DE1642653C3

DE1642653C3 - Multi-stage fermentation process

Info

Publication number: DE1642653C3
Application number: DE1642653A
Authority: DE
Inventors: Atsuo Kamakura Kitai; Asaichiro Tokio Ozaki; Hiroshi Fujusawa Kanagawa Tone
Original assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKIO
Current assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKIO
Priority date: 1966-10-06
Filing date: 1967-10-06
Publication date: 1975-04-10
Also published as: DE1642653B2; DE2037903B2; DE1642653A1; DE2037903C3; DE2037903A1

Description

Die Erfindung betrifft ein mehrstufiges Gärverfahren in einem durch perforierte Platten in Kammern geteilten Gärturm, der eine Luftzufuhr vom Boden aus aufweist.The invention relates to a multi-stage fermentation process in one through perforated plates in chambers split fermentation tower, which has an air supply from the ground.

Aus der DT-AS 1 207 324 ist eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Vergären von Würze bekannt, bei der über die Höhe eines Gärturms verteilt sich über den Querschnitt erstreckende perforierte Verteilerelemente vorgesehen sind, welche die mit der Würze unten zugeführte Luft über den Querschnitt des Gärturms zur Erzielung einer gleichmäßigen Strömungsgeschwindigkeit verteilen und die Ausbildung größerer Gasblasen verhindern. Demgegenüber geht die Erfindung von mehreren getrennt arbeitenden Gärkammern aus, die in Reihe geschaltet sind.A device for the continuous fermentation of wort is known from DT-AS 1 207 324, in the case of the perforated distributor elements extending over the cross section over the height of a fermentation tower are provided, which the air supplied with the wort below over the cross-section of the fermentation tower to achieve a uniform flow rate and distribute the training Prevent larger gas bubbles. In contrast, the invention is based on several working separately Fermentation chambers that are connected in series.

Die mikrobiologische Fermentation wird industriell gewöhnlich diskontinuierlich durchgeführt. Kontinuierliche Verfahrensweisen wurden entweder mit einer einzigen Gärvorrichtung oder mehreren in Reihe angeordneten Gärvorrichtungen angestrebt, jedoch wurde keine Verfahrenstechnik so weit entwickelt, daß sie für technische Zwecke besonders geeignet wäre. Allgemein wird ein kontinuierliches Verfahren mit einer einzigen Gärvorrichtung im Falle der mit Wachstum verbundenen Fermentation durchgeführt, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts zusammen mit dem Wachstum des Mikroorganismus in dem Kulturmedium stattfindet. Im Falle von nicht mit Wachstum verbundener Fermentation, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts nicht mit dem Wachstum des Mikroorganismus erfolgt, sondern nach Beendigung des mikrowellen Wachstums stattfindet, muß die kontinuierliche Fermentation mit mehr als zwei Gärvorrichlungen durchgeführt werden, wobei in jeder eine besondere Züchtungsphase, die von der anderen verschieden ist, vorgenommen wird, so daß das mikrobielle Wachstum und die Produktbildung während des Verfahrens getrennt stattfinden. Dies erfordert jedoch zusätzliche Einrichtungen, wie beispielsweise ein Belüftungssystem, eine Vorrichtung zum Durchmischen, eine Dosierpumpe mit einer Kapazität, die der Anzahl der verwendeten Gärvorrichtungen proportional ist, und dergleichen. Beim Einsatz im technischen Maßstab ist die zur Durchführung dieses Verfah/CnS auf der Basis eines stationären Zmtands erforderliche Anlage sehr kostspielig.Microbiological fermentation becomes industrial usually carried out batchwise. Continuous procedures were used with either a aspired to single fermentation device or several fermentation devices arranged in series, however No process engineering has been developed to the point that it is particularly suitable for technical purposes were. In general, a continuous process with a single fermenter is used in the case of with Growth related fermentation is carried out in which the formation of a desired product is related takes place with the growth of the microorganism in the culture medium. In the case of not using Growth related fermentation, in which the formation of a desired product is inconsistent with the Growth of the microorganism takes place, but takes place after the microwave growth has ended, continuous fermentation must be carried out with more than two fermentation devices, each with a special breeding phase that is different from the other, so that microbial growth and product formation take place separately during the process. However, this requires additional equipment, such as a ventilation system, a device for mixing, a metering pump with a capacity that corresponds to the number of fermenters used is proportional, and the like. When used on an industrial scale, it is necessary to carry out this process / CnS on the basis of a stationary Zmtand required system very expensive.

Der ErSndnsg liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrstufiges Gärverfahren der eingangs angegebenen Art so zu vereinfachen, daß es bei minimalem Kostenaufwand in technischem Maßstab eingesetzt werden kann.
Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurchThe object of the invention is to simplify a multi-stage fermentation process of the type specified at the outset so that it can be used on an industrial scale at minimal cost.
This object is achieved according to the invention

ίο gelöst, daß die Luft zur Erzielung eines freien Raumes im oberen Teil jeder Kammer des Gärturms geleitet wird. Damit wird eine Luftschicht unter jeder perforierten Platte aufrechterhalten, die eine freie Durchmischung dsr Flüssigkeit zwischen den einzel-ίο solved that air to achieve a free Space in the upper part of each chamber of the fermentation tower. This creates a layer of air under everyone perforated plate, which allows the fluid to mix freely between the individual

nen Kammern verhindert, so daß jede Kammer wie ein unabhängiger Fermenter arbeitet.Nen chambers prevented so that each chamber works like an independent fermenter.

Durch diese Verfahrensweise kann nicht nur diskontinuierlich und kontinuierlich gearbeitet werden, sondern es kann auch eine synchrone Züchtung undThis procedure can not only be discontinuous and be worked continuously, but it can also be a synchronous breeding and

»0 Gewinnung von Zellen sehr wirksam vorgenommen werden. Gegenüber den bekannten kontinuierlichen Verfahren ergeben sich eine Reihe von Vorteilen. Die zur Durchfühiung des Verfahrens erforderliche Vorrirhtt'jig ist in ihrem Aufbau äußerst einfach, es»0 The extraction of cells can be done very effectively. Compared to the known continuous Procedure result in a number of advantages. The necessary to carry out the procedure Vorrirhtt'jig is extremely simple in its construction, it

»5 ist keine Einrichtung zum Durchmischen notwendig, da die Flüssigkeit durch Belüftung gut gerührt wird, und es ist keine Pumpe zum Überführen der Brühe von einem Gefäß zu einem anderen erforderlich. Der Betrieb ist einfach und leicht zu automatisieren, und der stationäre Zustand kann ohne Schwierigkeiten aufrechterhalten werden. Das Kühlen und Erhitzen erfolgt mit hohem Wirkungsgrad aufgrund der großen Wärmeübergangsfläche je Einheit Innenvolumen. Wird ein festes Subsiratmaterial bei der Fermentation verwendet (im folgenden als »Feststoff-Fermentation« bezeichnet), so herden die dispergierten Feststoffteilchen in dem Gärturm durch den Betrieb dei Vorrichtung gehalten, wodurch gewöhnlich eine gute Ausbeute im Verhältnis /u dem eingesetzten Rohmaterial erzielt wird, da wenig Materialverlust durch den Überlauf der Flüssigkeit auftritt. Bei der Feststoff-Fermentation ist c!> weder erforderlich, das Material zu pulverisieren noch ein Lösungsmittel zu verwenden, das für den Mikroorganismus schädlich sein kann. Ferner kann hei einem kontinuierlichen Betrieb das Zellenaiter in der abgezogenen fermentierten Brühe enger in Beziehung zu der durchschnittlichen Verweilzeit gehalten werden als bei einem einzigen Rührbehälter, bei welchem das Zellenalter in der fermentierten Brühe zwischen Null und Unendlich liegt.»5 no device is necessary for mixing, since the liquid is stirred well by aeration and there is no pump to transfer the broth required from one vessel to another. The operation is simple and easy to automate, and the steady state can be maintained without difficulty. The cooling and heating takes place with high efficiency due to the large heat transfer surface per unit of internal volume. If a solid subsirate material is used in the fermentation (hereinafter referred to as "solid fermentation" called), the dispersed solid particles are focussed kept in the fermentation tower by operating the device, usually giving a good yield is achieved in the ratio / u of the raw material used, as little material loss due to the Liquid overflow occurs. In solid fermentation, c!> no need to pulverize the material or use a solvent, that can be harmful to the microorganism. It can also be operated continuously the cell string in the withdrawn fermented broth more closely related to the average Dwell time can be maintained than with a single stirred tank, in which the cell age in the fermented broth is between zero and infinity.

