DE2560288C2 - Sample holder for the fluorometric determination of substance samples - Google Patents
Sample holder for the fluorometric determination of substance samplesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen Probenhalter zur fluorometrischen Bestimmung von aus einem biologischen Medium oder Gewebe stammenden Substanzproben, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.The invention relates to a sample holder for the fluorometric determination of a biological one Medium or tissue-derived substance samples, according to the preamble of claim 1.
Die meisten durch Bakterien oder Viren verursachten Infektionskrankheiten erzeugen Antikörper im Blutserum des erkrankten Lebewesens. Diese geben einen gewissen Grad von Immunität gegen künftige Angriffe identischer Infektionsagenzien oder Antigene. Ein Verfahren zum Nachweis dos Vorhandenseins eines bestimmten Antigens besteht darin, es zu einem speziellen Antikörper hinzuzufügen, der sich an das Antigen bindet. Wenn der Antikörper vorher mit einem radioaktiven Element (RIA-Verl'ahren) oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert worden war. der sich mit seinen immunologischen Eigenschaften verträgt, so kann der Kopplungskomplex mittels eines geeigneten Meßinstrumentes nachgewiesen und, im Falle eines fluoreszierenden Zusatzes, am besten halbquantitativ gemessen werden. In fast allen bisher bekannten Fällen erfolgt die Messung auf einem für visuelle Betrachtung eingerichteten Objektträger.Most infectious diseases caused by bacteria or viruses create antibodies in the blood serum of the sick living being. These give some degree of immunity to future attacks identical infectious agents or antigens. A method of detecting the presence of a certain Antigen consists in adding it to a special antibody that binds to the antigen. If the antibody has previously been treated with a radioactive element (RIA procedure) or with a fluorescent Dye had been marked. which is compatible with its immunological properties, so the coupling complex can be detected by means of a suitable measuring instrument and, in the case of a fluorescent additive, best to be measured semi-quantitatively. In almost all previously known cases the measurement is carried out on a slide set up for visual observation.
In der DE-OS 22 62 479 wird eine Testvorrichtung für eine direkte Radioimmunprüfung auf Antigene oder deren Antikörper beschrieben. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Behälter zur Aufnahme einer zu untersuchenden Probe und einem Einsatz mit einem Griffteil und einer Spitze besteht Die Spitze paßt in den Aufnahmebehälter und besitzt einen Oberzug aus einem Antigen oder seinem Antikörper, der einen entsprechenden Antikörper oder ein entsprechendes Antigen in der Probe bindet In der Zeitschrift Annual Review of Biochemistry 35, Teil II, 1966 beschrieben I. H. Silman und E. Katchalski die Verwendung wasserunlöslicher Antigen-derivate zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern (Seite 902); die Antigen-derivate ihrerseits werden erhalten durch kovalente Bindung der Antigene an geeignete Träger (Seite 896).In DE-OS 22 62 479 a test device for a direct radioimmuno test for antigens or their antibodies is described. It is characterized by that they consist of a container for receiving a sample to be examined and an insert with consists of a handle part and a tip. The tip fits into the receptacle and has an upper pull an antigen or its antibody, the corresponding antibody or antigen binds in the sample. In the journal Annual Review of Biochemistry 35, Part II, 1966, I. H. Silman and E. Katchalski the use of water-insoluble Antigen derivatives for the quantitative determination of antibodies (page 902); the antigen derivatives for their part are obtained by covalent binding of the antigens to suitable carriers (page 896).
In der Zeitschrift »Ärztl. Laboratorium«, 18. Jahrg 1972, S. 133-142 wird ein flacher Probenhalter beschrieben, der für eine einzige immunochemische oder diagnostische Bestimmungsmethode brauchbar ist. Hierbei wird eine antigenhaltige Substanzprobe, beispielsweise ein einschichtiger Zellrasen, ein Zellausstrich, ein Abklatschpräparat od^r ein Gewebeschnitt unter Verwendung von Äthanol, Aceton oder einer schwach salzhaltigen Lösung oder in gefriergetrockneter Form vorgelegt und das Testreagenz in flüssiger Form zugegeben, d. h. es ist nicht kovalent an einen Probenhalter gebunden.In the journal »Ärztl. Laboratory ", 18th year 1972, pp. 133-142, a flat sample holder is described, which for a single immunochemical or diagnostic method of determination is useful. Here, an antigen-containing substance sample, for example a single-layer cell lawn, a cell smear, an impression preparation or a tissue section using ethanol, acetone or a weakly saline solution or in freeze-dried Form presented and the test reagent added in liquid form, d. H. it is not covalent to one Sample holder bound.
