DE3784479T2 - DIAGNOSTIC TOOL, ITS PRODUCTION AND USE. - Google Patents
DIAGNOSTIC TOOL, ITS PRODUCTION AND USE.Info
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests und Verfahren zur Durchführung dieser Tests. Insbesondere betrifft sie eine Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit von biologisch aktiven Materialien. Ganz besonders betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die eine mikroporöse Membran umfaßt, auf der Nachweisreagenzien immobilisiert sind, wobei die Membran an einen inerten Träger gebunden ist, was eine bequeme Handhabung der Vorrichtung ermöglicht, indem sie in die zu analysierenden Materialien eingeführt und dann herausgenommen wird. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Vorrichtungen.The invention relates to a device for performing clinical diagnostic tests and to methods for performing these tests. In particular, it relates to a device and methods for detecting and quantifying the presence of biologically active materials. More particularly, the invention relates to a device comprising a microporous membrane on which detection reagents are immobilized, the membrane being bound to an inert support, which allows convenient handling of the device by inserting it into the materials to be analyzed and then removing it. The invention also relates to a method for manufacturing diagnostic devices.
Die moderne medizinische Technik ist in starkem Umfang davon abhängig, die Anwesenheit von schädlichen Organismen, Antikörpern, Enzymen, Toxinen, genetischen Materialien und dgl. in biologischen Proben zu identifizieren. Derzeit werden analytische Verfahren angewandt, mit denen der Nachweis von einfachen chemischen Substanzen, wie Arzneistoffen, Zucker und Metaboliten (biochemische Abbauprodukte) von biologischen Materialien gelingt. Diese Verfahren werden im allgemeinen nach standardmäßigen chemischen analytischen Verfahren durchgeführt, bei denen häufig große Probenmengen erforderlich sind und eine schwierige, zeitraubende Umwandlung der Probe in eine Form erforderlich ist, die durch chemische oder instrumentelle Verfahren, beispielsweise durch colorimetrische Analyse, durch Chromatographie oder durch Massenspektrometrie, analysierbar ist.Modern medical technology is heavily dependent on identifying the presence of harmful organisms, antibodies, enzymes, toxins, genetic materials, and the like in biological samples. Analytical techniques are currently used to detect simple chemical substances such as drugs, sugars, and metabolites (biochemical breakdown products) of biological materials. These techniques are generally performed using standard chemical analytical procedures which often require large sample volumes and require difficult, time-consuming conversion of the sample into a form which can be analyzed by chemical or instrumental techniques such as colorimetric analysis, chromatography, or mass spectrometry.
In letzter Zeit wurden Testpackungen (Test Kits) eingeführt, mit denen die Anwesenheit von einfachen Chemikalien, wie Zucker, oder auch von komplexeren Materialien, wie Enzymen, in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Urin, festgestellt werden kann. Derartige Kits bestehen aus absorbierenden Materialien, die mit einem Reagenz oder einer Kombination von Reagenzien imprägniert sind, welche eine Farbänderung in Gegenwart von bestimmten biologischen Substanzen hervorrufen. Bei diesen Tests wird die Matrix zunächst in die Flüssigkeit eingetaucht, um die Reagenzien mit der interessierenden Substanz in der Flüssigkeit in Kontakt zu bringen. Anschließend wird die Matrix aus der Flüssigkeit entfernt und eine Farbänderung festgestellt. In zahlreichen Fällen muß die Matrix gewaschen oder mit einer Reihe von Reagenzien entwickelt werden, um eine sichtbare Reaktion hervorzurufen. Die sichtbare Veränderung zeigt die Anwesenheit der gesuchten biologischen Chemikalie an. Derartige Testkits werden beispielsweise zum Nachweis von Glucose im Urin und zum Nachweis von Phenylketonurie (Oligophrenia phenylpyruvica oder PKU) verwendet.Recently, test kits have been introduced to detect the presence of simple chemicals such as sugars or more complex materials such as enzymes in biological fluids such as blood or urine. Such kits consist of absorbent materials impregnated with a reagent or combination of reagents that cause a color change in the presence of certain biological substances. In these tests, the matrix is first immersed in the fluid to bring the reagents into contact with the substance of interest in the fluid. The matrix is then removed from the fluid and a color change is observed. In many cases, the matrix must be washed or developed with a series of reagents to produce a visible reaction. The visible change indicates the presence of the biological chemical being sought. Such test kits are For example, it is used to detect glucose in urine and to detect phenylketonuria (oligophrenia phenylpyruvica or PKU).
Derartige Testkits sind wertvoll, da sie häufig nur geringe Mengen an zu testender Flüssigkeit (Probe) und eine geringe Probenvorbereitung erfordern und die Analyse im allgemeinen rasch abläuft. Jedoch sind die Ergebnisse derartiger Tests nicht quantitativ, ausgenommen bestimmte Fälle, bei denen die zu analysierende Substanz in relativ großen Mengen vorhanden ist, beispielsweise Glucose in Urin.Such test kits are valuable because they often require only small amounts of fluid (sample) to be tested, little sample preparation, and the analysis is generally rapid. However, the results of such tests are not quantitative, except in certain cases where the substance to be analyzed is present in relatively large quantities, for example glucose in urine.