Zweckmäßige Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben. Anhand der Zeichnungen wird das erfindungsgemäßc Verfahren beispielsweise näher erläutert. Es zeigtAppropriate refinements of the method are given in the subclaims. Based on Drawings, the method according to the invention is explained in more detail, for example. It shows

F i g. 1 einen Längsschnitt durch einen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten mehrstufigen Fermenter,F i g. 1 shows a longitudinal section through a multistage used for the method according to the invention Fermenter,

F i g. 2 eine Draufsicht auf eine zwischen den einzelnen Kammern angeordnete perforierte Platte, F i g. 3 einen Längsschnitt durch eine andere Ausführungsform eines Fermenters,F i g. 2 shows a plan view of a perforated plate arranged between the individual chambers, F i g. 3 shows a longitudinal section through another embodiment of a fermenter,

F i g. 4 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Zellenkonzentration und der durchschnittlichen Verweilzeit in jeder Kammer im Vergleich zu einer Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Züchtung gemäß Versuch 4, die zeigt, daß die Zellcnkonzentration be einem kontinuierlichen Ver-F i g. Fig. 4 is a graph showing the relationship between cell concentration and average Residence time in each chamber compared to a discontinuous growth curve Cultivation according to experiment 4, which shows that the cell concentration in a continuous process

fahren unter Verwendung des Mehrstufenfermenters äß der nachfolgend beschriebenen Art einen tationären Zustand erreicht,
Fig. 5 den Betriebszustand innerhalb jeder Kam_r J_es Fermenters, wenn das Kulturmedium sich in der Fermentation befindet,driving using the multi-stage fermenter as described below reaches a stationary state,
5 shows the operating _state, when the culture medium is located. Kam within each _r J fermenter in the fermentation,

pjo 6 die Gesamtströmungscharakteristiken des F menters _{in bezug} auf verschiedene Kombinationen von Lochdurchmesser einer Platte mit dem Verhältnis des Öffnungsquerschnitts jeder Platte zu dem resamtunerschnitt dieser Platte unter Verwendung «nn eewotinlichem Wasser gemäß Versuch 1 undpjo 6 the overall flow characteristics of the menter _{in relation} to various combinations of hole diameters of a plate with the ratio of the opening cross-section of each plate to the total under-section of this plate using normal water according to experiment 1 and

Fie 7 ebenfalls die GesamtströmungscharakterUtiken eines Fermenters in bezug auf verschiedene Kombinationen des Lochdurchmessers einer Platte mit dem Verhältnis des öffnun^querschnitu jeder Pl-iue zu dem Gesamtquerschnitt der Platte unter Verwenüung einer tatsächlichen fermentierten Brühe maß Versuch '7 also shows the overall flow characteristics of a fermenter with respect to various combinations of the hole diameter of a plate with the ratio of the opening cross section each Pl-iue to the total cross-section of the plate below Dilution of an actual fermented broth measured attempt '

Fs sei nun auf F i g. 1 Bezug genommen, die im Vertikalschnitt einen zylindrischen mehrstufigen Fermpntcr 7eiet der aus vier Kammern 1 besteht, die Eeinamkr mit den Platten 2 als Trennwandungen äSeordnet sind. Fig. 2 «igt die Oberfläche einer Platte. Jede Kammer kann mit einer Temperaturreeuliereinricruung, wie beispielsweise einem Mantel 3 und einer elektrischen Heizung, ausgestattet sein, und das Kopfstück 5 sowie der Boden 6 sind mit einem PaL von Rohren 4 verbunden, die das Einströmen und Abfließen von Luft bzw. Medium ermöglichen. Diese Rohre können direkt an die Kammern angesSssen sein, und in diesem Falle sind Abschlußen TuJd 6 nicht erforderlich.Let Fs now be on F i g. 1 reference is made, in vertical section, a cylindrical multi-stage Fermpntcr 7eiet which consists of four chambers 1, the Eeinamkr with the plates 2 as partitions are ordered. Fig. 2 shows the surface of a Plate. Each chamber can be equipped with a temperature regulating device, such as a jacket 3 and an electric heater, and the head piece 5 and the bottom 6 are connected to a PaL of pipes 4, which the inflow and allow air or medium to flow away. These pipes can be attached directly to the chambers TuJd 6 degrees are not required in this case.

Der Fermenter weist gewöhnlich eine Anzahl von Kammern von einheitlicher Form und Größe auf, die üSnander angeordnet sind, doch kann er auch Kammern, die in Form und Größe verschieden sind, auSsen Die Hauptsache ist, daß der Fermenter durch e"ne Platte oder Platten unterteilt ist, von denen de zumindest eine öffnung aufweist. DieThe fermenter usually has a number of chambers of uniform shape and size, the üSnander are arranged, but it can also have chambers that are different in shape and size, EXTERIOR The main thing is that the fermenter is subdivided by a plate or plates, of which the has at least one opening

mmmm dieren können, in Betracht gezogen werden. Manchmal werden Drahtgewebeplatten oder poröse oder perforierte Platten verwendet. Die Größe von jedem Loch und die Anzahl der Löcher (öffnungsquerschnittsfläche) werden durch solche Faktoren, wie Größe des Fermenters und Art der gewünschten mikrowellen Reaktion, bestimmt. Die Anzahl der Kammern wird durch die besten Bedingungen vom Standpunkt solcher Faktoren, wie gewünschter Jrermentationstyp, Höhe und Volumen des Fermenters, Belüftungssystem, Druckabfall u. dgl., bestimmt Jede eingesetzte Platte kann mit den Flanschen der Oehäuseteile mit Dichtungen dazwischen verscnrauDt sein. Probeentnahme-, Beschickungs- und/oder Abzugsleitungen oder Hähne 7, die an einzelnen dammern montiert sind, sind ebenfalls zur Kontrolle uno Steuerung der Fermentation nützlich, da sie den Austritt oder Eintritt von flüssigem Inhalt ermöglichen^ Ein Luftfilter ist wie bei den üblichen Fermentern vorgesehen. Schließlich kann dieser mehrstufige Fe/-menter entweder allein oder in einer Gruppe verwendet werden. . . mmmm dates can be considered. Sometimes wire mesh panels or porous or perforated panels are used. The size of each hole and the number of holes (opening cross-sectional area) are determined by such factors as the size of the fermenter and the type of microwave reaction desired. The number of chambers is determined by the best conditions from the standpoint of such factors as the type of fermentation desired, the height and volume of the fermenter, ventilation system, pressure drop, and the like. Each inserted plate may be bolted to the flanges of the housing parts with gaskets therebetween. Sampling, charging and / or discharge lines or taps 7, which are mounted on individual dammers, are also useful for monitoring and controlling the fermentation, since they allow the exit or entry of liquid contents ^ An air filter is provided as in the usual fermenters . Finally, this multi-stage Fe / fermenter can be used either alone or in a group. . .

Spezielle Merkmale dieser Fermentationsvornchtung, wie sie oben beschrieben wurde, sind aus den folgenden Versuchen ersichtlich.Special features of this fermentation device, as described above can be seen from the following experiments.

