DE1642653B2

DE1642653B2 - Multi-stage fermentation process

Info

Publication number: DE1642653B2
Application number: DE1642653A
Authority: DE
Inventors: Atsuo Kamakura Kitai; Asaichiro Tokio Ozaki; Hiroshi Fujusawa Kanagawa Tone
Original assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKIO
Current assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKIO
Priority date: 1966-10-06
Filing date: 1967-10-06
Publication date: 1974-07-25
Also published as: DE2037903B2; DE2037903A1; DE2037903C3; DE1642653C3; DE1642653A1

Description

Die Erfindung betrifft ein mehrstufiges Gärverfahren in einem durch perforierte Platten in Kammern geteilten Gärturm, der eine Luftzufuhr vom Boden aus aufweist.The invention relates to a multi-stage fermentation process in one through perforated plates in chambers split fermentation tower, which has an air supply from the ground.

Aus der DT-AS 1 207 324 ist eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Vergären von Würze bekannt, bei der über die Höhe eines Gärturms verteilt sich über den Querschnitt erstreckende perforierte Verteilerelemente vorgesehen sind, welche die mit der Würze unten zugeführte Luft über den Querschnitt des Gärturms zur Erzielung einer gleichmäßigen Strömungsgeschwindigkeit verteilen und die Ausbildung größerer Gasblasen verhindern. Demgegenüber geht die Erfindung von mehreren getrennt arbeitenden Gärkammern aus, die in Reihe geschaltet sind.A device for the continuous fermentation of wort is known from DT-AS 1 207 324, in the case of the perforated distributor elements extending over the cross section over the height of a fermentation tower are provided, which the air supplied with the wort below over the cross-section of the fermentation tower to achieve a uniform flow rate and distribute the training Prevent larger gas bubbles. In contrast, the invention is based on several working separately Fermentation chambers that are connected in series.

Die mikrobiologische Fermentation wird industriell gewöhnlich diskontinuierlich durchgeführt. Kontinuierliche Verfahrensweisen wurden entweder mit einer einzigen Gärvorrichtung oder mehreren in Reihe angeordneten Gärvorrichtungen angestrebt, jedoch wurde keine Verfahrenstechnik so weit entwickelt, daß sie für technische Zwecke besonders geeignet wäre. Allgemein wird ein kontinuierliches Verfahren mit einer einzigen Gärvorrichtung im Falle der mit Wachstum verbundenen Fermentation durchgeführt, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts zusammen mit dem Wachstum des Mikroorganismus in dem Kulturmedium stattfindet. Im Falle von nicht mit Wachstum verbundener Fermentation, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts nicht mit dem Wachstum des Mikroorganismus erfolgt, sondern nach Beendigung des mikrobiellen Wachstums stattfindet, muß die kontinuierliche Fermentation mit mehr als zwei Gärvorrichtungen durchgeführt werden, wobei in jeder eine besondere Züchtungsphase, die von der anderen verschieden ist, vorgenommen wird, so daß das inikrobielle Wachstum und die Produktbildung während des Verfahrens getrennt stattfinden. Dies erfordert jedoch zusätzliche Einrichtungen, wie beispielsweise ein Belüftungssystem, eine Vorrichtung zum Durchmischen, eine Dosierpumpe mit einer Kapazität, die der Anzahl der verwendeten Gärvorrichtungen proportional ist, und dergleichen. Beim Einsatz im technischen Mabstab ist die zur Durchführung dieses Verfahrens auf der Basis eines stationären Zustands erforderli he Anlage sehr kostspielig.The microbiological fermentation is usually carried out discontinuously industrially. Continuous Procedures were carried out with either a single fermenter or several in series Aimed for fermentation devices, but no process technology has been developed so far that it would be particularly suitable for technical purposes. Generally it will be a continuous process carried out with a single fermenter in the case of fermentation associated with growth, in which the formation of a desired product along with the growth of the microorganism in the culture medium takes place. In the case of non-growth fermentation in which the Formation of a desired product does not occur with the growth of the microorganism, but rather After the microbial growth has ceased, continuous fermentation must take place more than two fermenters are carried out, each with a special cultivation phase, the different from the other, is made so that the microbial growth and product formation take place separately during the proceedings. However, this requires additional facilities, such as for example a ventilation system, a device for mixing, a metering pump with a capacity, which is proportional to the number of fermenters used, and the like. When using on a technical scale is the one to carry out this procedure on the basis of a stationary State of the art required system very expensive.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrstufiges Gärverfahren der eingangs angegebenen Art so zu vereinfachen, daß es bei minimalem Kostenaufwand in technischem Maßstab eingesetzt werden kann.
Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurchThe invention is based on the object of simplifying a multi-stage fermentation process of the type specified at the beginning in such a way that it can be used on an industrial scale at minimal cost.
This object is achieved according to the invention

jo gelöst, daß die Luft zur Erzielung eines freien Raumes im oberen Teil jeder Kammer des Gärturms geleitet wird. Damit wird eine Luftschicht unter jeder perforierten Platte aufrechterhalten, die eine freie Durchmischung der Flüssigkeit zwischen den einzel-jo solved that the air to achieve a free space in the upper part of each chamber of the fermentation tower is directed. This maintains a layer of air under each perforated plate, which is a free one Mixing of the liquid between the individual

nen Kammern verhindert, so daß jede Kammer wie ein unabhängiger Fermenter arbeitet.Nen chambers prevented so that each chamber works like an independent fermenter.

Durch diese Verfahrensweise kann nicht nur diskontinuierlich und kontinuierlich gearbeitet werden, sondern es kann auch eine synchrone Züchtung undThis procedure not only allows discontinuous and continuous work, but it can also be a synchronous breeding and

»ο Gewinnung von Zellen sehr wirksam vorgenommen werden. Gegenüber den bekannten kontinuierlichen Verfahren ergeben sich eine Reihe von Vorteilen. Die zur Durchführung des Verfahrens erforderliche Vorrichtung ist in ihrem Aufbau äußerst einfach, es»Ο Extraction of cells done very effectively will. There are a number of advantages over the known continuous processes. The device required to carry out the method is extremely simple in structure, it

ist keine Einrichtung zum Durchmischen notwendig, da die Flüssigkeit durch Belüftung gut gerührt wird, und es ist keine Pumpe zum Überführen der Brühe von einem Gefäß zu einem anderen erforderlich. Der Betrieb ist einfach und leicht zu automatisieren, und der stationäre Zustand kann ohne Schwierigkeiten aufrechterhalten werden. Das Kühlen und Erhitzen erfolgt mit hohem Wirkungsgrad aufgrund der großen Wärmeübergangsfläche je Einheit Innenvolumen. Wird ein festes Substratmaterial bei der Fermentation verwendet (im (olgenden als »Feststoff-Fermentation« bezeichnet), so werden die dispergierten Feststoffteilchen in dem Gärturm durch den Beirieb der Vorrichtung gehalten, wodurch gewöhnlich eine gute Ausbeute im Verhältnis zu dem eingesetzten Rohmaterial erzielt wird, da wenig Materialverlust durch den Überlauf der Flüssigkeit auftritt. Bei der Feststoff-Fermentation ist es weder erforderlich, das Material zu pulverisieren noch ein Lösungsmittel zu verwenden, das für den Mikroorganismus schädlich sein kann. Ferner kann bei einem kontinuierlichen Betrieb das Zellenalter in der abgezogenen fermentierten Brühe enger in Beziehung zu der durchschnittlichen Verweilzeit gehalten werden als bei einem einzigen Rührbehälter, bei welchem das Zellenalter in der fermentierten Brühe zwischen Null und Unendlich liegt.no device for mixing is necessary, as the liquid is stirred well by aeration, and no pump is required to transfer the broth from one vessel to another. Of the Operation is simple and easy to automate, and steady-state can be done without difficulty be maintained. The cooling and heating takes place with high efficiency due to the large Heat transfer area per unit of internal volume. Becomes a solid substrate material during fermentation (hereinafter referred to as "solid fermentation"), the dispersed solid particles are used kept in the fermentation tower by the operation of the device, which usually gives a good yield is achieved in relation to the raw material used, since little material loss due to the Liquid overflow occurs. In the solid fermentation it is not necessary to use the material to pulverize nor to use a solvent that can be harmful to the microorganism can. Furthermore, in the case of continuous operation, the cell age in the withdrawn fermented Broth can be held more closely related to the average residence time than with a single one A stirred tank in which the cell age in the fermented broth is between zero and infinity lies.

Zweckmäßige Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben. Anhand der Zeichnungen wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise näher erläutert. Es zeigtAppropriate refinements of the method are given in the subclaims. Based on Drawings the method according to the invention is explained in more detail, for example. It shows

Fig. 1 einen Längsschnitt durch einen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten mehrstufigen Fermenter,1 shows a longitudinal section through a multistage used for the method according to the invention Fermenter,

F i g. 2 eine Drautsicht auf eine zwischen den einzelnen Kammern angeordnete perforierte Platte, F i g. 3 einen Längsschnitt durch eine andere Ausführungsform eines Fermenters,F i g. 2 a top view of a perforated plate arranged between the individual chambers, F i g. 3 shows a longitudinal section through another embodiment of a fermenter,

F i g. 4 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Zellenkonzentration und der durchschnittlichen Verweilzeit in jeder Kammer im Vergleich zu einer Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Züchtung gemäß Versuch 4, die zeigt, daß die Zellenkonzentration bei einem kontinuierlichen Ver-F i g. Fig. 4 is a graph showing the relationship between cell concentration and average Residence time in each chamber compared to a discontinuous growth curve Cultivation according to experiment 4, which shows that the cell concentration in a continuous process

fahren unter Verwendung des Mehrstufenfermenters gemäß der nachfolgend beschriebenen Art einen stationären Zustand erreicht,drive using the multi-stage fermenter according to the type described below steady state reached,

F i g. 5 den Betriebszustand innerhalb jeder Kammer des Fermenters, wenn das Kulturmedium sich in der Fermentation befindet,F i g. 5 the operating status within each chamber of the fermenter when the culture medium is in the fermentation is located,

Fig. 6 die Gesamtströmungscharakteristiken des Fermenters in bezug auf verschiedene Kombinationen von Lochdurchmesser einer Platte mit dem Verhältnis des öflnungsquerschnitts jeder Platte /u dem Gesamtquerschnitt dieser Platte unter Verwendung von gewöhnlichem Wasser gemäß Versuch 1 undFig. 6 shows the overall flow characteristics of the Fermenter with respect to various combinations of hole diameter of a plate with the ratio of the opening cross-section of each plate / u dem Total cross-section of this plate using ordinary water according to experiment 1 and

F i g. 7 ebenfalls die Gesamtströmungscharakteristiken eines Fermenters in bezug auf verschiedene Kombinationen des Lochdurchmessers einer Platte mit dem Verhältnis des öffnungsquerschnitts jeder Platte zu dem Gesamtquerschnitt der Platte unter Verwendung einer tatsächlichen fermentierten Brühe gemäß Versuch 2.F i g. 7 also shows the overall flow characteristics of a fermenter in relation to various ones Combinations of the hole diameter of a plate with the ratio of the opening cross-section of each plate to the total cross-section of the plate below Use of an actual fermented broth according to experiment 2.

Es sei nun auf Fig. 1 Beiug genommen, die im Vertikalschnitt einen zylindrischen mehrstufigen Ferroenier zeigt, der aus vier Kammern 1 besteht, die übereinander mit den Platten 2 als Trennwandungen angeordnet sind. F i g. 2 zeigt die Oberfläche einer Platte. Jede Kammer kann mit einer Temperaturrcguliereinrichtung, wie beispielsweise einem Mantel 3 und einer elektrischen Heizung, ausgestattet sein, und das Kopfstück S sowie der Boden 6 sind mit einem Paiir von Rohren 4 verbunden, die das Einströmen und Abfließen von Luft bzw. Medium ermöglichen. Diese Rohre können direkt an die Kammern angeschlossen sein, und in diesem Falle sind Abschlußtcile 5 und 6 nicht erforderlich.It is now taken to Fig. 1 Beiug that in Vertical section of a cylindrical multistage ferroenier shows, which consists of four chambers 1, one above the other with the plates 2 as partition walls are arranged. F i g. 2 shows the surface of a plate. Each chamber can be equipped with a temperature regulating device, such as a jacket 3 and an electric heater, and the head piece S and the bottom 6 are with a Paiir connected by pipes 4, which allow the inflow and outflow of air or medium. These pipes can be connected directly to the chambers, in which case they are end pieces 5 and 6 not required.

Der Fermenter weist gewöhnlich eine Anzahl von Kammern von einheitlicher Form und Größe auf, die übereinander angeordnet sind, doch kann er auch Kamnern, die in Form und Größe verschieden sind, aufweisen. Die Hauptsache ist, daß der Fermenter durch eine Platte oder Platten unterteilt ist, von denen jede zumindest eine Öffnung aufweist. Die Größe, Höhe und Breite des Fermenters können daher frei gewählt werden, und die Form der Kammer kann teilkugelig, wie in F i g. 3 gezeigt, oder oval oder kubisch sein. Es ist besser, daß der Gesamtaufbau eines solchen Fermenters, wenn alle Kammern verbunden sind, ein langgestreckter ist. Bei einer speziellen Ausführungsform des Fermenters, wie er in den in einigen der folgenden Beispiele beschriebenen Versuchen verwendet wurde, weist jede Kammer eine Höhe von 12 cm und einen Durchmesser vonThe fermenter usually has a number of chambers of uniform shape and size, the are arranged one above the other, but it can also have chambers that are different in shape and size, exhibit. The main thing is that the fermenter is divided by a plate or plates, of each of which has at least one opening. The size, height and width of the fermenter can be can therefore be chosen freely, and the shape of the chamber can be partially spherical, as in FIG. 3 shown, or oval or be cubic. It is better that the overall structure of such a fermenter if all the chambers connected, is an elongated one. In a special embodiment of the fermenter, like him used in the experiments described in some of the following examples, each chamber has a height of 12 cm and a diameter of

7 cm auf; jede Platte hat 100 Löcher von 2 mm Durchmesser, und die Gesamtquerschnittsfläche, die von den Löchern eingenommen wird, beträgt etwa7 cm up; each plate has 100 holes of 2 mm in diameter, and the total cross-sectional area that occupied by the holes is approximately

8 bis 10°/o der Gesamtquerschnittsfläche der Platte. Die hier angegebenen Werte sind lediglich ein Beispiel für die Beziehung des Lochdurchmessers mit dem Öffnungsverhältnis einer Platte zur Gesamtplattenquerschnittsfläche. Die Kombination dieser Größen variiert, wie im folgenden noch erörtert wird, in einem weiten Bereich.8 to 10 per cent of the total cross-sectional area of the plate. The values given here are just an example of the relationship between hole diameter and the aperture ratio of a plate to the total plate cross-sectional area. The combination of these quantities varies over a wide range, as will be discussed below.

Die Gehäuseteile können aus Metall, Glas oder Kunststoff gefertigt sein. Ein transparentes Material ist jedoch zweckmäßig, da das Innere des Fermenters während des Betriebs dann sichtbar ist. Das Material, aus dem die Platten gefertigt sind, ist ebenfalls frei wählbar, doch sollten die Bestandteile des Mediums und das infolge der Fermentation erzeugte Produkt, die auf das Plattenniaterial wirken und dieses korrodieren können, in Betracht gezogen werden. Manchmal werden Drahtgcwebeplatten oder poröse oder perforierte Platten verwendet. Die Größe von jedem Loch und die Anzahl der Löcher (Öffnungsquerschnittsfläche) werden durch solche Faktoren, wie Größe des Fermenters und Art der gewünschten mikrowellen Reaktion, bestimmt. Die Anzahl der Kammern wird durch die besten Bedingungen vom Standpunkt solcher Faktoren, wie gewünschter Fermentationstyp, Höhe und Volumen des Fermenters, Belüftungssystem, Druckabfall u. dgl., bestimmt. Jede eingesetzte Platte kann mit den Flanschen der Gehäuseteile mit Dichtungen dazwischen verschraubt sein. Probeentnahme-, Beschickungs- und/oder Abzugsleitungen oder Hähne 7, die an einzelnen Kammern montiert sind, sind ebenfalls zur Kontrolle und Steuerung der Fermentation nützlich, da sie den Austritt oder Eintritt von flüssigem Inhalt ermöglichen. Ein Luftfilter ist wie bei den üblichen Fermentern vorgesehen. Schließlich kann dieser mehrstufige Fermenter entweder allein oder in einer Gruppe verwendet werden.The housing parts can be made of metal, glass or plastic. A transparent material however, it is useful because the inside of the fermenter is then visible during operation. The material, from which the plates are made can also be freely selected, but the components of the medium should and the product produced as a result of fermentation, which act on and corrode the plate material can be considered. Sometimes wire mesh panels or porous or perforated plates used. The size of each hole and the number of holes (opening cross-sectional area) are determined by such factors as the size of the fermenter and the type of microwave response desired. The number of Chambers is determined by the best conditions from the point of view of such factors as desired type of fermentation, The height and volume of the fermenter, ventilation system, pressure drop and the like are determined. Every Inserted plate can be screwed to the flanges of the housing parts with seals in between be. Sampling, charging and / or discharge lines or taps 7, which are attached to individual chambers are also useful for monitoring and controlling the fermentation, as they are the outlet or allow entry of liquid content. An air filter is like the usual fermenters intended. Finally, this multi-stage fermenter can be used either alone or in a group will.

Spezielle Merkmale dieser Fermentationsvorrichtung, wie sie oben beschrieben wurde, sind aus den folgenden Versuchen ersichtlich.Specific features of this fermentation device, as described above, are from following experiments.

Versuch 1Attempt 1

Die Wirkung der Plattenbeschaffenheit, d. h. des Durchmessers der Löcher und des Verhältnisses der perforierten Querschnittsfläche jeder Platte zur Gesamtquerschnittsfläche dieser Platte, auf die Strömungscharakteristiken der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Fermentalionsvorrichtung wurde untersucht. Die Vorrichtung war, wie in F i g. 1 gezeigt, mit perforierten Platten in vier Kammern unterteilt, von denen jede einen Durchmesser von 7 cm und eine Höhe von 12 cm aufwies. Wasser wurde mit einer Rate von 6 1 je Stunde in diese Vorrichtung vom Boden aus eingepumpt und floß von der obersten Kammer ab. Andererseits wurde Luft vom Boden durch die an diesem angebrachte Düse mit einer Rate von 10 1 je Minute zugeführt.The effect of the plate texture, i.e. H. the diameter of the holes and the ratio of the perforated cross-sectional area of each plate to the total cross-sectional area of this plate, on the flow characteristics the fermentation device used for the process according to the invention was examined. The device was, as in FIG. 1 shown, with perforated plates divided into four chambers, each of which has a diameter of 7 cm and a height of 12 cm. Water was poured into this device at a rate of 6 liters per hour Pumped in from the bottom and drained from the top chamber. On the other hand there was air fed from the ground through the nozzle attached to this at a rate of 10 1 per minute.

Wenn die Luft und die Flüssigkeit in stationärem Zustand strömten, wurde eine Tracer-Lösung von dem Wassereinlaß aus durch o-funktionelles Einspritzen eingeführt. Die Änderung der Tracer-Konzentration wurde in bestimmten Zeitabständen am Auslaß dieser Vorrichtung bestimmt, und es wurde so eine Empfindlichkeitskurve, d. h. Empfindlichkeit gegen Störung, erhalten. Die Gesamtströmungscharakteristiken wurden durch die entsprechenden Zahlen der in Reihe angeordneten Behälter ausgedrückt, wie es in F i g. 6 gezeigt ist. Wenn jede Kammer der Vorrichtung sich unabhängig von den anderen in dem stationären Zustand mit Belüftung befindet, so wäre die entsprechende Anzahl von in Reihe angeordneten Behältern vier. Wenn jedoch irgendein Rückmischen unter den Kammern stattfindet, so wäre die Anzahl weniger als vier. Dies bedeutet, daß sich ein vorstehend beschriebener mehrstufiger Fermenter in der gleichen Weise verhäl¹ wie die entsprechende Anzahl von in Serie angeordneten Behältern mit gleichem Volumen.When the air and liquid flowed in the steady state, a tracer solution was introduced from the water inlet by o-functional injection. The change in tracer concentration was determined at certain time intervals at the outlet of this device, and a sensitivity curve, ie sensitivity to disturbance, was thus obtained. The overall flow characteristics were expressed by the corresponding numbers of the containers arranged in series, as shown in FIG. 6 is shown. If each chamber of the apparatus were in the stationary, ventilated condition independently of the others, the corresponding number of containers in series would be four. However, if there was any backmixing among the chambers the number would be less than four. This means that an above-described multi-stage fermenter in the same manner verhäl ¹ as the appropriate number of containers arranged in series with the same volume.

Unter Verwendung der Platten mit Löchern mi 2 mm Durchmesser und einem Verhältnis von Ge samtlochquerschnittsfläche in jeder Platte zur Ge samtplattenquerschnittsfläche im Bereich von 1 bi 30% wurde das Verhalten des Fermenters nichUsing the plates with holes 2 mm in diameter and a ratio of Ge total hole cross-sectional area in each plate to the total plate cross-sectional area in the range of 1 bi The behavior of the fermenter was not 30%

beeinflußt. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 3 mm sollte jedoch das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität in dem Fermenter aufrechtzuerhalten. Aus diesem Versuch ist zu schließen, daß sehr komplizierte Beziehungen zwischen dem Lochdurchmesser und dem Verhältnis der perforierten Querschnittsfläche einer Platte zu der Gesamtquerschnittsfläche dieser Platte existieren, um einei optimalen Zustand für die Kombination von beiden zu erzielen. Der obige Versuch beruhte auf dem reinen Wasser-Luft-System, und die Situation wird daher durch das verwendete System weitgehend beeinflußt. influenced. However, if the hole diameter is larger than 3 mm, the aperture ratio should be smaller to maintain heterogeneity in the fermenter. From this attempt it can be concluded that very complicated relationships between the hole diameter and the ratio of perforated Cross-sectional area of a plate to the total cross-sectional area of this plate exist to ai to achieve optimal condition for the combination of both. The above attempt was based on that pure water-air system, and the situation is therefore largely influenced by the system used.

Versuch 2Attempt 2

Die Wirkung der Plaltenbeschaffenheit, wie sie in Versuch 1 beschrieben ist, auf die Strömungscharakteristiken eines vorstehend beschriebenen Fermenters wurde untersucht, wobei dieses Mal eine Fermentationsbrühe verwendet wurde.The effect of the pleat quality, as described in Experiment 1, on the flow characteristics of a fermenter described above was examined, this time a fermentation broth was used.

Xanthomonas campestoris B-324 wurde bei 30° C zwei Tage lang in einem Medium gezüchtet, das 3 °/o Glucose, 0,2% Pepton, 0,2°.ο Fumarsäure, 0,2°/ο ΚΗ_ΛΡΟ₄, 0,2Vo Na₂CO₃ und 0,05 «Ό MgSO₄ ■ 7H₂O enthielt und mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt war. Die oben erhaltene viskose Kulturbrühe wurde zur Bestimmung der Strömungscharakteristiken dieses Fermentes in der gleichen Weise, wie in Versuch 1 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.Xanthomonas campestoris B-324 was grown at 30 ° C for two days in a medium containing 3% glucose, 0.2% peptone, 0.2 ° .ο fumaric acid, 0.2 ° / ο ΚΗ _Λ ΡΟ ₄ , 0.2Vo Na ₂ CO ₃ and 0.05% MgSO ₄ · 7H ₂ O and was adjusted to pH 6.0 with NaOH. The viscous culture broth obtained above was used to determine the flow characteristics of this ferment in the same manner as described in Experiment 1. The results are shown in FIG.

Unter Verwendung der Platten mit Löchern mit 5 mm Durchmesser und einem Öffnungsverhältnis in jeder Platte im Bereich von 1 bis 4O°/o wurde die Heterogenität in dem Fermenter völlig aufrechterhalten. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 8 mm sollte dagegen das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität aufrechtzuerhalten.Using the plates with holes 5 mm in diameter and an aperture ratio in each plate in the range 1 to 40% heterogeneity was fully maintained in the fermenter. With a hole diameter of more than 8 mm, on the other hand, the aperture ratio should be smaller be to maintain heterogeneity.

Aus den obigen Versuchen 1 und 2 ist ersichtlich, daß eine solche Beziehung eine komplizierte Funktion der Flüssigkeitseigenschaften, wie Dichte, Viskosität und Oberflächenspannung, der Belüftungsrate, der Flüssigkeitsströmungsrate, des Abstands von einer Platte zu einer anderen, des Durchmessers einer Platte (der Größe des Fermenters) usw. ist. Die Wahl der Platte bezüglich der obigen Kombination von Lochdurchmesser und Öffnungsverhältnis hängt auch von dem Fermentationsobjekt ab. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Faktoren sollte die optimale Beschaffenheit einer Platte individuell bei jedem Versuch vor dem tatsächlichen Einsatz des Fermenters bestimmt werden. Es ist zwar sehr schwierig, solche Plattenbeschaffenheiten zu verallgemeinern, doch liegt die am häufigsten angewendete Kombination im Bereich zwischen 1 und 20 mm bezüglich des Durchmessers der Löcher und 1 und 40°/« bezüglich des Öffnungsverhältnisses.It can be seen from Experiments 1 and 2 above that such a relationship has a complicated function the liquid properties, such as density, viscosity and surface tension, the aeration rate, the liquid flow rate, the distance from one plate to another, the diameter of a Plate (the size of the fermenter) etc. is. The choice of plate related to the above combination of Hole diameter and aperture ratio also depend on the fermentation object. Considering the factors described above should contribute to the optimal texture of a panel must be determined for each experiment before the fermenter is actually used. Although it is very difficult to generalize such plate textures, but lies the most commonly used combination in the range between 1 and 20 mm with respect to the diameter of the holes and 1 and 40 ° / «with respect the aperture ratio.

Versuch 3Attempt 3

Ein Züchtungsmedium (pH 7,0), das je Liter 1 g Glucose, 0,5 g Hefeextrakt, 5,0 g NH₄CI, 1,0 g NH₄NO₃, 2,0 g Na,SO₄, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 3.0 g K₂HPO₄ und 1,Og^-KH₂PO₄ enthielt, wurde in einen zylinderförmigen Fermenter mit einer Höhe von 130 cm und einem Durchmesser von 7 cm eingebracht, der durch fünf quer angeordnete Platten gleichmäßig in sechs Kammern unterteilt war.A culture medium (pH 7.0) containing 1 g of glucose, 0.5 g of yeast extract, 5.0 g of NH ₄ CI, 1.0 g of NH ₄ NO ₃ , 2.0 g of Na, SO ₄ , 0, 1 g of MgSO ₄ · 7 H ₂ O, 3.0 g of K ₂ HPO ₄ and 1, Og ^- KH ₂ PO ₄ containing, was placed in a cylindrical fermenter with a height of 130 cm and a diameter of 7 cm, the through five transversely arranged plates was evenly divided into six chambers.

Die Beimpfung wurde mit 5 Volumprozent einer Impfkultur von E. coli B-548, die 18 Stunden gezüchtet worden war, vorgenommen. Die zugeführte Luft strömte mit einer linearen Geschwindigkeit von 7 cm/Sekunde durch den Fermenter. Nach dem Beginn des mikrowellen Wachstums füllte die Luft in jeder Kammer einen leeren Raum im oberen Teil dieser Kammer gegen die unmittelbar darüber befindliche Platte aus. Eine bestimmte Menge Flüssigkeit, die in jeder einzelnen Kammer gehalten wurde, wurde in Abhängigkeit von der Menge an zugeführter Luft,Inoculation was with 5 volume percent of an inoculum of E. coli B-548 grown for 18 hours had been made. The air supplied flowed at a linear velocity of 7 cm / second through the fermenter. After the onset of microwave growth, the air filled in each chamber an empty space in the upper part of this chamber against the one immediately above it Plate off. A certain amount of liquid, which was held in each individual chamber, became depending on the amount of air supplied,

ίο dem Durchmesser der Löcher, dem Öffnungsverhältnis in jeder Platte, den physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit u. dgl. bestimmt. Es wurde diese bestimmte Menge Flüssigkeit in jeder Kammer gehalten, wobei selten Mischen mit der Flüssigkeit in der be-ίο the diameter of the holes, the aperture ratio in each plate, the physical properties of the liquid and the like are determined. It became this particular one Amount of liquid held in each chamber, rarely mixing with the liquid in the loading

»5 nachbarten Kammer auftrat. Auf diese Weise arbeitete jede Kammer getrennt und einzeln als einzelne Fermentationsvorrichtung.»5 neighboring chamber occurred. Worked this way each chamber separately and individually as a single fermentation device.

Die Phasen von bakteriellem Wachstum in der Kultur in den jeweiUgen Kammern wurden beobachtet und aufgezeichnet (nachfolgende Tabelle I). Zusammenfassend gesagt unterscheiden sich die Wachstumsphasen von einer Kammer zu einer anderen, und die Unterschiede zwischen den erhaltenen Werten liegen außerhalb des Bereichs statistischer Fehler.The phases of bacterial growth in the culture in the respective chambers were observed and recorded (Table I below). In summary, the growth phases differ from one chamber to another, and the differences between the values obtained are outside the range of statistical errors.

Die Werte in Tabelle I geben die optische Dichteeinheit an (im nachfolgenden bezeichnet als O. D.: optische Dichte bei 610 mn-Anzahl von Verdünnungen). The values in Table I indicate the optical density unit (hereinafter referred to as O. D .: optical density at 610 nm number of dilutions).

Versuch 4Attempt 4

Kammer
(vomchamber
(from the O. DO. D zu verschiedenen Züchtungsstundenat different breeding hours 22 33 44th Bodenfloor 0,4210.421 0,7560.756 1,021.02 aus)the end) 00 11 0,4120.412 0,7430.743 0,980.98 ³⁵ Nr. 1 ³⁵ No. 1 0,100.10 0,2200.220 0,4100.410 0,7350.735 0,950.95 Nr. 2No. 2 0,100.10 0,2100.210 0,4050.405 0,7310.731 0,950.95 Nr. 3No. 3 0,110.11 0,2070.207 4o Nr. 44o No. 4 0,110.11 0,2050.205

Versuch 4Attempt 4

Nach den obigen Arbeitsweisen wurde eine Fermentation in einem anderen Fermenter durchgeführt, der dieses Mal in 10 Kammern mit in gleichem Abstand angeordneten Platten unterteilt war, wobei jede Platte Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm und ein Öffnungsverhältnis von 11⁰Zo aufwies.According to the above procedures, fermentation was carried out in another fermenter, which this time was divided into 10 chambers with equally spaced plates, each plate having holes 2 mm in diameter and an aperture ratio of 11 ⁰ zo.

Nach 3stündiger Vorkultivierung wurde ein Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie in Versuch 3 mit einer konstanten Rate vom Boden des Fermenters aus zugeführt. Die Verdünnungsrate, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, betrug Vs je Stunde. Insbesondere wurde die Menge an zugeführtem Medium so eingestellt, daß die Verdünnungsrate in der Bodenkammer die maximale spezifische Wachs tumsrate des Mikroorganismus nicht überstieg. Über schüssige Flüssigkeit, die durch den Fermenter nacl oben geführt wurde, floß vom oberen Ende über.After pre-culturing for 3 hours, a medium with the same composition as in Experiment 3 fed at a constant rate from the bottom of the fermenter. The dilution rate, related on the total volume of the medium, was Vs per hour. In particular, the amount of Medium adjusted so that the dilution rate in the bottom chamber has the maximum specific wax rate of the microorganism did not exceed. Excess liquid that is passed through the fermenter was passed above, overflowed from the upper end.

Die Unterschiede in der Zellenkonzentration voi einer Kammer zu der nächsten wurden mit fortschrei tender Zeit ersichtlicher, und nach 17 bis 20 Stundei kam der Gradient in der Zellenkonzentration in einei stationären Zustand. Die Zeilenkonzentration (O. D. bei diesem Zustand und der Nucleinsäuregehalt j O. D. in den einzelnen Kammern sind in Tabelle 1 angegeben. In F i g. 4 sind ebenfalls die ZellerThe differences in cell concentration from one chamber to the next became progressive later, and after 17 to 20 hours the gradient in the cell concentration came to a steady state. The line concentration (O. D. at this state and the nucleic acid content j O. D. in the individual chambers are in Table 1 specified. In Fig. 4 are also the Zeller

konzentrationen in einigen Kammern in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Verweilzeit, zu Vergleichszwecken zusammen mit der Wachstumskurve bei diskontinuierlicher Kultur, gezeigt.concentrations in some chambers as a function of the average residence time, for comparison purposes together with the discontinuous culture growth curve.

Table II

KanunerKanuner ZellenkonzentrationCell concentration Nuclein säureNucleic acid (vom Boden aus)(from the ground) (O. D.)(O. D.) y-RNS/O. D.y RNA / O. D. Nr. 3No. 3 0,3100.310 15,015.0 Nr. 5No. 5 0,4920.492 10,010.0 Nr. 7No. 7 0,6980.698 8,38.3 Nr. 9No. 9 0,7920.792 8,08.0 Nr. 10No. 10 0,8100.810 7,97.9

Die obigen beiden Versuche 3 und 4 zeigen, daß die mehrstufige Fermentationsvorrichtung die folgenden Merkmale aufweist: Wenn Mikroorganismen in einem solchen Fermenter wie in Versuch 3 gezüchtet werden, wirkt jede Kammer als einzelner Fermenter, in welchem die Luft den oberen Teil des Raums angrenzend an die darüber befindliche Platte ausfüllt und hier als Kissen wirkt. Mit anderen Worten, das Medium innerhalb einer Kammer wird durch Belüftung gründlich gemischt, doch mischt es sich kaum mit dem Medium in den benachbarten Kammern. Die Gehal*e an Zellen variieren daher zwischen den einzelnen Kammern.The above two experiments 3 and 4 show that the multi-stage fermentation apparatus does the following Features: When microorganisms are grown in such a fermenter as in Experiment 3 Each chamber acts as a single fermenter in which the air adjoins the upper part of the room fills the plate above and acts as a cushion here. In other words, that Medium within a chamber is thoroughly mixed by ventilation, but it hardly mixes with the medium in the neighboring chambers. The cell contents therefore vary between the individual chambers.

Wird andererseits das Kulturmedium mit einer bestimmten Rate vom Boden des Fermenters aus eingeführt, d. h. die Fermentation kontinuierlich durchgeführt, so ist die Verteilung der Zellen etwas anders. Während das Medium in jeder Kammer gut gerührt und gemischt wird, bewegt sich eine gewisse Menge des Mediums, die der vom Boden aus einströmenden Menge entspricht, aufwärts von einer Kammer zu der nächsten durch die Löcher in der oberen Platte. Hierbei hindern Faktoren, wie die Reibung an der Platte, der Flüssigkeitsgehalt, die Belüftung u. dgl., das Medium am Aufströmen und bewirken so, daß die Luft den oberen Teil einer Kammer unter der oberen Platte ausfüllt, wie wenn alle Kammern gesondert, wie oben beschrieben, betrieben werden. Diese Bedingungen sind in F i g. 5 gezeigt. Die Aufwärtsströmung und Zufuhr des Mediums werden jedoch quantitativ durchgeführt. Wenn das Medium in jeder Kamirer gründlich gemischt ist, nimmt die Strömung des Mediums als Ganzes die deutliche Form einer Kolbenströmung an. Das Medium wird so nach oben gedrückt und am oberen Ende des Fermenters quantitativ abgezogen. Das gleiche Prinzip kann auf den Betrieb mit einer Batterie von Fermentern, die in Reihe angeordnet sind, angewendet werden.On the other hand, if the culture medium is introduced at a certain rate from the bottom of the fermenter, d. H. If the fermentation is carried out continuously, the distribution of the cells is somewhat different. As the medium in each chamber is stirred and mixed well, some amount moves of the medium, which corresponds to the amount flowing in from the bottom, upwards from one chamber to the next through the holes in the top plate. Here, factors such as friction prevent the Plate, the liquid content, the aeration and the like, the medium on the upstream and thus cause the air fills the upper part of a chamber under the upper plate, as if all chambers were separated, as described above. These conditions are shown in FIG. 5 shown. The upward current and supply of the medium, however, are performed quantitatively. If the medium is in every Kamirer is thoroughly mixed, the flow of the medium as a whole takes on the distinct Shape of a piston flow. The medium is pushed upwards and at the top of the Fermenter deducted quantitatively. The same principle can be applied to the operation with a battery of fermenters, which are arranged in series can be applied.

Der Versuch 4 zeigt, daß, wenn das Wachstum den stationären Zustand erreicht, jede Kammer Zellen bei der durchschnittlichen Verweilzeit hält. Die Zellenkonzentration variiert daher mit den Kammern. Spezieller ausgedrückt erfolgt die Züchtung kontinuierlich unter solchen Bedingungen, daß die Zellen sich am Boden stets am Beginn ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, diejenigen in der Mitte in der Zwischenphase und diejenigen am oberen Ende in der Endphase, und zwar durch eine geeignete Kombination der Strömungsrate des Mediums mit der Zellenwachstumsrate. Wird ein gewünschtes Produkt bei dem Zellenwachstum oder bei einer gewissen Periode der Wachstumsphase gebildet, so tritt die unterschiedliche Verteilung der Produktkon2entration in der gleichen Weise auf.Experiment 4 shows that when the growth reaches steady state, cells at each chamber the average residence time. The cell concentration therefore varies with the chambers. More specifically, the cultivation is carried out continuously under such conditions that the cells are always at the beginning of their logarithmic growth phase on the ground, those in the middle in the intermediate phase and those at the top in the final phase, by a suitable one Combination of the flow rate of the medium with the rate of cell growth. Becomes a desired product formed during cell growth or during a certain period of the growth phase, the different distribution of product concentration in the same way.

Die Tatsache, daß der Unterschied in der Zellenkonzentration in den jeweiligen Kammern nicht nur auf physikalischen Faktoren beruht, wurde mittels der biologischen Aktivitäten von Zellen nachgewiesen, die aus den jeweiligen Kammern entnommen wurden,The fact that the difference in cell concentration in the respective chambers is not only is based on physical factors, has been demonstrated by means of the biological activities of cells, which were taken from the respective chambers,

ίο beispielsweise durch den Nucleinsäuregehalt der Zellen. Es ist wesentlich, daß beim Betrieb jeder Kammer als einzelne Fermentiervorrichtung in einem kontinuierlichen Verfahren das Verhältnis des Volumens der Kammer zu der Strömungsrate des Mediums. d. h. die Verdünnungsrate, die maximale spezifische Wachstumsrate des Mikroorganismus nicht übersteigt. Die aus dem Überlauf erhaltenen Zellen haben daher unter stationären Züchtungsbedingungen eine gewisse durchschnittliche Verweilzeit oder einίο, for example, by the nucleic acid content of the Cells. It is essential that when each chamber is operated as a single fermenter in one continuous process the ratio of the volume of the chamber to the flow rate of the medium. d. H. the rate of dilution, not the maximum specific growth rate of the microorganism exceeds. The cells obtained from the overflow therefore have under steady growth conditions a certain average residence time or a

»o gewisses Zellenalter. Je mehr der Fermenter unterteilt ist, um so mehr arbeitet das Gesamtverfahren nach einem perfekten Kolbenströmungsmuster und um so deutlicher wird das Muster des Zellenkonzentrationsgradienten. Dies kann sowohl theoretisch als auch experimentell nachgewiesen werden.“Oh, certain cell age. The more divided the fermenter the more the overall process operates on a perfect piston flow pattern and the more clearly the pattern of the cell concentration gradient becomes. This can be both theoretically and can also be proven experimentally.

Es wurde ein kontinuierliches Verfahren beschrieben, bei welchem das Medium vom Boden des Fermenters aus eingeführt wird, doch kann das gleiche Grundverfahren statt dessen auch umgekehrt unter Einführung des Mediums vom oberen Ende her ohne Einbuße der vorteilhaften Charakteristiken des bereits beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. In diesem zweiten Falle tritt die Verteilung der Zellen natürlich vom oberen Ende nach dem Boden zu auf.A continuous process has been described in which the medium is removed from the bottom of the fermenter from is introduced, but the same basic procedure can also be used vice versa instead Introducing the medium from the top end without sacrificing the beneficial characteristics of the already described procedure are carried out. In this second case, the distribution of cells occurs of course from the top to the bottom.

Bei anaerober Fermentation wird durch Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxyd, und im Verlaufe der Fermentation entwickelte Gasblasen der gleiche Effekt wie mit Luft oder Belüftung bei aerober Fermentation erzielt.In the case of anaerobic fermentation, inert gas, such as nitrogen or carbon dioxide, and in the course of fermentation gas bubbles developed the same effect as with air or aeration aerobic fermentation achieved.

Im folgenden wird die Erfindung beispielhaft erläutert. The invention is explained below by way of example.

example 1

Ein zylindrischer Fermenter mit einem Innendurchmesser von 6 cm und einer Höhe von 120 cm war durch vier quer angeordnete Platten in gleiche Teile unterteilt, wobei jede Platte mehrere Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm aufwies und das Öffnungsverhältnis 2O°/o ausmachte (vgl. Fig. 1).A cylindrical fermenter with an inside diameter of 6 cm and a height of 120 cm was divided into equal parts by four transversely arranged plates divided, each plate having a plurality of holes with a diameter of 2 mm and the aperture ratio 20 per cent (see Fig. 1).

Rohes technisches Naphthalin wurde in einer Menge von 10 Gewichtsprozent der Gesamtflüssigkeit in die zweite Kammer von unten eingeführt, und ein von Bakterien freies Züchtungsmedium, das 0,25% Ammoniumchlorid, 2°/o Manganchlorid.Crude technical naphthalene was used in an amount of 10% by weight of the total liquid introduced into the second chamber from below, and a culture medium free of bacteria that 0.25% ammonium chloride, 2% manganese chloride.

0,005"/« Ferrosulfat und 0,05 «/0 Calciumchlorid enthielt, wurde eingegossen, wonach die Kammer mit Pseudomonas aeruginosa Nr. B-344 beimpft wurde Bei der Durchführung der Fermentation bei 30° C unter Belüftung mit einer linearen Geschwindigkei von 8 cm/Sekunde gelangte eine gewisse Menge de! in dieser Kammer vorhandenen festen Naphthalin; durch die Löcher in den Platten in die benachbarte! Kammern. Nach 36stündiger Fermentation wäret 10,6 g Salicylsäure je Liter erzeugt. Diese Salicyl säure wird durch weitere Fermentation nicht vermin dert oder zersetzt.Contained 0.005 "/" ferrous sulphate and 0.05 "/ 0 calcium chloride, was poured, after which the chamber was inoculated with Pseudomonas aeruginosa No. B-344 When performing fermentation at 30 ° C with aeration at a linear rate of 8 cm / second a certain amount of de! solid naphthalene present in this chamber; through the holes in the plates into the neighboring one! Chambers. After 36 hours of fermentation it would be 10.6 g of salicylic acid produced per liter. This salicylic acid is not reduced by further fermentation changes or decomposes.

Nach beendeter Fermentation wurde die fernen tierte Brühe vom Boden des Fermenters abgezogenWhen the fermentation was complete, the distant broth was withdrawn from the bottom of the fermenter

409 530/15409 530/15

- .L- .L

ίοίο

und 85 °/o des anfänglichen festen Naphthalins wurde durchgeführt, bis das feste Naphthalin in dem Ferin dem Fermenter gesammelt. Unter Verwendung menter vollständig verbraucht war.
dieses wiedergewonnenen Naphthalins und der Zellen, . .
die in dem Fermenter geblieben waren, wurde ein B e ι s ρ ι e 1 4
weiterer Fermentationszyklus durch einfaches Ein- 5 Ein säulenförmiger 5-1-Fermenter war in 6 Kambringen der oben beschriebenen Minerallösung durch- mern unterteilt, wobei bei jeder Platte die Löcher geführt. Dieser Arbeitsgang wurde sechsmal wieder- 20% ihrer Gesamtfläche ausmachten und die Löcher holt. jeweils einen Durchmesser von 2 mm aufwiesen. Die B e i s ρ i e 1 2 Einteilung war so, daß die erste Kammer (Boden-and 85% of the initial solid naphthalene was carried out until the solid naphthalene was collected in the fermenter. Using menter was completely consumed.
this recovered naphthalene and cells,. .
that remained in the fermenter became a B e ι s ρ ι e 1 4
Another fermentation cycle by simple 5 A columnar 5-1 fermenter was subdivided into 6 chambers of the mineral solution described above, with holes made for each plate. This operation was repeated six times, making up 20% of its total area, and bringing out the holes. each had a diameter of 2 mm. The B eis ρ ie 1 2 division was such that the first chamber (floor

lo kammer) ein Volumen von 1,5 1 aufwies und die rest-lo chamber) had a volume of 1.5 1 and the remaining

Ein Züchtungsmedium mit einem Gehalt von 10⁰O liehen Kammern jeweils ein Volumen von 0,7 1 hatten.A culture medium with a content of 10 ⁰ O lent chambers each had a volume of 0.7 1.

Glucose, 1% Harnstoff, 0,1⁰Zo KH₂PO₄, 0,04° ο Unter Verwendung von Leichtöl wurde die Fermen-Glucose, 1% urea, 0.1 ⁰ Zo KH ₂ PO ₄ , 0.04 ° ο Using light oil, the fermentation

MgSO₄ · 7H₂O, O,6°/oMaisquellwassef, 0,1 °/o Hefe- tation von Hefe (Candida lypolitica) und die Ent-MgSO ₄ 7H ₂ O, 6% corn steep liquor, 0.1% yeast fermentation of yeast (Candida lypolitica) and the

extrakt, 2 Teile je Million Fe⁺⁺, 2 Teile je Million paraffinierung durchgeführt.extract, 2 parts per million Fe ⁺⁺ , 2 parts per million waxing carried out.

Mn⁺⁺ und 2 mg/1 Biotin wurde in den gleichen Fer- 15 100 Teile Medium (pH 4,5), das 3,0 g Ammoniummenter wie in Beispiel 1 in der gleichen Weise ein- sulfat, 1,0 g Kaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, gebracht. Nach der Sterilisation wurde das Medium 0,1 g Hefeextrakt und eine kleine Menge an Spurenauf 30° C abgekühlt und mit der Impfkultur in einer elementen je Liter enthielt, wurden mit 15 Teilen Menge, die 3 Volumprozent des Mediums entsprach, Leichtöl und 0,02 Teilen eines oberflächenaktiven beimpft, wobei die Impfkultur durch Züchtung von 20 Mittels so gemischt, daß eine stabile Emulsion ge-Corynebacteriurn gelatinosum Nr. 7183 in einem Me- bildet wurde.Mn ⁺⁺ and 2 mg / 1 biotin were in the same fermentation 15 100 parts medium (pH 4.5), the 3.0 g ammonium fermenter as in Example 1 in the same way a sulfate, 1.0 g potassium phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate, brought. After the sterilization, the medium 0.1 g of yeast extract and a small amount of traces was cooled to 30 ° C, and with the inoculum contained in one element per liter, 15 parts of an amount corresponding to 3% by volume of the medium was added light oil and 0.02 Sharing of a surface-active inoculated, the inoculation culture being mixed by culturing 20 agents in such a way that a stable emulsion ge-Corynebacteriurn gelatinosum No. 7183 was formed in one me-.

dium erhalten war, das die gleiche Zusammensetzung, Vor dieser Stufe wurde Candida lypolitica 35 Stun-dium was obtained which had the same composition, before this stage Candida lypolitica was 35 hours

wie oben beschrieben, mit der einzigen Ausnahme den in einem Medium der gleichen Zusammensetzungas described above, with the only exception that in a medium of the same composition

hatte, daß der Glucosegehalt 8%> betrug. Es wurde wie oben gezüchtet. 5 Volumprozent dieser Vorkulturhad that the glucose content was 8%>. It was bred as above. 5 percent by volume of this preculture

dann bei 30° C unter einer Belüftung von 200 bis 25 von Candida lypolitica wurde zu dem obigen emul-then at 30 ° C with an aeration of 200 to 25 of Candida lypolitica was to the above emul-

400 ecm je Minute gezüchtet. Nach 58 Stunden er- gierten Medium zugegeben und die Züchtune bei400 ecm grown per minute. After 58 hours, the resulting medium was added and the culture was started

reichte der m.-Alanin-Gehalt in dem Medium 40 g/l. 28° C unter Belüftung mit einer Rate von 15 l/Minutethe m.-alanine content in the medium was 40 g / l. 28 ° C with aeration at a rate of 15 L / minute

Die Anzahl der verwendeten Platten kann frei ge- durchgeführt.The number of plates used can be set freely.

wählt werden und beeinflußt selbst das Ergebnis des Nach 24stündiger Fermentation wurde ein einui-can be chosen and influences the result of the fermentation after 24 hours.

Arbeitsgangs im Falle dieses diskontinuierlichen Ver- 30 giertes Medium, das mit 15 Teilen Leichtöl je 100 TeileOperation in the case of this discontinuous fermented medium containing 15 parts of light oil per 100 parts

fahrens nicht. Wasser gemischt war. vom Boden her mit einer Ratenot driving. Water was mixed. from the ground at a rate

Ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung von 300 ml/Stunde eingeführt und so eine kontinuierder gleichen Bestandteile und von fünf in gleichem liehe Fermentation vorgenommen. Die fermentierte Abstand quer in dem Fermenter angeordneten Platten Brühe, die aus Hefezellen, nicht verwertetem Leichtöl wurde dann durchgeführt. V12 des Gesamtvolumens 35 und Wasser bestand und eine gewisse Verweiireit des Mediums wurde je Stunde vom Boden des Fer- hatte, wurde fortschreitend am oberen Ende des Fermenters aus eingebracht. In etwa 24 Stunden war der menters abgezogen.A continuous process using 300 ml / hour was introduced and so was a continuous process same ingredients and made by five fermentation in the same borrowed. The fermented Distance between plates arranged transversely in the fermenter Broth made from yeast cells, unused light oil was then carried out. V12 of the total volume 35 and water existed and a certain amount of retention the medium was per hour from the bottom of the fermenter, was progressing at the top of the fermenter brought out. In about 24 hours the menters was gone.

stationäre Zustand erreicht. Der Gehalt an Zellen Nach Erreichen des stationären Zustands wurdesteady state reached. The content of cells after reaching the steady state was

und Alanin in dem Medium war in den jeweiligen aus jeder Kammer eine Probe der Brühe entnommen.and alanine in the medium, a sample of the broth was taken from each compartment in the respective one.

Kammern verschieden. Beide Gehalte waren, wie 40 Der Gehalt an Hefezellen und Leichtöl war der iol-Chambers different. Both contents were as 40. The contents of yeast cells and light oil were the iol-

festgestellt wurde, in der obersten Kammer am gende: 1,6 g/l (Trockengewicht) Zellmasse und 14.Cwas found in the top chamber at the end: 1.6 g / l (dry weight) cell mass and 14.C

höchsten, nämlich 34 g/l Alanin und 9,2 O. D. Bak- Teile (Volumteile) ölschicht (je 100 Teile anfänc-highest, namely 34 g / l alanine and 9.2 O. D. Bak parts (parts by volume) oil layer (per 100 parts beginning

tcrienzellen. So betrug beispielsweise der Alanin- lichem Wasser) in der ersten Kammer, 2,5 g.'I undtcrion cells. For example, the alanine-like water) in the first chamber was 2.5 g.'I and

gehalt in den jeweiligen Kammern von unten nach 12,8 Teile in der dritten und 3,1 g/l und 11,5 Teilecontent in the respective chambers from the bottom to 12.8 parts in the third and 3.1 g / l and 11.5 parts

oben: (1) 0,5 g/l, (2) 5 g/l, (3) 17 g/l, (4) 29 g/l, 45 in der fünften. Die überfließende Brühe wurde nachabove: (1) 0.5 g / l, (2) 5 g / l, (3) 17 g / l, (4) 29 g / l, 45 in the fifth. The overflowing broth was after

(⁵) ³⁴ § ^L bekannten Methoden in Zellkörper, entparaffinierte;( ⁵ ) ³⁴ § ^L known methods in cell bodies, dewaxed;

Leichtöl und Wasser getrennt.
Beispiel 3Light oil and water separated.
Example 3

Example 5

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Arbeits- 50 In einem Fermenter mit einem InnendurchmesseiAfter the work described in Example 1, 50 In a fermenter with an internal diameter

weisen wurde das Medium hergestellt und mit dem von 6,5 cm, der in 10 Kammern unterteilt war wöbeThe medium was produced and wöbe with that of 6.5 cm, which was divided into 10 chambers

gleichen Bakterieninoculum beimpft. Naphthalin jede der Platten 100 Löcher mit 2 mm Durchmesse!inoculated with the same bacterial inoculum. Naphthalene each of the plates 100 holes with a diameter of 2 mm!

wurde wie in Beispiel 1 verwendet. aufwies, wurde die Produktion von Bakteriensporerwas used as in Example 1. exhibited was the production of bacterial spores

Nach 24stündiger Fermentation erreichte der Sah- in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführtAfter 24 hours of fermentation, the sah- achieved in a continuous process

cylsäuregehalt in dem Medium 6,2 g/l. Von diesem 55 Als Impfkultur wurde auf einem Bouillonschrä-Cylic acid content in the medium 6.2 g / l. 55 As an inoculation culture on a bouillon slope

Zeitpunkt ab wurde eine sterilisierte anorganische agar gelagerter Bacillus stearothermophilus ATCCFrom the time a sterilized, inorganic agar-stored Bacillus stearothermophilus ATCC was produced

Salzlösung vom Boden aus mittels einer Dosierpumpe 8005 in das Glucose-Bouillonmedium eingeimpft umSaline solution is inoculated from the ground into the glucose broth medium by means of a metering pump 8005

eingeführt. Der Mengenanteil dieser Lösung zu der unter aeroben Bedingungen bei 55° C gezüchtet Diiintroduced. The proportion of this solution to the Dii grown under aerobic conditions at 55 ° C

Gesamiflüssigkeit in dem Fermenter oder die Ver- Hauptsporenproduktion wurde mit 5 VolumprozenTotal liquid in the fermenter or the main spore production was 5 volume percent

dünnungsrate betrug Vi₆ je Stunde. Nach 40 Stunden 6₀ dieser Kultur begonnen. Das Gesamtvolumen betruithinning rate was Vi ₆ per hour. After 40 hours 6 ₀ this culture started. The total volume

vom Beginn des Verfahrens ab enthielt jede Kammer 4,0 1.from the beginning of the proceedings, each chamber contained 4.0 1.

Bakterienzellen und Salicylsäure, und der stationäre Das Medium enthielt 6 ο Glucose 12 g HefeBacterial cells and salicylic acid, and the stationary medium contained 6 ο glucose 12 g yeast

Zustand war erreicht. Die Menge an gebildeter Salicyl- extrakt, Ig KH₀PO₄, 0,Ig¹MnSO ·'FLO 0 01'State was achieved. The amount of salicylic extract formed, Ig KH ₀ PO ₄ , 0, Ig ¹ MnSO · 'FLO 0 01'

säure betrug von der Bodenkammer aus nach oben: FeSO, · 7 Η,Ο Ό 1 g CaCl nnrl ⁴I 1 iWillWteacidity from the bottom chamber upwards was: FeSO, · 7 Η, Ο Ό 1 g CaCl nnrl ⁴ I 1 iWillWte

(1) 0,8 g/l, (2) 0,8 g/l, (3) 6,3 g/l und (4) 7,5 g/l. Der 6₅ Wasser. Nach 4 bis 5 Stunäen v!urde ziSziichc(1) 0.8 g / l, (2) 0.8 g / l, (3) 6.3 g / l and (4) 7.5 g / l. The 6 ₅ water. After 4 to 5 hours v! Urde ziSziichc

Gehalt in der vierten Kammer war mit dem Gehalt Medium kontinuierlich am Boden des Fermenters irContent in the fourth chamber was continuous with the content of medium at the bottom of the fermenter ir

in der abgezogenen fermentierten Brühe identisch. einer Menge von 360 ml/Stunde zugeführt Die feridentical in the withdrawn fermented broth. fed at an amount of 360 ml / hour The fer

Die Fermentation wurde kontinuierlich etwa 10 Tage mentierte Brühe, die Sporen enthielt floß am obererThe fermentation was carried out continuously for about 10 days. The broth contained spores flowed on the top

12/012/0

Ende über. Der Dipicolinsäuregehalt und die O. D. der Zellen in den jeweiligen Kammern erreichten den stationären Zustand. Die Zellenkonzentration erhöht sich gegen die oberen Kammern zu. In den unteren Kammern wurde keine DipieoUnsäure festgestellt, sondern nur in den Kammern oberhalb der sechsten. Der Dipicolinsäuregehalt wurde bei 60 y/ml gehalten. Dies ermöglichte, daß mehr als 80% der Gesamtzellen unter den Züchtungsbedingungen Sporen bilden. Die Sporen enthaltende Brühe wurde zentrifugiert, oder es wurden die Sporen aus der Sporensuspension durch die Schaumflotationsmethode gesammelt. End over. The dipicolinic acid content and the O.D. of the cells in the respective chambers reached the steady state. The cell concentration increases towards the upper chambers too. In the lower No dipsoid was found in the chambers, only in the chambers above the sixth. The dipicolinic acid content was kept at 60 μg / ml. This enabled more than 80% of the total cells to spore under the culture conditions form. The broth containing spores was centrifuged or the spores were removed from the spore suspension collected by the froth flotation method.

Example 6

Unter Verwendung einer Kulturlösung von Escherichia coli IAM-1253, die in einem 2 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthaltenden Medium 24 Stunden bei 30° C gezüchtet worden waren, wurden Bakterienzellen konzentriert und/oder fraktioniert. Zu der obigen Kulturlösung wurden 0,2 g/l an Aluminiumsulfat und 40 mg/1 an Laurinsäure (Äthanollösung) zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 7,2 eingestellt und in einen zylindrischen mehrstufigen Fermenter mit einer Höhe von 120 cm und einem Durchmesser von 6 cm gegossen, der durch 10 Platten in 11 Kammern unterteilt war, wobei in jeder Platte die Löcher von 5 mm Durchmesser 11 % der gesamten Platten fläche ausmachten. Luft wurde in den obigen Fermenter nach dessen Füllen mit dem Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 era' Sekunde eingeführt. Nach 25minütiger Belüftung wurde eine Probe der Lösung aus jeder Kammer entnommen, und die Anzahl der Zellen wurde darin bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Anzahl der Zellen in der obersten Kammer diejenige in der Bodenkammer um etwa das lOfache überstieg. Die Anzahl der Zellen in den dazwischenliegenden Kammern differierte stufenweise von einer Kammer zur nächsten vom Boden aus nach oben ansteigend. Obgleich die Zellkörper in den verschiedenen Kammern durch ein Mikroskop nicht sichtbar waren, waren nicht bakterielle Festsubstanzen in den unteren Kammern sichtbar, deren Anzahl gegen den Boden zunahm. Die physiologischen Aktivitäten der aus den jeweiligen Kammern entnommenen Zellkörper wurden in Termen der Aktivität für die Substratoxydation einer Zelleneinheit mit Glucose als Substrat bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Werte. Die Gesamt-O.D.Zml wurde durch Multiplizieren der optischen Dichte bei 610 mji der verdünnten Probe mit der Anzahl der Verdünnungen erhalten. Sie betrug in allen Kammern vor der Belüftung 5,0. Nach Belüftung variierte sie jedoch von 1.0 am Boden bis 10,4 in der neunten Kammer.Using a culture solution of Escherichia coli IAM-1253, which is in a 2% glucose and medium containing 1% yeast extract had been cultured at 30 ° C for 24 hours Bacterial cells concentrated and / or fractionated. To the above culture solution was added 0.2 g / l of aluminum sulfate and 40 mg / 1 of lauric acid (ethanol solution) added. The mixture was adjusted to pH 7.2 set and placed in a cylindrical multi-stage fermenter with a height of 120 cm and a Poured diameter of 6 cm, which was divided by 10 plates into 11 chambers, in each of which Plate, the holes with a diameter of 5 mm made up 11% of the total plate area. Air was in the above fermenter after filling it with the mixture at a speed of about 7 era ' Second introduced. After 25 minutes of ventilation, a sample of the solution was obtained from each chamber and the number of cells therein was determined. The results showed that the number of the cells in the uppermost chamber exceeded those in the bottom chamber by about ten times. the The number of cells in the intervening chambers gradually differed from one chamber to the other next rising from the ground upwards. Although the cell bodies in the different chambers were not visible through a microscope, bacterial solids were not in the lower Chambers visible, the number of which increased towards the floor. The physiological activities of the Cell bodies removed from the respective chambers were in terms of activity for substrate oxidation a cell unit with glucose as a substrate. The table below shows the obtained Values. The total O.D.Zml was calculated by multiplying the optical density at 610 mji of the diluted Sample obtained with the number of dilutions. It was in all chambers before ventilation 5.0. After aeration, however, it varied from 1.0 on the floor to 10.4 in the ninth chamber.

Die nachfolgende Tabelle zeigt auch die Anzahl der Zellen in jeder Kammer gegenüber der Gesamtznzahl an Zellen: 73% der Gesamtanzahl der Zellen fanden sich in den Kammern 7 bis 10 und die restlichen 27⁰Zo in der ersten bis sechsten Kammer. Q_n ₂ in der Tabelle, die Rate der Sauerstoffabsorption je Zelleneinheit, ist im Vergleich zu dem Wert in der ersten Kammer mit 1,00 als Basiswert angegeben. Es ist ersichtlich, daß die Aktivität in der ersten Kammer am niedrigsten ist und nach den oberen Kammern hin zunimmt.The table below also shows the number of cells in each chamber versus the total number of cells: 73% of the total number of cells were found in chambers 7 to 10 and the remaining 27 ⁰ zo in the first to sixth chambers. Q _n ₂ in the table, the rate of oxygen absorption per cell unit, is given as a base value of 1.00 compared to the value in the first chamber. It can be seen that the activity is lowest in the first chamber and increases towards the upper chambers.

Table III

Kammer
¹⁰ (vom Boden aus)chamber
¹⁰ (from the ground) O. D.
(610 ηιμ)OD
(610 ηιμ) Verteilung
der Zellendistribution
of cells Qo₂ Qo ₂ Nr. 1number 1 11 1,971.97 1,001.00 Nr. 3No. 3 2,12.1 4,134.13 1,101.10 Nr. 5No. 5 3,83.8 7,487.48 1,301.30 Nr. 7No. 7 8,18.1 15,9515.95 1,381.38 Nr. 9No. 9 10,410.4 20,4720.47 1,501.50

Example 7

Ein Züchtungsmedium (pH 7,0), das 0,5 ⁰Zu Glucose, i,3°/o Hefeextrakt, O₁I⁰Zo KR₁PO₄, 0,01 % MnSO₄ H₂O, 0,001 ^o/o FeSO₄ · 7H₂O'und 0,005⁰Z₀ MgSO₄-7 H₂O enthielt, wurde mit'Bacillus subtilis IAM/1214 beimpft und unter Belüftungsbewegung 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Nach dieser Zeitspanne waren l,9-10⁹/ccm Sporen aus insgesamtA culture medium (pH 7.0) containing 0.5 to ⁰ glucose, i, 3 ° / o of yeast extract, ₁ O I ⁰ Zo KR ₁ PO _4, 0.01% MnSO ₄ H ₂ O, 0.001 ^o / o FeSO ₄ · 7H ₂ O'and 0.005 ⁰ Z ₀ MgSO ₄ -7 H ₂ O was inoculated with Bacillus subtilis IAM / 1214 and cultured with aeration agitation for 24 hours at 30 ° C. After this period of time, 1. 9-10 ⁹ / cc spores were out total

2.1 ■ 10⁹/ccm Zellen gebildet. 2 1 der obigen Lösung, in der die Sporen und vegetativen Zellen des obiger.2.1 ■ 10 ⁹ / ccm cells formed. 2 1 of the above solution, in which the spores and vegetative cells of the above.

Stammes gemischt waren, wurden in einen mehrstufigen Fermenter mit einem Volumen von 3,21 eingebracht, der durch 8 Platten (bei denen die Löcher von jeweils 4 mm Durchmesser 16% ihrer Gesamt-Mixed strains were placed in a multi-stage fermenter with a volume of 3.21, by 8 plates (in which the holes, each 4 mm in diameter, 16% of their total

fläche ausmachten) in 9 Kammern unterteilt war. Die Luft wurde durch eine Belüftungsdüse am Boden mit einer Rate von 4 l/Minute eingeführt. Bei einem pH-Wert von 7,3 und einer Temperatur von 28° C begann das Schäumen in den Kammern, und es wurdearea) was divided into 9 chambers. The air was using an air vent on the floor introduced at a rate of 4 l / minute. At a pH of 7.3 and a temperature of 28 ° C the foaming started in the chambers, and it was

unmittelbar unterhalb von jeder Platte ein fortgeschrittenes Schäumen beobachtet. Die Luftmenge wurde alle 5 Minuten um 0,5 l/Minute erhöht, bis schließlich 191ZMinute erreicht waren. Hierdurch wurde das Volumen der Schaumschichten an den fortgeschrittenen Stellen erhöht, so daß eine gewisse Menge der Kulturlösung in jeder Kammer gehalten wurde. Nach 120minütiger Belüftung unter den obigen Bedingungen wurde die Anzahl der Sporen für die oberen beiden und unteren beiden Kammern bestimmt: 1,1 ■ 1O¹⁰ZcCm und 1,0 ■ 10¹⁰/ccm für die beiden oberen Kammern und 2 · 10⁷Zccm undadvanced foaming was observed immediately below each plate. The air flow was increased by 0.5 l / minute every 5 minutes until it finally reached 1910 minutes. This increased the volume of the foam layers at the advanced points so that a certain amount of the culture solution was kept in each chamber. After aeration for 120 minutes under the above conditions, the number of spores for the upper two and lower two chambers was determined: 1.1 ^{· 10 10} ZcCm and 1.0 ^{· 10 10} / ccm for the two upper chambers and 2 · 10 ⁷ Zccm and

1.2 · lö^T/ccm für die beiden unteren Kammern. Mit anderen Worten zeigen die obigen Ergebnisse, daß etwa 90% oder mehr der Gesamtsporen in den oberen beiden Kammern gesammelt waren. Sie zeigen auch, daß, da die Anzahl der Zellen in den jeweiligen Kammern sich nicht stark unterschied, die Anzahl der Sporen je Anzahl der Zellen in diesen oberen Kammern beträchtlich erhöht war. Die Flüssigkeit in diesen Kammern wurde abgezogen und als Sporensuspension verwendet.1.2 · lo ^T / ccm for the two lower chambers. In other words, the above results show that about 90% or more of the total spores were collected in the upper two chambers. They also show that since the number of cells in the respective chambers did not differ much, the number of spores per number of cells in these upper chambers was considerably increased. The liquid in these chambers was drawn off and used as a spore suspension.

Hierzu 4 Blatt ZeichnungenFor this purpose 4 sheets of drawings

Claims

Patent claims:

1. Multi-stage fermentation process in a fermentation tower divided into chambers by perforated plates, which has an air supply from the bottom, characterized in that the air to achieve a free space in the upper Part of each chamber is directed.

2. The method according to claim 1, characterized in that that in the formation of the free space in the upper part of each chamber a nutrient medium is passed up through the fermentation tower with ventilation from the bottom of the fermentation tower.

3. The method according to claim 2, characterized in that the nutrient medium is continuous is fed.

4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the nutrient medium component at least one petroleum product is used.