In letzter Zeit haben die Fortschritte in der Immunologie, der Genetik und der Biotechnologie zur Entwicklung von wissenschaftlichen Techniken zum Nachweis von überaus geringen Mengen an biologisch aktiven Substanzen geführt, z.B. von Enzymen, Hormonen, Antikörpern, Antigenen und genetischen Materialien. Der Nachweis derartiger Substanzen und die Fähigkeit, sie quantitativ zu bestimmen, würde eine rasche Diagnose von zahlreichen Krankheiten ermöglichen. Ferner würde eine quantitative Bestimmung sowohl eine differentielle Diagnose von Krankheiten als auch die Feststellung, ob eine Krankheit noch im aktiven Stadium ist oder nicht, erlauben.Recently, advances in immunology, genetics and biotechnology have led to the development of scientific techniques for the detection of extremely small amounts of biologically active substances, such as enzymes, hormones, antibodies, antigens and genetic materials. The detection of such substances and the ability to quantify them would enable rapid diagnosis of numerous diseases. Furthermore, quantitative determination would allow both differential diagnosis of diseases and the determination of whether or not a disease is still in an active stage.
Beispielsweise können geringe Menge eines Toxins nach folgendem Verfahren nachgewiesen werden. Das zu analysierende Material kann einer Matrix ausgesetzt werden, auf der ein Antikörper für das Toxin immobilisiert ist. Bei einem Antikörper handelt es sich um ein Protein, das durch lebende Zellen eines Tiers gebildet wird, das eine spezifische Affinität für eine andere (im allgemeinen fremde) biologische Substanz, mit der das Tier in Kontakt kommen kann, aufweist. Jedes dieser Toxine in der Probe bildet dann einen Affinitätskomplex mit dem Antikörper auf der Matrix. Da die Antikörper für die Substanz, mit der sie einen Komplex bilden, spezifisch sind, wird nur das Toxin, dessen Antikörper auf der Matrix immobilisiert ist, eine Bindung damit eingehen. Keine weiteren Toxine oder anderen Materialien in der Probe bilden einen Komplex mit dem Antikörper auf der Matrix. Daher muß die Probe vor der Analyse nicht gereinigt oder in eine zweckmäßigere Form übergeführt werden.For example, small amounts of a toxin can be detected by the following procedure. The material to be analyzed can be exposed to a matrix on which an antibody to the toxin is immobilized. An antibody is a protein produced by living cells of an animal that has a specific affinity for another (generally foreign) biological substance with which the animal may come into contact. Each of these toxins in the sample then forms an affinity complex with the antibody on the matrix. Since the antibodies are specific for the substance with which they form a complex, only the toxin whose antibody is immobilized on the matrix will bind to it. No other toxins or other materials in the sample will form a complex with the antibody on the matrix. Therefore, the sample does not need to be purified or converted to a more convenient form before analysis.
Nachdem das Toxin an die antikörperbeladene Matrix gebunden worden ist, kann die Matrix einer Lösung, die einen weiteren Antikörper für das Toxin enthält, ausgesetzt werden. Dieser Antikörper muß zuerst mit einem chemischen Marker oder "Label" modifiziert werden, was seinen leichten Nachweis ermöglicht. Bei der Markierung kann es sich um ein radioaktives Atom, einen fluoreszierenden Farbstoff oder ein Enzym, das mit anderen Chemikalien unter Bildung einer sichtbaren Färbung reagiert, handeln. Der markierte Antikörper geht eine Bindung mit der Matrix nur in einem solchen Umfang, wie Toxin in der vorhergehenden Stufe an die Matrix gebunden worden ist, ein, da der markierte Antikörper eine Bindung nur mit dem Toxin eingeht.After the toxin has been bound to the antibody-loaded matrix, the matrix can be exposed to a solution containing another antibody for the toxin. This antibody must first be modified with a chemical marker or "label" that allows its easy detection. The label can be a radioactive atom, a fluorescent dye, or an enzyme that reacts with other chemicals to produce a visible color. The labeled antibody binds to the matrix only to the extent that toxin was bound to the matrix in the previous step, since the labeled antibody binds only to the toxin.
Bei einer derartigen Analyse läßt sich der markierte Antikörper leicht nachweisen und quantitativ bestimmen. Da er in der gleichen Menge wie das Toxin vorhanden ist, wird durch dieses Verfahren auch das Toxin quantitativ bestimmt. Es sind verschiedene Variationen dieses Verfahrens bekannt, die alle auf der Fähigkeit von Antikörpern zur Bildung von spezifischen Komplexen mit anderen biologischen Substanzen (als "Antigene" bezeichnet) beruhen. Derartige Tests ermöglichen den Nachweis und die Diagnose von Krankheiten, wie Serumhepatitis. Man verfügt derzeit über die Technologie zur Bildung von großen Mengen an Antikörpern, die für Antigene von zahlreichen Typen spezifisch sind. Daher sollte es möglich sein, eine diagnostische Testausrüstung zum Nachweis von zahlreichen klinisch wichtigen Substanzen zu schaffen.In such an analysis, the labeled antibody is easily detected and quantified. Since it is present in the same amount as the toxin, the toxin is also quantified by this method. Several variations of this method are known, all of which rely on the ability of antibodies to form specific complexes with other biological substances (called "antigens"). Such tests enable the detection and diagnosis of diseases such as serum hepatitis. The technology currently exists to produce large quantities of antibodies specific to antigens of numerous types. Therefore, it should be possible to create diagnostic test kits for the detection of numerous clinically important substances.
