit Interferon induzierender Aktivität sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.Substance with interferon-inducing activity and process for their preparation.

Bei Interferon, welches nachstehend auch als IP oder als virushemmender Paktor bezeichnet wird, handelt es sich um eine Substanz, welche auf tierische Zellen einwirken kann, um das Wachstum eines Virus zu hemmen, wobei es sich um eine von der Zelle entsprechend der Virusinfektion freigegebene Proteinart handelt-Die vir.ozide Aktivität von IP ist in Bezugv auf eine Tierspezies spezifisch, jedoch unspezifisch in Bezug auf eine VirusspeziesIn the case of interferon, which is also referred to below as IP or as virus-inhibiting Paktor is called, it is a substance that can act on animal cells to promote growth to inhibit a virus, which is a type of protein released by the cell in accordance with the virus infection-die virocidal activity of IP is specific with respect to an animal species, but unspecific with respect to a virus species

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3QQ05213QQ0521

Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in EssenAndrejewski, Honke & Partner, patent attorneys in Essen

und kann unter für ihre Induzierung unterschiedlichen Bedingungen ; schwanken. Es ist auch bekannt, daß das Wachstum bestimmter tie- j rischer tumorartiger Viren durch IP unter bestimmten Bedingungen | stark gehemmt werden kann.and can under different conditions for their induction; vary. It is also known that the growth of certain animal tumor-like viruses by IP under certain conditions | can be strongly inhibited.

Eine Substanz, welche zur Induzierung von IF auf tierische Zellen | einwirken kann, wird als Interferon induzierende Substanz bezeich« net. Eine derartige Substanz ist daher von Interesse für-Vorbeu- i gungsmaßnahmen und für die Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Erkrankungen durch Virusinfektion. Allerdings wurden in der Praxis bisher verschiedene bekannte derartige Substanzen niemals für einen derartigen Zweck verwendet, da gewisse schwerwiegende Schäden auftragen. So ist beispielsweise in der US-Patentschrift 3 583 893 (1971) eine doppelsträngige Ribonucleinsäure als Interferon induzierende Substanz offenbart, welche unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt wird, wobei im Hinblick auf den Stand der Technik darauf hingewiesen wird, daß viele Substanzen wie Bakterien, Viren, Polysaccharide, mitogene Wirkstoffe, Indotoxine und dgl. die Interferonbildung stimulieren, daß jedoch keine für den Routinegebrauch von Interesse ist, und zwar unter anderem wegen der Giftigkeit, der Antigenwirkung und wegen der Infektiösitat. Weitere bekannte Interferon induzierende Substanzen sind beispielsweise in den US-Patentschriften 3 773 924 und 3 884 845 sowie in der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho 121919/78 beschrieben. Diese Interferon induzierenden Substanzen sind jedoch nicht aus Pflanzen isoliert und man weiß auch, daß aus Mikroorganismen isolierte Interferon induzierende Substanzen im allgemeinen wegen ihrer hohen Giftigkeit für therapeutische Zwecke unvorteilhaft sind.A substance used to induce IF on animal cells | can act is called an interferon-inducing substance « net. Such a substance is therefore of interest for prevention i measures and for the treatment of various human and animal diseases caused by viral infection. However In practice, various known such substances have never been used for such a purpose, as certain apply serious damage. For example, in U.S. Patent 3,583,893 (1971) there is a double-stranded ribonucleic acid disclosed as an interferon-inducing substance which is produced using a microorganism, wherein With regard to the prior art, it should be noted that many substances such as bacteria, viruses, polysaccharides, mitogenic Active ingredients, indotoxins and the like stimulate the formation of interferon, but none of them of interest for routine use is, among other things because of the toxicity, the antigenic effect and because of the infectiousness. More known interferon inducing substances are described, for example, in US Pat. Nos. 3,773,924 and 3,884,845 and in Japanese Patent Laid-Open Kokai Koho 121919/78. However, these interferon-inducing substances are not isolated from plants and it is also known that interferon-inducing substances isolated from microorganisms are generally known because of their high toxicity are unfavorable for therapeutic purposes.

~~~0"3W3O7 0 6 9 9~~~ 0 "3W3O7 0 6 9 9

Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte Andrejewski, Honke & Partner, patent attorneys

- jf -- jf -

Beispiele bekannter mitogener Mittel sind Phytoheinaglutinin (Wheelock, Science, 14? QlO (1965), Pokeweed Mitogen (Friedman et al, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., _125:901 (1967) und Concanavalin A (Willen et al. Cell.Immunol., 6:110 (1973)^ welche jeweils aus Geweben zweier in Amerika als "kidney bean" und als "horse beanj bekannter Bohnenarten und aus einer unter dem Namen Pokeweed bekannter Pflanze isoliert wurden. Infolge ihrer extrem niedrigen Aktivität, Interferon zu induzieren, wurde jedoch kein erfolgreicher Versuch gemacht, diese mitogenen Mittel zu Präventivzwecken und zum Heilen verschiedener menschlicher und tierischer Krankheiten infolge VirusInfektionen zu verwenden.Examples of known mitogenic agents are phytoheinaglutinin (Wheelock, Science, 14? Q10 (1965), Pokeweed Mitogen (Friedman et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 125: 901 (1967) and Concanavalin A (Willen et al. Cell.Immunol., 6: 110 (1973) ^ which were each isolated from tissues of two types of beans known in America as "kidney bean" and as "horse bean" and from a plant known under the name of Pokeweed. As a result of their extremely low activity, interferon however, no successful attempt has been made to use these mitogenic agents for preventive purposes and for curing various human and animal diseases due to viral infections.

Man kennt auch andere Interferon Induzierende Substanzen^, welche aus Geweben höherer Pflanzen isoliert werden. So geben beispielsweise Kumazawa, Kojima et al (japanische Offenlegungsschrii't Kokai Koho 52107/78) an, daß eine Interferon Induzierende Substanz, von welcher angenommen wird, daß es sich um eine Art von hydropolymerem Saccharid handelt, welche als Hauptbestandteile Hexose (48$), Protein (5$) und Uronsäure (40$) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan bekannt als Tokl) durch Extraktion mit heißem Wasser isoliert wird, sodaß eine extrahierte Lösung entsteht, welche der Dialyse unterworfen wird. Dem entstandenen Rückstand wird Azeton zugesetzt, um ein Präzipitat zu erhalten, welches dann gefriergetrocknet wird. In diesem Fall kann, falls gewünscht, die extrahierte Lösung durch Konzentration j unter vermindertem Druck oder durch Verwendung siner Diaflo-Membrane und anschließende Dialyse auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden. Als Nächstes beschreiben Kojima und TamamuraOther interferon-inducing substances are also known, which can be isolated from tissues of higher plants. For example, Kumazawa, Kojima et al (Japanese Offenlegungsschrii't Kokai Koho 52107/78) that an interferon inducing substance, which is believed to be a type of hydropolymeric saccharide which are the main components Contains hexose ($ 48), protein ($ 5), and uronic acid ($ 40) and one Molecular weight in excess of 10,000, obtained from the root of Angellica acutiloba Kitagawa (known as Tokl in Japan) Extraction is isolated with hot water, so that an extracted solution is formed, which is subjected to dialysis. The resulting Acetone is added to the residue to obtain a precipitate which is then freeze-dried. In this case can, if desired, the extracted solution by concentration j under reduced pressure or by using his Diaflo membrane and subsequent dialysis can be made up to an appropriate amount. Next, describe Kojima and Tamamura

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-X--X-

(japanische Offenlegungsschrift Kokai Koho 99313/7&) eine Inter- \ feron induzierende Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr j(Japanese Patent Kokai Koho 99313/7 &) a Inter- \ feron inducing substance having a molecular weight greater j

als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000), welche als Hauptbestandteil eine 1-5 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 90$) j enthält, welche dadurch hergestellt wird, daß die Wurzelrinde | eines Maulbeerbaumes wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan als Maguwa bekannt·) oder Morus bombycis Koizdumi (in Japan bekanntthan 20,000 (mostly more than 100,000), which is the main ingredient a 1-5 bound glucose (hexose: more than $ 90) j which is produced by the fact that the root bark | of a mulberry tree such as Morus alba Linne (in Japan known as Maguwa ·) or Morus bombycis Koizdumi (known in Japan

als Yamaguwa) mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten ^! Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesem Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird und dieser Rückstand dann gefriergetrocknet wird. Dabei kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse erforderlichenfalls durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer Diaflo-Membrane auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden.as Yamaguwa) is extracted with hot water, the extracted ^! An organic solvent is added to the solution to obtain a precipitate, and a small amount of water is added to this precipitate, the solution is subjected to dialysis to produce a residue, and the residue is then freeze-dried. After the extraction and / or before the dialysis, the solution can, if necessary, be made up to a suitable amount by concentration under reduced pressure or by using a Diaflo membrane.

Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Der billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierende Substanz erhalten wird, kann jedoch infolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzengewebe über viele Jahre hinweg als Quelle der traditionellen Sino-japanischen Drogen zu Ende gehen.These two interferon inducing substances have a low level Toxicity and can be easily manufactured. The cheap and plentiful supply of the plant tissues from which the Interferon inducing substance is obtained, however, as a result the continued use of this plant tissue for many years as a source of traditional Sino-Japanese Drugs run out.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Interferon induzierende Substanz mit ausgezeichneten Eigenschaften zu schaffen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu verwirklichen.The invention has set itself the task of an interferon to create an inducing substance having excellent properties and to realize a process for its production.

