DE2828982C2

DE2828982C2 - Device for carrying out tests with microorganisms

Info

Publication number: DE2828982C2
Application number: DE2828982A
Authority: DE
Inventors: Leslie Dr. 4600 Dortmund Webb
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1978-07-01
Filing date: 1978-07-01
Publication date: 1982-01-07
Also published as: DE2828982A1; DE2828982B1

Description

2525th

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von Tests mit Mikroorganismen entweder mit Luftzutritt oder gleichzeitig mit oder nur unter Luftabschluß, wobei eine Pipette zur Aufnahme von Testmedium dientThe invention relates to a device for carrying out tests with microorganisms either with Access to air or simultaneously with or only with exclusion of air, with a pipette for receiving Test medium is used

Organismen, die ein Substrat bzw. Testmedium nur unter aerobisohen Bedingungen verwerten können, werden obligat Aerobe genan> .. Obligataerobe Bakterien können festgestellt werden, wenn sie auf einem verwertbaren Medium wachse oder nachweisbare Metaboliten ausscheiden, jedoch nur wenn genügend Sauerstoff vorhanden ist. Einige Arten der Genera Pseudomonas, Xanihomonas und Agrobacterium können Säure aus Glukose bilden unter aerobischen Bedingungen. *oOrganisms that can only utilize a substrate or test medium under aerobic conditions, are called obligatory aerobes> .. obligatory aerobic bacteria can be determined if they grow on a usable medium or if they are detectable Eliminate metabolites, but only if there is enough oxygen. Some kinds of genera Pseudomonas, Xanihomonas and Agrobacterium can Acid form from glucose under aerobic conditions. *O

Andere Bakterien können Substrate sowohl unter aerobischen als unter anaerobischen Bedingungen verwerten (fakultative Anaerobe). Vorausgesetzt, cfaß Glukose als Substrat in Hugh und Leifson Medium dient, können die Enterobacteriaceae Säure aus Glukose unter aerobischen und anaerobischen Bedingungen bilden. Der Abbau der Glukose erfolgt meistens zusammen mit Gasbildung, wie bei z. B. Escherichia. Edwardsieila, Citrobacter und Enterobacter. Bei anderen Arten wird Gas nicht immer gebildet, z. B. einige Arten von Salmonella, Proteus und Erwinia. Auch andere, nicht zur Enterobacteriaceae gehörende Bakterien können Glukose aerobisch und anaerobisch abbauen. Dies geichieht bei Bacillus polymixa, B. macerans und Aeromonas hydrophila mit Gasbildung und bei Bacillus ccagulans ohne Gasbildung.Other bacteria can become substrates under both aerobic and anaerobic conditions utilize (facultative anaerobes). Assuming cfaß If glucose is used as a substrate in Hugh and Leifson's medium, the Enterobacteriaceae can take acid from glucose aerobic and anaerobic conditions. The breakdown of glucose usually takes place together with Gas formation, as in z. B. Escherichia. Edwardsieila, Citrobacter and Enterobacter. In other species will Gas not always formed, e.g. B. some species of Salmonella, Proteus and Erwinia. Others too, not for Enterobacteriaceae bacteria can break down glucose aerobically and anaerobically. This is the case in Bacillus polymixa, B. macerans and Aeromonas hydrophila with gas formation and in Bacillus ccagulans without gas formation.

Bestimmte Kohlenstoffquellen können für die Identifizierung bestimmter Bakteriengruppen eingesetzt werden. Typisch für die Coliformbakterien ist, daß sie Säure und Gas aus Laktose in MacConkey Bouillin bei 37⁰C bilden. Die Bildung von Gas aus Laktose bei 44⁰C kann als spezifisches Merkmal von EsGherichia coli betrachtet v/erden.Certain carbon sources can be used to identify certain groups of bacteria. Is typical of the coliform bacteria that they form acid and gas from lactose MacConkey Bouillin at 37 ⁰ C. The formation of gas from lactose at 44 ⁰ C can be regarded as a specific characteristic of EsGherichia coli.