Dieser Analysentyp stellte insofern einen großen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar, als die zur Vorbereitung der Probe erforderliche Arbeit vermindert und die untere Nachweisgrenze häufig verbessert wurden. Jedoch haben die Vorrichtungen, die sich derzeit dieser Technik bedienen, wesentliche Nachteile. Diese Nachteile sind: (1) Die verfügbaren Vorrichtungen haben eine begrenzte Empfindlichkeit, da die Trägermatrices nicht optimal für die im Test zu verwendenden Materialien sind, und (2) die verfügbaren Testvorrichtungen sind nicht quantitativ. Die vorliegende Erfindung überwindet diese beiden Nachteile und stellt einen erheblichen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar.This type of analysis represented a major advance over the prior art in that the labor required to prepare the sample was reduced and the lower limit of detection was often improved. However, the devices currently using this technique have significant disadvantages. These disadvantages are: (1) the available devices have limited sensitivity because the support matrices are not optimal for the materials to be used in the test, and (2) the available test devices are not quantitative. The present invention overcomes both of these disadvantages and represents a significant advance over the prior art.
Die Erfindung ist auf eine diagnostische Vorrichtung zum Testen einer Flüssigkeit für den quantitativen Nachweis der Anwesenheit eines biologisch aktiven Materials in der Flüssigkeit abgestellt. Die diagnostische Vorrichtung umfaßt ein längliches Trägerelement, an dem zumindest in einem Teilbereich ein liquophiles, mikroporöses, synthetisches, polymeres Membran-Indikatormedium oder Teststreifen befestigt ist, wobei die Membran eine Oberfläche von 2 bis 12 m²/g, eine Porengröße von 0,04 bis 10 um mit einer Porengrößenverteilung von nicht mehr als ± 15 % aufweist und die Fähigkeit besitzt, daran ein Reagenz in reproduzierbarer Weise zu immobilisieren. Bei der polymeren Membran handelt es sich um eine in Alkohol unlösliche Polyamid-Membran oder eine Polyvinylidendifluorid-Membran.The invention is directed to a diagnostic device for testing a liquid for the quantitative detection of the presence of a biologically active material in the liquid. The diagnostic device comprises an elongate support element to which a liquophilic, microporous, synthetic, polymeric membrane indicator medium or test strip is attached in at least a partial area, the membrane having a surface area of 2 to 12 m²/g, a pore size of 0.04 to 10 µm with a pore size distribution of not more than ± 15% and the ability to immobilize a reagent thereon in a reproducible manner. The polymeric membrane is a Alcohol insoluble polyamide membrane or a polyvinylidene difluoride membrane.
Die Erfindung ist auch auf ein diagnostisches Verfahren zum Testen einer Flüssigkeit zum quantitativen Nachweis eines biologisch aktiven Materials in der Flüssigkeit gerichtet, das folgendes umfaßt: Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem Gehalt an dem zu analysierenden, biologisch aktiven Material mit einem liquophilen, mikroporösen, synthetischen, polymeren Membran-Indikatormedium oder Testfeld, das zumindest an einem Teilbereich eines länglichen Trägerelements befestigt ist und an dem Reagenz immobilisiert ist, mit der das zu analysierende, biologisch aktive Material enthaltenden Flüssigkeit, wobei die Membran eine Oberfläche von 2 bis 12 m²/g und eine Porengröße von 0,04 bis 10 um mit einer Porengrößenverteilung von nicht mehr als ± 15 % aufweist und die Fähigkeit besitzt, das Reagenz daran in reproduzierbarer Weise zu immobilisieren.The invention is also directed to a diagnostic method for testing a fluid for quantitatively detecting a biologically active material in the fluid, comprising: contacting the fluid containing the biologically active material to be analyzed with a liquophilic, microporous, synthetic, polymeric membrane indicator medium or test pad attached to at least a portion of an elongated support member and having the reagent immobilized thereon with the fluid containing the biologically active material to be analyzed, the membrane having a surface area of 2 to 12 m²/g and a pore size of 0.04 to 10 µm with a pore size distribution of no more than ± 15% and having the ability to immobilize the reagent thereon in a reproducible manner.
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Herstellung einer diagnostischen Vorrichtung für biologisch aktive Materialien abgestellt, das folgendes umfaßt: (1) Behandlung eines Indikatormediums oder Testfeldmaterials, um daran eines oder mehrere Testreagenzien zu immobilisieren, und (2) anschließende Herstellung einer diagnostischen Vorrichtung aus einem Teil des behandelten Indikatormediums oder Testfeldmaterials.The invention is further directed to a method of making a diagnostic device for biologically active materials, comprising: (1) treating an indicator medium or test field material to immobilize one or more test reagents thereon, and (2) subsequently making a diagnostic device from a portion of the treated indicator medium or test field material.