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-A--A-

Die Erfindung basiert auf der Peststellung, daß eine Substanz, welche aus dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurde, welche zum Genus Artemisia der Familie Compositae und ihren Varianten gehören, bei geringer Giftigkeit ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus den Pflanzengeweben leicht und preiswert isoliert werden.The invention is based on the plague claim that a substance which has been isolated from the tissue of various plants, which belong to the genus Artemisia of the Compositae family and theirs Variants include, with low toxicity, excellent interferon shows inducing activity. In addition, the active substance can be isolated from the plant tissues easily and inexpensively will.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung ist eine Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche in der Form von amorphem weißlichem Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie in praktisch reiner Form nachstehende physikalisch-chemische Merkmale aufweist:According to one feature of the invention is a substance with interferon inducing activity which is stable in the form of amorphous whitish powder, characterized in that it the following physico-chemical in practically pure form Features:

1) Elementaranalyse:1) Elemental analysis:

H: 7/4 + 0,4 #,_C: 45,6 + 0,4 %, N: IJ,5 ± 0,4 %, P: 2,8 + . Q3 #H: 7/4 + 0.4 #, _ C: 45.6 + 0.4 %, N: IJ, 5 ± 0.4 %, P: 2.8 +. Q3 #

2) Molekulargewicht:2) Molecular Weight:

Ca. 100 000 bis ca. j5 000 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000) .Approx. 100,000 to approx. 5,000,000 (mainly approx. 500,000 up to approx. 1,000,000).

bestimmt durch Ultrazentrifugieren mit einer Spinco Model E Analytical Ultrazentrifuge (Handelsprodukt der Beckman Instrument Inc., USA), Ultrafiltrieren mit einem Amicon Ultrafilter mit Amicon XM 50, XM lOOA und XM J500-Membranen (Handelsprodukte der Amicon Corp., USA) und UK 50-, UK 100- und UK j500-Membranen (Handelsprodukte der Toy ο Roshi K.K., Tokyo) und Gel-filtrieren mit Sephadex G-200 (Handelsprodukt der Phrmacia Fine Chemical AB, Schweden).determined by ultracentrifugation with a Spinco Model E. Analytical ultracentrifuge (commercial product from Beckman Instrument Inc., USA), ultrafiltration with an Amicon Ultrafilter with Amicon XM 50, XM 100A and XM J500 membranes (Commercial products of Amicon Corp., USA) and UK 50, UK 100 and UK j500 membranes (commercial products of Toy ο Roshi K.K., Tokyo) and gel filtering with Sephadex G-200 (commercial product of Phrmacia Fine Chemical AB, Sweden).

J>) Schmelz- oder Zersetzungspunkt: Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220⁰C. J>) Melting or decomposition point: Melting point undetermined. Charred at about 220 ^0C .

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:4) Ultraviolet absorption spectrum:

Siehe Pig.l (bestimmt in O,1N NaOH), welches in Wasser oder IN NaOH im wesentlichen unverändert ist.See Pig.l (determined in 0.1N NaOH), which in water or IN NaOH is essentially unchanged.

5) Infrarot-Absorptionsspektrum:
Siehe Fig.2 (durch KBr-Methode).5) Infrared absorption spectrum:
See Fig. 2 (by KBr method).

6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:6) Solubility in various solvents:

Löslich in Wasser, leicht löslich in wässrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Azeton, Chloroform und Diäthyläther.Soluble in water, easily soluble in aqueous solutions of sodium hydroxide, potassium hydroxide and ammonium hydroxide, essentially insoluble in methanol, ethanol, propanol, acetone, chloroform and diethyl ether.

7) Farbreaktion:7) Color reaction:

Positiv in Ninhydrinreaktion und Dittmer-Reaktion. Negativ in Folin's Reagens und Elson-Morgan-Reaktion.Positive in ninhydrin reaction and Dittmer reaction. Negative in Folin's reagent and Elson-Morgan reaction.

8) Natur:
Sauer.8) nature:
Sour.

9) Chemische Hauptbestandteile:
a) Aminosäuren: (+ O,β %) 9) Main chemical components:
a) Amino acids: (+ O, β %)

Asparaginsäure 9,5 % Serin 4,7 % Prolin 3,1 % Aspartic acid 9.5 % serine 4.7 % proline 3.1 %

Threonin 4,9 Glutaminsäure 8,4 Glycin 10,2Threonine 4.9 glutamic acid 8.4 glycine 10.2

030030/0699030030/0699

AlaninAlanine 11,2 ££ 11.2 ValinValine 6,9 % 6.9 % IsoleucinIsoleucine .-.MJi..-. MJi. LeucinLeucine 7,8 #7.8 # TyrosinTyrosine Spurentraces PhenylalaninPhenylalanine 2,9 % 2.9 % Ammoniakammonia 12,1 #12.1 # LysinLysine 6,2 % 6.2 % HistidinHistidine 1,8*1.8 * ArgininArginine 5,3 % 5.3 % b) Zuckert b) sugar t Nicht feststellbar.Not detectable.

Die vorhandenen Aminosäuren wurden durch Hydrolyse mit 6N HCl bei 110°C in einer Zeitspanne von 48 h in vaouo und durch nachfolgende Analyse mit Technicon Amino Acid Autoanalyzer Type NC-I (Handelsprodukt, der Technicon Corporation, USA) und der Zucker wurde durch Hydrolyse mit 0,IN Schwefelsäure bei 80°C während einer Zeitspanne von 20 min bezw. mit IN Schwefelsäure bei 100⁰C in einer Zeitspanne von 2 h und anschließende Analyse mit Technicon Sugar Autoanalyzer Type N-I (Handelsprodukt der Technicon Corporation, USA) bestimmt.The amino acids present were determined by hydrolysis with 6N HCl at 110 ° C. in a period of 48 h in vaouo and by subsequent analysis with Technicon Amino Acid Autoanalyzer Type NC-I (commercial product, Technicon Corporation, USA) and the sugar was hydrolyzed with 0, IN sulfuric acid at 80 ° C for a period of 20 min respectively. h with IN sulfuric acid at 100 ⁰ C in a period of 2 and subsequent analysis using Technicon autoanalyzer Sugar Type NI (commercial product of Technicon Corporation, USA).

10) Optisches Drehvermögen:10) Optical rotation:

|⁶> +37° bis +79° (+76° im Durchschnitt) (c=0,W in 0,IN NaOH).| ⁶ > + 37 ° to + 79 ° (+ 76 ° on average) (c = 0, W in 0, IN NaOH).

Biologische Merkmale:Biological characteristics:

1. Interferon induzierende Aktivität; 1. Interferon inducing activity ;

Proben der Interferon induzierenden Substanz der Erfindung wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und im Serum von Testtieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen InterferonSamples of the interferon inducing substance of the invention were made used to make interferon in the cells and in the serum of test animals to induce. The activity of the resulting interferon

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AlAl -if--if-

wurde durch die im Versuch 1_ beschriebene Methode bestimmt. Die Resultate dieser Bestimmung gibt Tabelle 1 wieder, welche zeigt, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.was determined by the method described in experiment 1_. the The results of this determination are given in Table 1, which shows that the interferon-inducing activity is positive.

Table 1

Konzentration der Probe
(/Ug/ml)Concentration of the sample
(/ Ug / ml) 1010 1,01.0 22 0,10.1 Aktivität
(in vitro)activity
(in vitro) P-IOOP-IOO >1OO> 1OO 9393 TabelleTabel

0,010.01

Aktivität (in vivoActivity (in vivo

Kaninchen 1 Kaninchen 2Rabbit 1 rabbit 2

Blutentnahme in (h) nach Verabreichung 0 12 4 6Blood withdrawal in (h) after administration 0 12 4 6

55
2555
25th

480
230480
230

95
5095
50

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen
Resultate, aus denen sich ergibt, daß die Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im Versuch 1 beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Körper des Testtieres durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz induziert wurde.Table 2 shows those obtained by the method to be described below in Experiment 1 in two rabbits
Results from which it appears that the activity reaches its maximum value two hours after the administration. The method described in experiment 1 also confirmed that interferon was induced in the body of the test animal by the action of the interferon-inducing substance according to the invention.

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Es^iQ 00521Andrejewski, Honke & Partner, patent attorneys in Es ^ iQ 00521

-4-4

2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität:2. Stability of the interferon-inducing activity:

Proben von jeweils 1 mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 1OO°G für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für lh erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise wie im Versuch 1 beschrieben (in vitro-Methode) behandelt und man ι erhielt die in den Tabellen 3 und 4 wiedergegebenen Resultate, ; welche zeigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.Samples of 1 mg each of the interferon inducing according to the invention Substances were dissolved in water (1 ml each) and kept at 100 ° G for a given period of time or at a given temperature heated for lh. Each sample was then processed in the same way treated as described in experiment 1 (in vitro method) and man ι received the results shown in Tables 3 and 4, ; which show that the interferon-inducing substance according to the invention is very stable to the action of heat.