Versuch 1Attempt 1

Die Wirkung der Plattenbeschaffenhert, d. n. des Durchmessers der Löcher und des Verhältnisses der perforierten Querschnittsfläche jeder Platte zur oesamtquerschnittsfläche dieser Platte, ^a™ «»« ™£ mungscharakteristiken der fur das erfindungsgemaße Verfahren verwendeten Fermentationsvornch ung wurde untersucht. Die Vorrichtung war, wie in F\g. 1The effect of the plates on the diameter of the holes and the ratio of the perforated cross-sectional area of each plate to the total cross-sectional area of this plate, ^a ™ «» «™, the ventilation characteristics of the fermentation pre-chamber used for the process of the invention was investigated. The device was, as in g F \. 1

gezeigt, mit perforierten Platten m vier« unterte.lt, von denen ,ede eine η Du rehmesscr von 7 cm und eine Hohe von 12 ^ J?*¹«:^^ wurde mit einer Rate von 61 je Stunde η diese Vor richtung vom Boden aus eingepumpt und floß vonshown, with perforated plates m four "Unterte.lt, of which, ede a η Du rehmesscr of 7 cm and a height of 12 ^ J? * ¹ ": ^^ was at a rate of 61 per hour η this device from Soil pumped in and flowed out

der obersten K-mmer .b. *^™*™£ ^the top chamber .b. * ^ ™ * ™ £ ^

5HiHES5HiHES

spiel für die Beziehung des Lochdurchmessers mit dem öffnungsverhältnis e.ner Platte zur Gesamtplattenquerschnittsfläche. Die Kombination dieser Größen variiert, wieim folgenden noch erörtert w,rd, Reiheplay for the relationship of the hole diameter the opening ratio of one panel to the total panel cross-sectional area. The combination of these quantities varies, as will be discussed below line

hndethandles

_vier. Wenn jedoch Kammern stattweniger als vier. Dies _four . However, if chambers instead of less than four. this

ist jeaocn zwecMiiauig, ua uaa ..,,.^,„ »»„„ . is jeaocn two-way, including uaa .. ,,. ^, "» »" ".

während des Betriebs dann sichtbar ist. Das Material, unier vciwcuuun_B ^*.. ..„.._ is then visible during operation. The material, unier vciwcuuun _B ^ * .. .. ".._

aus dem die Platten gefertigt sind, ist ebenfalls frei 65 2 mm Durchmesser und einem Verhältnis von Gewählbar, doch sollten die Bestandteile des Mediums samtlochquerschnittsfläche in jeder Platte zur Ge- und das infolge der Fermentation erzeugte Produkt, samtplattenquerschnittsfiäche im Bereich von 1 bis die auf das Plattenmaterial wirken und dices korro- 30 "/0 wurde das Verhalten des Fermenters nichtfrom which the plates are made is also freely 65 2 mm diameter and a ratio of selectable, however, the components of the medium, including the cross-sectional area of the holes in each plate, should and the product produced as a result of fermentation, velvet plate cross-sectional area in the range of 1 to which act on the plate material and dices corro- 30 "/ 0 the behavior of the fermenter was not

beeinflußt. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 3 mm sollte jedoch das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität in dem Fermenter aufrechtzuerhalten. Aus diesem Versuch ist zu schließen, daß sehr komplizierte Beziehungen zwischen dem Lochdurchmesser und dem Verhältnis der perforierten Querschnittsfläche einer Platte zu der Gesamtquerschnittsfläche dieser Platte existieren, um einen optimalen Zustand für die Kombination von beiden züchtet worden war, vorgenommen. Die zugeführte Luft strömte mit einer linearen Geschwindigkeit von 7 cm/Sekunde durch den Fermenter. Nach dem Beginn des mikrowellen Wachstums füllte die Luft in jeder Kammer einen leeren Raum im oberen Teil dieser Kammer gegen die unmittelbar darüber befindliche Platte aus. Eine bestimmte Menge Flüssigkeit, die in jeder einzelnen Kammer gehalten wurde, wurde in Abhängigkeit von der Menge an zugeführter Luft,influenced. However, if the hole diameter is larger than 3 mm, the aperture ratio should be smaller to maintain heterogeneity in the fermenter. From this attempt it can be concluded that very complicated relationships between the hole diameter and the ratio of perforated Cross-sectional area of a plate to the total cross-sectional area of this plate exist to one optimal condition for the combination of both breeds had been made. The supplied Air flowed through the fermenter at a linear velocity of 7 cm / second. After the beginning of microwave growth, the air in each chamber filled an empty space in the upper part this chamber against the plate immediately above it. A certain amount of liquid, which was kept in each individual chamber, depending on the amount of air supplied,

zu erzielen. Der obige Versuch beruhte auf dem io dem Durchmesser der Löcher, dem ÖffnungsverhäK-to achieve. The above experiment was based on the diameter of the holes, the opening ratio

reinen Wasser-Luft-System, und die Situation wird daher durch das verwendete System weitgehend beeinflußt. pure water-air system, and the situation will therefore largely influenced by the system used.

Versuch 2Attempt 2

nis in jeder Platte, den physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit u. dgl. bestimmt. Es wurde diese bestimmte Menge Flüssigkeit in jeder Kammer gehalten, wobei selten Mischen mit der Flüssigkeit in der benachbarten Kammer auftrat. Auf diese Weise arbeitete jede Kammer getrennt und einzeln als einzelne Fermentationsvorrichtung.nis in each plate, the physical properties of the liquid and the like. It became this particular one Amount of liquid held in each chamber, rarely mixing with the liquid in the neighboring one Chamber occurred. In this way each chamber worked separately and individually as an individual Fermentation device.

Die Phasen von bakteriellem Wachstum in der Kultur in den jeweiligen Kammern wurden beobachtet und aufgezeichnet (nachfolgende Tabelle 1). Zusammenfassend gesagt unterscheiden sich die Wachstumsphasen von einer Kammer zu einer anderen, und die Unterschiede zwischen den erhaltenen Werten liegen außerhalb des Bereichs statistischer Fehler.The phases of bacterial growth in the culture in the respective chambers were observed and recorded (Table 1 below). In summary, the growth phases differ from one chamber to another, and the differences between the values obtained are outside the range of statistical errors.

Die Wirkung der Plattenbeschaffenheit, wie sie in Versuch 1 beschrieben ist, auf die Strömungscharakleristiken eines vorstehend beschriebenen Fermenters wurde untersucht, wobei dieses Mal eine Fermentationsbrühe verwendet wurde.The effect of the plate texture, as described in Experiment 1, on the flow characteristics of a fermenter described above was examined, this time a fermentation broth was used.

Xanthomonas campestoris B-324 wurde bei 30 X zwei Tage lang in einem Medium gezüchtet, das 3% Glucose, 0,2°/n Pepton, 0,2«/- Fumarsäure, 0,2⁰O KH.,PO₄, 0,2 °/o Na₂CO₃ und 0,05⁰O MgSO₄ 7H₂OXanthomonas campestoris B-324 was grown in a medium long X 30 two days, the 3% of glucose, 0.2 ° / n peptone, 0.2 "/ -. Fumaric acid, 0.2 ⁰ O KH, PO _4, 0 , 2 _{% Na 2} CO ₃ and 0.05 ⁰ O MgSO ₄ 7H ₂ O

enthielt und mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt war. 25 Die Werte in Tabelle I geben die optische Dichte-Die oben erhaltene viskose Kulturbrühe wurde zur einheit an (im nachfolgenden bezeichnet als O. D.:and was adjusted to pH 6.0 with NaOH. The values in Table I give the optical density-die The viscous culture broth obtained above became a unit of (hereinafter referred to as O. D .:

Bestimmung der Strömungscharakteristiken dieses Fermentes in der gleichen Weise, wie in Versuch 1 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.Determination of the flow characteristics of this ferment in the same way as in experiment 1 described, used. The results are in Fig. 7 shown.

Unter Verwendung der Platten nut Löchern mit 5 mm Durchmesser und einem Öffnungsverhältnis in jeder Platte im Bereich von 1 bis 40 ⁰Zo wurde die Heterogenität in dem Fermenter völlig aufrechterhalten. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 8 mm sollte dagegen das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität aufrechtzuerhalten.Using the plates with holes 5 mm in diameter and an aperture ratio in each plate in the range of 1 to 40 ⁰ Zo, the heterogeneity in the fermenter was fully maintained. On the other hand, if the hole diameter is more than 8 mm, the aperture ratio should be smaller in order to maintain the heterogeneity.

Aus den obigen Versuchen 1 und 2 ist ersichtlich, daß eine solche Beziehung eine komplizierte Funktion der Flüssigkeitseigenschaften, wie Dichte, Viskosität und Oberflächenspannung, der Belüftungsrate, der Flüssigkeitsströmungsrate, des Abstands von einer Platte zu einer anderen, des Durchmessers einer Platte (der Größe des Fermenters) usw. ist. Die Wahl optische Dichte bei 610 ηηι
nungen).It can be seen from Experiments 1 and 2 above that such a relationship is a complicated function of liquid properties such as density, viscosity and surface tension, aeration rate, liquid flow rate, distance from one plate to another, the diameter of a plate (the size of the Fermenter) etc. is. Choosing optical density at 610 ηηι
nings).