Die Tests, die auf einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beruhen, und die Tests, die auf der Identifizierung von genetischem Material (DNA) beruhen, beinhalten jeweils die Umsetzung von zwei Reagenzien. Im erstgenannten Fall findet die Umsetzung zwischen Antikörpern und Antigenen statt und im letztgenannten Fall zwischen DNA und genspezifischen Chemikalien, die als "DNA-Sonden" bezeichnet werden. In beiden Fällen handelt es sich bei einer Komponente des reaktiven Systems - einem Antikörper, einem Antigen oder einer DNA-Sonde - um ein kleines Molekül, das in die Porenstruktur der meisten Matrices, die als Träger verwendet werden können, eindringt. Dagegen kann die zweite Komponente - ein Antigen oder ein genetisches Material - in Formen vorliegen, die in ihrer Größe von molekularer Dimension bis zu gesamten Zellen von mehreren Mikrometern Durchmesser variieren.The tests based on antibody-antigen interaction and the tests based on the identification of genetic material (DNA) both involve the reaction of two reagents. In the former case, the reaction is between antibodies and antigens, and in the latter case, between DNA and gene-specific chemicals called "DNA probes." In both cases, one component of the reactive system - an antibody, an antigen, or a DNA probe - is a small molecule that penetrates the pore structure of most matrices that can be used as a carrier. In contrast, the second component - an antigen or genetic material - can exist in forms that vary in size from molecular dimensions to entire cells several micrometers in diameter.
Wie nachstehend näher erörtert wird, müssen die Materialien, die für die poröse Trägermatrix, d.h. das Indikatormedium oder Testfeld, ausgewählt werden, verschiedene Anforderungen erfüllen. Diese Anforderungen sind: (1) Eine vorbestimmte, in hohem Maße in ihrer Gesamtheit verfügbare Oberfläche, (2) eine sorgfältig definierte und kontrollierte Porengröße und Porengrößenverteilung, (3) eine liquophile und vorzugsweise hydrophile Beschaffenheit und (4) die Fähigkeit, das ausgewählte Reagenz auf reproduzierbare Weise zu immobilisieren.As discussed in more detail below, the materials selected for the porous support matrix, i.e. the indicator medium or test pad, must meet several requirements. These requirements are: (1) A predetermined, highly available in its entirety surface, (2) a carefully defined and controlled pore size and pore size distribution, (3) a liquophilic and preferably hydrophilic nature, and (4) the ability to immobilize the selected reagent in a reproducible manner.
Um die Empfindlichkeit der diagnostischen Vorrichtung zu optimieren, ist es wesentlich, daß sämtliche Materialien vollständig in die poröse Trägermatrix, d.h. in das Indikatormedium oder Testfeld, eindringen. Daher muß die Porengröße des Trägers groß genug sein, daß die größten Reagenzien, d.h. Antigene oder genetisches Material, in den Träger eindringen. Ferner ist es wichtig, die Oberfläche des Indikatormediums auf einem Maximum zu halten, um die Immobilisierung eines größtmöglichen Anteils des Reagenz zu ermöglichen, mit dem Ziel, die Empfindlichkeit zu steigern. Der hier verwendete Ausdruck "Oberfläche" oder "Oberflächenbereich" bezieht sich nicht nur auf die gesamte(n) Oberfläche(n) des Mediums, sondern auch auf die Oberflächen der Mikroporen des Mediums, d.h. die inneren Oberflächen, die während der Verwendung mit der Flüssigkeit in Kontakt kommen. Die verfügbare Oberfläche nimmt mit steigender Porengröße ab. Demzufolge soll es sich für ein vorgegebenes System von Reagenzien bei der optimalen Porengröße für den Träger um die kleinstmögliche Porengröße handeln, die ein vollständiges Eindringen des größten Reaktanten ermöglicht. Diese Größe variiert von Abmessungen im Submikronbereich, wenn es sich beim größten Reaktanten um ein Virus, ein Enzym oder einen Antikörper handelt, bis zu mehreren Mikrometern, wenn es sich beim größten Reaktanten um eine gesamte Zelle oder ein Zellfragment handelt. Die Leichtigkeit und die Vollständigkeit des Eindringens wird auch durch die Benetzungseigenschaften des Indikatormediums beeinflußt, wie nachstehend erörtert wird.In order to optimize the sensitivity of the diagnostic device, it is essential that all materials fully penetrate the porous support matrix, i.e. the indicator medium or test pad. Therefore, the pore size of the support must be large enough to allow the largest reagents, i.e. antigens or genetic material, to penetrate the support. Furthermore, it is important to keep the surface area of the indicator medium to a maximum in order to allow the immobilization of the largest possible proportion of the reagent, with the aim of increasing sensitivity. The term "surface area" or "surface area" as used here refers not only to the total surface area(s) of the medium, but also to the surfaces of the micropores of the medium, i.e. the internal surfaces that come into contact with the liquid during use. The available surface area decreases with increasing pore size. Accordingly, for a given system of reagents, the optimal pore size for the support should be the smallest possible pore size that allows complete penetration of the largest reactant. This size varies from submicron dimensions when the largest reactant is a virus, enzyme or antibody to several micrometers when the largest reactant is an entire cell or cell fragment. The ease and completeness of penetration is also influenced by the wetting properties of the indicator medium, as discussed below.