Heiztemperatur (⁰C)Heating temperature ( ⁰ C)

Table 3

IP-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /Ug/ml) IP activity at a sample concentration of (/ Ug / ml)

1010

1,01.0

0,10.1

UnbehandeltUntreated

3737

8080

100100

>100 >100 >100 >100 >ioo >100>100>100> 100 > ioo

•>ioo•> ioo

>100 >100 >100 ^100> 100> 100> 100 ^ 100

70 75 73 70 7570 75 73 70 75

Erwärmungszeit: 1 h.Heating time: 1 h.

030030/0699 BAD ORIGINAL030030/0699 BATH ORIGINAL

■" - 300052Ί■ "- 300052Ί

-yf--yf-

Tabel

Erwärmungszeit (h)Heating time (h) IF-Aktivität beiIF activity at 1,01.0 Probe vonSample of einerone Konzentration derConcentration of >100> 100 0,0, ( /ug/ml)(/ ug / ml) 1010 >1OO> 1OO '70'70 1 0,011 0.01 UnbehandeltUntreated >100> 100 >100> 100 7575 < 10 < 10 ¹ 1 ¹ 1 >1OO> 1OO >100> 100 7373 < 10<10 44th >1OO> 1OO >1QO> 1QO 6565 88th >100> 100 3030th <1O<1O 2424 >1OO> 1OO

Heiztemperatur: 100 C.Heating temperature: 100 C.

J. Akute Giftigkeit:J. Acute toxicity:

Männliche und weibliche Mäuse (ddy-Stammj 5 Wochen altj Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD,-_n-Werte, von 1 g/kg (ip.) und über 5 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.Male and female mice (ddy strainj 5 weeks oldj weight 20 + 1 g; each group consisting of 10 mice) were used as test animals. A physiological solution of sodium chloride, containing the interferon according to the invention inducing substance, the mice were administered to the LD (ip or orally.) - _n values, kg of 1 g / kg and 5 g / ((ip.) oral). There was no noticeable difference between the male and female mice.

4. Anti-Tumor Aktivität:4. Anti-tumor activity:

Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20+_l g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. In die Achselhöhle eines jeden Testtieres wurde eine Probe von S-l8o Sarcoma solid Tumor (2x2x2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5x10Mice (ddy strain; 5 weeks old; weight 20 + _l g; each group consisting of 10 mice) were used as test animals. A sample of S-l8o Sarcoma solid tumor (2x2x2 mm) or Ehrlich ascites tumor (2.5x10

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i Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die Interferon induzierende Substanz der Erfindung (0,2 mg) in Wasser gelöst und jeder Maus
oral verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und
wurde I^ Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter Anti-Tumor-Effekt wurde beobachtet. ■i cells) vaccinated. After 24 hours, the interferon inducing substance of the invention (0.2 mg) was dissolved in water and each mouse
administered orally. The administration was carried out once a day and
was carried out for one and a half days. A remarkable anti-tumor effect was observed. ■

Aus den vorgenannten Merkmalen wurde festgestellt, daß es sich i bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz um \ \ eine Substanz handelt, welche ein Molekulargewicht von etwa
¹ 100 000 bis etwa 5 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwaFor the above characteristics, it was found that it is i in the inventive interferon inducing substance to \ \ a substance which has a molecular weight of about
¹ 100 000 to about 5 000 000. (mainly about 500 000 to about

1 ι1 ι

I 1 000 000) besitzt, wobei angenommen wird, daß es sich um eine ; j proteinartige Substanz handelt, welche Phosphorsäure enthält.I 1 000 000), which is assumed to be a; j is a proteinaceous substance which contains phosphoric acid.

j Ij I

¹ Diese Substanz entspricht auch der weitgehend anerkannten Defl- ! ¹ This substance also corresponds to the widely recognized Defl-!

; I; I.

j nition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz, da sie , I Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro i I induziert, welches mit 0,08$ Trypsin bei 37⁰C für 2 h inaktiviert
i wird, wobei außerdem die Aktivität der induzierten Substanz in | Bezug auf tierische Spezies spezifisch, Jedoch in Bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sich, daß die erfindungs- ^: ^! . ij nition of any interferon-inducing substance, since it, I induces interferon in animal cells or serum in vivo or in vitro, which ^{inactivates with 0.08 $ trypsin at 37 °} C. for 2 h
i, and also the activity of the induced substance in | Specific to animal species, However non-specific to virus species. It follows that the ^{^{inventiveness:}} . i

i gemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende ! ! Substanz ist, sondern daß es sich auch um eine neue Substanz an ι 1 sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalisch- ιi proper substance not just a novel interferon inducing! ! Substance is, but that it is also a new substance in ι 1, since there is no substance with the same physical ι

j Ij I

ι chemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße
Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen
Literatur beschrieben wurde.ι chemical and biological features such as those according to the invention
Interferon-inducing substance so far in the relevant
Literature has been described.

J Bei den in der einschlägigen Literatur beschriebenen mitogenen j ! Mitteln mit Interferon induzierender Aktivität (z.B. Phytohäma- ^: ! glutinin, Pokeweed-mitogen und Concanavalin A) handelt es sich IJ The mitogenic j! Means inducing interferon activity (eg ^Phytohäma-: glutinin, pokeweed mitogen and concanavalin A!) Is, I

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3OOQ52T3OOQ52T

beispielsweise um Proteintypen mit Molekulargewichten von über 100 000, welche eine sehr schwache Interferon induzierende Aktivität besitzen, welche bei Erwärmung auf 56⁰C für 5 h inaktiviert wird. Demgegenüber besitzt die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz andersartige chemische Bestandteile, eine hohe Wärmestabilität selbst bei 100°C für mehrere Stunden und ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität.for example protein types with molecular weights of over 100,000, which have a very weak interferon-inducing activity, which is ^{inactivated when heated to 56 °} C. for 5 h. In contrast, the interferon-inducing substance according to the invention has different chemical components, high heat stability even at 100 ° C. for several hours and excellent interferon-inducing activity.

Die aus der Tokiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat zwar auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf 100⁰C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose:48$, Uronsäure:4o$, Protein:5$) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden Werten der erfindungsgemäßen Interferon .induzierenden Substanz. Die aus der Maulbeerbaum-Wurzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als aktiven Hauptbestandteil eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose:96$) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (hauptsächlich mehr als 60 000), sodaß auch diese Substanz sich von der erfindungsgemäßen Substanz unterscheidet. Außerdem ist die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, welche von bakteriellem Endotoxin und höheren Pflanzen herstammt, bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz sehr schwach.The known interferon-inducing substance isolated from the Tokyo root (Angellica acutiloba Kitagawa) also has a high molecular weight (more than 100,000) and its interferon-inducing activity is not inactivated if it is ^{heated to 100 °} C. for 1 h. However, their chemical components (hexose: $ 48, uronic acid: $ 40, protein: $ 5) and the infrared absorption spectrum differ from the corresponding values of the interferon-inducing substance according to the invention. The well-known interferon-inducing substance isolated from the mulberry tree root bark contains 1-3 bound glucose (hexose: $ 96) as its main active ingredient and has a molecular weight of more than 20,000 (mainly more than 60,000), so that this substance is also different from the substance according to the invention differs. In addition, the mitogenic activity found in the known interferon-inducing substances derived from bacterial endotoxin and higher plants is very weak in the interferon-inducing substance of the present invention.

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Artemisia gehören und als Ausgangsstoff für das Produkt der Erfindung verwendet werden können, enthalten beispielsweise Absinthin, Anabasinthin, Artemi-Various plants belonging to the genus Artemisia and used as a starting material for the product of the invention can contain, for example, absinthin, anabasinthin, artemia

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— 30 O Q 5 21- 30 O Q 5 21

setin, Paraffin, Cineol, Semicarbazon, 1-camphor, Sesquiterpen, ! Cadinen, Caryophyllen, Sequiterpenalkohol, Artemisia-keton, Isoartemisia-keton, (X -pinen, Camphen, Bornol, Cuminaldehyd, Phenol, Essigsäure, Buttersäure, Hexanol, Benzylalkohol, Methyl- j butyrat, Cuminal, Caryophyllenoxid, Pentacosan, Artemisiaalkohol., ^! /3-pinen, Capillen, Capillon, Santonin, ex -thujon, Monogynin, j Mibulacton, Cerylalkohol, Carnaubasäure, Hentriacontan, Ricosanol,, Vitamine A, B, C, D und andere niedermolekulare Substanzen, wel- ' ehe sieh insgesamt von der erfindungsgemäßen IF-induzierenden j Substanz in Bezug auf die physikalisch-chemischen und biologi- J sehen Merkmale unterscheiden und keine IF-induzierende Aktivität .setin, paraffin, cineole, semicarbazone, 1-camphor, sesquiterpene,! Cadinene, caryophyllene, Sequiterpenalkohol, Artemisia ketone, Isoartemisia ketone, (X-pinene, camphene, Bornol, cuminic aldehyde, phenol, acetic acid, butyric acid, hexanol, benzyl alcohol, methyl butyrate j, cumin aldehyde, caryophyllene oxide, pentacosane, ^{Artemisiaalkohol.,!} / 3-pinene, Capillen, Capillon, Santonin, ex -thujon, Monogynin, j Mibulacton, Ceryl alcohol, Carnaubic acid, Hentriacontan, Ricosanol ,, Vitamins A, B, C, D and other low molecular substances, wel- 'before see total of the IF-inducing substance according to the invention with regard to the physicochemical and biological J see characteristics differ and no IF-inducing activity.