Anzahl von Verdün-Number of thinners

Versuch 4Attempt 4

Kammer
(vom
Boden
aus)chamber
(from the
floor
the end) OD
0OD
0 zu verseil
1too stranded
1 tedenen Zu
2tedenen zu
2 ohtungsstu
3ohtungsstu
3 lden
4load
4th Nr. 1number 1 0,100.10 0,2200.220 0,4210.421 0,7560.756 1,021.02 Nr. 2No. 2 0,100.10 0,2100.210 0,4120.412 0,7430.743 0,980.98 Nr. 3No. 3 0,110.11 0,2070.207 0,4100.410 0,7350.735 0,950.95 Nr. 4No. 4 0,110.11 0,2050.205 0,4050.405 0,7310.731 0,950.95

Versuch 4Attempt 4

Nach den obigen Arbeitsweisen wurde eine Fer-According to the above working methods, a manufacturing

der Platte bezüglich der obigen Kombination von 45 mentation in einem anderen Fermenter durchgeführt, Lochdurchmesser und Öffnungsverhältnis hängt auch der dieses Mal in 10 Kammern mit in gleichem Abstand angeordneten Platten unterteilt war, wobei jede Platte Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm undthe plate regarding the above combination of 45 mentation carried out in another fermenter, Hole diameter and aperture ratio also depend on this time in 10 chambers with the same distance arranged plates was divided, each plate having holes with a diameter of 2 mm and

ein Öffnungsverhältnis von 11⁰O aufwies.had an aperture ratio of 11 ⁰ O.

von dem Fermentationsobjekt ab. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Faktoren sollte die optimale Beschaffenheit einer Platte indmduell beifrom the fermentation object. Considering of the factors described above, the optimum consistency of a panel should be considered individually

jedem Versuch vor dem tatsächlichen Einsatz des 50 Nach 3stündiger Vorkultivierung wurde ein Medium Fermenters bestimmt werden. Es ist zwar sehr schwie- mit der gleichen Zusammensetzung wie in Versuch 3 rig, solche Plattenbeschaffenheiten zu verallgemei- " ~every attempt before the actual use of the 50. After 3 hours of preculturing, a medium was used Fermenter are determined. It is indeed very difficult with the same composition as in experiment 3 rig to generalize such plate textures "~

nern, doch liegt die am häufigsten angewendete Kombination im Bereich zwischen 1 und 20 mm bezüglich mit einer konstanten Rate vom Boden des Fermenters aus zugeführt. Die Verdünnungsrate, bezoger auf das Gesamtvolumen des Mediums, betrug Vs j<nern, but is the most commonly used combination in the range between 1 and 20 mm with respect to at a constant rate from the bottom of the fermenter fed out. The dilution rate, based on the total volume of the medium, was Vs j <

des Durchmessers der Löcher und 1 und 40·/« bezug- 55 Stunde. Insbesondere wurde die Menge an zugeführ Hch des Öffnungsverhältnisses. tem Medium so eingestellt, daß die Verdünnungsrat«of the diameter of the holes and 1 and 40 · / «referred to 55 hours. In particular, the amount of supplied was High of the aperture ratio. medium so that the dilution rate «

,_ in der Bodenkammer die maximale spezifische Wachs, _ in the bottom chamber the maximum specific wax

Versucn S tumsrate des Mikroorganismus nicht überstieg. ÜberVersucn S not tumsrate the microorganism exceeded. Above

Ein Zochtungsmednim (pH 7,0), das je Liter 1 g schüssige Flüssigkeit, die durch den Fermenter naclA Zochtungsmednim (pH 7.0), which per liter 1 g of liquid, which through the fermenter nacl

Glucose, 0,5 g Hefeextrakt, 5,0 g NH₄Cl, 1,0 g 60 oben geführt wurde, floß vom oberen Ende über.Glucose, 0.5 g yeast extract, 5.0 g NH ₄ Cl, 1.0 g 60 led above overflowed from the top.

NH₁NO₃. 2.0 g Na₂SO,, 0,1 g MgSO₄ · 7 H.O, 3,0 g Die Unterschiede in der Zellenkonzentration voNH ₁ NO ₃ . 2.0 g Na ₂ SO, 0.1 g MgSO ₄ · 7 HO, 3.0 g

K.HPO₄ und 1,0 g KH₄PO₄ enthielt, wurde in einen einer Kammer zu der nächsten wurden mit fortschreiK.HPO ₄ and 1.0 g of KH ₄ PO ₄ contained was moved into one of the chambers to the next were screaming

zyiinderförmigen "Fermenter mit einer Höhe von tender Zeit ersichtlicher, and nach 17 bis 20 StundeCylindrical fermenter with a height of tender time more noticeable, and after 17 to 20 hours

130 cm und einem Durchmesser von 7 cm einge- kam der Gradient in der Zellenkonzentration in eine130 cm and a diameter of 7 cm, the gradient in the cell concentration came into one

bracht, der dutcJi fünf quer angeordnete Platten 65 stationären Zustand. Die ZeJlenkonzentration (O. Dbrings the dutcJi five transversely arranged plates 65 stationary state. The cell concentration (O. D

gleichmäßig in sechs Kammern unterteilt war. bei diesem Zustand und der Nudeinsäuregehalt :was evenly divided into six chambers. in this condition and the nucleic acid content:

Die Beimpfunp wurde mit 5 Volumprozent einer O. D. in den einzelnen Kammern sind in TabelleThe inoculation was 5 percent by volume of an O.D. in the individual chambers are shown in the table

Imnfkiiitur von I coli B-548. die IC Stunden cc- anccpcbcn. In Fip. 4 sind ebenfalls die ZcllciInfection of I coli B-548. the IC hours cc- anccpcbcn. In Fip. 4 are also the Zcllci

konzentrationen in einigen Kammern in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Veirweilzeit, zu Vergleichszwecken zusammen mit der Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Kultur, gezeigt.concentrations in some chambers depending on of the average residence time, for comparison purposes, together with the growth curve in discontinuous culture shown.

Tabelle IITable II Kammerchamber ZellenkonzentrationCell concentration NucleinsäureNucleic acid (vom Boden aus)(from the ground) (O. D.)(O. D.) J--RNS/O. D.J - RNS / O. D. Nr. 3No. 3 0,3100.310 15,015.0 Nr. 5No. 5 0,4920.492 10,010.0 Nr. 7No. 7 0,6980.698 8,38.3 Nr. 9No. 9 0,7920.792 8,08.0 Nr. 10No. 10 0,8100.810 7,97.9

Die obigen beiden Versuche 3 und 4 zeigen, daß die mehrstufige Fermentationsvorrichtung die folgenden Merkmale aufweist: Wenn Mikroorganismen in einem solchen Fermenter wie in Versuch 3 gezüchtet werden, wirkt jede Kammer als einzelner Fermenter, in welchem die Luft den oberen Teil des Raums angrenzend an die darüber befindliche Platte ausfüllt und hier als Kissen wirkt. Mit anderen Worten, das Medium innerhalb einer Kammer wird durch Belüftung gründlich gemischt, doch mischt es sich kaum mit dem Medium in den benachbarten Kammern. Die Gehalte an Zellen variieren daher zwischen den einzelnen Kammern.The above two experiments 3 and 4 show that the multi-stage fermentation apparatus does the following Features: When microorganisms are grown in such a fermenter as in Experiment 3 Each chamber acts as a single fermenter in which the air adjoins the upper part of the room fills the plate above and acts here as a pillow. In other words, that Medium within a chamber is thoroughly mixed by ventilation, but it hardly mixes with the medium in the neighboring chambers. The contents of cells therefore vary between the individual chambers.