Um für ein diagnostisches Verfahren quantitative Ergebnisse zu erhalten, müssen die Mengen an Reagenzien, die an das System abgegeben werden, fixiert sein und bei den einzelnen Tests reproduzierbar sein. Das Indikatormedium oder das Testfeld einer diagnostischen Vorrichtung soll daher in der Lage sein, auf seiner Oberfläche in gleichmäßiger Weise eine fixierte Menge an Reagenz pro Volumeneinheit des Indikatormediums oder Testfelds (Membran) in immobilisierter Form aufzunehmen. Unter "Volumeneinheit" des Mediums ist das Volumen gemeint, das von einem Abschnitt des Mediums (Membran), bei einer gegebenen planaren Membranfläche und Dicke, eingenommen wird. Innerhalb dieser Volumeneinheit des Indikatormediums liegt ein Hohlraumvolumen, z.B. 70 %, vor, das für das Eindringen des das Reagenz enthaltenden flüssigen Mediums verfügbar ist. Für eine verfügbare Porengröße ist das Hohlraumvolumen umso größer, je größer die Oberfläche pro Volumeneinheit des Indikatormediums ist, das für die Immobilisierung des Mediums verfügbar ist, und um so größer ist damit die Testempfindlichkeit. Die Oberfläche des Indikatormediums oder des Testfelds der Volumeneinheit (wie vorstehend erwähnt) muß groß sein, um zur Erhöhung der Empfindlichkeit die größtmögliche Menge an Reagenz zu immobilisieren. Ferner müssen zur Erzielung von quantitativen Ergebnissen die Oberfläche der Membran in der Volumeneinheit sowie das Gleichgewicht des Indikatormediums oder Testfelds gleichmäßig verteilt sein, um eine gleichmäßige Immobilisierung des Reagenz zu gewährleisten.In order to obtain quantitative results for a diagnostic procedure, the amounts of reagents delivered to the system must be fixed and reproducible for each test. The indicator medium or test field of a diagnostic device should therefore be able to hold on its surface in an immobilized form a fixed amount of reagent per unit volume of the indicator medium or test field (membrane) in a uniform manner. The term "volume unit" of the medium means the volume occupied by a section of the medium (membrane) for a given planar membrane area and thickness. Within this volume unit of the indicator medium there is a void volume, e.g. 70%, which is required for the penetration of the liquid medium containing the reagent is available. For an available pore size, the larger the surface area per unit volume of indicator medium available for immobilization of the medium, the greater the void volume and hence the greater the test sensitivity. The surface area of the indicator medium or test pad of the unit volume (as mentioned above) must be large to immobilize the largest possible amount of reagent to increase sensitivity. Furthermore, to obtain quantitative results, the surface area of the membrane in the unit volume and the equilibrium of the indicator medium or test pad must be evenly distributed to ensure uniform immobilization of the reagent.
Die Gesamtmenge des immobilisierten Reagenz wird von der Bindungskapazität pro Volumeneinheit des Indikatormediums oder Testfelds und durch dessen Gesamtvolumen festgelegt. Die Reproduzierbarkeit des Tests hängt von der Gleichmäßigkeit des Mediums ab. Daher ist es zur Bereitstellung einer diagnostischen Vorrichtung, die quantitative Ergebnisse, eine hohe Empfindlichkeit und eine gute Reproduzierbarkeit gewährleistet, erforderlich, eine fixierte Menge an immobilisiertem Reaktanten in gleichmäßiger Weise an einem fixierten Volumen des gleichmäßigen Mediums mit hoher Bindungskapazität zu verwenden, wobei dessen Porengröße so festgelegt worden ist, daß die vorstehend dargelegten Anforderungen erfüllt sind, d.h. die Porengröße muß groß genug sein, um einen Zugang des größten Reagenz unter Bereitstellung einer angemessenen Oberfläche zu ermöglichen, wobei zu berücksichtigen ist, daß bei zunehmender Porengröße die Oberfläche abnimmt. Materialien, die sich als geeignet für das Indikatormedium oder Testfeld in den erfindungsgemäßen diagnostischen Vorrichtungen erwiesen haben, sind liquophile, mikroporöse Membranen, die nachstehend näher erläutert werden. Das Indikatormedium oder Testfeld (Membran) darf nicht in nachteiliger Weise mit Substanzen, die sich in Proben, Reagenzien oder Lösungsmitteln, die in den Analysen eingesetzt werden, finden. Ferner sollten die verwendeten Membranen im wesentlichen frei von extrahierbaren Substanzen sein, die den durchgeführten speziellen Test nachteilig beeinflussen könnten. Um ein gutes Eindringen und eine gleichmäßige Verteilung der Testreagenzien zu gewährleisten, muß die Membran liquophil sein, d.h. sie muß spontan durch die Testflüssigkeiten benetzbar sein. Ferner muß das Indikatormedium oder Testfeld aus den vorstehend erörterten Gründen eine große Oberfläche in Verbindung mit einer Porengröße, die ein Eindringen des größten Testreagenz oder Reaktanten ermöglicht, aufweisen. Membranen, mit Oberflächen von mindestens 2 m²/g bis zu 12 m²/g oder darüber in Verbindung mit einer Porengröße im Bereich von 0,04 bis 10 um und insbesondere von 0,1 bis 5 um sind zufriedenstellend. Die Porengrößen der erfindungsgemäß als Indikatormedium oder Testfeld geeigneten