aufweisen. Iexhibit. I.

Die physikalisch-chemischen Merkmale der bekannten in den US-Patentschriften 3 773 924 und J 884 845 sowie der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho I21919/78 beschriebenen Interferon induzierenden Substanzen entsprechen nicht den Merkmalen der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.The physicochemical characteristics of those known in US patents 3 773 924 and J 884 845 and the Japanese Offenlegungsschrift Kokai Koho I21919 / 78 described interferon inducing substances do not correspond to the features of the interferon-inducing substance according to the invention.

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur Verhinderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten, welche durch Viren verursacht werden, wie beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferon induzierende Aktivität im Vergleich mit bekannten, aus Pflanzengeweben isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral an Menschen und Tiere verabreicht wird.The interferon-inducing substance according to the invention is of potential interest as a medicament for prevention and for Treatment of various diseases caused by viruses such as animal tumor-like viruses, since their interferon-inducing activity in comparison with known, Interferon-inducing substances isolated from plant tissues is excellent and because they are effective against animal tumor viruses is active. In addition, its toxicity is very low when it is orally administered to humans and animals.

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In verfahrensmäßiger Hinsicht schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit Interferon induzierender Aktivität vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß diese aktive Substanz aus dem Gewebe einer Pflanze des Genus Artemisia der Familie Compositae oder einer Variante derselben, welche diese aktive Substanz enthält, extrahiert wird und die aktive Substanz aus dem dadurch erhaltenen Extrakt gewonnen wird.In terms of the method, the invention proposes a method for producing a substance with interferon-inducing activity before, which is characterized in that this active substance from the tissue of a plant of the genus Artemisia Family Compositae or a variant thereof, which contains this active substance, is extracted and the active substance is obtained from the extract thus obtained.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Pflanzen wachsen in vielen Ländern der Erde in großem Umfange wild oder werden angepflanzt und können auf natürliche oder künstliche Weise die ! verschiedensten Varianten wie Mutanten und Hybriden bilden. Es ! soll etwa ^0, 120 bezw. 60 Spezies in Japan und China, USA bezw. Europa geben, wobei einige dieser Pflanzen seit vielen Jahren z.B. als Nahrungsmittel, Volksdroge oder Rohstoff für die Arzneimittelherstellung verwendet werden. Soweit bekannt, ist jedoch bisher nirgends darüber berichtet worden, daß die Gewebe dieser Pflanzen eine Substanz mit Interferon induzierender Aktivität enthalten.The plants suitable for the process according to the invention grow in many countries of the world wild or planted on a large scale and can naturally or artificially the! form various variants such as mutants and hybrids. It! should be about ^ 0, 120 resp. 60 species in Japan and China, USA and Europe, with some of these plants for many years e.g. as food, folk drug or raw material for pharmaceutical production be used. As far as is known, however, it has not yet been reported anywhere that the tissues of these Plants contain a substance with interferon inducing activity.

Alle zum Genus Artemisia gehörenden Pflanzen können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, wenn sie die aktive Substanz der Erfindung enthalten. Nachstehende Pflanzen sind lediglich als Beispiel angegeben:All plants belonging to the genus Artemisia can be used for the purposes of the invention if they contain the active substance of the invention included. The following plants are only given as an example:

Artemisia princeps Pamp.; Artemisia princeps Pamp .;

A. Maritima L.; A. Maritima L .;

A. montana Pamp.; A. montana Pamp .;

A. japonica Thun.; A. japonica Thun .;

A. stolonifera Komar.j A. stolonifera Komar.j

A. absinthium L.; A. kurramensis Qaz; A. feddei Le" ν. et Van. A. keiskeana Miq.; A. monophylla Kitam.; A. absinthium L .; A. kurramensis Qaz; A. feddei Le "ν. Et Van. A. keiskeana Miq .; A. monophylla Kitam .;

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L 3Ü.QLQ.5 Zl L 3Ü.QLQ. 5 Zl

-yf--yf-

A. stelleriana Bess.; A. vulgaris L.j A. vallesiaca All.; A. ludoviciana Nutt. A. tridentata Nutt. A-. caudata Michx.; A. frigida Willd.; A. campestris L.; und deren Varianten. A. stelleriana Bess .; A. vulgaris Lj A. vallesiaca All .; A. ludoviciana Nutt. A. tridentata Nutt. A-. caudata Michx .; A. frigida Willd .; A. campestris L .; and their variants.

A. capillaris Thun.j A. capillaris Thun.j

A. abrotanum L.; A. abrotanum L .;

A. dracunculus L.j A. dracunculus Lj

A. arbuscula Nutt.j A. arbuscula Nutt.j

A. filifolia Torr.; A. filifolia Torr .;

A. lindleyana Bess.; A. Lindleyana Bess .;

A. biennis Willd. A. biennis Willd.

A. molinieri QuezA. molinieri Quez

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden Druckschriften entnommen: "Yakuyo Shokubutus Dai Jiten" herausgegeben von Kariyone und Kimura und veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1974); "Saishin Yakuyo Shokubutsu" von Kariyone und Kimura und veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1978); "Flora of Japan" von Oui und veröffentlicht von Shibundo, Tokyo (1965); "North American Flora", herausgegeben von P.A. Rydberg und veröffentlicht von The New York Botanical Garden, New York (1916), "illustrated Flora of the.Pacific States", vol. IV der Stanford University Press, CA. (I965), "Flora Europaea", vol. 4 herausgegeben von T.G. Tutin u.a. und veröffentlicht von Cambridge University Press, London (I976), und "The Flora of Canada", von H.J. Scoggan und veröffentlicht vom National Museum of Canada, Ottawa (1979)»The aforementioned botanical names are taken from the following publications: "Yakuyo Shokubutus Dai Jiten" published by Kariyone and Kimura and published by Hirokawa Shoten, Tokyo (1974); "Saishin Yakuyo Shokubutsu" by Kariyone and Kimura and published by Hirokawa Shoten, Tokyo (1978); "Flora of Japan" by Oui and published by Shibundo, Tokyo (1965); "North American Flora, "edited by P.A. Rydberg and published by The New York Botanical Garden, New York (1916)," illustrated Flora of the Pacific States ", vol. IV of Stanford University Press, CA. (1965)," Flora Europaea ", vol by T.G. Tutin et al. And published by Cambridge University Press, London (1976), and "The Flora of Canada", by H.J. Scoggan and published by the National Museum of Canada, Ottawa (1979) »

j Für das erfindungsgemäße Verfahren können alle Gewebe der Pflanzen verwendet werden. Es können jedoch zusätzliche Arbeitsgänge zur Entfernung der Erde erforderlich sein. Sowohl die Blätter wie die Stengel der Pflanzen enthalten im wesentlichen die gleiche Menge der aktiven Substanz der Erfindung, und die in verschiedenen Geweben einer Pflanze enthaltenen Mengen der aktiven Substanzj All tissues of the plants can be used for the method according to the invention be used. However, additional soil removal operations may be required. Both the leaves like the stems of the plants contain essentially the same amount of the active substance of the invention, and those in different Tissues of a plant contain amounts of the active substance

bleiben vor und nach der Blühperiode im wesentlichen unverändert. Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches Material zu verwenden. Zum Trocknen kann jedes gewünschte Verfahren wie beispielsweise Naturtrocknung, Trocknung mit Heißluft usw. angewendet werden. Erforderlichenfalls kann das Material vor der Verwendung auch mit Wasser gewaschen werden.remain essentially unchanged before and after the flowering period. For better preservation and extraction, it is preferable to use dried material, although it is also possible to use fresh material Material to use. Any desired method such as natural drying or drying with hot air can be used for drying etc. can be applied. If necessary, the material can also be washed with water before use.

Die Extraktion kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Extraktionsmischung, mit Wasser erfolgen. Da die aktive Substanz der Erfindung besonders in Wasser unter alkalischen Bedingungen (z.B. pH 7-10) löslich ist, wird vorzugsweise der pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Extraktion kann während einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich 1-5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So kann beispielsweise die Extraktion während einer Zeitspanne von 30 min bis 6 h bei 45-8o°C unter Umrühren erfolgen. Erfindungsgemäß kann man den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz extrahieren (in einigen Fällen mehr als 90$). Allerdings sollte die Anwendung einer übermäßig hohen Temperatur vermieden werden, da hierdurch die Menge an unerwünschten Verunreinigungen wie Pigmenten, niedermolekularen Substanzen usw., die im Extrakt auftreten, erhöht werden kann. Man kann erforderlichenfalls dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.The extraction can take place at any convenient temperature, for example between room temperature and the boiling point of the extraction mixture with water. Because the active substance of the invention is particularly soluble in water under alkaline conditions (e.g. pH 7-10), preferably the pH of the Water before use, for example with a suitable buffer solution such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonium hydroxide set. The extraction can be performed for any length of time, usually 1-5 days at room temperature, this period of time can be shortened as the temperature of the extraction is increased. For example, extraction for a period of 30 minutes to 6 hours at 45-8o ° C below Stirring done. According to the invention, most of the active substance contained in the starting material can be extracted (in some cases more than $ 90). However, the application should an excessively high temperature can be avoided, as this reduces the amount of undesirable impurities such as pigments, low molecular weight Substances, etc. appearing in the extract can be increased. One can use the extracting water if necessary also add a suitable antiseptic agent. The extraction can be carried out continuously or intermittently, and any ratio that appears appropriate between the extracting water and the raw material can be used.

