DE2752452A1 - METHOD OF BREEDING MICRO-ORGANISMS - Google Patents
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Description
Schwedt, den 14.11.1977Schwedt, November 14th, 1977
Anmelder: VEB Petrolchemisches Kombinat Schwedt, 133 Schwedt/Oder Applicant: VEB Petrolchemisches Kombinat Schwedt, 133 Schwedt / Oder
"Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen""Process for the cultivation of microorganisms"
IPK: C 12 b-1/20IPK: C 12 b-1/20
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen, insbesondere die aerobe Kultivierung von Mikroorganismen, wobei die Mikroorganismen zur Gewinnung von Einzellerprotein für Pütterungszwecke oder auch für die menschliche Ernährung gezüchtet werden.The invention relates to a method for growing microorganisms on straight-chain hydrocarbons, especially the aerobic cultivation of microorganisms, whereby the microorganisms are bred to obtain single-cell protein for feeding purposes or for human consumption will.
809825/0666 ~ 2 ~ 809825/0666 ~ 2 ~
Die Erfindung gehört in das Gebiet der technischen Mikrobiologie und kann in Anlagen genutzt «erden, in denen aus Kohlenwasserstoffen Proteine erzeugt «erden.The invention belongs to the field of technical microbiology and can be used in systems in which from Hydrocarbons Proteins produced «earth.
Bei industriell genutzten Verfahren spielen die Fragen der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens neben der Qualität der Produkte eine entscheidende Bolle, wobei die nachfolgenden Hauptziele angestrebt werden:In the case of industrially used processes, the questions of the cost-effectiveness of the process play a role alongside the quality of the Products play a decisive role, with the following main objectives being pursued:
- Hohe Nutzungsrate der eingesetzten Kohlenwasserstoffquelle für die Zellsubstanzsynthese·- High utilization rate of the hydrocarbon source used for cell substance synthesis
- Hohe Nutzungsrate des eigetragenen Sauerstoffs für die Zellsubstanzsynthese, da für die Dispergierung des Sauerstoffs oder des sauerstoffhaltigen Gases Energie aufgewendet werden muß und ein Ve rat me η des Sauerstoffs aufterdem zu Kohlenstoffverlusten fiihrt.- High utilization rate of the introduced oxygen for the cell substance synthesis, since for the dispersion of the Oxygen or the oxygen-containing gas expended energy must be and a Ve rat me η of the oxygen aufterdem leads to carbon losses.
- Soll die Biomasse zu Putter- oder Nahrungsmitteln aufgearbeitet werden, wird ein hoher Rohproteingehalt und eine günstige Nutzungsrate des verbrauchten Stickstoffs für verdauliche Proteine angestrebt, so daß z.B. der Nukleinsäurestickstoffanteil möglichst niedrig gehalten wird.- If the biomass is to be processed into putter or food, a high crude protein content and a A favorable rate of use of the nitrogen consumed for digestible proteins is sought, so that, for example, the nucleic acid nitrogen content is kept as low as possible.
- Erreichung hoher Biomassekonzentrationen im Permentor, um die Verarbeitungskosten niedrig zu halten.- Achieving high biomass concentrations in the Permentor to keep processing costs low.
Um diese Zielstellungen zu erreichen, wurden bereits unterschiedliche Wege vorgeschlagen.In order to achieve these objectives, different Ways suggested.
- 3 8 0 982 5/066 6 - 3 8 0 982 5/066 6
Es wurden Fermentoren mit hoher Begasungsintensität und hoher SauerstoffÜbergangsrate entwickelt, z.B. Tauchstrahlfermentoren (DL-WP 111.144).There were fermentors with high aeration intensity and high oxygen transfer rate, e.g. submersible jet fermentors (DL-WP 111.144).
Zur Verbesserung des Stoffaustausches für den Sauerstoff aus der Luft in das Ferraentationsmedium wurde vorgeschlagen, oberflächenaktive Substanzen einzusetzen (DT-OS 1.442.296). Es wurden eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen untersucht und entsprechend ihren unterschiedlichen spezifischen Leistungs- und Qualitätskennziffern je nach dem Hauptziel des Verfahrens vorgeschlagen.To improve the exchange of substances for oxygen from the air into the fermentation medium, it has been proposed to use surface-active substances (DT-OS 1.442.296). A variety of different microorganisms have been studied and proposed according to their different specific performance and quality indicators depending on the main objective of the process.