Membranen werden durch Messung des KL-Werts der Membran bestimmt. Der KL-Wert entspricht im wesentlichen dem Blasenbildungspunkt, "foam-all-over point" und anderen ähnlichen Techniken, die dem Fachmann geläufig sind.The total amount of immobilized reagent is determined by the binding capacity per unit volume of the indicator medium or test field and by its total volume. The reproducibility of the test depends on the uniformity of the medium. Therefore, in order to provide a diagnostic device which ensures quantitative results, high sensitivity and good reproducibility, it is necessary to use a fixed amount of immobilized reactant in a uniform manner in a fixed volume of the uniform medium with high binding capacity, the pore size of which has been determined to meet the requirements set out above, ie the pore size must be large enough to allow access of the largest reagent while providing an adequate surface area, taking into account that as the pore size increases the surface area decreases. Materials which have been found to be suitable for the indicator medium or test field in the diagnostic devices according to the invention are liquophilic, microporous membranes, which are explained in more detail below. The indicator medium or test field (membrane) must not interact adversely with substances found in samples, reagents or solvents used in the analyses. Furthermore, the membranes used should be essentially free of extractable substances that could adversely affect the specific test being performed. To ensure good penetration and uniform distribution of the test reagents, the membrane must be liquophilic, ie it must be spontaneously wettable by the test liquids. Furthermore, for the reasons discussed above, the indicator medium or test field must have a large surface area in combination with a pore size that allows the largest test reagent or reactant to penetrate. Membranes with surface areas of at least 2 m²/g up to 12 m²/g or more in combination with a pore size in the range from 0.04 to 10 µm and in particular from 0.1 to 5 µm are satisfactory. The pore sizes of the membranes suitable as indicator medium or test field according to the invention are determined by measuring the KL value of the membrane. The KL value corresponds essentially to the bubble formation point, "foam-all-over point" and other similar techniques familiar to the person skilled in the art.
Die Porengröße steht gemäß folgender Formel mit KL in Beziehung:The pore size is related to KL according to the following formula:
D = C/KLD = C/CL
worin D die Porengröße in um, KL den in psi gemessenen KL-Wert und C eine Konstante bedeutet, die einen Wert von etwa 10 hat, wenn Wasser als benetzende Flüssigkeit für die KL-Messung verwendet wird. Diese Beziehung ist in der Veröffentlichung NM 900a, September 1980, der Firma Pall Corporation beschrieben. Die als Indikatorinedium oder Testfeld verwendeten Membranen besitzen typischerweise Porengrößenverteilungen von nicht mehr als ± 15 % der auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmten Porengröße, vorzugsweise nicht mehr als ± 10 %.where D is the pore size in µm, KL is the KL value measured in psi and C is a constant having a value of about 10 when water is used as the wetting liquid for the KL measurement. This relationship is described in Pall Corporation publication NM 900a, September 1980. The membranes used as indicator media or test fields typically have pore size distributions of no more than ± 15% of the pore size determined in the manner described above, preferably no more than ± 10%.
Membranen, die zur Verwendung als Indikatormedium oder Testfeld geeignet sind, weisen typischerweise Hohlraumvolumina im Bereich von 60 bis 90 % und vorzugsweise im Bereich von 70 bis 90 % auf. Bevorzugte Materialien besitzen eine hydrophile Natur und sind daher leicht mit Wasser benetzbar und neigen dazu, wäßrige Lösungen frei durchlaufen zu lassen.Membranes suitable for use as an indicator medium or test pad typically have void volumes in the range of 60 to 90%, and preferably in the range of 70 to 90%. Preferred materials are hydrophilic in nature and are therefore easily wettable with water and tend to allow aqueous solutions to pass freely.
Zu erfindungsgemäß geeigneten liquophilen, mikroporösen Membranen gehören in Alkohol unlösliche Polyamid-Membranen und Polyvinylidendifluorid-Membranen, die durch eine entsprechende Behandlung, beispielsweise durch eine Oberflächenmodifikation, liquophil gemacht worden sind. Unter den hier verwendeten Ausdruck "in Alkohol unlösliche Polyamid-Membranen", fallen auch modifizierte Polyamid-Membranen, die ein in Alkohol unlösliches Polyamid als Hauptbestandteil enthalten.Liquophilic, microporous membranes suitable for the invention include alcohol-insoluble polyamide membranes and polyvinylidene difluoride membranes which have been made liquophilic by an appropriate treatment, for example by surface modification. The term "alcohol-insoluble polyamide membranes" as used here also includes modified polyamide membranes which contain an alcohol-insoluble polyamide as the main component.