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Alternativ ist es auch möglich, die erfindungsgemäße aktive Substanz aus dem Pflanzengewebe mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton und dgl. in irgendeiner zweckmäßigen Menge beispielsweise von 20 bis 80$ zu extrahieren. In diesem Pail kann die Extraktionszeit und die Temperatur beispielsweise 4 h bis 2 Tage bei 4o bis 8o°C betragen. Vorzugsweise erfolgt jedoch die Extraktion mit Wasser, da dies einfacher, sicherer und preiswerter durchgeführt werden kann. Hierbei kann die Extraktion, falls gewünscht, durch Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels trotz der Unlöslichkeit des reinen Produktes der Erfindung in derartigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die Extraktion unter Verwendung hydrophiler organischer Lösungsmittel kann beispielsweise dann durchgeführt werden, wenn die extrahierte Lösung eine Mischung oder einen Komplex von Substanzen wie beispielsweise Fettsäuren, Steroiden, Proteinen, Mono- oder Polyxacchariden und dgl. enthält. Wenn auch nicht beabsichtigt ist, sich auf theoretische Betrachtungen festzulegen, so darf doch angenommen werden, daß die Extraktion mit derartigen organischen Lösungsmitteln durch die Pufferwirkung ermöglicht wird.Alternatively, it is also possible to use the active substance according to the invention from the plant tissue with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, propanol, To extract butanol, acetone and the like in any convenient amount, for example from $ 20 to $ 80. In this pail can the extraction time and the temperature are, for example, 4 hours to 2 days at 40 to 80 ° C. Preferably, however, the Extraction with water, as this can be done more easily, safely and cheaply. Here the extraction, if desired, by using a hydrophilic organic solvent despite the insolubility of the pure product of the Invention can be carried out in such solvents. The extraction using hydrophilic organic solvents can for example be carried out when the extracted solution is a mixture or a complex of substances such as fatty acids, steroids, proteins, mono- or polyxaccharides and the like. Contains. Even if not intended is to commit oneself to theoretical considerations, it can be assumed that the extraction with such organic Solvents is made possible by the buffer effect.

Aus der extrahierten Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filterung, Pressen, Zentrifugieren und dgl. Anschließend werden unerwünschte Verunreinigungen wie Pigmente und niedermolekular-gewichtige Substanzen von der entstehenden überstehenden Flüssigkeit (supernatant).entfernt, um die - Gewinnung der aktiven Fraktion zu ermöglichen« Für diesen Zweck geeignete bevorzugte Verfahren werden nachstehend angegeben. The plant residue is made from the extracted solution in the usual way removed, for example by filtering, pressing, centrifuging and the like. Undesired impurities are then removed such as pigments and low molecular weight substances removed from the resulting supernatant liquid (supernatant). to enable the active faction to be won «For this one Preferred methods suitable for this purpose are given below.

Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Es0^) Q 0 5 2 1Andrejewski, Honke & Partner, patent attorneys in Es0 ^) Q 0 5 2 1

2Z2Z -vf--vf-

! A) Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafilterung fraktioniert, beispielsweise mittels einer geeigneten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa j5 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Die Ultrafilterung kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm mittels einer Membrane durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man braune Pulver enthält.! A) The supernatant liquid is fractionated by ultrafiltration, for example by means of a suitable membrane to hold back substances which have a molecular weight of more own than 100,000, since the active substance according to the invention, which is present in the fractions have a molecular weight of about 100,000 to about 5,000,000 (mainly about 500,000 to about 1,000,000). The ultrafiltration can take place under a suitable pressure of, for example, 0.1 to 5 kg / cm by means of a membrane can be carried out which can retain substances with a molecular weight of more than 100,000 or 200,000. The active ones Fractions are collected and pooled and then freeze-dried to yield brown powders.

B) Die überstehende Flüssigkeit wird konzentriert, wenn gewünscht unter vermindertem Druck, und wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, n-butanol, Azeton und dgl. bei einer zweckmäßig erscheinenden Konzentration von beispielsweise 40-70 w/v % behandelt, wobei Präzipitate entstehen, welche die aktive Substanz enthalten. Diese Präzipitate werden dann gefriergetrocknet und man erhält ein braunes Pulver.B) The supernatant liquid is concentrated, if desired under reduced pressure, and is treated with a hydrophilic organic solvent such as, for example, methanol, ethanol, propanol, n-butanol, acetone and the like % treated, forming precipitates which contain the active substance. These precipitates are then freeze-dried and a brown powder is obtained.

C) Anstelle des organischen Lösungsmittels kann man der überstehenden Flüssigkeit auch ein Ammoniumsalz wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Cetylmethylammoniumbromid und dgl. oder ein anorganisches Metallsaltz wie beispielsweise Zinkchlorid, Kupferchlorid und dgl. bei einer zweckmäßigen Konzentration von beispielsweise 20 bis 50 w/v % zusetzen, wobei Präzipitate entstehen, welche dann z.B. unter Verwendung einer· Dialyse-C) Instead of the organic solvent, an ammonium salt such as ammonium chloride, ammonium sulfate, cetylmethylammonium bromide and the like or an inorganic metal salt such as zinc chloride, copper chloride and the like can be added to the supernatant liquid at an appropriate concentration of, for example, 20 to 50 w / v % , whereby precipitates arise, which are then, for example, using a dialysis

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Membrane oder eines Ultrafilters, welche Substanzen mit einem :Membrane or an ultrafilter, which substances with a:

Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 zurückhalten können, ent- I salzt und gefriergetrocknet werden. Man erhält wiederum einCan withhold molecular weight of 5000 to 10,000, ent- I salted and freeze-dried. Again you get a

braunes Pulver. ■brown powder. ■

■ - . ι■ -. ι

Es ist möglich, den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthalte- j nen aktiven Substanz zu gewinnen, und zwar in einigen Fällen
über 90$· Dabei ist die Menge an Verunreinigungen, welche im iIt is possible to recover most of the active substance contained in the starting material, in some cases
over $ 90 · where the amount of impurities in the i

braunen Rohpulver enthalten sind, bei Durchführung der Methode J (A) am geringsten, welche auch einfach durchgeführt werden kann. : Außerdem hat sich bestätigt, daß jegliche bemerkenswerte Neben- j wirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des
nach der Methode (A) erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und
Tiere verabreicht wird, sodaß dieses Rohpulver für orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet werden kann. Es ist
darauf hinzuweisen, daß bestimmte Pflanzen des Genus Artemisia
seit vielen Jahren in Japan und China als Nahrungsmittel und als
Volksdroge verwendet werden.brown raw powder are contained in the lowest amount when carrying out method J (A), which can also be carried out easily. : It has also been confirmed that any notable side effects can be avoided even if a large amount of the
by the method (A) obtained raw powder orally on humans and
Animals is administered so that this raw powder can be used for oral administration without further purification. It is
to point out that certain plants of the genus Artemisia
for many years in Japan and China as food and as
Folk drug are used.

Falls gewünscht, kann das auf diese Weise erhaltene Rohpulver
noch weiter gereinigt werden, und zwar beispielsweise durch
Säulenchromatographie unter Verwendung eines geeigneten Wirkstoffes für die Gel-Filterung oder eines Ionentauschers. Im erstgenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden^,
wenn es auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer geeig- ; neten Pufferlösung durchgeführt werden. Bevorzugte Wirkstoff für \ die Gel-Filterung sind beispielsweise Sephadez G-50 bis G-200^ ; Sepharose 2B bis 6B, Sephacryl S-200 oder S-300 (Handelsprodukte ■ der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), Bio-Gel P-J50 bis jIf desired, the raw powder thus obtained can
can be further cleaned, for example by
Column chromatography using a suitable agent for gel filtering or an ion exchanger. In the former case, the elution can be carried out with water ^,
if it is also possible to use a suitable buffer solution. In the latter case, the elution with a suitable; Neten buffer solution can be carried out. Preferred active ingredient for \ the gel filtration, for example, Sephadez G-50 to G-200 ^; Sepharose 2B to 6B, Sephacryl S-200 or S-300 (commercial products from Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden), Bio-Gel P-J50 to j

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2H2H

P-J500, Bio-Gel A (Handelsprodukte der Bio-Rad Laboratories Ltd., USA), Sagavac (Handelsprodukt der Saravac Laboratories Ltd., U.K. und dgl. Bevorzugte Wirkstoffe für die Ionentauscher-Behandlung sind beispielsweise YAE-Sephadex A-25 und A-50 (Cl"-Forra), CM-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), SP-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), DEAE-Sephacel (Cl"-Form), DEAE-Sepharose C1-6B (Cl"-Form), CM-Sepharose CL-βΒ (Na⁺-Form) (Handelsprodukte der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und dgl.. Für die Reinigung kann man auch eine geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische Zwecke ausreicht. Falls gewünscht, lassen sich die Mengen an Verunreinigungen durch Kombination der vorgenannten Behandlungen weiter herabsetzen.P-J500, Bio-Gel A (commercial products from Bio-Rad Laboratories Ltd., USA), Sagavac (commercial products from Saravac Laboratories Ltd., UK and the like. Preferred active ingredients for the ion exchange treatment are, for example, YAE-Sephadex A-25 and A-50 (Cl "-Forra), CM-Sephadex C-25 and C-50 (Na ⁺ form), SP-Sephadex C-25 and C-50 (Na ⁺ form), DEAE-Sephacel (Cl" -Form), DEAE-Sepharose C1-6B (Cl "-form), CM-Sepharose CL-βΒ (Na ⁺ -form) (commercial products of Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) and the like The product thus obtained may contain certain impurities, although its interferon-inducing activity is sufficient for practical purposes, and if desired, the amounts of impurities can be further reduced by a combination of the above treatments.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Substanz der vorbeschriebenen Art zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthält. Die Zusammensetzung oder Mischung kann in geeigneter Form für orale, rektale oder parenterale Verabreichung dargeboten werden. So kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körnern, Tabletten, überzogenen Tabletten, Kapseln, Syrup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablettier-Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen.A pharmaceutical composition according to the invention is im essentially characterized in that they combine a substance according to the invention of the type described above as the active ingredient with a pharmaceutical carrier or excipient. The composition or mixture can be in any suitable form for oral, rectal or parenteral administration. For example, the composition or mixture be solid or liquid for oral administration and take the form of granules, tablets, coated tablets, capsules, syrups, emulsions, Have suspensions or drops and have carriers or excipients as generally used in the pharmaceutical art be used. For example, suitable tableting excipients made from lactose, potato and soluble starches and Magnesium stearate.