Wird andererseits das Kulturmedium mit einer bestimmten Rate vom Boden des Fermenters aus eingeführt, d. h. die Fermentation kontinuierlich durchgeführt, so ist die Verteilung der Zellen etwas anders. Während das Medium in jeder Kammer gut gerührt und gemischt wird, bewegt sich eine gewisse Menge des Mediums, die der vom Boden aus einströmenden Menge entspricht, aufwärts von einer Kammer zu der nächsten durch die Löcher in der oberen Platte. Hierbei hindern Faktoren, wie die Reibung an der Platte, der Flüssigkeitsgehalt, die Belüftung u.dgl., das Medium am Aufströmen und bewirken so, daß die Luft den oberen Teil einer Kammer unter der oberen Platte ausfüllt, wie wenn alle Kammern gesondert, wie oben beschrieben, betrieben werden. Diese Bedingungen sind in F i g. 5 gezeigt. Die Aufwärtsströmung und Zufuhr des Mediums werden jedoch quantitativ durchgeführt. Wenn das Medium in jeder Kammer gründlich gemischt ist, nimmt die Strömung des Mediums als Ganzes die deutliche Form einer Kolbenströmung an. Das Medium wird so nach oben gedrückt und am oberen Ende des Fermenters quantitativ abgezogen. Das gleiche Prinzip kann auf den Betrieb mit einer Batterie von Fermentern, die in Reihe angeordnet sind, angewendet werden. If, on the other hand, the culture medium is introduced from the bottom of the fermenter at a certain rate, ie the fermentation is carried out continuously, the distribution of the cells is somewhat different. As the medium in each chamber is stirred and mixed well, an amount of medium equal to the amount flowing in from the bottom moves upward from one chamber to the next through the holes in the top plate. Here, factors such as the friction on the plate, the liquid content, the ventilation, etc. prevent the medium from flowing up and thus cause the air to fill the upper part of a chamber under the upper plate, as if all the chambers were separate, such as described above. These conditions are shown in FIG. 5 shown. However, the upward flow and supply of the medium are performed quantitatively. When the medium in each chamber is thoroughly mixed, the flow of the medium as a whole takes the distinct form of a piston flow. The medium is thus pushed upwards and drawn off quantitatively at the upper end of the fermenter. The same principle can be applied to battery operation of fermenters arranged in series.

Der Versuch 4 zeigt, daß, wenn das Wachstum den stationären Zustand erreicht, jede Kammer Zellen bei der durchschnittlichen Verweilzeit hält. Die Zellenkonzentration variiert daher mit den Kammern. Spezieller ausgedrückt erfolgt die Züchtung kontinuierlich unter solchen Bedingungen, daß die Zellen sich am Boden stets am Beginn ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, diejenigen in der Mitte in der Zwischenphase und diejenigen am oberen Ende in der Endphase, und zwar durch eine geeignete Kombination der Strömungsrate des Mediums mit der Zellenwachstumsrate. Wird ein gewünschtes Produkt bei dem Zellenwachstum oder bei einer gewissen Periode der Wachstumsphase gebildet, so tritt die unterschiedliche Verteilung der Produktkonzentration in der gleichen Weise auf. Run 4 shows that when the growth reaches steady state, each chamber will hold cells at the average residence time. The cell concentration therefore varies with the chambers. More specifically, the cultivation is carried out continuously under such conditions that the cells at the bottom are always at the beginning of their logarithmic growth phase, those in the middle in the intermediate phase and those at the top in the final phase by a suitable combination of the flow rate of the medium with the cell growth rate. If a desired product is formed during cell growth or during a certain period of the growth phase, the different distribution of the product concentration occurs in the same way.

Die Tatsache, daß der Unterschied in der Zellenkonzentration in den jeweiligen Kammern nicht nur auf physikalischen Faktoren beruht, wurde mittels der biologischen Aktivitäten von Zellen nachgewiesen, die aus den jeweiligen Kammern entnommen wurden,The fact that the difference in cell concentration in the respective chambers is not only is based on physical factors, has been demonstrated by means of the biological activities of cells, which were taken from the respective chambers,

ίο beispielsweise durch den Nucleinsäuregehalt der Zellen. Es ist wesentlich, daß beim Betrieb jeder Kammer als einzelne Fermentiervorrichtung in einem kontinuierlichen Verfahren das Verhältnis des Volumens der Kammer zu der Strömungsrate des Mediums. d. h. die Verdünnungsrate, die maximale spezifische Wachstumsrale des Mikroorganismus nicht übersteigt. Die aus dem Überlauf erhaltenen Zellen haben daher unter stationären Züchtungsbedingungen eine gewisse durchschnittliche Verweilzeit oder einίο, for example, by the nucleic acid content of the Cells. It is essential that when each chamber is operated as a single fermenter in one continuous process the ratio of the volume of the chamber to the flow rate of the medium. d. H. the dilution rate, not the maximum specific growth range of the microorganism exceeds. The cells obtained from the overflow therefore have under steady growth conditions a certain average residence time or a

ao gewisses Zellenalter. Je mehr der Fermenter unterteilt ist, um so mehr arbeitet das Gesamtverfahren nach einem perfekten Kolbenströmungsmuster und um so deutlicher wird das Muster des Zellenkonzentrationsgradienten. Dies kann sowohl theoretisch als auch experimentell nachgewiesen werden.ao certain cell age. The more the fermenter is divided, the more the overall process works after a perfect piston flow pattern and the more pronounced the pattern of the cell concentration gradient becomes. This can be proven both theoretically and experimentally.

Es wurde ein kontinuierliches Verfahren beschrieben, bei welchem das Medium vom Boden des Fermenters aus eingeführt wird, doch kann das gleiche Grundverfahren statt dessen auch umgekehrt unter Einführung des Mediums vom oberen Ende her ohne Einbuße der vorteilhaften Charakteristiken des bereits beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. In diesem zweiten Falle tritt die Verteilung der Zellen natürlich vom oberen Ende nach dem Boden zu auf.A continuous process has been described in which the medium is removed from the bottom of the fermenter from is introduced, but the same basic procedure can also be used vice versa instead Introducing the medium from the top end without sacrificing the beneficial characteristics of the already described procedure are carried out. In this second case, the distribution of cells occurs of course from the top to the bottom.

Bei anaerober Fermentation wird durch Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxyd, und im Verlaufe der Fermentation entwickelte Gasblasen der gleiche Effekt wie mit Luft oder Belüftung bei aerober Fermentation erzielt.In the case of anaerobic fermentation, inert gas, such as nitrogen or carbon dioxide, and in the course of fermentation gas bubbles developed the same effect as with air or aeration aerobic fermentation achieved.

Im folgenden wird die Erfindung beispielhaft erläutert. The invention is explained below by way of example.

example 1

Ein zylindrischer Fermenter mit einem Innendurchmesser von 6 cm und einer Höhe von 120 cm war durch vier quer angeordnete Platten in gleiche Teile unterteilt, wobei jede Platte mehrere Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm aufwies und das Öffnungsverhältnis 20%> ausmachte (vgl. Fig. 1). A cylindrical vessel with an inner diameter of 6 cm and a height of 120 cm was divided by four transverse plates in equal parts, each plate having a plurality of holes having mm with a diameter of 2 and the aperture ratio of 20%> constituted (see. Fig. 1).

Rohes technisches Naphthalin wurde in einer Menge von 10 Gewichtsprozent der Gesamtflüssigkeit in die zweite Kammer von unten eingeführt, und ein von Bakterien freies Züchtungsmedium, das 0,25 ⁰Zo Ammoniumchlorid, 2% Manganchlorid, 0,005 ^β,Ό Ferrosulfat und 0,05⁰O Calciumchlorid enthielt, wurde eingegossen, wonach die Kammer mit Pseudomonas aeruginosa Nr. B-344 beimpft wurde. Bei der Durchführung der Fermentation bei 30⁰C unter Belüftung mit einer linearen Geschwindigkeit von 8 cm/Sekunde gelangte eine gewisse Menge des in dieser Kammer vorhandenen festen Naphthalins durch die Löcher in den Platten in die benachbarten Kammern. Nach 36stündiger Fermentation waren 10,6 g Salicylsäure je Liter erzeugt. Diese Salicyl säure wird durch weitere Fermentation nicht vermin dert oder zersetzt. Crude technical naphthalene was introduced in an amount of 10 weight percent of the total liquid in the second chamber from below, and a free of bacterial growth medium containing 0.25 ⁰ Zo ammonium chloride, 2% manganese chloride, 0.005 ^β, Ό ferrous sulfate and 0.05 ⁰ O Calcium chloride was poured, after which the chamber was inoculated with Pseudomonas aeruginosa No. B-344. When the fermentation was carried out at 30 ^° C. with aeration at a linear speed of 8 cm / second, a certain amount of the solid naphthalene present in this chamber got through the holes in the plates into the adjacent chambers. After 36 hours of fermentation, 10.6 g of salicylic acid per liter had been produced. This salicylic acid is not reduced or broken down by further fermentation.

Nach beendeter Fermentation wurde die fermentierte Brühe vom Boden des Fermenters abgezogen,After the fermentation was finished, the fermented broth was drawn from the bottom of the fermenter,

und 85% des anfänglichen festen Naphthalins wurde in dem Fermenter gesammelt. Unter Verwendung dieses wiedergewonnenen Naphthalins und der Zellen, die in dem Fermenter geblieben waren, wurde ein weiterer Fermentationszyklus durch einfaches Einbringen der oben beschriebenen Minerallösung durchgeführt. Dieser Arbeitsgang wurde sechsmal wiederholt. and 85% of the initial solid naphthalene was collected in the fermenter. Under use this recovered naphthalene and the cells remaining in the fermenter became a Another fermentation cycle is carried out by simply adding the mineral solution described above. This operation was repeated six times.

Example 2

Ein Züchtungsmedium mit einem Gehalt von 10"« Glucose, 1% Harnstoff, 0,1 «Ό KR₁PO₄, 0,04»« MgSO₁ · 7 K₁O, 0,6% Maisquell wasser, 0,1 «Ό Hefeextrakt, 2 Teile je Million Fe⁺ + , 2 Teile je Million Mn⁺⁺ und 2 mg/1 Biotin wurde in den gleichen Fermenter wie in Beispiel 1 in der gleichen Weise eingebracht. Nach der Sterilisation wurde das Medium auf 30° C abgekühlt und mit der Impfkultur in einer Menge, die 3 Volumprozent des Mediums entsprach, beimpft, wobei die Impfkultur durch Züchtung von Corynebacterium gelatinosum Nr. 7183 in einem Medium erhalten war, das die gleiche Zusammensetzung, wie oben beschrieben, mit der einzigen Ausnahme hatte, daß der Glucosegehalt 8% betrug. Es wurde dann bei 30° C unter einer Belüftung von 200 bis 400 ecm je Minute gezüchtet. Nach 58 Stunden erreichte der Di.-Alanin-Gehalt in dem Medium 40 g/l. Die Anzahl der verwendeten Platten kann frei gewählt werden und beeinflußt selbst das Ergebnis des Arbeitsgangs im Falle dieses diskontinuierlichen Verfahrens nicht.A culture medium with a content of 10 "« glucose, 1% urea, 0.1 «Ό KR ₁ PO ₄ , 0.04» «MgSO ₁ · 7 K ₁ O, 0.6% corn steep liquor, 0.1« Ό Yeast extract, 2 parts per million Fe ⁺ +, 2 parts per million Mn ⁺⁺ and 2 mg / 1 biotin were introduced in the same manner in the same fermenter as in Example 1. After the sterilization, the medium was cooled to 30 ° C and inoculated with the inoculum in an amount equal to 3 percent by volume of the medium, the inoculum having been obtained by culturing Corynebacterium gelatinosum No. 7183 in a medium having the same composition as described above with the only exception that the Glucose content was 8%. Cultivation was then carried out at 30 ° C. with an aeration of 200 to 400 ecm per minute. After 58 hours, the di-alanine content in the medium reached 40 g / l. The number of plates used can be freely selected be chosen and influences itself the result of the operation in the case of this discontinuous Verfa not at all.

Ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung der gleichen Bestandteile und von fünf in gleichem Abstand quer in dem Fermenter angeordneten Platten wurde dann durchgeführt. ■''« des Gesamtvolumens des Mediums wurde je Stunde vom Boden des Fermenters aus eingebracht. In etwa 24 Stunden war der stationäre Zustand erreicht. Der Gehalt an Zellen und Alanin in dem Medium war in den jeweiligen Kammern verschieden. Beide Gehalte waren, wie festgestellt wurde, in der obersten Kammer am höchsten, nämlich 34 g/l Alanin und 9,2 O. D. Bakterienzellen. So betrug beispielsweise der Alaningehalt in den jeweiligen Kammern von unten nach oben: (1) 0,5 g/l, (2) 5 g/l, (3) 17 g/l, (4) 29 g/l, (5)34gl.A continuous process using the same ingredients and five in the same Spacing across plates in the fermenter was then carried out. ■ '' «of the total volume of the medium was introduced every hour from the bottom of the fermenter. That was in about 24 hours steady state reached. The contents of cells and alanine in the medium were in the respective Chambers different. It was found that both contents were in the uppermost chamber on highest, namely 34 g / l alanine and 9.2 O.D. bacterial cells. For example, the alanine content was in the respective chambers from bottom to top: (1) 0.5 g / l, (2) 5 g / l, (3) 17 g / l, (4) 29 g / l, (5) 34gl.

Example 3

Nach den in Beispiel I beschriebenen Arbeitsweisen wurde das Medium hergestellt und mit dem gleichen Bakterieninoculum beimpft Naphthalin wurde wie in Beispiel 4 verwendet.According to the procedures described in Example I, the medium was prepared and with the same bacterial inoculum inoculated naphthalene was used as in Example 4.

Nach 24stündiger Fermentation erreichte der SaIicylsäuregehaU in dem Medium 6,2 gi. Von diesem Zeitpunkt ab wurde eine sterilisierte anorganische Salzlösung vom Boden aus mittels einer Dosierpumpe eingeführt. Der Mengenanteil dieser Lösung zu der Gesamtflüssigkeit in dem Fermenter oder die Verdünnungsrate betrug ¹Zu je Stunde. Nach 40 Stunden vom Beginn des Verfahrens ab enthielt jede Kammer Bakterienzellcn und Salicylsäure, und der stationäre Zustand war erreicht. Die Menge an gebildeter Salicylsäure betrug von der Bodenkammer aus nach oben: (I) 0,8 g I. (2) 0,8 g/l. (3) 6,3 g/l und (4) 7,5 g/l. Der Gehalt in der vierten Kammer war mit dem Gehalt in der abgezogenen fermentierten Brühe identisch. Die Fermentation wurde kontinuierlich etwa 10 Tage durchgeführt, bis das feste Naphthalin in dem Fermenter vollständig verbraucht war.After fermentation for 24 hours, the salicylic acid content in the medium reached 6.2 gi. From this point on, a sterilized inorganic saline solution was introduced from the bottom by means of a metering pump. The proportion of this solution to the total liquid in the fermenter or the dilution rate was ¹ to per hour. After 40 hours from the start of the procedure, each chamber contained bacterial cells and salicylic acid and the steady state was reached. The amount of salicylic acid formed was from the bottom chamber upwards: (I) 0.8 g I. (2) 0.8 g / l. (3) 6.3 g / L and (4) 7.5 g / L. The content in the fourth chamber was identical to the content in the fermented broth drawn off. The fermentation was carried out continuously for about 10 days until the solid naphthalene in the fermenter was completely consumed.

Example 4

Ein säulenförmiger 5-1-Fermenter war in 6 Kammern unterteilt, wobei bei jeder Platte die Löcher 20% ihrer Gesamtfläche ausmachten und die Löcher jeweils einen Durchmesser von 2 mm aufwiesen. Die Einteilung war so, daß die erste Kammer (Bodenkammer) ein Volumen von 1,5 1 aufwies und die restlichen Kammern jeweils ein Volumen von 0,7 1 hatten. Unter Verwendung von Leichtöl wurde die Fermentation von Hefe (Candida lypolitica) und die Entparaffinierung durchgeführt.A 5-1 columnar fermenter was divided into 6 chambers, with holes on each plate 20% of their total area and the holes each had a diameter of 2 mm. the The division was such that the first chamber (bottom chamber) had a volume of 1.5 liters and the remaining ones Chambers each had a volume of 0.7 l. The fermentation was carried out using light oil of yeast (Candida lypolitica) and the dewaxing carried out.