Und schließlich wurden verschiedene Substanzen als Wachstums- und Qualitätsstimulatoren vorgeschlagen (DT-OS 1.470.490, DT-OS 1.470.507, DL-WP 50.543 und DT-OS 2.043.206). Verwendung einer Kohlenstoffquelle mit einer bevorzugten C-Zahl von 10 - 14 zur Fermentation in einer Konzentration an η-Paraffinen in der Phase des logarithmischen Wachstums der Hefezellen zwischen 0,08 und 0,10 Gewichts-^ der Kultursuspension (DL-AP 113.927).And finally, various substances were used as growth and quality stimulators are proposed (DT-OS 1.470.490, DT-OS 1.470.507, DL-WP 50.543 and DT-OS 2.043.206). Use of a carbon source with a preferred carbon number from 10-14 for fermentation in a concentration of η-paraffins in the phase of logarithmic growth of the Yeast cells between 0.08 and 0.10% by weight of the culture suspension (DL-AP 113.927).
Alle diese vorgeschlagenen Verfahren bringen zwar Fortschritte, aber aus den theoretischen Bilanzen ist erkennbar, daß die verwendeten Mikroorganismen noch erhebliche Reserven hinsichtlich der Nutzung des verbrauchten Kohlenstoffs, Sauerstoffs und auch des Stickstoffs zugunsten der gewünschten Reinproteine besitzen.While all of these proposed procedures bring advances but from the theoretical balances it can be seen that the microorganisms used still have considerable reserves in terms of the use of the consumed carbon, oxygen and also of nitrogen in favor of the desired pure proteins.
Der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, durch eine bessere Nutzung der Reserven der Mikroorganismen eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zur Züchtung von Mikroorganismen auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen zu erreichen«The invention is based on the aim of improving the use of the reserves of the microorganisms to achieve the economic viability of the process for the cultivation of microorganisms on straight-chain hydrocarbons «
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Aus dem Ziel der Erfindung leitet sich die technische Aufgabe ab, die Verfahrensbedingungen so zu gestalten, daß ein optimaler .Reifegrad der Mikroorganismen ze Ilen erreicht werden kann.From the aim of the invention, the technical problem is derived from designing the process conditions so that an optimal .Maturity level of the microorganisms can be reached.
Überraschend wurde gefunden, daß die Zusammensetzung der n-Paraffine auf die Charakteristika der verwendeten Kohlenwasserst off rohstoffe selbst in Verbindung mit definierten Verfahrensbeding-ungen einen erheblichen Einfluß auf den Reifegrad der Mikroorganismenzellen und auch auf die Qualität der Produkte ausüben.Surprisingly, it was found that the composition of the n-paraffins on the characteristics of the hydrocarbons used off raw materials themselves in conjunction with defined Process conditions have a considerable influence on the degree of maturity the microorganism cells and also affect the quality of the products.
Beim Studium der einschlägigen Fach- und Patentliteratur ist ersichtlich, daß zur Züchtung von Mikroorganismen die Einsatzprodukte der Kohlenstoffquelle so zur Anwendung kommen, wie sie in der Baffenerie anfallen.When studying the relevant technical and patent literature it can be seen that for the cultivation of microorganisms the starting products of the carbon source are used as they occur in the baffle industry.
Andererseits werden die n-paraffinhaltigen Kohlenwasserstofffraktionen so eingesetzt, daß sie nach der mikrobiologischen Entparaffinierung dem vorgesehenen Verwendungszweck genügen. Zusammenhänge zwischen der Ausreifung der Mikroorganismenzellen, der Qualität des Endproduktes Protein im Hinblick auf die Einsatzfraktionen und die Fermentationsbedingungen wurden bisher nicht bekannt.On the other hand, the n-paraffin-containing hydrocarbon fractions used in such a way that they meet the intended use after microbiological dewaxing. Connections between the maturation of microorganism cells, the quality of the end product protein with regard to the feed fractions and the fermentation conditions not known so far.
Durch systematische Untersuchungen wurde gefunden, daß anstelle der allgemein verwendeten Einsatzfraktionen der Siedelage 200 - 380 0C definierte n-Paraffinschnitte bzw. n-paraffinhalt ige Kohlenwasserstoffgemische einer höheren Siedelage eingesetzt und jeweils für die Schnitte die Bedingungen des günstigsten Züchtungsresultates gewählt, wesentlich bessereBy systematic research it has been found that instead of the commonly used insert fractions of boiling range 200 - defined 380 0 C n-paraffin sections or n-paraffin holding strength hydrocarbon mixtures of a higher boiling employed and in each case selected the conditions of the best breeding outcome for the cuts significantly better
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Ergebnisse bei der Verbesserung des spezifischen Sauerstoff-, Kohlenstoff- und StickstoffVerbrauches zugunsten des Reinproteins erzielt werden.Results in improving the specific oxygen, carbon and nitrogen consumption in favor of pure protein be achieved.