Der hier verwendete Ausdruck "liquophile Beschaffenheit" bezieht sich auf die spontane Benetzbarkeit der Membran durch die Flüssigkeit(en), die damit in Kontakt kommen. Die Benetzbarkeit oder liquophile Beschaffenheit einer Struktur, z.B. einer Membran, stellt eine Funktion der kritischen Oberflächenenergie dieser Struktur und der Oberflächenspannung der aufgebrachten Flüssigkeit dar. Ist die kritische Oberflächenenergie mindestens ebenso hoch wie die Oberflächenspannung der Flüssigkeit, so wird die Flüssigkeit spontan die Struktur benetzen. Beispielsweise wird eine mikroporöse Membran mit einer kritischen Oberflächenenergie von 0,72 N/m (72 dyn/cm) oder darüber von Wasser, das eine Oberflächenspannung von 0,72 N/m (72 dyn/cm) besitzt, benetzt, d.h. die Membran ist hydrophil.The term "liquophilic nature" as used here refers to the spontaneous wettability of the membrane by the liquid(s) that come into contact with it. The wettability or liquophilic nature of a structure, e.g. a membrane, is a function of the critical surface energy of that structure and the surface tension of the applied liquid. If the critical surface energy is at least as high as the surface tension of the liquid, the liquid will spontaneously wet the structure. For example, a microporous membrane with a critical surface energy of 0.72 N/m (72 dyn/cm) or more will be wetted by water which has a surface tension of 0.72 N/m (72 dyn/cm), ie the membrane is hydrophilic.
Geeignete Membranen müssen dazu in der Lage sein, mit dem Reagenz, das zur Durchführung eines speziellen Tests oder einer Umsetzung mit der zu analysierenden Substanz in einer Probe verwendet wird, behandelt zu werden und dieses festzuhalten oder zu immobilisieren. Wie vorstehend erwähnt, muß das Reagenz zur Erzielung quantitativer Ergebnisse auf der Oberfläche der Membran in gleichmäßiger Weise in einer fixierten Menge und in reproduzierbarer Weise immobilisiert werden. Die Notwendigkeit einer gleichmäßigen Immobilisierung und einer hohen Empfindlichkeit macht die Verwendung einer gleichmäßigen, homogenen Membran erforderlich und schließt die Verwendung eines faserartigen/auf Harz basierenden Systems als Indikatormedium aus, und zwar aufgrund (1) der nicht-homogenen Beschaffenheit des Systems, (2) der von Natur aus gegebenen geringen Oberfläche der Fasern und (3) der nicht-diskriminierenden Porengrößen von derartigen faserartigen Systemen mit stark variierenden Porengrößen, die sich aus einer willkürlichen Kreuzung der Fasern ergeben. Der Reaktant, der ionischer, molekularer oder makromolekularer Natur sein kann, kann auf der Reaktionsschicht durch starke physikalische Kräfte oder durch Bindung in bestimmter Weise, beispielsweise durch kovalente chemische Kupplung, an der Oberfläche der Membranschicht immobilisiert werden.Suitable membranes must be capable of being treated with and retaining or immobilizing the reagent used to perform a specific test or reaction with the analyte in a sample. As mentioned above, to obtain quantitative results, the reagent must be immobilized on the surface of the membrane uniformly, in a fixed amount, and in a reproducible manner. The need for uniform immobilization and high sensitivity requires the use of a uniform, homogeneous membrane and precludes the use of a fibrous/resin-based system as an indicator medium due to (1) the non-homogeneous nature of the system, (2) the inherently small surface area of the fibers, and (3) the non-discriminatory pore sizes of such fibrous systems with widely varying pore sizes resulting from random crossing of the fibers. The reactant, which can be ionic, molecular or macromolecular in nature, can be immobilized on the reaction layer by strong physical forces or by binding in a certain way, for example by covalent chemical coupling, to the surface of the membrane layer.
Wie vorstehend erwähnt, stellt die Benetzbarkeit oder liquophile Beschaffenheit der erfindungsgemäß als Indikatormedium oder Testfeld verwendeten Membranen eine Voraussetzung dafür dar, daß (1) ein vollständiges und gleichmäßiges Eindringen der reagenzhaltigen Flüssigkeit und daher die vollständige Verwendung der Membran und die gleichmäßige Immobilisierung des Reagenz auf der Oberfläche der Membran sowie (2) ein vollständiges und gleichmäßiges Eindringen der den Analyten, d.h. der zu analysierenden Substanz, enthaltenden Flüssigkeit gewährleistet werden. Bei bevorzugten Membranen, die erfindungsgemäß als Indikatormedium oder Testfeld verwendet werden, handelt es sich um von Natur aus hydrophile oder mit Wasser benetzbare Membranen.As mentioned above, the wettability or liquophilic nature of the membranes used according to the invention as indicator medium or test field is a prerequisite for ensuring (1) complete and uniform penetration of the liquid containing the reagent and therefore complete use of the membrane and uniform immobilization of the reagent on the surface of the membrane and (2) complete and uniform penetration of the liquid containing the analyte, i.e. the substance to be analyzed. Preferred membranes used according to the invention as indicator medium or test field are naturally hydrophilic or water-wettable membranes.