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Für die parenterale Verabreichung kann der Träger aus einer sterilen parenteral verträglichen Flüssigkeit wie beispielsweise sterilem Wasser oder einem parenteral verträglichen öl wie beispielsweise Arachis-Öl in Ampullen bestehen. Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff besteht. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzmengen formuliert, von denen jede eine feststehende Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tablette, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorien und Ampullen sind Beispiele geeigneter Formen von Einsatzmengen.For parenteral administration, the carrier can be sterile parenterally compatible liquid such as sterile water or a parenterally compatible oil such as, for example Arachis oil are made up in ampoules. For rectal administration, suppositories are suitable, the carrier consisting of a there is a suitable raw material. Preferably, the composition or mixture is formulated in use amounts of which each can deliver a fixed dose of the active ingredient. Tablet, coated tablets, capsules, suppositories and ampoules are examples of suitable forms of dosage.

Schließlich schafft die Erfindung noch eine Interferon induzierende Substanz der vorstehend beschriebenen Art in ihrer Verwendung als Medikament.Finally, the invention also creates an interferon-inducing Substance of the type described above in its use as a medicament.

Die beiliegenden Figuren 1 und 2 zeigen das Ultraviolett-Absorptionsspektrum bezw. das Infrarot-Absorptionsspektrum der aktiven Substanz der Erfindung.The accompanying Figures 1 and 2 show the ultraviolet absorption spectrum respectively the infrared absorption spectrum of the active substance of the invention.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele des weiteren beschrieben, wobei diese Beispiele keinerlei Einschränkung der Erfindung bedeuten.The invention is explained below with the aid of a few exemplary embodiments further described, these examples in no way implying any restriction of the invention.

example 1

Zunächst wurden getrocknete Blätter (ά kg) von Artemisia princeps Pamp. mit Wasser gewaschen und in 20 1 Wasser bei Raumtemperatur 3 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion durchzuführen.First, dried leaves (ά kg) of Artemisia princeps Pamp. washed with water and allowed to stand in 20 liters of water at room temperature for 3 days to conduct extraction.

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Anschließend wurde das Ganze mit 6000 U/min 20 min lang zentri- j fugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 5 1 Wasser verwendet wurden.The whole was then centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes in order to remove the residue, which was washed twice with water was washed using 5 liters of water each time.

Die Waschflüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der Feststoffgehalt der kombinierten Lösungen betrug 138,735 g (Tockenbasis). Die kombinierten Lösungen wurden durch Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters (Model UD-6, Han- j delsprodukt der Bio Engineering K.K., Tokyo) mit einer UK-200-The washing liquid was mixed with the supernatant liquid. The solids content of the combined solutions was 138.735 g (dry basis). The combined solutions were through ultrafiltration using an ultrafilter (Model UD-6, Han- j product of Bio Engineering K.K., Tokyo) with a UK-200-

j Membrane (Handelsprodukt 'der Toyo Roshi K.K., Tokyo) fraktioniert, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 bei einem Druck von 3 kg/cm festzuhalten, wobei sich ein Rückstand ergab, welcher dann nach Gefriertrocknung ein braunes Pulver,j membrane (commercial product of Toyo Roshi K.K., Tokyo) fractionated, to hold substances with a molecular weight of over 200,000 at a pressure of 3 kg / cm, leaving a residue resulted, which then after freeze-drying a brown powder,

j und zwar 8,813 g, ergab. Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Behandlung mit einer Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten, wobei sich 19,676 g an braunem Pulver ergaben. Zum Vergleich wurde die gleiche Behandlung mit einer XM lOOA-Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten. Dabei entstanden 20,835 g braunes Pulver.j, namely 8.813 g. For comparison purposes, the same treatment was carried out with a membrane to remove substances with molecular weight greater than 100,000, yielding 19.676 grams of brown powder. For comparison, the the same treatment was carried out with an XM 100A membrane in order to retain substances with a molecular weight of more than 100,000. This produced 20.835 g of brown powder.

In der zweiten Stufe, der Reinigung, wurden 1,5g des ersten Rohpulvers in 5 ml Wasser gelöst und in eine Säule (4,5 χ 70 cm) übergeleitet, welche mit'Sephadex G-200 (einem Wirkstoff für die Gel-Filterung) angefüllt war. Die Elution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 27-60 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet^ wobei ein weißliches Pulver (220 mg) entstand.In the second stage, the cleaning, 1.5 g of the first raw powder were used dissolved in 5 ml of water and placed in a column (4.5 χ 70 cm) transferred, which with'Sephadex G-200 (an active ingredient for the Gel filtering) was filled. Elution was carried out with 600 ml of water and the effluent was divided into fractions divided by 3 ml each. Fractions 27-60 were collected and poured together and the whole thing then freeze-dried ^ a whitish powder (220 mg) resulted.

030030/0 699030030/0 699

-yf--yf-

In der dritten Stufe (weitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer 0,1M tris-HCl-Pufferlösung (5 ml; pH 7,0; 1=0,01) gelöst und in eine Säule (2,5 χ 70 cm) gefüllt, welche mit DEAE-Sephadex Ä-50 (Ionentauscher) angefüllt war. Eine 0,1M ί tris-HCl-Pufferlösung (300 ml; pH 9,0, welche 0,5M NaCl enthielt) j wurde für die Elution verwendet und die ausfließende Flüssigkeit i
in Fraktionen von jeweils 3 ^mi aufgeteilt. Die Fraktionen 15 bis 30 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (62,7 mg) erhielt, welches geringe Mengen an Verunreinigungen enthielt und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die vorbeschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale und sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.In the third stage (further purification) this powder (100 mg) was dissolved in a 0.1M tris-HCl buffer solution (5 ml; pH 7.0; 1 = 0.01) and transferred to a column (2.5 χ 70 cm) filled with DEAE-Sephadex Ä-50 (ion exchanger). A 0.1M ί tris-HCl buffer solution (300 ml; pH 9.0, which contained 0.5M NaCl) was used for the elution and the liquid flowing out i
divided into fractions of 3 ^mi each. Fractions 15-30 were collected and poured together and then freeze-dried to give an off-white amorphous powder (62.7 mg) which contained small amounts of impurities and had essentially the same interferon inducing activity as the off-white powder obtained first . The final product had the physicochemical characteristics described above and its high degree of purity was confirmed by ultracentrifugation and electrophoresis.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher Weise bestimmt wie im nachstehend erläuterten Versuch 1 (in vitro-Methode), wobei sich nachstehende Resultate ergaben;For comparison purposes, the interferon-inducing activities of the substance obtained in each step of this example was determined in the same manner as explained below Experiment 1 (in vitro method), with the following results;

Table 5

Stufe Probe (nach)Stage sample (after)

Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /ug/ml)Activity at a sample concentration of (/ ug / ml)

1,01.0

0,10.1

11 Extraktionextraction >100> 100 11 UltrafilterungUltrafiltration >100> 100 22 Gel-FilterungGel filtering >100> 100 33 Ione ntaus ehe r-B eha ndlungIone ntau nt before r treatment >100> 100 (Endprodukt)(End product)

8888 ■< 10 ■ < 10 >100> 100 9393 >100> 100 >100> 100

030030/0691030030/0691

Andrejewslei, Honke & Partner, Patentanwälte in EssenAndrejewslei, Honke & Partner, patent attorneys in Essen

Example 2

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Artemisia capillaris Thun in der Weise extrahiert wurde, daß man die Blätter bei Raumtemperatur 2 h lang in Wasser stehen ließ, dem Wasser IN Natriumhydroxid zusetzte, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, und dann bei 65⁰C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (6o,2 mg) waren im wesentlichen die gleichen wie bei dem Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.The procedure was the same as in Example 1, except that Artemisia capillaris tuna was extracted in such a way that the leaves were left to stand in water at room temperature for 2 hours, and IN sodium hydroxide was added to the water to bring the pH to 8, 5 to set, and then ^{extracted again at 65 0} C for a further 2 h. The physicochemical characteristics of the final product (6o, 2 mg) were essentially the same as those of the final product obtained in Example 1.