Besonders hohe Biomassekonzentrationen werden erreicht, wenn die verwendeten n-Paraffinschnitte oder n-paraffinhalt igen Gemische einen um 60 - 120 0C insbesondere 80 - 100 0C höheren Siedebeginn haben, d.h. es ist eine höhere C-Zahl der n-Paraffine bei gleichzeitiger Einengung des C-Zahlbereiches erforderlich.Particularly high biomass concentrations are reached when the n-paraffin sections used or n-paraffin holding strength mixtures a to 60-120 0 C, in particular 80 - have higher 100 0 C Initial boiling point, ie, it is a higher number of C atoms of the n-paraffins with a simultaneous narrowing of the C number range is required.
Dieser Wert wird erreicht, wenn mindestens 70 % der eingesetzten geradkettigen Kohlenwasserstoffe eine C-Zahl größer als 15 besitzen.This value is achieved when at least 70 % of the straight-chain hydrocarbons used have a C number greater than 15.
Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Verweilzeit des Fermentationsgemisches zu Mikroorganismen/Kohlenstoffquelle/wässriges Nährmedium im Permentor einen definierten Grenzwert nicht unterschreiten darf. Dieser Grenzwert liegt um ca. 1-2 Stunden höher, als entsprechend der natürlichen Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen unter den Bedingungen der Kohlenwasserstofffermentation möglich wäre und bei den bisherigen Verfahren angewendet wird.Another essential feature of the invention is that the residence time of the fermentation mixture to microorganisms / carbon source / aqueous The nutrient medium in the Permentor must not fall below a defined limit value. This limit is about 1-2 hours higher than the natural growth rate of the microorganisms under the conditions of the hydrocarbon fermentation would be possible and with the previous processes is applied.
Bei den bisherigen Verfahren unter Einsatz der normalen Gemische wurde in der Regel die Verweilzeit in der Nähe der kürzest möglichen Verweilzeit eingestellt, um die bekanntermaßen bei längerer Verweilzeit höhere Veratmungsrate der eingesetzten Kohlenstoffquelle und des eingetragenen Sauerstoffs zu vermeiden.In the previous processes using the normal mixtures, the residence time was usually in the vicinity of the Shortest possible dwell time is set in order to cope with the breathing rate of the known to be higher with longer dwell times to avoid the carbon source used and the oxygen introduced.
Diese kurzen Verweilzeiten haben jedoch den Nachteil, daß es nicht zum vollständigen Ausreifen der Zelle kommen kann. Die Unterschiede im biologischen Gesamtreaktionsablauf der Zellsubstanzsynthese bei Anwendung der erfindungsgemäßen Lösung sind außerordentlich komplexer Natur.However, these short residence times have the disadvantage that the cell can not fully mature. The differences in the overall biological reaction sequence of cell substance synthesis when using the solution according to the invention are of an extremely complex nature.
809825/0666 " 6 "809825/0666 " 6 "
Insgesamt rühren die aus diesem Unterschied resultierenden Vorteile daher, daß bei der Zellsubstanzsynthese aus längeren einheitlichen n-Paraffinketten weniger Energie und Stoffwechselprodukte aus der Zelle abgegeben werden und daß bei dem gefundenen höheren Verweilzeitoptimum ein besseres Ausreifen der Zelle ermöglicht wird, z.B. ist bei Zellen mit höherem Reifegrad das Verhältnis von Zellplasma zum Zellkern günstiger, so daß die im Zellkern gebundenen unverdaulichen Stickstoffverbindungen sich relativ verringern.Overall, the advantages resulting from this difference stem from the fact that cell substance synthesis takes longer uniform n-paraffin chains less energy and metabolic products are released from the cell and that with the higher optimal residence time found, better ripening the cell, e.g. in cells with a higher degree of maturity, the ratio of cytoplasm to the cell nucleus is cheaper, so that the indigestible nitrogen compounds bound in the cell nucleus are relatively reduced.
Es wird offensichtlich weniger Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff für Stoffwechselprodukte und unverdauliche Stickstoffverbindungen verbraucht, wobei die bei der höheren Verweilzeit bekanntermaßen höhere Veratmungsrate durch die eintretenden Vorteile mehr als oder mindestens kompensiert wird.Obviously there is less oxygen, carbon and nitrogen for metabolites and indigestible nitrogen compounds consumed, with the known higher breathing rate due to the entering with the higher dwell time Benefits are more than or at least compensated for.