100 Teile Medium (pH 4,5), das 3,0 g Ammoniumsulfat, ! ,0 g Kaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,1 g Hefeextrakt und oine kleine Menge an Spurenelementen je Liter enthielt, wurden mit 15 Teilen Leichtöl und 0,02 Teilen eines oberflächenaktiven Mittels so gemischt, daß eine stabile Emulsion gebildet wurde.100 parts of medium (pH 4.5) containing 3.0 g of ammonium sulfate, ! , 0 g potassium phosphate, 0.5 g magnesium sulfate, 0.1 g yeast extract and a small amount of trace elements per liter, 15 parts of light oil and 0.02 parts of a surface-active Mixed by means to form a stable emulsion.

Vor dieser Stufe wurde Candida lypolitica 35 Stunden in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben gezüchtet. 5 Volumprozent dieser Vorkultur von Candida lypolitica wurde zu dem obigen emulgierten Medium zugegeben und die Züchtung bei 28° C unter Belüftung mit einer Rate von 15 1 Minute durchgeführt.Prior to this stage, Candida lypolitica was left in a medium of the same composition for 35 hours bred as above. 5 percent by volume of this preculture of Candida lypolitica was emulsified into the above Medium added and cultivation at 28 ° C with aeration at a rate of 15 1 minute carried out.

Nach 24stündiger Fermentation wurde ein emulgiertes Medium, das mit 15 Teilen Leichtöl je 100 Teile Wasser gemischt war, vom Boden her mit einer Rate von 300 ml· Stunde eingeführt und so eine kontinuierliche Fermentation vorgenommen. Die fermentierte Brühe, die aus Hefezellen, nicht verwertetem Leichtöl und Wasser bestand und eine gewisse Verfilzen hatte, wurde fortschreitend am oberen Ende des Fermenters abgezogen.After fermentation for 24 hours, an emulsified medium containing 15 parts of light oil per 100 parts Water was mixed, introduced from the bottom at a rate of 300 ml · hour and so continuous Fermentation done. The fermented broth made from yeast cells, unused light oil and water persisted and some matting was progressively withdrawn from the top of the fermenter.

Nach Erreichen des stationären Zustands wurde aus jeder Kammer eine Probe der Brühe entnommen. Der Gehalt an Hefezellen und Leichtöl war der folgende: 1,6 g/l (Trockengewicht) Zellmasse und 14,0 Teile (Volumteile) ölschicht (je 100 Teile anfänglichem Wasser) in der ersten Kammer, 2,5 g 1 und 12,8 Teile in der dritten und 3,1 g/l und 11,5 Teile in der fünften. Die überfließende Brühe wurde nach bekannten Methoden in Zellkörper, entparaffiniertes Leichtöl und Wasser getrennt.After the steady state was reached, a sample of the broth was taken from each chamber. The content of yeast cells and light oil was as follows: 1.6 g / l (dry weight) cell mass and 14.0 Parts (parts by volume) of oil layer (per 100 parts of initial Water) in the first chamber, 2.5 g 1 and 12.8 parts in the third and 3.1 g / l and 11.5 parts in the fifth. The overflowing broth was dewaxed into cell bodies using known methods Light oil and water separated.

Example 5

5» In einem l-ermenter mit einem Innendurchmesset von 6,5 cm, der in 10 Kammern unterteilt war, wobei jede der Platten 100 Locher mit 2 mm Durchmesset aufwies, wurde die Produktion von Bakteriensporeti in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt5 “In a fermenter with an inside diameter of 6.5 cm, which was divided into 10 chambers, each of the plates having 100 holes 2 mm in diameter the production of bacterial spores was carried out in a continuous process

Als Impfkultur wurde auf einem Bouillonschräg· agar gelagerter Bacillus stearothermophilus ATCC 8005 in das Glucose-Bouillonmedium eingeimpft unti unter aeroben Bedingungen bei 55 C gezüchtet. Di« Hauptsporenproduktion wurde mit 5 VolumprozentThe seed culture used was Bacillus stearothermophilus ATCC stored on an agar slant 8005 inoculated into the glucose broth medium and grown under aerobic conditions at 55 ° C. Tue « Main spore production was at 5 volume percent

dieser Kultur begonnen. Das Gesamtvolumen betruf 4,01.started this culture. The total volume was 4.01.

Das Medium enthielt 6 g Glucose, Π g Hefe extrakt, 1 g KH,,PO₄, 0,! g MnSO₁ H₄O, 0,01 j FeSO₄^H₄O, 0,1g CaCl. und 11 destillierte Wasser. Nach 4 bis 5 Stunden wurde zusätzliche: Medium kontinuierlich am Boden des Fermenters it einer Menge von 360 ml/Stunde zugeführt. Die fer mentierte Brühe, uic Sporen enthielt, floß am oberetThe medium contained 6 g glucose, Π g yeast extract, 1 g KH ,, PO ₄ , 0 ,! g MnSO ₁ H ₄ O, 0.01 j FeSO ₄ ^ H ₄ O, 0.1 g CaCl. and 11 distilled water. After 4 to 5 hours, additional: medium was continuously fed to the bottom of the fermenter at a rate of 360 ml / hour. The fermented broth, which contained spores, flowed on the top

Ende über. Der Dipicolinsäuregehalt und die O. D. der Zellen in den jeweiligen Kammern erreichten den stationären Zustand. Die Zellenkonzentration erhöht sich gegen die oberen Kammern zu. In den unteren Kammern wurde keine Dipicolinsäure festgestellt, sondern nur in den Kammern oberhalb der sechsten. Der Dipicolinsäuregehalt wurde bei 60 v/ml gehalten. Dies ermöglichte, daß mehr als 80% der Gesamtzellen unter den Züchtungsbedingungen Sporen bilden. Die Sporen enthaltende Brühe wurde zentrifugiert, oder es wurden die Sporen aus der Sporensuspension durch die Schaumflotationsmethode gesammelt. End over. The dipicolinic acid content and the O.D. of the cells in the respective chambers reached the steady state. The cell concentration increases towards the upper chambers too. In the lower No dipicolinic acid was found in the chambers, only in the chambers above the sixth. The dipicolinic acid content was kept at 60 v / ml. This allowed more than 80% of the total cells Form spores under the cultivation conditions. The broth containing spores was centrifuged, or the spores were collected from the spore suspension by the foam flotation method.

Example 6

Unter Verwendung einer Kulturlösung von Escherichia coli IAM-1253, die in einem 2%> Glucose und 1 °/o Hefeextrakt enthaltenden Medium 24 Stunden bei 30° C gezüchtet worden waren, wurden Bakterienzellen konzentriert und/oder fraktioniert. Zu der obigen Kulturlösung wurden 0,2 g/l an Aluminiumsulfat und 40 mg/1 an Laurinsäure (Äthanollösung) zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 7,2 eingestellt und in einen zylindrischen mehrstufigen Fermenter mit einer Höhe von ! 20 cm und einem Durchmesser von 6 cm gegossen, der durch 10 Platten in 11 Kammern unterteilt war, wobei in jeder Platte die Löcher von 5 mm Durchmesser 11 °/o der gesamten Plattenfläche ausmachten. Luft wurde in den obigen Fermenter nach dessen Füllen mit dem Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 cm/ Sekunde eingeführt. Nach 25minütiger Belüftung wurde eine Probe der Lösung aus jeder Kammer entnommen, und die Anzahl der Zellen wurde darin bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Anzahl der Zellen in der obersten Kammer diejenige in der Bodenkammer um etwa das lOfache überstieg. Die Anzahl der Zellen in den dazwischenliegenden Kammern differierte stufenweise, von einer Kammer zur nächsten vom Boden aus nach oben ansteigend. Obgleich die Zellkörper in den verschiedenen Kammern durch ein Mikroskop nicht sichtbar waren, waren nicht bakterielle Festsubstanzen in den unteren Kammern sichtbar, deren Anzahl gegen den Boden zunahm. Die physiologischen Aktivitäten der aus den jeweiligen Kammern entnommenen Zellkörper wurden in Termen der Aktivität für die Substratoxydation einer Zelleneinheit mit Glucose als Substrat bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Werte. Die Gesamt-O. D./ml wurde durch Multiplizieren der optischen Dichte bei 610 πΐμ der verdünnten Probe mit der Anzahl der Verdünnungen erhalten. Sie betrug in allen Kammern vor der Belüftung 5,0. Nach Belüftung variierte sie jedoch von 1,0 am Boden bis 10,4 in der neunten Kammer.Using a culture solution of Escherichia coli IAM-1253 that is in a 2%> Medium containing glucose and 1% yeast extract had been grown for 24 hours at 30 ° C Bacterial cells concentrated and / or fractionated. To the above culture solution was added 0.2 g / l of aluminum sulfate and 40 mg / 1 of lauric acid (ethanol solution) added. The mixture was adjusted to pH 7.2 set and placed in a cylindrical multi-stage fermenter with a height of! 20 cm and one Poured diameter of 6 cm, which was divided by 10 plates into 11 chambers, in each of which Plate the holes of 5 mm in diameter 11% made up the entire surface of the plate. Air was in the above fermenter after filling it with the Mixture introduced at a rate of about 7 cm / second. After 25 minutes of ventilation A sample of the solution was taken from each chamber and the number of cells therein was recorded certainly. The results showed that the number of cells in the top chamber was that in the Exceeded the floor chamber by about ten times. The number of cells in the intervening chambers differed gradually, rising from one chamber to the next from the floor upwards. Although the cell bodies in the various chambers were not visible through a microscope, Bacterial solids were not visible in the lower chambers, their numbers against the floor increased. The physiological activities of the cell bodies removed from the respective chambers were in terms of the activity for the substrate oxidation of a cell unit with glucose as substrate certainly. The table below shows the values obtained. The overall O. D./ml was obtained by multiplying the optical density at 610 πΐμ the diluted Sample obtained with the number of dilutions. It was in all chambers before ventilation 5.0. After aeration, however, it varied from 1.0 in the bottom to 10.4 in the ninth chamber.

Die nachfolgende Tabelle zeigt auch die Anzahl der Zellen in jeder Kammer gegenüber der Gesamtanzahl an Zellen: 73⁰O der Gesamtanzahl der Zellen fanden sich in den Kammern 7 bis 10 und die restlichen 27 ⁰Zo in der ersten bis sechsten Kammer. Cj in der Tabelle, die Rate der Sauerstoffabsorption je Zelleneinheit, ist im Vergleich zu dem Wert in der ersten Kammer mit 1,00 als Basiswert angegeben. Es ist ersichtlich, daß die Aktivität in der ersten Kammer am niedrigsten ist und nach den oberen Kammern hin zunimmt.The following table also shows the number of cells in each chamber from the total number of cells: 73 ⁰ O is the total number of cells were found in the chambers 7 to 10 and the remaining 27 ⁰ Zo in the first to sixth chamber. Cj in the table, the rate of oxygen absorption per cell unit, is given as 1.00 as the base value compared to the value in the first chamber. It can be seen that the activity is lowest in the first chamber and increases towards the upper chambers.

Table III

Kammer
(vom Boden aus)chamber
(from the ground) O. D.
(610 πιμ)OD
(610 πιμ) Verteilung
der Zellendistribution
of cells 1,001.00 Nr. 1number 1 11 1,971.97 1,101.10 Nr. 3No. 3 2,12.1 4,134.13 1,301.30 Nr. 5 .No. 5. 3,83.8 7,487.48 1,381.38 Nr. 7No. 7 8,18.1 15,9515.95 1,501.50 Nr. 9No. 9 10,410.4 20,4720.47

Example 7

Ein Züchtungsmedium (pH 7,0), das 0,5 °/o Glucose, l,3»/o Hefeextrakt, 0,1 ".Ό KR₁PO₄, 0,01 «/■> MnSO₄ ■ H₂O, 0,001 % FeSO₄ · 7 H₂O"und 0,005«,. MgSO₄ · 7 H..O enthielt, wurde mit Bacillus subtilis IAM/1214 beimpft und unter Belüftungsbewegung 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Nach dieser Zeitspanne waren 1,9 -1O¹VcCm Sporen aus insgesamtA culture medium (pH 7.0) containing 0.5% glucose, 1.3% yeast extract, 0.1 ". KR ₁ PO ₄ , 0.01" / ■> MnSO ₄ ■ H ₂ O , 0.001% FeSO ₄ · 7 H ₂ O "and 0.005". MgSO ₄ · 7 H..O. was inoculated with Bacillus subtilis IAM / 1214 and cultured with aeration agitation for 24 hours at 30 ° C. After this period were 1.9 -1O ¹ Vccm spores interesting

2.1 ■ 10⁹/ccm Zellen gebildet. 2 1 der obigen Lösung, in der die Sporen und vegetativen Zellen des obigen Stammes gemischt waren, wurden in einen mehrstufigen Fermenter mit einem Volumen von 3,2 1 eingebracht, der durch 8 Platten (bei denen die Löcher von jeweils 4 mm Durchmesser 16^u/o ihrer Gesamtfläche ausmachten) in 9 Kammern unterteilt war. Die Luft wurde durch eine Belüftungsdüse am Boden mit einer Rate von 4 l/Minute eingeführt. Bei einem pH-Wert von 7,3 und einer Temperatur von 28° C begann das Schäumen in den Kammern, und es wurde2.1 ■ 10 ⁹ / ccm cells formed. 2 liters of the above solution, in which the spores and vegetative cells of the above strain were mixed, were placed in a multi-stage fermenter with a volume of 3.2 liters, which was filled by 8 plates (in which the holes of 4 mm in diameter each were 16 ^u / o their total area) was divided into 9 chambers. The air was introduced through an air vent on the floor at a rate of 4 liters / minute. At a pH of 7.3 and a temperature of 28 ° C, the chambers began to foam and it became

unmittelbar unterhalb von jeder Platte ein fortgeschrittenes Schäumen beobachtet. Die Luftmenge wurde alle 5 Minuten um 0,5 l/Minute erhöht, bis schließlich 19 l/Minute erreicht waren. Hierdurch wurde das Volumen der Schaumschichten an den fortgeschrittenen Stellen erhöht, so daß eine gewisse Menge der Kulturlösung in jeder Kammer gehalter wurde. Nach 120minütiger Belüftung unter der obigen Bedingungen wurde die Anzahl der Sporer für die oberen beiden und unteren beiden Kämmen bestimmt: 1,1 ■ 10¹⁰/ccm und 1,0· 10^I0/ccm für di< beiden oberen Kammern und 2 · 10⁷/ccm un<advanced foaming was observed immediately below each plate. The amount of air was increased by 0.5 l / minute every 5 minutes until it finally reached 19 l / minute. This increased the volume of the foam layers at the advanced points so that a certain amount of the culture solution was retained in each chamber. After 120minütiger ventilation under the above conditions, the number of Sporer for the top two and bottom two combs was determined: 1.1 ■ 10 ¹⁰ / cc and 1.0 × 10 ^I0 / cc for di <two upper chambers and 2 × 10 ⁷ / ccm un <

1.2 · l0⁷/ccm für die beiden unteren Kammern. Mi anderen Worten 7«gen die obigen Ergebnisse, dal etwa 90 ⁰O oder mehr der Gesamtsporen in dei oberen beiden Kammern gesammelt waren. Sie zeigei auch, daß, da die Anzahl der Zellen in den jeweilige! Kammern sich nicht stark unterschied, die Anzah der Sporen je Anzahl der Zellen in diesen oberei Kammern beträchtlich erhöht war. Die Flüssigkeit ii diesen Kammern wurde abgezogen und als Sporen suspension verwende!.1.2 · l0 ⁷ / ccm for the two lower chambers. Mi other words, 7 "were collected two chambers gen, the above results dal about 90 ⁰ O or more of the total spores top in dei. They also show that, since the number of cells in the respective! Chambers did not differ greatly; the number of spores per number of cells in these upper chambers was considerably increased. The liquid in these chambers was drawn off and used as a spore suspension.

Hierzu 4 Blatt ZeichnungenFor this purpose 4 sheets of drawings

Claims

Patent claims:

1. Multi-stage fermentation process in a fermentation tower divided into chambers by perforated plates, which has an air supply from the bottom, characterized in that the air to achieve a free space in the upper Part of each chamber is directed.

2. Veifahren according to claim 1, characterized in that that in the formation of the free space in the upper part, each chamber a nutrient medium is passed up through the fermentation tower with ventilation from the bottom of the fermentation tower.

3. The method according to claim 2, characterized in that the nutrient medium is continuous is fed.

4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the nutrient medium component at least one petroleum product is used.