Die Bildung von Gas aus anderen Substanzen, wie z. B, Nitrat, kann auch als Iderttifikatiorismerkmal benutzt werden. Pseudomonas stutzen und Alcalige· nes sp* können Stickstoffgas aus Nitrat bilder!,The formation of gas from other substances, such as B, nitrate, can also be used as an identifier to be used. Pseudomonas stutzen and Alcalige · nes sp * can form nitrogen gas from nitrate!

Um die unterschiedlichen Kulturen von Algen und Bakterien testen zu können, werden viele Untersuchungen notwendig. Es hat sich herausgestellt, daß Tests wie die von Hugh und Leifson (Journal of Bacteriology, 66, Seilen 24 bis 26) zur Bestimmung oxidativer oder fermentativer Stoffwechsel unpraktisch sind für Routinetests, da eine große Menge in Röhrchen abgefüllter Testmedien benötigt werden. Die Tests sind außerdem zeitaufwendig, da zwei Röhrchen mit Testmedium geimpft werden müssen. Eines der Röhrchen wird anschließend mit Paraffin überklebt, damit ein Luftabschluß gewährleistet ist. Die Bedingungen für ein anaerobisches Wachstum der Bakterien können nur in tiefem Agar erhalten werden.In order to be able to test the different cultures of algae and bacteria, many examinations are made necessary. Tests such as those by Hugh and Leifson (Journal of Bacteriology, 66, Ropes 24 to 26) for determining oxidative or fermentative metabolism are impractical for routine tests, because a large amount of test media filled into tubes is required. The tests are as well Time consuming as two tubes have to be inoculated with test medium. One of the tubes will then pasted over with paraffin, so that an air seal is guaranteed. The conditions for a Anaerobic growth of the bacteria can only be obtained in deep agar.

Die Aufgabe, webhe der Erfindung gestellt ist, besteht nunmehr darin, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der gleichzeitig ein aerobischer und ein anaerobischer Test durchgeführt werden kann.The object of the invention is now to create a device with which an aerobic and an anaerobic test can be carried out at the same time.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht erfindungsgemäß darin, daß in die Pipette ein Rohr eingelegt ist, dessen dem Hals der Pipette zugewandte Stirnseite einen Außendurchmesser aufweist, der gleich oder größer dem Innendurchmesser des Halses ist und daß die Länge des Rohres derart bemessen ist, daß die andere Stirnseite mit der Oberfläche des Testmediums abschließt oder über sie hinausragt.This object is achieved according to the invention in that a tube is inserted into the pipette, its the end face facing the neck of the pipette has an outer diameter which is equal to or larger is the inner diameter of the neck and that the length of the tube is such that the other End face flushes with the surface of the test medium or protrudes beyond it.

Eine Weiterführung der Erfindung sieht vor. daß die Pipette mit eine·: Verengung versehen ist, die ein Entfernen des Rohres aus der Pipette verhindert.A continuation of the invention provides. that the pipette is provided with a ·: constriction that a Prevents removal of the tube from the pipette.

Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, daß z. B. eine Pasteurpipette benutzt werden kann, in die ein Kapillarröhrchen hineingesetzt ist. Die in der Pipette befindlichen Medien können direkt aus einer Bakterienkolonie geimpft werden und sind daher außerordentlich gut für schnelle Routinetests von einfachen Bakterienkolonien verwendbar, wobei gleichzeitig in einer einzigen Pipette der Test unter Luftabschluß und mit Luftzutritt erfolgen kann. Das Testmedium kann beliebig ausgewählt werden. Der schmale Durchhang zwischen dem eingesetzten Kapillarröhrchen und dem Pipettenhals gestattet insbesondere den zu untersuchenden Bakterien bzw. Organismen den Zutritt zu dem Testmedium, während ein Auslaufen des Testmediums aus der Pipette aufgrund von Adhäsionskräften an diesem engen Durchtritt verhindert wird.The particular advantage of the device according to the invention is that, for. B. a Pasteur pipette can be used, in which a capillary tube is inserted. The media in the pipette can be vaccinated directly from a bacterial colony and are therefore extremely good for quick Routine tests of simple bacterial colonies can be used, taking simultaneously in a single pipette the test can be carried out in the absence of air and with access to air. The test medium can be freely selected will. The narrow slack between the inserted capillary tube and the pipette neck in particular allows the bacteria or organisms to be examined access to the test medium, while leakage of the test medium from the pipette due to adhesive forces on this tight Passage is prevented.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mittels der Fig. 1 bis 7 näher erläutert. Getestet wurden folgende Bakterienstämme: Acinetobacter calcoaceticus 34, 37; Aeromonas hydrophila 29; Alcaligenes eutrophus DSM 531; A. faecalis DSM 30 030; Alcaligenes sp. 50; Citrobacter sp. 020; Enterobacter cloacae 23; E. aerogenes 26; Escherichia coli 001, 002; Pseudomonas aeruginosa 009; Zoogloea ramigera DSM 287.The invention is explained in more detail below with the aid of exemplary embodiments by means of FIGS. 1 to 7 explained. The following bacterial strains were tested: Acinetobacter calcoaceticus 34, 37; Aeromonas hydrophila 29; Alcaligenes eutrophus DSM 531; A. faecalis DSM 30 030; Alcaligenes sp. 50; Citrobacter sp. 020; Enterobacter cloacae 23; E. aerogenes 26; Escherichia coli 001, 002; Pseudomonas aeruginosa 009; Zoogloea ramigera DSM 287.

Als Testmedium wurde unter anderem das von Hugh und Leifson beschriebene benutzt, welches 0,3% Agar beinhaltet. Die Glukose-Lösung wurde sterilisiert und zu dem Testmedium hinzugefügt, nachdem es im Autoklav behandelt wurde, um eine Konzentration von 1 Gew.-% zu erhalten. Die endgültige Farbe des Testmediums 7 (siehe F i g, 1 bis 7) wurde so abgestimmt, daß sie grün war; die Abstimmung könnte durch Veränderung des pH^Wertes von 6,6 bis 6,7 erreicht werden*The test medium used, inter alia, was that described by Hugh and Leifson, which contains 0.3% agar contains. The glucose solution was sterilized and added to the test medium after it was im Was autoclaved to obtain a concentration of 1% by weight. The final color of the Test medium 7 (see Fig. 1 through 7) was tuned to be green; the vote could can be achieved by changing the pH ^ value from 6.6 to 6.7 *

Die Nitratreduktion wurde in einem Testmedium 7 nachgewiesen, wobei als Testmedium das Von Lelliott et al. (Journal of Applied Bacteriology, 29, 1966, Seiten 470 bis 489) benutzt wurde und auch 0,3% Agar enthält.The nitrate reduction was demonstrated in a test medium 7, with Von Lelliott as the test medium et al. (Journal of Applied Bacteriology, 29, 1966, pages 470 to 489) and also contains 0.3% agar.

Paraffinwachs, welches zum Versiegeln der Pipetten 1 benutzt wurde, bestand aus 75% Paraffinwachs (Verfestigungspunkt 51 bis 53⁰C) und 25% viskosem Paraffin, welche beide zusammengeschmolzen und im Autoklav sterilisiert wurden. Die verwendeten Pipetten wurden vor Aufnahme von Testmedium 7 bzw. Bakteriensuspension 9 (siehe Fig.2, 3, 5, 6 und 7) gewaschen und getrocknet. Das gleiche erfolgte mit dem Kapillarröhrchen 2, das in die Pipette 1 hineingesetzt wird und dessen dem Hals 3 der Pipette zugewandte Stirnseite 4 einen Außendurchmesser aufweist, der mindestens gleich dem Innendurchmesser des Halses 3 ist. Er ist in bevorzugter Weise etwas größer, damit das Kapillarröhrchen 2 nicht zu tief in den Hals 3 der Pipette 1 hineinrutscht. Die Länge des Röhrchens 2 wird so bemessen, daß der Höhenstand des Testmediums 7 ausreicht, um aerobische und anaerobische Versuche ausführen zu können. Hierzu muß die Stirnseite 5 des Röhrchens 2 mit der Oberfläche 6 des Testmediums 7 abschließen oder etwas über sie hinausragen. Zusätzlich kann die Pipette 1 mit einem Wattestopfen 10 verschlossen werden. Au~h kann eine Verengung 8 des Querschnitts der Pipette 1 am oberen Ende der Pipette vorgesehen werden, die dazu dient, daß das Kapillarröhrchen 2 nicht aus der Pipette 1 entfernt werden kann. Die Befüllung der Pipetten 1 erfolgt z. B. mit geschmolzenem Agarmedium, welches in die Pipette 1 durch den Hals 3 hineingesaugt werden kann. Der Höhenstand wird durch die Länge des Kapiilarröhrchens 2 bestimmt, da überstehendes flüssiges Medium 7 durch das Kapillarröhrchen 2 abfließt. An der schmalen Berührungsstelle von Kapillarröhrchen 2 und Hals 3 kann jedoch das Testmedium 7 nicht ablaufen, da Adhäsionskräfte dies verhindern bzw. das Testmedium erstarrt. Anschließend kann die Pipette 1 an ihrer Spitze 12 zugeschmolzen und mittels des Stopfens 10 luftdurchlässig und steril verschlossen werden. Die Pipette 1 mit Testmedium 7 ist somit vorbereitet und transportfähig.Paraffin wax, which was used to seal the pipettes 1, consisted of 75% paraffin wax (solidification point 51 to 53 ^° C.) and 25% viscous paraffin, both of which were melted together and sterilized in the autoclave. The pipettes used were washed and dried before taking up test medium 7 or bacterial suspension 9 (see FIGS. 2, 3, 5, 6 and 7). The same was done with the capillary tube 2, which is inserted into the pipette 1 and whose end face 4 facing the neck 3 of the pipette has an outer diameter which is at least equal to the inner diameter of the neck 3. It is preferably somewhat larger so that the capillary tube 2 does not slip too deep into the neck 3 of the pipette 1. The length of the tube 2 is dimensioned so that the level of the test medium 7 is sufficient to be able to carry out aerobic and anaerobic tests. For this purpose, the end face 5 of the tube 2 must be flush with the surface 6 of the test medium 7 or protrude slightly beyond it. In addition, the pipette 1 can be closed with a cotton plug 10. A narrowing 8 of the cross section of the pipette 1 can also be provided at the upper end of the pipette, which serves to prevent the capillary tube 2 from being removed from the pipette 1. The filling of the pipettes 1 takes place z. B. with molten agar medium, which can be sucked into the pipette 1 through the neck 3. The height is determined by the length of the capillary tube 2, since protruding liquid medium 7 flows off through the capillary tube 2. At the narrow point of contact between the capillary tube 2 and the neck 3, however, the test medium 7 cannot run off, since adhesive forces prevent this or the test medium solidifies. The pipette 1 can then be melted shut at its tip 12 and closed in a sterile and air-permeable manner by means of the stopper 10. The pipette 1 with test medium 7 is thus prepared and transportable.

Zur Durchführung von Tests wird die Spitze 12 der Pipette 1 (siehe Fi g. 2) z. B. mechanisch geöffnet. Dann wird der Hals 3 und das Kapillarröhrchen 2 mit Suspension gefüllt bzw. die Oberfläche 6 des Testmediums 7 überdeckt. Dies kann in zwei Schritten erfolgen:To carry out tests, the tip 12 of the pipette 1 (see Fig. 2) z. B. opened mechanically. then the neck 3 and the capillary tube 2 are filled with suspension or the surface 6 of the test medium 7 covered. This can be done in two steps:

Die Spitze bzw. der Hals 3 der Pipette 1 wird in ein Gefäß H mit Roger's Lösung eilgetaucht, die mittels eines Unterdrucks aus dem Gefäß 14 hochgesaugt wild. Anschließend kann diese Lösung 13 von einer Bakterienkolonie 15 (siehe Fig. 3) durchsetzt werden und ergibt die Suspeni'on 9. Der Schritt von F i g. 2 nach F i g 3 muß derart erfolgen, daß die Lösung 13 nicht aus dem Kapillarröhrchen 2 bzw. dem Hals 3 der Pipette herausläuft, d. h.. der Unterdruck muß in der Pipette 1 bestehen bleiben.The tip or the neck 3 of the pipette 1 is quickly dipped into a vessel H with Roger's solution, which is sucked up from the vessel 14 by means of a negative pressure. This solution 13 can then be penetrated by a bacterial colony 15 (see FIG. 3) and results in the suspenion 9. The step of FIG. 2 according to FIG. 3 must be carried out in such a way that the solution 13 does not run out of the capillary tube 2 or the neck 3 of the pipette, ie. the negative pressure must remain in the pipette 1.

Damit sich die Lösung 13 und die Bakterien auch gut durchmischen und die !suspension 9 ergeben, wird die gesamte im Hals 3 und dem Kapillarröhrchen befindliche Flüssigkeit in den Raum 16 der Pipette 1 oberhalb der Oberfläche 6 des Testmediums 7 hineingesaugt (siehe Fig.4). Anschließend wird die Suspension 9 über das Kapillarröhrchen 2 und den Hals 3 der Pipette 1 v/ieder ausgespritzt (siehe F i g. 5), damit keinerlei Gasblasen sich mehr im Kapillarröhrchen 2 befinden. Es wird aber wiederum verhindert, daß sämtliche Suspension 9 durch das Kapillarröhrchen 2 abfließt, d. h., bleibt ein Teil 17 der Suspension 9 über der Oberfläche 6 des Testmediums 7 stehen.So that the solution 13 and the bacteria also mix well and result in the suspension 9, the all of the liquid in the neck 3 and the capillary tube into the space 16 of the pipette 1 sucked in above the surface 6 of the test medium 7 (see FIG. 4). Then the Suspension 9 is sprayed out through the capillary tube 2 and the neck 3 of the pipette 1 (see FIG. 5) so that There are no longer any gas bubbles in the capillary tube 2. But it is again prevented that all suspension 9 drains through capillary tube 2, d. i.e., a portion 17 of the suspension 9 remains above the Surface 6 of the test medium 7 are standing.

Über die Testdauer wird die Spitze 12 der Pipette 1 anschließend in ein Behältnis 81 mit Paraffinwachs gesteckt (Fig.6), damit der Hals 3 an seinem Ende 12 abgedichtet wird. Es bildet sich somit im Hals 3 der Pipette 1 ein Wachsstopfen 19, der den Pipetteninnenraum bzw. die Suspension 9 vor Luftrutritt durch den Hals 3 schützt (siehe F i g. 7).For the duration of the test, the tip 12 of the pipette 1 is then placed in a container 81 with paraffin wax inserted (Fig. 6) so that the neck 3 at its end 12 is sealed. A wax stopper 19 is thus formed in the neck 3 of the pipette 1, which closes the interior of the pipette or the suspension 9 protects against air ingress through the neck 3 (see FIG. 7).

Aeruoisehe Bedingungen bestehen nunmehr an der Oberfläche 6 des Testmediums ', .m Suspensionsteil 17 bzw. dem angrepzenden Teil des Tesirnediums 7. Da das Kapillarröhrchen 2 an der Berührungsstelle 4 mit der Pipette 1 bzw. 3 keine ganz dichte Verbindi-ng bildet, können dort auch Bakterien bzw. Mikroorganismen aus der Suspension 9 in das Testmedium 7 gelangen. Für diese bestehen hier anaerobische Bedingungen, d. h„ es ist ein absoluter Luftabschluß gewährleistet. Es Kann also an dem einen Ende des Testmediums 7 ein aerobischer Test und gleichzeitig am anderen Ende (Berührungsstelle 4) ein anaerobischer Test erfolgen.Aeruoisehe conditions now exist at the Surface 6 of the test medium, .m suspension part 17 or the angrepzenden part of the Tesirnediums 7. Since the capillary tube 2 at the point of contact 4 with the Pipette 1 or 3 does not form a very tight connection, Bacteria or microorganisms can also get from the suspension 9 into the test medium 7 there. For these exist here anaerobic conditions, i. h "it absolute air exclusion is guaranteed. It can thus an aerobic test at one end of the test medium 7 and at the same time at the other end (Contact point 4) an anaerobic test is carried out.

Eine Reduktion von Nitrat kann in der Pipette 1 dadurch bestimmt werden, daß in die Pipette ein bekanntes Reagenz eingefüllt wird. Dies ist z. B. 0.8% sulfanilic acid in 5N acetic acid oder 0,5% naphthylamine in 5N acetic acid. Eine Rotfärbung bestätigt die Anwesenheit von Nitrit.A reduction of nitrate can be determined in the pipette 1 in that a known reagent is filled. This is e.g. B. 0.8% sulfanilic acid in 5N acetic acid or 0.5% naphthylamine in 5N acetic acid. A red color confirms the presence of nitrite.

Das Testmedium 7 wird durch die Tests gelb gefärbt. Erfolgt innerhalb von 24 Stunden eine Gelbfärbung des gesamten Testmediums, d. h. über seine gesamte Länge, so ist das ein Indiz für einen fermentativen Stoffwechsel. Erfolgt die Gelbfärbung nur in den oberen paar Millimetern des Testmediums 7 (Teilmediurn 17. welches der Luft zugewandt ist), dann ist e!n oxidativer Stoffwechsel erfolgt.The test medium 7 is colored yellow by the tests. If the entire test medium, d. H. along its entire length, this is an indication of a fermentative metabolism. If the yellow coloration only occurs in the upper few millimeters of test medium 7 (partial medium 17th which facing the air), then an oxidative metabolism has taken place.

Eine Gaserzeugung, die z. B. dann erfolgt, wenn in der Suspension 9 Coliform-Bakterien enthalten sind, zeigt sich dadurch, daß in dem Testmedium 7 Gasblasen sich bilden. Dies wird dadurch begünstigt, weil das Testmedium 7 viskos ist und 0,3% Agar enthält.A gas generation z. B. occurs when in the Suspension 9 Coliform bacteria are contained, is shown by the fact that 7 gas bubbles form in the test medium form. This is favored because the test medium 7 is viscous and contains 0.3% agar.

Die Erfindung ist nicht auf die in den Ausführungsbeispielen aufgeführten Testmedien 7 bzw. Bakteriell bzw. Suspensionen beschränkt. Sie kann auch für andere Tests Verwendung finden, wo gleichzeitig mit Luftzufuhr und unter Luftabschluß getestet we^rden soll.The invention is not restricted to the test media 7 or bacterial or suspensions listed in the exemplary embodiments. It can also be used for other tests where simultaneously tested with air and the absence of air ^r we to want.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patent claims:

1, device for carrying out tests on microorganisms, at the same time being an aerobic and an anaerobic test can be performed, consisting of a pipette for Recording of test medium, characterized in that that in the pipette (1) a tube (2) is inserted, whose neck (3) of the pipette (1) facing end face (4) has an outer diameter which is equal to or greater than the inner diameter of the neck (3), and that the length of the tube (2) is such that the other Front side (5) with the surface (6) of the test medi- ß ums (7) or protrudes beyond it.

2. Device for carrying out tests with microorganisms according to claim 1, characterized in that that the pipette (1) is provided with a constriction (8) which enables removal of the Tube (2> from the pipette (1).