Die Erfindung betrifft also im wesentlichen ein neues Verfahren, bei dem das Erreichen des optimalen Reifegrades der MO-Zeile für die Proteingewinnung unter den günstigsten ökonomischen Bedingungen ermöglicht wird· Weiterhin ergibt sich ein direkter Vorteil bei Einsatz höherer Schnitte in der Form, daß bei der aeroben Fermentation natürlichen Verdampfungsverluste an Kohlenwasserstoffen auf etwa die Hälfte gesenkt werden.The invention thus relates essentially to a new method in which the achievement of the optimal degree of maturity of the MO line for protein production among the cheapest economic Conditions is made possible · Furthermore, there is a direct advantage when using higher Sections in such a way that natural evaporation losses of hydrocarbons occur during aerobic fermentation be reduced by about half.
Wird das erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenhang mit der Produktverarbeitung der Mineralölwirtschaft oder eines erdölverarbeitenden bzw. petrolchemiechen Kombinates gesehen, können weiterhin eine Reihe Vorteile hinsichtlich der ökonomischen Nutzung der Bestandteile schwerer Erdölfraktionen für die Proteingewinnung eintreten sowie auch in der Form, daß die leichteren bisher eingesetzten Bestandteile einer ökonomisch bzw. volkswirtschaftlich günstigeren Verwendung zugeführt werden können.If the method according to the invention in connection with the Product processing of the mineral oil industry or a petroleum processing company or petrochemical combines can continue to have a number of advantages in terms of economic Use of the constituents of heavy petroleum fractions for protein production occur as well as in the form that the lighter components previously used an economically or economically more favorable use can be.
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In den folgenden Beispielen sind zwei Verfahrensvarianten unter Verwendung von Candida guilliermondii als Produktionskultur angegeben. In the following examples, two process variants are given using Candida guilliermondii as the production culture.
In den anschließenden zusammenfassenden Tabellen sind die Vorteile gegenüber eines üblichen Verfahrensbeispiel dargestellt. Wie die Kennziffern ausweisen, sind erhebliche Vorteile bei der industriellen Nutzung zu erkennen.In the following summary tables are the advantages shown compared to a conventional process example. As the indicators show, there are significant advantages in of industrial use.
Die Anwendung von Candida guilliermondii ist als Beispiel, jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen. Die prinzipiellen Tendenzen besitzen wie auch thermodynamisch belegt werden kann, Gültigkeit für alle Mikroorganismen, die vorwiegend η-Paraffine zur Zellsubstanzsynthese verwerten können.The use of Candida guilliermondii is to be regarded as an example, but not as a limitation. The fundamental tendencies, as can also be proven thermodynamically, are valid for all microorganisms, which can mainly utilize η-paraffins for cell substance synthesis.
In einem 500 1-Rührkesselversuchsfermentor, der mit allen für die aerobe kontinuierliche Züchtung von MO notwendigen Einrichtungen und der erforderlichen Meßtechnik ausgerüstet ist, wurde Candida guilliermondii auf gereinigten n-Paraffinen unter folgenden Bedingungen gezüchtet:In a 500 1 stirred tank test fermentor that is used with all Equipped with the necessary facilities and measuring technology for the aerobic continuous cultivation of MO is, Candida guilliermondii was grown on purified n-paraffins under the following conditions:
Siedebeginn der n-Paraffinfraktion 300 0C Siedeende der n-Paraffinfraktion 380 0CInitial boiling point of n-paraffin fraction 300 0 C final boiling point of the n-paraffin fraction 380 0 C.