Beispiele 3-26Examples 3-26

Die Blätter, Stengel und Saatkörner der in nachstehender Tabelle ' 6 angegebenen getrockneten Pflanzen wurden unabhängig voneinanderThe leaves, stems and seeds of the table below ' 6 indicated dried plants were independently

wie im Beispiel 1 behandelt. Die in der zweiten Stufe aller Beispiele erhaltenen Produkte wurden unabhängig voneinander in gleicher Weise wie nachstehend im Versuch 1 (in vitro-Methode) behandelt, um ihre Interferon induzierenden Aktivitäten zu bestimmen. Die Resultate zeigt nachstehende Tabelle 6. Die physikalisch-chemischen Merkmale der Endprodukte der Beispiele 3-26 waren im wesentlichen die gleichen wie die des Endproduktes aus dem Beispiel 1.treated as in example 1. The ones in the second stage of all examples The products obtained were independently of one another in the same way as in Experiment 1 below (in vitro method) treated to determine their interferon inducing activities. The results are shown in Table 6 below. The physico-chemical Characteristics of the final products of Examples 3-26 were essentially the same as those of the final product from Example 1.

030030/0699030030/0699

. ,. , " "' ".. ." 30100:52. ,. , "" '"..." 30100: 52

Tabelle 6 A = Saat; B = Stengel; C = Blätter Table 6 A = seed; B = stem; C = leaves

Nr. Artemisia Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /Ug/ml) jNo Artemisia tissue IF activity at one concentration the sample of (/ Ug / ml) j

10 1,0 0,110 1.0 0.1

1 A. prlnceps Pamp.1 A. prlnceps Pamp.

^l 00
>100
>100^ l 00
> 100
> 100

>100 >100 >100> 100> 100> 100

22 A.A. capillaris Thun.capillaris tuna. AA. >100> 100 >100> 100 8o8o otdotd >100
>1OO> 100
> 1OO >100
^100> 100
^ 100 90
8590
85 ₅₅ A.A. absinthium L.absinthium L. AA. >1OO> 1OO >100> 100 6060 otdotd >100> 100 > 100
>100> 100
> 100 90
9290
92 44th A.A. maritima L.maritima L. AA. >100> 100 >100> 100 5555 FQOFQO >100
^?100> 100
^? 100 >100
>100> 100
> 100 8o
858o
85 55 .A..A. kurramensis Qaz.kurramensis Qaz. AA. >100> 100 >100> 100 8o8o B
CB.
C. >100
>100> 100
> 100 >100
>100> 100
> 100 COOC
OVJlCOOC
OVJl 66th A.A. montana Pamp.montana pamp. AA. > 100> 100 ?100? 100 9090 otdotd >100
>100> 100
> 100 >100
>100> 100
> 100 VDVD
VJlVJIVDVD
VJlVJI 77th A.A. feddeifeddei AA. >1OO> 1OO > 100> 100 7070 Le*Le * v. et Van.v. et Van. otdotd >1OO
>100> 1OO
> 100 > 100
> 100> 100
> 100 75
7075
70

030030/0699030030/0699

-X--X-

! Nr.! No.

Tabelle 6 (Fortsetzung) A = Saat; B = Stengel; C = Blätter Table 6 (continued) A = seed; B = stem; C = leaves

ArtemisiaArtemisia

Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von (/Ug/ml)Tissue IF activity at a sample concentration of (/ Ug / ml)

10 1,0 0,110 1.0 0.1

A. japonica Thun. A. japonica Thun.

A
B
CA.
B.
C.

^100
>100
>100^ 100
> 100
> 100

>100 >100 >100> 100> 100> 100

90 9590 95

A. keiskeana Miq. A A. keiskeana Miq. A.

>100
>100> 100
> 100

>100 >100 >100> 100> 100> 100

90 90 8590 90 85

A. stolonifera
Komar. A. stolonifera
Komar.

A
B
CA.
B.
C.

>100
>100
>100> 100
> 100
> 100

>100 >100> 100> 100

60 75 7060 75 70

A. monophylla
Kitam. A. monophylla
Kitam.

A B CA B C

>100
>100
>100> 100
> 100
> 100

-100 >100 >100-100> 100> 100

55 70 7055 70 70

A. stelleriana
Bess. A. stelleriana
Bess.

>100
>100
>100> 100
> 100
> 100

>100 >100> 100> 100

90 85 9090 85 90

A. vulgaris L.A. vulgaris L.

>100
>100
>100> 100
> 100
> 100

^ 100 ;>100 >100^ 100;> 100> 100

98 9998 99

A. abrotanum L. A A. abrotanum L. A

>100> 100

>100 > 100 >100> 100 > 100> 100

90 93 9590 93 95

03003Ö/069903003Ö / 0699

Tabelle 6 (Fortsetzung) ! Table 6 (continued)!

A = Saat; B = Stengel; C = Blätter ;A = seed; B = stem; C = leaves;

Nr. Artemisia Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzen- :No Artemisia tissue IF activity at a concentration:

tration der Probe von ( /Ug/ml) jtration of the sample of (/ Ug / ml) j

10 1,0 0,1 I10 1.0 0.1 I.

1515th -- 1616 A. campestris L.A. campestris L. AA. >1OO> 1OO > 100> 100 7070 B
CB.
C. >100
>100> 100
> 100 >100
> 100> 100
> 100 93
9593
95 1717th A. vallesiaca All.A. vallesiaca All. AA. B
CB.
C. >1OO> 1OO > 100
> 100 > 100
> 100 92
9992
99 1818th A. molinieriA. molinieri AA. Quo z.Quo z. B
CB.
C. >1OO
>100> 1OO
> 100 > 100
> 100> 100
> 100 νονό
ONVJl νονό
ONVJl 1919th A. dracunculus L.A. dracunculus L. AA. B
CB.
C. >1OO
>100> 1OO
> 100 >100
> 100> 100
> 100 97
9597
95 2020th A. ludovicianaA. ludoviciana AA. Nutt.Nutt. B
CB.
C. >100
> 100> 100
> 100 >100
> 100> 100
> 100 92
9592
95 2121 A. arbusculaA. arbuscula AA. Nutt.Nutt. B
CB.
C. >1OO
>1OO> 1OO
> 1OO >100
>100> 100
> 100 ONVD
OO ONONVD
OO ON A. tridentataA. tridentata AA. > 100> 100 >100> 100 9090 Nutt.Nutt. B
CB.
C. > 100
> 100> 100
> 100 > 100
>100> 100
> 100 93
9593
95

03003Q/G89303003Q / G893

Andrejewski, Honice & Partner, Patentanwälte in EssenAndrejewski, Honice & Partner, patent attorneys in Essen

Tabelle 6 (Portsetzung)
A = Saat; B = Stengel; C = Blätter Table 6 (port setting)
A = seed; B = stem; C = leaves

Nr. ArtemisiaNo. Artemisia

Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von (/Ug/ml)Tissue IF activity at one concentration the sample of (/ Ug / ml)

10 1,0 0,110 1.0 0.1

2222nd A. filifoliaA. filifolia AA. >100
>100> 100
> 100 - >100
> 100-> 100
> 100 .88
94.88
94 Torr.Torr. B
CB.
C. 2323 A. caudataA. caudata AA. ^100
> 100^ 100
> 100 > 100
>1OO> 100
> 1OO 93
9593
95 Michx.Michx. B
CB.
C. 2424 A. lindleyanaA. lindleyana AA. > 100
>1OO> 100
> 1OO > 100
> 100> 100
> 100 96
9796
97 Bess.Bess. B
CB.
C. 2525th A. frigidaA. frigida AA. > 100
>100> 100
> 100 > 100
>100 > 100
> 100 98
9598
95 Willd.Willd. B
CB.
C. 2626th A. biennisA. biennis AA. >1OO
>1OO> 1OO
> 1OO >100
>100> 100
> 100 89
9089
90 Willd.Willd. B
CB.
C.

030030/0899030030/0899

j/.j /.

Jit?Jit?

Versuch 1Attempt 1

Bestimmung der IF-Induktion mit IF-induzierender Substanz und IF-Bestimmung: (siehe Y. Kojima's Bericht in Kitasato Arch. Med., !Determination of IF induction with IF inducing substance and IF determination: (see Y. Kojima's report in Kitasato Arch. Med.,!

a) IF-Induktion (in vitro):a) IF induction (in vitro):

Ein Kaninchen (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) wurde durch Herzpunktur getötet und Milz, Knochenmark und Lymphknotenzellen entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (lO'Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils 1 ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1,0, 0,1 oder 0,01 yug/ml eines Endproduktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 24 h lang bei 25°C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die induzierte Interferon-Aktivität zu bestimmen.A rabbit (weight about 1 kg; New Zealand White; SPF) was sacrificed by cardiac puncture and spleen, bone marrow and lymph node cells removed and combined to form a cell suspension which contained the mixed cells (10 'cells). The crowd became then divided into samples of 1 ml each. Four samples were taken independently at 10, 1.0, 0.1, or 0.01 yug / ml of one End product added, which had been prepared in the same manner as described in Example 1. The samples were then 24 h cultured for a long time at 25 ° C and then centrifuged. The resulting supernatant liquids were each used as a sample used to determine the induced interferon activity.