In der OE-OS 20 19 190 werden Objektträger beschrieben, die sämtliche für einen gegebenen Test notwendigen Reagenzien tragen, und auf die die zu untersuchenden Körperflüssigkeiten aufgebracht werden können.In the OE-OS 20 19 190 slides are described, which carry all the reagents necessary for a given test and those to be tested Body fluids can be applied.
Die Testreagenzien — Antigen und Antikörper — liegen in festem, trockenem Zustand vor und werden beim Benetzen mit der flüssigen Substanzprobe wieder in flüssige Testreagenzien überführt; auch hierbei besteht keine kovalente Bindung zum Probenhalter. Die Bestimmung erfolgt nicht fluorometrisch.The test reagents - antigen and antibody - are in a solid, dry state and are converted back into liquid test reagents when wetted with the liquid substance sample; also exists here no covalent bond to the sample holder. The determination is not carried out fluorometrically.
In der DE-OS 21 00 830 werden flache Kartonblätter beschrieben, die getrocknete Testreagenzien zur Rückbildung und zum Vermischen mit einem zu untersuchenden Stoff tragen; es besteht keine kovalente Bindung zum Probenhalter und die Bestimmung erfolgt nicht fluorometrisch.In DE-OS 21 00 830 flat cardboard sheets are described, the dried test reagents for regression and carry for mixing with a substance to be examined; there is no covalent bond to the sample holder and the determination is not carried out fluorometrically.
Alle Literaturstellen beschreiben Verfahren bzw. Probenhalter, durch die nur jeweils ein Antigen oder Antikörper bestimmt werden kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, einen Probenhalter der eingangs genannten Art zu entwickeln, der es ermöglicht, mehrere, aus einem biologischen Medium oder Gewebe stammende, unterschiedliche Substanzproben fluorometrisch zu bestimmen. Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde überraschenderweise dadurch gelöst, daß der Probenhalter zur Bestimmung von mehreren unterschiedlichen Substanzprobcn an der Oberfläche des Probenhalters oder an ein dort lest mit seiner Oberfläche verbundenes Substrat to unterschiedliche spezifische Bindungsreagenzien kovaleni gebunden enthält, die nach der spezifischen Bindungsrcaktion mit den zu bestimmenden Substanzproben, gegebenenfalls nach deren Fluoreszenzmaikic-All literature references describe methods or sample holders through which only one antigen or Antibodies can be determined. The object of the present invention was therefore To develop a sample holder of the type mentioned, which makes it possible to collect several from one biological Medium or tissue derived, different substance samples to determine fluorometrically. The object according to the invention was surprisingly achieved in that the sample holder for determination of several different substance samples on the surface of the sample holder or on one there read substrate connected to its surface to different specific binding reagents kovaleni contains bound after the specific binding reaction with the substance samples to be determined, if necessary after their fluorescence maikic-
rung, unterschiedlich fluoreszieren.tion, fluoresce differently.
Die unterschiedlichen spezifischen Bindungsreagenzien können in einem Testbereich willkürlich verteilt oder in mehreren Testbereichen voneinander getrennt vorliegen.The different specific binding reagents can be randomly distributed in a test area or in several test areas separated from one another.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der Probenhalter die Form eines Polyeders mit mehreren, jeweils Testbereiche aufweisenden Flachseiten. Die Testbereiche haben vorzugsweise die Form von Bändern. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Probenhalter die Form eines Würfels auf, der zweckmäßig an einem Ende eines Schaftes angebracht ist, an dessen anderem Ende sich ein Griff befindet Vorzugsweise weist der Testbereich einen Mindestdurchmesser von 1 mm in jeder Richtung auf. Selbstverständlich kann der Probenhalter beliebig, beispielsweise auch in der Form eines Zylinders oder einer Kugel gestaltet sein, auch die Testbereiche können beliebig geformt sein.According to a preferred embodiment of the invention, the sample holder has the shape of a polyhedron several flat sides each having test areas. The test areas are preferably in the form of Ribbons. According to a particularly preferred embodiment, the sample holder according to the invention has the shape of a cube, which is conveniently attached to one end of a shaft, at the other At the end there is a handle. Preferably, the test area has a minimum diameter of 1 mm in each Direction on. Of course, the sample holder can be arbitrary, for example also in the form of a A cylinder or a sphere can be designed, and the test areas can also be shaped as desired.
Gewünschtenfalls kann der erfindungsgemäße Probenhalter eine oder mehrere Bereiche mit fluoreszenzmarkierten Standardbelägen der zu bestimmenden Substanzproben aufweisen. Diese Bereiche dienen bei der Fluoreszenzmessung als Vergleichs- bzw. Bezugsgrundlage. If desired, the sample holder according to the invention can have one or more areas with fluorescence-marked Have standard coatings of the substance samples to be determined. These areas are used for Fluorescence measurement as a basis for comparison or reference.
Für die fluorometrische Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Probenhalters sind alle Substanzen geeignet, die entweder selbst fluoreszieren oder fluoreszierend gemacht werden können. Den nicht fluoreszierenden Substanzen kann die Eigenschaft der Fluoreszenz entweder durch direkte Fluoreszenzmarkierung oder durch ihre Bindung an fluoreszenzmarkierte spezifische Bindungsproteine, spezielle chemische Verbindungen, Inhibitoren, Enzyme, Antigene oder Antikörper verliehen werden. Als Beispiele geeigneter Substanzen werden folgende genannt: Drogen, die mißbraucht werden können, wie Morphium, Methadon, Kokain und Barbiturate; Drogen, die für die Kontrolle bestimmter chronischer Krankheiten oder Zustände gebraucht werden, wie Digoxin (für Herzbeschwerden), Insulin (Diabetes), und Diphenylhydantoin (Epilepsie): Hormone wie Thyroxin und Trijodthyroxin; Steroidhormone wie Aldosteron, Cortisol, Testosteron, Östriol und Progesteron; Peptide und Protein-Hormone wie Adrenocorticotropic Angiotensin, Gastrin, Chorin-Gonadotropin, follikelstimulierende Hormone, Wachstumshormone, luteinisierende Hormone, Neurophysin, Laktationshormone der Plazenta und thyroidstimulierende Hormone; Vitamine wie Cyanocobalamin und Folsäure; Enzyme wie Chymotrypsin, Kreatinphosphokinase, alkalische Phosphatase und Milchsäure-Dehydrogenase; Antigene wie Karzinoembryon-Antigen, Hepatitis zugeordnetes Antigen und Alpha-Fetoprotein; Antikörper wie Anti-Toxoplasmose-Antikörper, Anti-thyroid-Antikörper wie Bakterien, Pilze, Protozoen, Erythrozyten und Leukozyten; Serum-Protein wie Fibrinogen, Antihämophile Faktoren, Lipoprotein, Immunoglobuline und thyroxinbindendes Globulin; Zellabbauprodukte wie Myoglobine, bakterielle Toxine und Lyzozyme.For the fluorometric determination using the sample holder according to the invention are all Substances that either fluoresce themselves or can be made fluorescent. Not that one Fluorescent substances can change the property of fluorescence either by direct fluorescent labeling or through their binding to fluorescence-labeled specific binding proteins, special chemical ones Compounds, inhibitors, enzymes, antigens or antibodies can be conferred. More suitable as examples Substances are named as follows: Drugs that can be abused, such as morphine, methadone, cocaine and barbiturates; Drugs used for the control of certain chronic diseases or conditions like digoxin (for heart problems), insulin (diabetes), and diphenylhydantoin (epilepsy): Hormones such as thyroxine and triiodothyroxine; Steroid hormones like aldosterone, cortisol, testosterone, and estriol Progesterone; Peptides and protein hormones such as adrenocorticotropic angiotensin, gastrin, chorin-gonadotropin, follicle stimulating hormones, growth hormones, luteinizing hormones, neurophysin, lactation hormones the placenta and thyroid stimulating hormones; Vitamins such as cyanocobalamin and folic acid; Enzymes such as chymotrypsin, creatine phosphokinase, alkaline phosphatase, and lactic acid dehydrogenase; Antigens such as carcinoembryon antigen, hepatitis-associated antigen, and alpha-fetoprotein; antibody such as anti-toxoplasmosis antibodies, anti-thyroid antibodies such as bacteria, fungi, protozoa, erythrocytes and leukocytes; Serum protein such as fibrinogen, antihemophilic factors, lipoprotein, immunoglobulins and thyroxine binding globulin; Cell breakdown products such as myoglobins, bacterial toxins and lyzozyme.
Die erfindungsgemäßen Probenhalter eignen sich insbesondere bei der fluorometrischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern. Antigene werden allgemein definiert als Substanzen mit der Fähigkeit, eine Antikörper-Antwort hervorzurufen. Unter Antigen-Reaktionen sollen hier nicht lediglich ganz eng solche verstanden werden, welche sich auf eine in Vivo-Antikörperproduktion und Bindung an solche Substanzen beziehen, sondern vielmehr auch solche, welche in Vitro-Situationcn betreffen, bei denen normalerweise nicht antigene Substanzen verwendet werden können, um andere Substanzen zu binden. Zum Beispiel kann Thyroxinbindendes Globulin (TBG), ein normaler Bestandteil des menschlichen Blutes, verwendet werden, um Thyroxin (Tt), einen anderen normalen Bestandteil des menschlichen Blutes, immunochcmisch zu binden. Somit ist die T4-TBG-Bindung das Analogen der Anligen-Antikörperbindung und Tt kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Probenhalters fluorometrisch bestimmt werden. Weitere Beispiele hierfür sind die Kombinationen Thyroxin (Ti) mit thyroxinbindendem Pre-Albumin (TBPA), lntrinsicfaktor mit Vitamin B-12, Insulin mit Alpha-2-Macroglobulin, Cortisol mit Transcortin und Haptoglobin mit Hämoglobin. Fluorometrische Bestimmungen, bei welchen die tvfindungsgemäßen Probenhalter Verwendung finden können, sind auch Proteinbindungsreaktionen, also Reaktionen zwischen einem Protein und einer an diese bindungsfähigen Substanz. Hierzu zählt auch die Bindung gewisser Drogen, Hormone oder Enzyme an Substrate und immunologische Materialien.The sample holders according to the invention are particularly suitable for the fluorometric determination of Antigens and antibodies. Antigens are broadly defined as substances with the ability to produce a Elicit antibody response. Antigen reactions are not only intended to be understood here in a very narrow sense referring to an in vivo antibody production and binding to such substances, but rather also those which concern in vitro situations, in which normally not antigenic substances can be used to bind other substances. For example, thyroxine binding agent Globulin (TBG), a normal component of human blood, used to make thyroxine (Tt), another normal component of human blood, to bind immunochemically. Consequently the T4-TBG bond is the analog of the Anligen antibody bond and Tt can using the inventive Sample holder can be determined fluorometrically. Other examples are the combinations Thyroxine (Ti) with thyroxine-binding pre-albumin (TBPA), intrinsic factor with vitamin B-12, insulin with alpha-2-macroglobulin, cortisol with transcortin and haptoglobin with hemoglobin. Fluorometric determinations in which the sample holder according to the invention Can be used are also protein binding reactions, i.e. reactions between one Protein and a substance capable of binding to this. This also includes the binding of certain drugs, hormones or enzymes to substrates and immunological Materials.
An die Flächen des Testbereiches können entsprechend der zu bestimmenden Probensubstanzen entweder Antigene oder Antikörper oder die obengenannten den Antigenen bzw. Antikörper entsprechenden Verbindungen kovalent gebunden sein. Die kovalente Bindung der Testreagenzien im Testbereich kann entweder an der Oberfläche des Probenhalters oder an einem mit seiner Oberfläche fest verbundenem Substrat erfolgen. Die Materialien für die Herstellung des Probenhalters bzw. des Substrats werden hinsichtlich ihrer physikalischen Beschaffenheit und des erforderlichen kovalenten Bindungsvermögens für die jeweiligen Testreagenzien ausgewählt. Es ist ebenso möglich, die Testreagenzien nicht direkt, sondern mit Hilfe eines Zwischenbindemittels an die Oberfläche des Probenhalters oder an das Substrat im Tesibercich zu binden. Als Beispiele geeigneter Materialien für den Probenhaltcr bzw. das Substrat seien Polymere wie Polymethacrylate, Polymethylmethacrylsäure. Polystyrol. Polyamide und Cellulose genannt. Bezüglich weiterer Möglichkeiten und der Durchführung der kovalenten Bindung von immunochemischen Testreagenzien an feste Substrate wird ergänzend auf Zaborskys »Immobilized Enzyms«. The Chemical Rubber Company, Cleveland, Ohio (USA), 1973 sowie auf Campbell und Weliky, »Methods in Immunology and Immunochcinistry«, Band 1, Academic Press, New York, verwiesen.Depending on the sample substances to be determined, either Antigens or antibodies or the above-mentioned compounds corresponding to the antigens or antibodies be covalently bound. The covalent binding of the test reagents in the test area can either take place on the surface of the sample holder or on a substrate firmly connected to its surface. The materials for the production of the sample holder or the substrate are in terms of their physical Nature and the required covalent binding capacity for the respective test reagents selected. It is also possible to use the test reagents not directly but with the help of an intermediate binder to bind to the surface of the sample holder or to the substrate in the tissue. More suitable as examples Materials for the sample holder or the substrate are polymers such as polymethacrylates, polymethyl methacrylic acid. Polystyrene. Called polyamides and cellulose. Regarding further possibilities and the Implementation of the covalent binding of immunochemical test reagents to solid substrates is supplementary on Zaborsky's "Immobilized Enzyms". The Chemical Rubber Company, Cleveland, Ohio (USA), 1973 and to Campbell and Weliky, "Methods in Immunology and Immunochcinistry," Volume 1, Academic Press, New York.
Gewünschtenfalls kann der erfindungsgemäße Probenhalter außer den Testbereichen noch einen oder mehrere Bereiche mit fluoreszierenden bzw. fluoreszenzmarkierten Standardbelägen der zu bestimmenden Substanzproben aufweisen. Der Standardbelag entspricht dem bei der bestimmungsgemäßen Anwendung des Probenhalters entsprechenden Kopplungskomplex aus Testreagenz und Substanzprobe, ggf. fluoreszenzmarkiert, wobei die Substanzprobe mit bekanntem Titer eingesetzt wurde. Der Standardbelag dient demzufolge als Eichkörper, welcher auch zur Justierung des Fluorometers benutzt werden kann.If desired, the sample holder according to the invention can In addition to the test areas, one or more areas with fluorescent or fluorescence-marked areas Have standard coatings of the substance samples to be determined. The standard covering corresponds to the corresponding coupling complex for the intended use of the specimen holder of test reagent and substance sample, if necessary fluorescence-marked, the substance sample with a known titer was used. The standard covering therefore serves as a calibration body, which is also used to adjust the fluorometer can be used.
Der erfindungsgemäße Probenhaltcr ist auch wegen dieser Möglichkeit, ihn mit einem internen Standard auszurüsten, den bekannten Probenhaltern überlegen, weil er so die Fluoreszenzmessung beträchtlich erleichtert. Because of this possibility, the sample holder according to the invention can also be used with an internal standard to equip, superior to the known sample holders, because it facilitates the fluorescence measurement considerably.
Besonders eignet sich der errindungsgemäße Probenhalter für die Fluorcs/en/.mcssung in dem in der deut-The sample holder according to the invention is particularly suitable for the fluorine / en / .measurement in the German
sehen Offenlegungsschrift DE-OS 25 09 215 beschriebenen Fluorometer.see laid-open specification DE-OS 25 09 215 described Fluorometer.
Der Testbereich des erfindungsgemäßen Probenhalters sollte in jeder Richtung einen Min<iestdurchmesser von 1 mm aufweisen. Im Falle einer kugelförmigen oder zylindrischen Gestalt des Probenhalters ist der Durchmesser des Testbereiches nicht größer als 5 bis 20 mm. Wenn der Probenhalter eine flache Platte oder ein Würfel ist, sollte die Breite des Testbereiches nicht größer als 20 Em sein. Die Mindestfläche des Testbereiches von 1 mm Durchmesser stellt für Fluorometer eine makroskopische Fläche dar und ermöglicht die Integration von Fluoreszenzlicht aus großen Aggregaten von markierten Molekülen, wodurch Testfehler von Probe zu Probe vermindert werden.The test area of the sample holder according to the invention should have a minimum diameter in every direction of 1 mm. In the case of a spherical or cylindrical shape of the sample holder, the diameter of the test area is not larger than 5 to 20 mm. If the specimen holder is a flat plate or a cube, the width of the test area should not be greater than be 20 em. The minimum area of the test area of 1 mm in diameter is macroscopic for fluorometers Area and enables the integration of fluorescent light from large aggregates of marked Molecules, thereby reducing test errors from sample to sample.
Die erfindungsgemäßen Probenhalter eignen sich hervorragend für die fluorometrischen Bestimmungen nach den üblichen Verfahren. So wird beispielsweise bei der »Sandwich Technik« ein Antikörper gegen die spezielle Krankheit, deren Vorhandensein geprüft werden soll, auf den erfindungsgemäßen Probenhalter bzw. das Substrat im Testbereich kovalent gebunden. Das Serum des zu untersuchenden Patienten, von dem vermutet wird, daß es das Antigen enthält, wird auf den Testbereich aufgebracht. 1st das Antigen vorhanden, so bindet es sich immunologisch an die Antikörper. Nach Abspülen mit Wasser zwecks Entfernung allen ungebundenen Materials wird der Testbereich mit f luoreszenzmarkiertem Antikörper versetzt, der sich mit dem ggf. an den Antikörper gebundenen Antigen umsetzt. Eine danach vorgenommene Endspülung entfernt den nicht gebundenen fluoreszenzmarkierten Antikörper. Die vom Testbereich emittierte Fluoreszenz ist Indiz oder Maß für die Anwesenheit bzw. die Konzentration des Antigens im Serum.The sample holders according to the invention are outstandingly suitable for fluorometric determinations according to the usual procedures. For example, in the "sandwich technique", an antibody against the special Disease, the presence of which is to be checked, on the sample holder according to the invention or the Substrate covalently bound in the test area. The serum of the patient to be examined, suspected of being is determined to contain the antigen is applied to the test area. If the antigen is present, it binds it is immunologically linked to the antibodies. After rinsing with water to remove any unbound Material is the test area with fluorescence-marked Antibodies are added, which reacts with the antigen that may be bound to the antibody. One after that Final rinsing carried out removes the unbound fluorescently labeled antibody. The ones from Fluorescence emitted in the test area is an indication or measure of the presence or concentration of the antigen in the serum.
Ein anderes gebräuchliches fluorometrisches Bestimmungsverfahren, bei welchem die erfindungsgemäßen Probenhalter vorteilhaft eingesetzt werden können, ist das »direkte Verfahren«. Hierbei wird z. B. ein Antigen kovalent an den Probenhalter oder an das Substrat im Testbereich gebunden. Das auf die entsprechenden Antikörper zu untersuchende Humanserum wird mit dem Probenhalter inkubiert. Nach dem Abspülen werden fluoreszenzmarkierte Antihuman-Antikörper von Ziege oder Kaninchen zugegeben, inkubiert und abgespült. Hier ist die vom Testbereich emittierte Fluoreszenz Indiz oder Maß für die Anwesenheit bzw. die Konzentration der Antikörper im Humanserum.Another common fluorometric determination method in which the inventive Sample holders can be used advantageously is the "direct method". Here z. B. an antigen covalently bound to the specimen holder or to the substrate in the test area. That on the corresponding antibodies The human serum to be examined is incubated with the sample holder. After rinsing it will be fluorescence-labeled anti-human antibodies from goat or rabbit added, incubated and rinsed off. Here the fluorescence emitted by the test area is an indication or measure of the presence or the concentration the antibody in human serum.
Die erfindungsgemäßen Probenhalter eignen sich insbesondere für die fluorometrisch^ Bestimmung von Infektionskrankheiten, in deren Verlauf Antikörper gebildet werden. Dazu gehören insbesondere Krankheiten, die für das öffentliche Gesundheitswesen von besonderem Interesse sind, wie Syphilis, Gonorrhöe, »Strepw-Halsinfektionen, Ruhr, Salmonellen-Infektion, Typhus, Tollwut, Serumhepatitis, Influenza-Arten usw. Hierbei können nicht nur die Anwesenheit der Krankheit, d. h. die Antigene, diagnostiziert, sondern auch die Körperschutzimmunitäi gegenüber einer Krankheit, d. h. der Antikörpcr-Titcr, als Ergebnis einer Impfung bestimmt werden. Fin Beispiel für die besondere Eignung dos erfitidungsgemaßen Probenhalters bei dein letztgenannten iluoromeirisehen Unslimmungsvorfahrens ist die Impfung eines Kindes mit D.P.T.-Serum, um Immunität gegen Diphthcrie-Toxin. Pertusin oder Keuchhusten und Tciaivjs zu schaffen. Mit einem einzigen Test kann nun geprüft werden, ob die Impfung voll ecjirilfen hat.d. h. ob alle Antigene in der Weise gewirkt haben, daß genügend immunisierende Antikörper erzeugt wurden. Mit den bekannten Probenhaltern ist eine derartige einfache fluorometrische Bestimmung nicht möglich.The sample holders according to the invention are particularly suitable for the fluorometric determination of infectious diseases, in the course of which antibodies are formed. These include in particular diseases of particular interest to public health, such as syphilis, gonorrhea, »Strepw throat infections, dysentery, salmonella infection, Typhoid, rabies, serum hepatitis, influenza species, etc. Not only the presence of the disease, d. H. the antigens diagnosed, but also the body's protective immunity to a disease, d. H. the antibody titre, can be determined as a result of vaccination. Fin example of special suitability dos according to the invention sample holder at your last-mentioned iluoromeiris discrepancy procedure is vaccinating a child with D.P.T. serum to Immunity to Diphtheria Toxin. Pertusin or whooping cough and tciaivjs to create. With a single Test can now be checked whether the vaccination has fully ecjirilfen. H. whether all antigens worked in the way have that sufficient immunizing antibodies have been generated. With the known specimen grips is one such simple fluorometric determination is not possible.
In entsprechender Weise können die erfindungsgemäßen Probenhalter auch bei der Gütekontrolle in der
Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrie von Nutzen sein.
Beispiele für Verbindungen, welche sich zur Fluoreszenzmarkierung
eignen, sind Fluoreszein (gelb-grün), Fluoreszein-Isothiocyanat (gelb-grün), Lissamin-Rhodamin
B-200 (tief orange), D.A.N.S. 1-Dimethylaminonaphihalin-5-sulfonsäure
(rot), o-Phthalatdehyd (blaugrün) und Fluoreszamin (blau-grün).In a corresponding manner, the sample holders according to the invention can also be useful for quality control in the food and pharmaceutical industries.
Examples of compounds that are suitable for fluorescent labeling are fluorescein (yellow-green), fluorescein isothiocyanate (yellow-green), lissamine-rhodamine B-200 (deep orange), DANS 1-dimethylaminonaphihaline-5-sulfonic acid (red), o-Phthalatedehyde (blue-green) and fluoreszamine (blue-green).
Der Probenhalter besteht aus einem Kunststoffstreifen, auf welchem in den Testbereichen vier quadratische Blättchen aus Cellulose angebracht sind. Jedes der vier Celluloseblättchen enthält in kovalent gebundener Form einen der Immunoglobulin-Antikörper Ziegen-Anti-Human IgA, IgE, IgG und IgM.The sample holder consists of a plastic strip on which four square strips are placed in the test areas Cellulose flakes are attached. Each of the four cellulose flakes contains covalently bound Form one of the goat anti-human immunoglobulin antibodies IgA, IgE, IgG and IgM.
Der Probenhalter wurde wie folgt benutzt: Er wurde in eine Serumprobe eingebracht, welche zuvor mit einem geeigneten Puffer verdünnt worden war. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden wurde er aus der verdünnten Serumprobe herausgenommen. Die Celluloseblättchen hatten sich durch die Reaktion der Antikörper mit den Immunoglobulinen mit einem Belag überzogen. Dieser wurde mit einer Pufferlösung abgespült und danach mit einer Lösung, welche gleich aktive Konzentrationen von mit Fluoreszein-Isothiocyanat markierten Ziegen-Anti-Human IgA, IgE. IgG und IgM, verdünnt mit einem geeigneten Puffer, enthielt, zur Reaktion gebracht und für weitere zwei Stunden inkubiert. Die Streifen wurden wieder gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. Danach wurde jeder der Testbereichc fluorometrisch ausgemessen. Auf diese Weise wurden die relativen Konzentrationen der verschiedenen Immunoglobuline bestimmt.The sample holder was used as follows: It was placed in a serum sample which had previously been treated with a appropriate buffer was diluted. After an incubation period of two hours, it became out of the diluted serum sample. The cellulose flakes had grown due to the reaction of the antibodies coated with the immunoglobulins with a coating. This was rinsed off with a buffer solution and then with a solution containing equal active concentrations of fluorescein isothiocyanate labeled goat anti-human IgA, IgE. IgG and IgM, diluted with a suitable buffer, contained for reaction brought and incubated for another two hours. The strips were washed again and left in the air left to dry. Thereafter, each of the test areas was measured fluorometrically. That way were the relative concentrations of the various immunoglobulins are determined.
Der Probenhalter besteht aus einem Streifen aus Polymethacrylat, auf welchem im Testbereich ein« Kreisscheibe aus Polymethylmethacrylsäure angebracht ist. An die Polymetnylmethacrylsäure-Kreisscheibe sind in willkürlicher Mischung drei verschiedene Anti-Drogen-The sample holder consists of a strip of polymethacrylate on which a circular disk is placed in the test area made of polymethyl methacrylic acid is attached. On the polymethyl methacrylic acid disc are in arbitrary mix of three different anti-drug
r)0 Antikörper kovalent gebunden, nämlich Kaninchen-Anti-Morphin, Kaninchen-Anti-Kokain und Kaninchen-Anti-Barbiturat. r ) 0 antibodies covalently bound, namely rabbit anti-morphine, rabbit anti-cocaine and rabbit anti-barbiturate.
Der Probenhalter wurde wie folgt angewendet. Er wurde mit einer Probe Urin, welche zuvor mit einem geeigneten Puffer verdünnt worden war, behandelt. Nach einstündiger Inkubation wurde die Scheibe mit Pufferlösung abgespült. Anschließend wurde sie in einer Lösung inkubiert, welche aus einer Mischung von Kaninchen-Antikörpern zu den genannten Drogen bestand, verdünnt in einem geeigneten Puffer. Jeder der Antikörper war mit einem unterschiedlichen Fluorov'hrom markiert, nämlich Kaninchen-Anti-Morphin mit Fluoroszamin. Kaninchen-Anti-Kokain mitThe sample holder was used as follows. He was given a urine sample that had previously been taken with a appropriate buffer was diluted. After one hour of incubation, the disc was with Buffer solution rinsed off. It was then incubated in a solution consisting of a mixture of rabbit antibodies to the drugs mentioned, diluted in a suitable buffer. Each of the antibodies was with a different Fluorov'hrom labeled, namely rabbit anti-morphine with fluoroszamine. Rabbit anti-cocaine with
Fluoreszein-Isothiocyanate und Kaninehen-Anti-Barbi-Fluorescein isothiocyanates and rabbit anti-barbari
br> 1 urat mit Lissamin-Rhodamin B-200. Dann wurde der Streifen mit Pufferlösung gewaschen und trocknen gelassen. Der Testbereich wurde fluorometrisch ausgemessen, wobei eine Anregung zuerst bei 390 mn und b r > 1 urate with lissamine-rhodamine B-200. The strip was then washed with buffer solution and allowed to dry. The test area was measured fluorometrically, with an excitation first at 390 mn and
eine Ablesung der Emission bei 485 nm erfolgte, danach
bei 480 bzw. 520 nm und schließlich bei 520 bzw. 595 nm.
Die Anwesenheit von Morphin, Kokain oder Barbiturat
wurde auf diese Weise bestimmt.an emission reading was made at 485 nm, then
at 480 or 520 nm and finally at 520 or 595 nm.
The presence of morphine, cocaine or barbiturate
was determined this way.
2020th
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