Durchschnittliche C-Zahl der η-Paraffine C^gAverage C number of the η paraffins C ^ g
Fermentationsgemisch im Permentor 200 kgFermentation mixture in the permentor 200 kg
Verweilzeit des Permentatbnsgemisches 8 hResidence time of the Permentatbnsgemisches 8 h
Zufuhr an n-Paraffinen 1,05 kg/hFeed of n-paraffins 1.05 kg / h
Temperatur 34 0CTemperature 34 0 C
pH-Wert 4,2pH 4.2
809825/0666 - 8 -809825/0666 - 8 -
Die Konzentration an Nähr- und Spurenelementen im Fermentationsgemisch wurde durch kontinuierliche Dosierung bei einer entsprechenden Nährlösung gehalten bei:The concentration of nutrients and trace elements in the fermentation mixture was maintained by continuous dosing with an appropriate nutrient solution:
Spezifische Beliiftungsrate: 70 1 Luft/kg Ferment at ions gemisch Specific ventilation rate: 70 1 air / kg fermentation mixture
Spezifischer LeistungseintragSpecific service entry
durch das Rührwerk (Netto): 10 Watt/kg Permentationsgemischthrough the agitator (net): 10 watts / kg permentation mixture
Der Versuch wurde über ca. 10 Tage durchgeführt, wobei die Biomasse entnommen, gereinigt und getrocknet zur Analytik und den entsprechenden Tests gegeben wurde. Folgende Resultate wurden erzielt (Spalte 2). In der Tabelle 1 sind zum Vergleich die Resultate einer üblichen Fermentation mit dem n-Paraffingemisch der SiedelageThe experiment was carried out over about 10 days, with the Biomass was removed, cleaned and dried for analysis and the corresponding tests. The following results were obtained (column 2). Table 1 shows the results of a conventional one for comparison Fermentation with the n-paraffin mixture from the boiling area
850
85
,01, 5
, 01
140
1
BiomasseerzeugungBiomass concentration
Biomass production
o, 17,
O,
kg/hg / kg
kg / h
809825/0666 - 9 -809825/0666 - 9 -
275245?275245?
M>M>
Anteil des verbrauchten Stickstoffs im
ReinproteinPercentage of nitrogen consumed in the
Pure protein
81,0 87,581.0 87.5
In der Versuchsstation gemäß Beispiel 1 wurde Candida guilliermondii unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wie folgt kontinuierlich gezüchtet:In the test station according to Example 1, Candida guilliermondii was produced under similar conditions as in Example 1 continuously bred as follows:
Belüftungsrate: 70 1 Luft/kg FermentationsgemischAeration rate: 70 1 air / kg fermentation mixture
Spezifischer Leistungseintrag durch das Rührwerk: 8 Watt/kg Fermentationsgemisch
Die Konzentration an Nähr- und Spurensalzen wurde analog Beispiel 1 gehalten.
Temperatur:
pH-Wert:Specific power input by the stirrer: 8 watts / kg fermentation mixture. The concentration of nutrient and trace salts was maintained as in Example 1.
Temperature:
PH value:
33 0C33 0 C
Verweilzeit:Dwell time:
Es wurde ein G-asöl-It became a gas oil
schnitt der Siedelage:section of the settlement:
'23 809825/0666'23 809825/0666
295 - 370 0C aus einem Erdöl eingesetzt, das 20,1 Gewichts-^ n-Paraffine mit einer mittleren C-Zahl von C18 enthielt, im Bereich C^c-295 - 370 0 C used from a petroleum containing 20.1 weight ^ n-paraffins with an average C number of C 18 , in the range C ^ c-
- 10 -- 10 -
Die Gasölkonzentration
im Permentationsmedium
betrug:The gas oil concentration
in the permentation medium
fraud:
26,5 *26.5 *
Der Versuch wurde Über 8 Tage gefahren.The experiment was run for 8 days.
Nach der Fermentation wurde das unverbrauchte Gasöl mittels eines kontinuierlich arbeitenden Te Hers eparat ors abgetrennt. Die vom Gasöl weitestgehend befreite Hefesuspension wurde getrocknet. Danach wurde in diskontinuierlichen Chargen mit einem organischen Lösungsmittelgemisch (Benzin/Isopropanol) extrahiert, getrocknet und entsprechend analysiert. Folgende Ergebnisse wurden erhalten (Spalte S). In Spalte 1 sind zum Vergleich die Ergebnisse eines analogen Versuches nach einem bisher üblichen Verfahren mit einem Gasölschnitt der Siedelage 230 - 350 0C angegeben. Die Verweilzeit betrug bei diesem Versuch 4 Stunden. Die Gasölkonzentration 14 f> bei 19,8 % η-Paraffinen im Gasölschnitt· Die mittlere C-Zahl der im Gasölschnitt enthaltenen η-Paraffine im Bereich Cq - C22 betrugAfter the fermentation, the unused gas oil was separated off by means of a continuously operating te maker. The yeast suspension, largely freed from the gas oil, was dried. It was then extracted in discontinuous batches with an organic solvent mixture (gasoline / isopropanol), dried and analyzed accordingly. The following results were obtained (column S). Column 1 shows the results of an analogous experiment for a usual method with a gas oil section of the boiling range 230 for comparison - indicated 350 0 C. The residence time in this experiment was 4 hours. The gas oil concentration 14 f> at 19.8% η-paraffins in the gas oil cut · The mean C number of the η-paraffins contained in the gas oil cut was in the range Cq - C 22
π·π
809825/0 666809825/0 666
- 11 -- 11 -
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |