DE2638657A1

DE2638657A1 - Radioaktiv markiertes orgotein

Info

Publication number: DE2638657A1
Application number: DE19762638657
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Huber; Mark G Saifer; Lewis D Williams
Original assignee: Diagnostic Data Inc
Current assignee: Diagnostic Data Inc
Priority date: 1975-09-09
Filing date: 1976-08-27
Publication date: 1977-03-17
Also published as: CA1077419A; NL7609877A; FR2323398A1; BE845636A; US4022877A; SE7609977L; SE8005920L; JPS5238008A; GB1561048A

Description

Radioaktiv markiertes Orgotein Die Erfindung betrifft radioaktiv markiertes Orgotein.

Orgotein ist der offizielle Name, den das United States Adopted Name council einer Familie von artgleichen wasserlöslichen Proteinen in weitgehend reiner, injizier-, "barer Form, d. h. weitgehend frei von anderen Proteinen, mit denen es zusammen vorzukommen pflegt oder vermischt ist, verliehen hat. Die US-PS 3.758.682 beschreibt Orgotein enthaltende pharmazeutische Präparate. Verschiedene Verwendungen von Orgotein sind in den US-PS 3.637.441, 3.773.928, 3.773.929 und 3.781.4H beschrieben. Die Orgotein-Metallproteine sind Mitglieder einer Familie von Proteinen-Artgenossen, die sämtlich eine charakteristische Kombination von physikalischen, chemischen, biologischen und pharmakotynamischen Eigenschaften aufweisen. Jeder dieser Artgenossen ist nach seinen physikalischen Kennzeichen die isolierte, weitgehend reine Form eines globularen, in Pufferlösung und Wasser löslichen Proteins mit einer sehr kompakten nativen Konformation, die zwar hitzeempfindlich, jedoch gegen Erwärmen auf 65° C bei

709811/1064

einem pH-".7ert von 4-10 beständig ist« In chemischer Hinsicht ist jedes dieser Proteine dadurch gekennzeichnet, daß es alle bis auf o-2 der Protein-Aminosäuren, einen geringen Prozentgehalt an Kohlehydraten, keine lipide, 0,1 bis 1,0 $ Metallgehalt, der aus 1 bis 5 Grammatomen je Mol eines oder mehrerer chelatgebundener, divalenter Metalle mit einem Ionenradius von 0,6 bis 1,0 A. herrührt, und im wesentlichen keine chelatgebundenen, monovalenten Metalle oder solche, die Zellgifte darstellen, in Molekülen aufweist.

Tabelle I zeigt die Verteilung der Aminosäure-Reste, berechnet für ein Molekulargewicht von 32.500, verschiedener Orgotein-Artgenossen.

811/10

Tabelle I Aminosäuren - Leber,

AninosSuren-Zusammensetzung Terschiedener Orgotein-Artgenossen (Reste pro Mol; HQ * 32 500)

Rote 'Blutzellen

	Rind	53	Rind	Schaf Pferd Schwein Hund Kaninchen Hatte	18	18	16	- 19	22	Heerschw	. Huhn	Mensch	Bereich
Alanin	η	IS	19	18	C	8	8	8	7	22	23	22	16-23
Arginin	8	18	:8	10	35	31	29	3«	30	8	β	8	6-10
Asparagin.	37	17	36	35						3*	36	37	29-37
■Zur·		22			β	6	6	6	6			S
Cystin-1/2	6	2	6	.6	30	28	30	25	38	«	10	8	M-IO
Glutaminsäure 21	8	23	22	51	52	53	5*	5«	29	26	28	21-38
Glycin'	32	52	52.	20	16	15	17	20	53	56	51	51-56
Histidin	17	16	1*	1*	16	18	16	16	15	17	It	*l-20**
Isoleucin	26	18	18	18	16	16	19	12	18	15	17	1«-18
Leucin	HiI	17	17	2«	23	20	21	18	17	15	20	12-2Ο
Lysin	2	21	23	2	2	6	3	>	20	21	23	18-26
Hethionin	33	2 ■	2	9	. 8	8	9	S	2	3	1	1-6
Phenylalanin'	317	8	T	10	10	10	13	10	8	8	8	6-9
Prolin	13	15	1«	13	20	18	18	12	13	12	10-15
Serin	17	1*	16	27	20	21	17	18	15	19	13-20
Threonin	25	20	Nil	Nil	Nil	Nil	Nil	17	18	18	16-27
Tryptophan¹	Nil	KiI	Nil	«	2	Nil	2	Nil	1.	2	0- 2
Tyrosin	2	2	29	29	3*	31	35	Nil	2	Nil	0- ·
Talin	32	31	304	307	311	315	315	32	30	30	2-9-35
Gesamtzahl	315	306	309	317	318	3OH-318

Colorimetricehe Bestimmung Mittelwert aus Aminosäurenanalyse und epektrophotometrlscher Bestimmung

CD CO OO CO

Im Jahr 1969 wur.de der Rinder-Artgenosse des Orgotein-Proteins als ein Enzym festgestellt, das die Fähigkeit besitzt, den Abbau von Superoxid-Radikalen in einer Disproportionierungsreaktion in molekularen Sauerstoff und ,Vasserstoffperoxid zu katalysieren. Der Name "Superoxid Dismutase" (SOD) wurde dem Protein hinsichtlich dieser enzymatischen Aktivität verliehen; vgl. McOord, J.M. und Fridovich, I., J.Biol. Chem. Bd. 244·. 1969 S. 6049-6055»

Radioaktiv markierte Verbindungen sind als Diagnosemittel von großem Interesse. Zahlreiche radioaktive Diagnosemittel enthalten ein radioaktives Halogen, ins-

131 besondere Jod. Beispielsweise werden Thyroxin-J für

131 die Schilddrüse-Diagnose, Natriumdiatrizoat -J zum Test der Nierenfunktion, das Natriumsalz von Tetrachlor-

131
tetrajodfluorescein-J zum Test der leberfunktion,

Λ'ΖΛ

Bromthalein-J zum Überprüfen der Gallenblase (N,N'-Hydroxydiacetylbis-(3-methylamino-2,4,6-tri jodbenzoesäure)-J ^ und N,N'-Adipoylbis-(3-amino-2,4,6-tri3od-

111

benzoesäure)-J ^ ) zum Überprüfen der Leber und der Gallenblase verwendet. Die Verwendung von radioaktiv markierten Verbindungen in Verbindung mit verschiedenen biochemischen

Verfahren ist ebenfalls bekannt.

131 131

Tetrachlortetrajodfluorescein-J ^J , Bromthalein-J und

1 QR

Goldkolloid Au ^ wurden zum Test der Leberfunktion verwendet.

Die Verabreichung von mit Tritium markierten Steroiden an Menschen ist bekannt; vgl. Chem. Abstracts Bd, 76 1972, 335 g.

Hinsichtlich einer Diskussion der Verwendung von radioaktiven Spurenelementen in der Medizin siehe Winchell, H.S., Hospital Practice, Oktober 1971 S. 49 - 60.

709811/1064

Es wurde jetzt festgestellt, daß radioaktiv markiertes ' Orgotein zur Scintigraphy, insbesondere zur Sichtbarmachung der Nieren einsetzbar ist, da das Orgotein,rasch in den nieren nach Parenteralverabreichung angereichert wird.

QQM Gegenstand der Erfindung ist somit ein teilweise mit ^J^ Tc chelatgebundenes Orgotein. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Orgotein, das mit einem radioaktiven

-] ¹Z-I

Isotop von Jod, vorzugsweise J, jodiert ist.

Die Erfindung betrifft ebenso pharmazeutische Mittel für die parenterale Verabreichung, bestehend aus einem radioaktiv markierten Orgotein der Erfindung .im Gemisch mit einem pharmakologisch verträglichen Träger.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Erfindung und Verfahren zu ihrer Verwendung, insbesondere in der Scintigraphie.

Die kompakte native Konformation des Orgotein-Proteins wird, wie es üblicherweise in Tieren vorkommt, durch etwa 2 Grammatome je Mol (gapm) von jeweils chelatgebundenem Kupfer und Zink aufrechterhalten, wenn das Protein in seinem natürlichen Zustand vorliegt. Diese chelatgebundenen Metalle können teilweise oder sogar vollständig durch eine Chelataustauschreaktion mit anderen divalenten Metallen ersetzt sein. Rinder-Orgotein und weitere Orgotein-Artgenossen, die Tyrosin-Reste enthalten, können mit radioaktivem Jod durch Jodierung der Benzolringe der Tyrosine markiert werden. Es ist deshalb möglich, Orgotein mit einem radioaktiven Metall durch eine Ohelatreaktion oder Orgotein-Artgenossen mit Tyrosin-Resten mit einem Radioaktiven Jod-Isotop durch Jodierung zu markieren.

709811/1064

"Tc ist ein künstlich hergestelltes Isotop mit einer Halbwertszeit von 5 Stunden und nur mit einer Gammastrahlung von inneren Übergängen. Es klingt zum ^yy Tc mit einer Halbwertszeit von 200.000 Jahren ab. Dabei klingen mehrere Millicuries des metastabilen " Tc in

QQM einigen Tagen zu einem geringen Mikrocurieanteil von Tc ab. Es ist deshalb ein ideales Isotop für die nukleare Medizin und das bevorzugte radioaktive Metall für die Chelatreaktion mit dem Orgotein.

Kationisches Tc wird durch das Orgotein stark chelatge- : bunden. Bei dem zum Markieren von Orgotein angewandten Verfahren werden Pertechnetat - Ionen durch metallisches Zinn zu zweiwertigem Technetium reduziert, die durch das Orgotein chelatgebunden werden können. Die Reaktion wird zur Verhinderung der Bildung von Zinnkolloiden, die ebenso kationisches Technetium binden können, bei einem sauren pH-Wert durchgeführt. Wenn das Technetium durch das Orgotein chelatgebunden ist, kann das Reaktionsgemisch ohne signifikantes Markieren des Zinnkolloids neutralisiert werden.

Zu einem zweckmäßigen Verfahren zum Markieren von Proteinen mit einem radioaktiven Jod-Isotop gehört das kalte Umsetzen des Proteins mit einem trägerfreien radioaktiven Isotop, beispielsweise J oder J, und Chloramin-T bei einem leicht alkalischen pH-Wert, beispielsweise etwa 7»5.

Ein mild ablaufendes Verfahren zum Markieren von Proteinen mit '²^J zu hochspezifischen Radioaktivitäten mit

^J-N-Succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)-propionat ist von Bolton und Hunder, Biochem. J. Bd. 133 1973 8. 529 beschrieben worden; vgl. ebenso Lou Dilts, Radioassay Symposium, Hartford, Connecticut, Mai 1974. Hinsichtlich der Verfahren zum Radiojodieren von Peptiden und Proteinen

709811/108A

mit Rinderlactoperoxidase vgl. Witte, A. et al, Proc. Nat. Acad. Sol., Bd. 70 (1973) S. 36; Miyachi, Y. et al., Endocrinology, Bd. 92 (1973) S. 1725; David, G. et al., Biochem., Bd. 13(1974) S. 1oH; Mollhinney, J. et al*, · Endocrinology, Bd. 94, (1974) S. 1259 und Taurog, A. et al., Ibid., S. 1286.

Das radioaktive Orgotein wird vorzugsweise mit einer bestimmten Menge "To markiert, die eine Radioaktivitätsmenge von etwa 0,1 bis 100, vorzugsweise 5 bis 10 mCi/mg Orgotein aufweist, die etwa 6 σ 10" bis 5 x 10*" , vorzugsweise 10 Grammatome radioaktives Isotop/Mol Orgotein (gapm) entspricht.

ir

Der ^Zn-.Austausch in Orgotein-Protein (Cytocuprein) bis zu einem gewissen Überschuß wurde von Funakoshi, S. et al.," J. Biol. Chem. Bd. 243 (1968) S. 6474 beobachtet und von Carrico, R. J. et al., J. Biol. Ghem. Bd. 245 (1970) S. 723 besprochen. Es wurde ebenso berichtet, daß zu Menschenblut zugesetztes ^Cu im Orgotein-Protein (Erythrocuprein) austauscht; (Schieids, G.S. et al,, J. Clin. Invest., Bd. 40 (1961) S. 2007).

125 131 In ähnlicher Weise hat Orgotein, das mit J oder J markiert ist vorzugsweise einen Radioaktivitätswert von 0,1 bis 20, insbesondere 10 mOi/ mg Orgotein, was etwa 10"^ bis 10" , vorzugsweise 2 χ 10"² (J¹^¹') oder 15 x. - ' '

λ IOC

10 (J ) gapm des radioaktiven Isotops entspricht.

J-markiertes Orgotein hat eine Halbwertszeit von

QQM

8 Tagen, verglichen mit 5 Stunden, die das ^v Tc-markierte Orgotein besitzt. Weniger als 1 fo der injizierten Dosis des radioaktiven .Jods wandert zur Schilddrüse, wenn

■4 nc A "Z 4

das J- oder ^ J-markierte Orgotein injiziert wird, verglichen mit 30 bis 40 $, wenn radioaktives Jod selbst, injiziert wird. ■

709811/1064

QQM

In Betracht zu ziehende Äquivalente der ^JZ> Tc-markierten

64 Orgoteine der Erfindung sind die entsprechenden Cu-,

^Zn- und Co-markierten Orgoteine, die durch Austausch eines Teils des chelatgebundenen Cu und/oder Zn des nativen Orgoteins in einer '/eise hergestellt v/erden, die den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung

QQ
von *^Tc-markiertem Orgotein analog ist.

Die pharmazeutischen Präparate gemäß der Erfindung bestehen aus einem radioaktiv markierten Orgotein der Erfindung und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Art und die Natur dieses Trägers werden vom Verabreichungsmodus bestimmt.

Die bevorzugten pharmazeutischen Produkte sind sterile, injizierbare Präparate, zum Beispiel sterile injizierbare, wässrige Lösungen. Solche Lösungen können in bekannter Weise unter Verwendung üblicher Träger zubereitet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen, parenteral akzeptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, wie 1,3-Butandiol, sein.

Die erfindungsgemäßen Präparate'enthalten eine wirksame Einheitsdosismenge eines Orgoteins der Erfindung; d.h. das markierte Orgotein liegt in einer Konzentration vorj die die gewünschte Sichtbarmachung in der Scintigraphic zeigt, wenn eine Einheitsdosis des Produkts auf dem für den speziellen Träger anwendbaren Weg verabreicht wird. Beispielsweise enthalten flüssige injizierbare Produkte üblicherweise etwa 0,5 bis 20 mg Orgotein je 0,25 bis 10 ml, vorzugsweise etwa 0,5 bis 5 ml. Es ist einzusehen, daß die zur Sichtbarmachung benötigte Minimaldosis vom Radioaktivitätswert der speziellen Probe des verabreichten

709811/1064

Orgoteins abhängt. Da der Teil des verabreichten Orgoteins, der sich in den Nieren sammelt, und sein Radioaktivitätswert vorher bestimmt werden können, kann die Menge Orgotein, die zur ausreichenden Sichtbarmachung benötigt wird, leicht berechnet werden.

Das markierte Orgotein wird üblicherweise intravenös . ',. oder intermuskulär, üblicherweise in einer¹ Einzeldosis :' von etwa 0,5'bis 20 mg, vorzugsweise etwa 0,5 bis 8 mg, ' ; an Menschen verabreicht. Es ist einzusehen, daß zusätzlich· zur Sichtbarmachung in der Scintigraphie das markierte. Orgotein ebenso wirksam ist wie das unmarkierte Orgotein, beispielsweise wie es in der TJS-PS 3.758.682 beschrieben ist.

Das markierte Orgotein der Erfindung ist besonders zur Sichtbarmachung der Nieren in der Scintigraphie brauchbar, wo das Orgotein rasch nach intravenöser Verabreichung innerhalb weniger Minuten angereichert wird. Das Orgotein hat den Vorteil, einen nichttoxischen Träger für das radioaktive Element zur Verfugung zu stellen und in den Nieren lange genug zu verweilen, wobei eine vorteilhaft lange Zeitdauer von mehreren Stunden, innerhalb der die scintigraphische Überprüfung abgeschlossen sein muß, von dem Zeitpunkt an bereit steht, wo das markierte Orgotein verabreicht wird.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

70 9811/108 4

Beispiel 1

^3J Tc-markiertes Orgotein

Eine wasserfreie Probe Orgotein (1-10 mg) wird mit 2 glänzenden Zinn-Schrot-Pellets, 1,0 ml 0,2n Salzsäure und 0,5 ml Pertechnetat-Lösung versetzt. Es wird zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltene Lösung wird als solche verwendet oder vor Gebrauch mit 0,2 η Natriumcarbonat-Lcsung neutralisiert.

Beispiel 2

125

J -kodiertes Orgotein

125 Die Jodierung von Orgotein mit trägerfreiem J-markiertem Jod wird mit Chloramin-T ausgeführt. Es wird folgende

Jodierungsmethode (NEN) verwendet:

125 ein Gemisch von 10 mg Orgotein, 10 mOi trägerfreiem J , und 50 meg 0hloramin-T wird in 2,5 ml, 0,05m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 30 Minuten bei 9° C gehalten. Anschließend werden 75 meg Batriummetabisulfit zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. Gemäß der Sephadex G-25-Chromatographie werden 83 i* des J ^ in das Org-otein-Molekül einverleibt. Das markierte Orgotein hat eine spezifische Aktivität von 0,5 mCi/mg und eine radiometrische Reinheit von 99$ι wobei es zu weniger als 2^B/o durch anorganisches Jod nach dem Reinigen auf einer mit Sephadex-25 gefüllten Säule verunreinigt ist. Die Lösung (ungefähr 10 mg Orgotein in 4,8 ml)wirä gefroren. Das elektrophoretische Verhalten und die Superoxiddismutase-Aktivität des Orgoteins hat sich durch das Jodierungsverfahren nicht verändert.

70981 1/1064

Gemäß dem "Verfahren von Beispiel 2, jedoch unter Einsetzen von J^ anstelle von J wird J -markiertes Orgotein mit etwa derselben Radioaktivität wie dae Produkt von Beispiel 2 hergestellt.

Beispiel A * Nieren-Sichtbarmachung mit Technetium-Orgotein

η ητ,/r

^yy Tc-markiertes Orgotein wird dadurch erhalten, daß man 1-10 mg wasserfreie Proben von Orgotein mit 2 Zinn-Schrot-Pellets (glänzend), 1,0 ml 0,2n Salzsäure und 0,5 ml Pertechnetat-Lösung (5-20 mCi) versetzt und anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gegebenenfalls wird vor der Injektion mit 1ml 0,2n Natriumcarbonat-Lösung neutralisiert. Dieses Orgotein wird in den Untersuchungen verwendet.

An Hunden wird eine intravenöse Injizierung von 0,4-1 ml einer 2 bis 5 mCi " Tc-markiertes Orgotein enthaltenden Lösung zur Abbildung der Nieren verwendet.

Bestrahlungs-Nachweig

QQM
Die ^Όv Tc-Verteilungen werden auf einem Polaroid-Film abgebildet, der den Oscilloscop-Schirmen von Lochkameras (Hersteller: Picker Nuclear, Inc. und Nuclear Chicago Corporation) ausgesetzt wurde. Quantitative Daten werden unter Verwendung der digitalen Integrierung mit den gleichen Instrumenten erhalten. Die Zellgeometrie ist innerhalb jedes Experiments konstant.

Organ-Aus zählung

Ratten werden mit Pentabarbital entweder vor der Injektion mit markiertem Orgotein oder kurz vor dem Abtöten betäubt. Die Organe werden herausgeschnitten und unter die

709811/1064

Lochkamera gelegt. Das Zentrieren wird mit Hilfe des Oscilloscops-Ausschlags geprüft. Der Hintergrund wird subtrahiert, wenn er mehr als 1 fa der Zählrate darstellt.

Blut und Urin

Blutproben werden dadurch erhalten, daß man die Aorta der betäubten Ratten xvährend des Heraus schneidens aufschneidet. Urinproben werden aus den Blasen sezierter Ratten mit einer Kanüle (27 ga) und einer Spritze ( 3 ml) entnommen.

Zählen an der Injektionsstelle

Die Radioaktivität an den Stellen der subkutanen Injektion wird dadurch gemessen, daß man über den Teil des durch die Injektionsstelle gebildeten Feldes mit einer Picker-Kamera integriert. Die Integration wird zu den angezeigten Zeiten wiederholt.

Photographische Abbildung

Ratten werden zur Abbildung der ^^y Tc-Yerteilungen innerhalb 2 Minuten nach der Injektion von markiertem Orgotein in die Schwanzvene in Stellung gebracht. Die Nieren erscheinen bereits fast so markiert wie die Leber und das Herz, die die Blutgefäße darstellen. Anschließend Inst sich die Radioaktivität· vom Blutgefäßsystem und konzentriert sich immer mehr in den Fieren, so daß nach 15 Minuten die Hieran die Bilder beherrschen. Eine Spur von Aktivität erscheint nach 15 Minuten im Urin, die sich sogar nach 4 Stunden nicht viel verstärkt. Die Radioaktivität in den Heren bleibt bestehen. Die Neutralisierung der zu injizierenden Lösung beeinflußt nicht die beobachteten Muster.

Nach subkutaner, intraperitonealer oder intramuskulärer

QQM

Verabreichung von ^⁷ Tc-Örgotein an betäubte Ratten verbleibt nahezu die gesamte Radioaktivität an der Injektions-

709811/1064

stelle; über den intraperitonealen Weg füllt es die Bauchhülle und "bleibt dort. Bei nicht betäubten Ratten verläßt die Markierung langsam die Injektionsstelle und taucht in den liieren auf. Etwa die gleichen Bildintensitäten für die Injektionsstelle und die Nieren werden nach 2 Stunden erhalten. Das Abziehen nach 3 Stunden zeigte eine diffuse Radioaktivitätsverteilung über den gesamten Rumpf und das Fell mit heißen Stellen an den Injektionsstellen. Eine ähnlich rasche Aufnahme von

Ic-Orgotein durch die Nieren wird an 2 Hunden nach intravenöser Verabreichung beobachtet.

Nahaufnahmen von Nieren von unversehrten Hunden zeigen, daß die Markierung in den Nieren im wesentlichen in der ■ Cortex lokalisiert ist. Ein Markieren der Nebenniere ist nicht sichtbar.

Zählungen von Organen von sezierten Ratten bestätigten' die Rolle der Nieren beim Lösen von ^" Tc-Orgotein.vom Serum. Blutproben, die etwa 1/3 bis 1/4 des berechneten Blutvolumens der Tiere darstellen, enthalten 30 Minuten nach intravenöser Injektion höchstens 2 fo der gesamten Radioaktivität, Zu dieser Zeit liegen 1/3 bis 2/3 der gesamten Radioaktivität in den Nieren vor. Es wi£d eine geringe Doaisabhängigkeit hinsichtlich der Anreicherung in der Niere beobachtet, wobei ein höherer Anteil der injizierten Dosis in den Nieren bei höheren Orgotein-Dosen erscheint.

Zwischen 30 Minuten und 24 Stunden nach der Injektion löst sich das Orgotein fortwährend von der leber, Lunge, Milz und Magen, was einen Anstieg des Radioaktivitätsanteils in der -Niere und dem Rumpf zur Folge hat. Während der gesamten Untersuchungszeit enthält der Urin nur * wenige Hundertstel der Gesamtradioaktivität«

709811/1064

QQM

Nach subkutaner Injektion von ^ΌΖ> Tc-Orgotein an betäubten Ratten findet keine signifikante Fortbewegung der Markierung von der Injektionastelle statt. Wenn der gleiche Vorgang an nicht betäubten Ratten durchgeführt wird, findet jedoch eine Fortbewegung statt. Dabei erscheint 1/3 der Markierung in den Nieren nach 2 Stunden. Eine Radioaktivität im Blut ist nicht feststellbar, was sehr niedrige Aktivitäten in der Leber, Lunge, Milz und Magen zur Folge hat. Die diffuse Markierung des Rumpfes und der Haut ist dabei für etwa die Hälfte der Gesamtaktivität verantwortlich.

Nach intraperitonealer Injektion an betäubten Ratten liegt das Verhalten von ^y^ Tc-Orgotein etwa zwischen dem, was an betäubten Tieren, mit subkutanen und intravenösen Dosen behandelten Tieren beobachtet wird. Es ist etwas Anreicherung in der Niere nach 30 Minuten meßbar. Zu dieser Zeit enthält das Blut und die Leber mehrere Hundertstel der Markierung.

Beispiel B

125 Verabreichung von J-Orgotein

jeder Hund wird eine 'Joche vor dem Experiment an den vorgesehenen Stofffiechsel-Käfig gewöhnt. Hund 1 wird

125

intravenös in das Vorderbein 0,4 ml J-Orgotein-Lösung injiziert. Es werden Blutproben sowohl von der Vene des Vorderbeins als auch der Jugularvene in 15-Minuten-Ab- · ständen bis zur Tötung 3 Stunden nach der Injektion entnommen. Hund 2 werden subkutan an der Rückseite des ·

125
Halses 0,8 ml J-Orgotein-Lösung injiziert. Es werden Blutproben in 30 Minuten-Abständen bis zum Töten 6 Stunden

709811/1064

nach der Injektion entnommen. Hund 3 werden ebenfalls subkutan 1,2 ml . ^J-Orgotein-Lösung injiziert. Die Hunde sind während des gesamten Experiments nicht betäubt. Es werden tägliche Urin- und Kotproben bis zum Töten 12 Tage nach der Injektion gesammelt.

Nach dem Töten werden die größeren inneren Organe entfernt. Das Gesamtgewicht jedes Organs wird aufgezeichnet, charakteristische Proben jedes Organs, beispielsweise Teile der Lunge oder der Leber aus jedem Lappen oder verschiedene Bereiche der Gedärme, werden der Radioaktivitätsbestimmung unterzogen, Gewebeproben werden nach dem Homogenisieren mit 3 Teilen V/asser (Gcwicht/Yolumen) gezählt. Gewebeteile, die nicht vollständig wegen der Zähigkeit homogenisiert wurden, werden sowohl als Homogenate als auch als Rückstände zur Bestimmung der Gesamtzählrate gezählt. Sämtliche Proben (0,1 - 1 ml) werden doppelt mit einem automatischen Gammazähler (Nuclear-Chicago, Modell 4224·) gezählt.

Eine Reihe von Standards, die zu Beginn des Experiments hergestellt wurden, wird jeweils gezählt, wenn die Proben gezählt werden. Die Radioaktivitätsabnahme als Ergebnis

125
des natürlichen Zerfalls von J- wird dadurch korrigiert, daß die täglichen Standardzählraten zu den Anfangszählraten der Standards zurückbezogen werden. Die Zählergebnisse werden zur Berechnung der spezifischen Aktivität (cpm/ml oder -g) eines Gewebes und des Prozentsatzes der verabreichten Dosis verwendet, die im jeweiligen Gewebe festgestellt wird. Hinsichtlich der letzteren Berechnung wird eine Annahme gemacht, daß das Blut, die Muskeln und das Fett 9»4, 40 bzw. 15 '?<> des Körpergewichts ausmachen.

Nach intravenöser Verabreichung von 0,4 ml einer Lösung

125 von etwa 0,8 mg frisch hergestelltem ^J-markiertem

Orgotein (insgesamt 6 χ 10 cpm) an Hund 1 vop Gewicht

709811/1064

8,9 kg nimmt die Radioaktivität im Plasma mit einer anfänglichen biologischen Halbwertszeit von weniger als 15 Minuten (2,7 x 10 cpm/ml Blut) ab. Der Radioaktivitäts-wert im Blut änderte sich nur wenig zwischen 45 Minuten und 3 Stunden nach der Injektion. ITach 3 Stunden ist die spezifische Aktivität (cpm/g) der Radioaktivität im Genebe der Schild drüfse (6,4 x 10 cpm/g) am höchsten. Die Niere (1,3 x 10 cpm/g), der Blaseninhalt (6,6 χ 10 cpm/ g) und der Magen (5,6 χ 10 cpm/g zeigten höhere spezifische Aktivitäten als das Blut. Auf Grund der niedrigen spezifischen Aktivität der Galle und des Dünndarms wird die Gallenabscheidung nicht als größere Ausscheidungs-

125
route für ^J-Orgotein angesehen.

ITach subkutaner Verabreichung von 0,8 ml einer Lösung von

-JpC Q

etwa 1,6 mg J-Orgotein (insgesamt 1,2 χ 10 cpm) an Hund 2 vom Gewicht 8,8 kg wird kein ,Spitzenwert von

J im Blut beobachtet. Die Radioaktivität·steigt allmählich über 6 Stunden an. Die Radioaktivitätsverteilung im Gewebe nach subkutaner Verabreichung gleicht der am Ende des intravenösen Experiments. Schilddrüse, Niere, Blaseninhalt und Magen besitzen höhere spezifische Aktivitäten als Blut.

Einem Hund vom Gewicht 9,3 kg (Hund 3) werden subkutan

125

etwa 2,4 mg J-Örgotein verabreicht. Die Radioaktivitätsausscheidung wird 12 Tage lang verfolgt. Der Hund scheidet nahezu quantitativ die radioaktive Dosis im Urin mit dem vierten Tag aus. Die Kotausscheidung ist nur für V/o der Dosis verantwortlich. Nach 12 Tagen hält die Schilddrüse noch 2,3 $ der verabreichten Dosis zurück. Die spezifische Aktivität in der Schilddrüse, Niete, Leber, subkutanem Fett und Lunge ist größer als im Blut.

Die Radioaktivität im gesamten Blut de3 Hundes 1 nach intravenöser Injektion des Orgoteins nimmt zu Beginn mit

709811/1064

einer Halbwertszeit von weniger als 15 Minuten ab. Wach einer langsamen Gleichgewichtsperiode von 45 Minuten bleibt die Radioaktivität im Blut im wesentlichen bis zum Abtöten 3 Stunden nach der Injektion unverändert. Die Schilddrüse zeigt die höchste spezifische Aktivität. Diese Feststellung kann jedoch nicht

125 als Beweis einer umfassenden Dejodierung des J-Orgoteins angesehen werden, da die gesamte, in der Drüse vorliegende Radioaktivität weniger als 1 bis 2 ^c/o der

125 Orgotein-Yerunreinigung mit anorganischem J ausmacht. In der Niere, dem Blaseninhalt und Magen werden höhere Radioaktivitätskonzentrationen beobachtet als im ge-

1 25 samten Blut. Diese Mengen stellen anorganisches ^J5

125
oder orgoteingebundenes J auf dem Ausscheidungsweg

125

dar. ^J3 wird nahezu ausschließlich über die Niere ausgeschieden. Die Ursache für die hohe Radioaktivitätskonzentration in den Magenzellen ist nicht ersichtlich. Es kann einen Versuch der Magenzellen darstellen, entweder

125 freies oder die gebundene Form von J auszuscheiden. Wegen der niedrigen spezifischen Aktivität'-der Galle kommt der Gallenabscheidung keine signifikante führende

125 Rolle bei der Ausscheidung von J-Orgotein zu.

125

Nach der subkutanen Verabreichung von J-Orgotein an Hund 2 steigt der Radioaktivitätswert im Blut allmählibh innerhalb 6 Stunden, jedoch ohne Bildung eines Spitzenwerts an. Ein Vergleich der Verte im Blut zwischen Hund und Hund 2 zeigt, daß etwa die Hälfte der subkutanen Dosis möglicherweise den Zugang zum Blut nach 3 Stunden gefunden hat und daß diese Menge für weitere 3 Stunden im Steigen gehalten -.vird. Die Radioaktivitätsverteilung im Gewebe nach subkutaner Injektion ähnelt der im intravenösen Experiment. Die Schilddrüse, Niere, der Blaseninhalt und Magen besitzen höhere spezifische Aktivitäten als das Blut von Hund 2. Gewebsuntersuchungen an der Injektions-

709811/1064

stelle zeigten, daß weniger als 1 $ der injizierten Dosis an der Stelle "blieben. Me gesamte zählbare Radioaktivität (39,6 $) an Hund 2 ist/niedrig verglichen mit.59,1 "ß>i die im intravenösen Experiment an Hund erhalten wurden.

125 Nach subkutaner Injektion von etwa 2,4 mg J-Orgotein an Hund 3 wird die Ausscheidung der Radioaktivität täglich 12 Tage aufgenommen. Hund 3 scheidet die Radioaktivität nahezu vollständig am vierten Tag aus, wobei sehr wenig Abscheidung im Kot stattfindet. An Hund 3 zeigt die Schilddrüse bei '.veitem die höchste spezifische Aktivität unter sämtlichen Geweben und hält noch über 1 ^cß> der verabreichten Dosis zurück.

Niere, Leber und Lunge zeigten spezifische Aktivitäten, die gleich oder größer als die von Blut sind. Die Nebenniere, Milz und die Verdaungstrakte zeigen dazwischenliegende ^TiVerte von spezifischer Aktivität.

Beispiel G

Gemäß dem Verfahren von Beispiel B wird die Sichtbar-

131
machung der Niere mit ^ J-markiertem Orgotein erreicht, das den gleichen Radioaktivitätswert pro Gramm wie das

J-markierte Orgotein besitzt.

Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg unter Einsetzen der allgemeinen oder speziell beschriebenen reaktanten und/oder Betriebsbedingungen der Erfindung anstelle derjenigen wiederholt werden, die in den vorstehenden Beispielen verwendet wurden.

70981 1 /1064

Aus der vorstehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die Haupteigenschaften der Erfindung erkennen und ohne vom Gegenstand der Erfindung abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen.

709811/1064

Claims

Patentans prHch e

Durch chelatgebundenes ⁹ Tc radioaktiv markiertes Orgotein.
2. Orgotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit 10" bis 10 mCi/mg chelatgebundenem ⁹⁹¹Tc markiert ist.
3. Orgotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Orgotein das Rinder-Orgotein ist.
4. Orgotein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

es mit 10" bis 10 mCi/mg chelatgebundenem Tc markiert ist.
5. Durch ein radioaktives Jodisotop kodiertes, Tyrosinhaltiges Orgotein.
6. Orgotein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

125
daß es mit J jodiert ist.
7* Orgotein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Radioaktivität von 0,1 bis 20 mCi/mg ¹²⁵J besitzt.
8. Orgotein nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß der Orgotein-Artgenoese das Rinder-Orgotein ist,
9. Verfahren zum Sichtbarmachen der Nieren durch Scintigraphic, dadurch gekennzeichnet, daß man intravenös eine die Nieren sichtbar machende Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 verabreicht .

70981 1 /1064
10. Verfahren zum Sichtbarmachen der Fieren durch
Scintigraphie, dadurch gekennzeichnet, daß man
intravenös eine die Nieren sichtbar machende Menge
einer Verbindung nach Anspruch 5 verabreicht.
11. Orgotein, das entweder

a. durch chelatgebundenes ^yy Tc, ^Cu, Zu oder
⁶⁰Go oder

b, durch Jodieren der Tyrosinreste mit einem radioaktiven Jodisotop radioaktiv markiert ist.
12. Verfahren zur Herstellung eines radioaktiven Orgoteins nach Anspruch 11, daduroh gekennzeichnet, daß man
entweder

a. Pertechnetat-Ionen in einer Orgoteinlösung bei
einem sauren pH-Wert reduziert und anschließend
das Eeaktionsgemisch neutralisiert,oder

b. eine kalte Orgoteinlösung mit einem trägerfreien radioaktiven Jodisotop bei einem leicht alkalischen pH-'fert in Berührung bringt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,

QQM
daß man das Orgotein mit ^J* Tc radioaktiv markiert.
14· Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man das Orgotein mit 10 bis 10 mOi/mg chelat

QQM gebundenem ^^v Tc radioaktiv markiert.
15. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man als Orgotein das Rinder-Orgotein verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tyrosin enthaltenden Rinder-Artgenossen mit einem radioaktiven Jodisotop jodiert.

709811/1064
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,

125 daß man als radioaktives Isotop J einsetzt.
18. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß man den Orgotein-Artgenossen mit einer Radioaktivität von 0,1 bis 20 mCi/mg ¹²⁵J jodiert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Orgotein-Artgenossen Rinder-Orgotein
einsetzt.

709811/1064