b) ' IF-Induktion (in vivo):b) 'IF induction (in vivo):

Das Endprodukt vom Beispiel 1 (1 mg) wurde in 2 ml Wasser gelöst und in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) injiziert. 1, 2, 4 und 6 h nach der Injektion wurde eine Blutprobe von jeweils 2 ml den Testtieren entnommen und das Serum einer jeden Probe wurde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Interferon verwendet.The end product from Example 1 (1 mg) was dissolved in 2 ml of water and placed in the ear vein of a rabbit (weight about 1 kg; New Zealand White; SPF) injected. 1, 2, 4 and 6 hours after the injection, a blood sample of 2 ml each was taken from the test animals and the serum of each sample was isolated from the blood and used as a sample for determination of the activity of induced interferon used.

030030/0S99030030 / 0S99

3 Oi Q; 0:5:213 Oi Q; 0: 5: 21

c) Bestimmung der IF-Aktivität:c) Determination of IF activity:

In beiden Methoden (a) und (b) wurde Vesicular-stomatitis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Einschicht-Kultur der belegten Zellen (lined cells) RK-13 von Kaninchen wurde in eine Flachschale gefüllt und derselben eine vorgegebene Menge der Probe der durch die vorgenannten Methoden (a) oder (b) erhaltenen Lösung zugesetzt. Die Kultur wurde bei 37 C über Nacht unter Zusatz von Vesicular stomatitis Viren als Krankheitsviren bebrütet. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Reduktionsverhältnisses von Platten (plaques) bestimmt. Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrückt, welche zur Reduzierung der Zahl von Platten auf 50$ erforderlich ist.In both methods (a) and (b) vesicular stomatitis virus was found used as a threatening virus to determine the activity of induced interferon in the following ways. One Single-layer culture of the lined cells RK-13 from Rabbits were placed in a shallow dish and one of the same predetermined amount of the sample is added to the solution obtained by the aforementioned methods (a) or (b). The culture was at 37 C overnight with the addition of vesicular stomatitis viruses as Incubated disease viruses. The interferon activity was determined on the basis of the reduction ratio of plaques. The unit of interferon activity is expressed by the reciprocal number of the highest dilution of the sample which can be used for Reducing the number of panels to $ 50 is required.

Versuch 2: Definition der Interferon induzierenden Substanz: Experiment 2: Definition of the interferon-inducing substance:

Es bestätigte sich, daß die nach den Methoden (a) und (b) hergestellten Proben das Wachstum des Vesicular stomatitis-Virus und des Vaccinia-Virus in den RK-13-belegten Zellen von Kaninchen der gleichen Spezies hemmen, nicht jedoch das Wachstum des Vaccinia -Virus in L-Zellen von Mäusen unterschiedlicher Spezies. Außerdem wurden ihre IF-Aktivitäten nach 2-stündiger Behandlung mit 0,08$ Trypsin bei 37°C inaktiviert. Diese Fakten zeigen, daß die aktive Substanz der Erfindung eine Interferon induzierende Substanz ist.It was confirmed that those prepared by methods (a) and (b) Sample the growth of vesicular stomatitis virus and vaccinia virus in the RK-13-coated cells of rabbits of the same species, but not inhibit the growth of the vaccinia virus in L cells from mice of different species Species. In addition, their IF activities were inactivated after treatment with 0.08 $ trypsin at 37 ° C for 2 hours. These Facts show that the active substance of the invention is an interferon inducing substance.

030030/06 99030030/06 99

Versuch attempt J>:J>:

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese bei 4⁰C in herkömmlicher Weise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung (Model AE-2, Handelsprodukt der Toyo Kagaku Sangyo K.K., Tokyo), eine Polyacrylamid-Gel-Platte (Dicke 3 ^mm) ^und eine 0,j5M Borsäure-Pufferlösung (pH &Λ) verwendet wurden. Das entstehende Einzelband zeigte, daß das geprüfte Endprodukt einen hohen Reinheitsgrad hatte.In Example 1, the electrophoresis was carried out at 4 ^° C. in a conventional manner, using a commercially available device (model AE-2, commercial product of Toyo Kagaku Sangyo KK, Tokyo), a polyacrylamide gel plate (thickness 3 ^mm ) ^and d a 0.15M boric acid buffer solution (pH & Λ) were used. The resulting single tape showed that the final product tested had a high degree of purity.

030030/0699030030/0699

Claims

Andrejewski, Honke & Partner, patent attorneys in Essen

-αϊ--αϊ-

Patent claims:

1. Substance with interferon-inducing activity, which is stable as an amorphous whitish powder, characterized in that that it has the following physical-chemical characteristics:

1) Elemental analysis:

H: 7.4 + 0.4 %, C: 45.6 + 0.4 % _s N: 13.5 + 0.4 %, P: 2.8 + 0.3%

2) Molecular Weight:

Approx. 100,000 to approx. 300,000 (mainly approx. 500,000 to approx. 1,000,000), determined by ultracentrifugation, ultrafiltration and gel filtration.

3) Melting or decomposition point: melting point indefinite. Charred at about 220 ^0C .

4) Ultraviolet absorption spectrum: See Pig. 1 (determined in 0.1N NaOH).

5) Infrared absorption spectrum: See Fig. 2 (by KBr method).

6) Solubility in various solvents:

Soluble in water, easily soluble in aqueous solutions of sodium hydroxide, potassium hydroxide and ammonium hydroxide, essentially insoluble in methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, chloroform and diethyl ether.

~~ 030030/0699~~ 030030/0699

Andrejewski, Honke & Partner, patent attorneys in Essen

7) Color reaction:

Positive in ninhydrin reaction and Dittmer reaction. negative in Polin's reagent and Elson-Morgan reaction.

8) nature: : (+ 0.6 %) 4.7 % Threonine 4,9 % 4.9 % Sour. Aspartic acid 9.5 % 3.1 % Glutamic acid 8,4 % 8.4 % Serine 11.2 % Glycine 10.2 % Proline 4,6 % 4.6 % Valine 6,9 % 6.9 % 9) Main chemical components: Alanine traces Leucine 7,8 <?o 7.8 <? O a) amino acids Isoleucine 12.1 % Phenylalanine 2.9 % Tyrosine 1,8 % 1.8 % Lysine 6.2 % ammonia Arginine 5.3 % Histidine

b) sugar:

Not detectable.

10) Optical rotation:

M p ⁶ = + 37 ° to + 79 ° (+ 76 ° on average) (c = 0.47 % in O, 1N NaOH).

2. Substance according to claim 1, characterized in that it has the features according to claim 1 in a substantially pure form.

030030/0699

J5. Process for producing a substance with interferon j inducing activity, characterized in that this active substance comes from a plant of the genus Artemisia and its this active substance-containing variants is extracted and the substance is obtained from the extract obtained.

4. The method according to claim J> plant is selected from

Artemisia princeps Pamp .;

A. Maritima L .;

A. montana Pamp .;

A. japonica Thun.j

A. stolonifera Komar .;

A. stelleriana Bess .;

A. vulgaris Lj

A. vallesiaca All .;

A. ludoviciana Nutt .;

A. tridentata Nutt .;

A. caudata Michx .;

A. frigida Willd .;

A. campestris L .;

and their variants.

characterized in that the

A. absinthium L .;

A. kurramensis Qaz;

A. feddei Löv. et Van .;

A. keiskeana Miq .;

A. monophylla Kitam .;

A. capillaris Thun .;

A. abrotanum L .;

A. dracunculus L .;

A. arbuscula Nutt .;

A. filifolia Torr .;

A. Lindleyana Bess .;

A. biennis Willd .;

A. molinieri Quez.

5. The method according to claim 3, characterized in that the extraction is carried out with water.

6. The method according to claim 5> characterized in that the extraction is carried out at a pH of 7-10.

0 30030/0689

30ΧΓ052Τ

7. The method according to claim 3, characterized in that the i Extraction is carried out with a hydrophilic solvent which is essentially incapable of absorbing the active substance to solve. '■

8. The method according to claim j5, characterized in that for Obtaining a supernatant liquid (supernatant) is formed and this is fractionated into fractions by ultrafiltration which contain the active substance.

9. The method according to claim 8, characterized in that the ultrafiltration is carried out by means of an ultrafilter, through which substances with a molecular weight of more than 100,000 can be filtered off.

10. The method according to claim 3 * characterized in that for Obtaining a supernatant liquid (supernatant) is formed and a hydrophilic organic solvent is added to this which is incapable of dissolving the active substance, whereby fractions can be obtained which contain the active substance contain.

11. Substance with interferon-inducing activity, characterized in that it by the method according to one of Claims 3 to 10 is made.

12. Pharmaceutical composition, characterized in that it is an interferon-inducing active ingredient Substance according to claim 11 in association with a carrier or excipient.

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