Die besonders hohe Bindungskapazität, Gleichmäßigkeit, kontrollierte Porengröße und hohe Oberfläche der hydrophilen, mikroporösen Nylon 66-Membranen, die im US-Patent 4,340,479 beschrieben sind und von der Firma Pall Corporation unter der Warenbezeichnung BIODYNE A vertrieben werden, machen diese Membranen als Indikatormedium oder Testfeld besonders geeignet. Im Grunde handelt es sich bei den im US-Patent 4,340,479 beschriebenen hydrophilen, mikroporösen, Polyamid-Filtermembranen um Membranen, die aus in Alkohol unlöslichen Polyamidharzen mit einem Methylen-Amid-Verhältnis im Bereich von 5:1 bis 7:1 hergestellt worden sind. Zu Membranen dieser Gruppe gehören Copolymere von Hexamethylendiamin und Adipinsäure (Nylon 66), Copolymere von Hexamethylendiamin und Sebacinsäure (Nylon 610), Homopolymere von Poly-ε-caprolactam (Nylon 6) und Copolymere von Hexamethylendiamin und Azelainsäure (Nylon 69).The particularly high binding capacity, uniformity, controlled pore size and high surface area of the hydrophilic, microporous nylon 66 membranes described in US Patent 4,340,479 and The special properties of the membranes sold by Pall Corporation under the trade name BIODYNE A make these membranes particularly suitable as indicator media or test fields. Basically, the hydrophilic, microporous, polyamide filter membranes described in US Patent 4,340,479 are membranes made from alcohol-insoluble polyamide resins with a methylene-amide ratio in the range of 5:1 to 7:1. Membranes in this group include copolymers of hexamethylenediamine and adipic acid (nylon 66), copolymers of hexamethylenediamine and sebacic acid (nylon 610), homopolymers of poly-ε-caprolactam (nylon 6) and copolymers of hexamethylenediamine and azelaic acid (nylon 69).
Eine weitere bevorzugte Membran ist POSIDYNE , die ebenfalls von der Firma Pall Corporation vertrieben wird. POSIDYNE ist eine hydrophile, mikroporöse, hautlose Nylon 66-Membran mit Oberflächeneigenschaften, die durch quaternäre Ammoniumgruppen eines Polyamin-Epichlorhydrin-Polymeren oder Harzes, das mit dem Nylon 66 gemeinsam gegossen wird, kontrolliert werden.Another preferred membrane is POSIDYNE, also sold by Pall Corporation. POSIDYNE is a hydrophilic, microporous, skinless nylon 66 membrane with surface properties controlled by quaternary ammonium groups of a polyamine-epichlorohydrin polymer or resin co-molded with the nylon 66.
Eine weitere bevorzugte Membran ist IMMUNODYNE , die von der Firma Pall Corporation vertrieben wird. IMMUNODYNE ist eine modifizierte CARBOXYDYNE -Membran, die ebenfalls von der Firma Pall Corporation vertrieben wird. Bei CARBOXYDYNE handelt es sich um eine hydrophile, mikroporöse, hautlose Nylon 66-Membran mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften, die durch das im US-Patent 4,707,266 beschriebene Verfahren zum gemeinsamen Vergießen hergestellt wird, wie nachstehend näher erörtert wird, insbesondere durch gemeinsames Vergießen von Nylon 66 und eines Polymeren mit einer großen Menge an Carboxylgruppen unter Bildung einer Membran mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften, die durch funktionelle Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche gekennzeichnet sind. IMMUNODYNE -Membranen können aus CARBOXYDYNE -Membranen durch Behandlung mit Trichlor-s-triazin gemäß dem nachstehend erörterten Verfahren des US-Patents 4,693,985 hergestellt werden.Another preferred membrane is IMMUNODYNE, sold by Pall Corporation. IMMUNODYNE is a modified CARBOXYDYNE membrane, also sold by Pall Corporation. CARBOXYDYNE is a hydrophilic, microporous, skinless nylon 66 membrane with controlled surface properties, prepared by the co-molding process described in U.S. Patent 4,707,266, as discussed in more detail below, particularly by co-molding nylon 66 and a polymer having a large amount of carboxyl groups to form a membrane with controlled surface properties characterized by functional carboxyl groups on its surface. IMMUNODYNE membranes can be prepared from CARBOXYDYNE membranes by treatment with trichloro-s-triazine according to the method of U.S. Patent 4,693,985 discussed below.
Polyvinylidendifluorid-Membranen sind nicht von Natur aus mit Wasser benetzbar, aber sie können durch eine entsprechende Oberflächenbehandlung in diesen Zustand versetzt werden. Mikroporöse Polyvinylidendifluorid-Membranen, die hydrophil ausgerüstet worden sind, sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Pall Corporation unter der Handelsbezeichnung FLUORODYNE und von der Millipore Corporation als hydrophiles DURAPORE . Wie vorstehend erörtert, stellt die Benetzbarkeit oder liquophile Beschaffenheit eine Funktion der kritischen Oberflächenenergie der Struktur und der Oberflächenspannung der Flüssigkeit dar. Die Benetzbarkeit kann auch als Eindringdruck angegeben werden, der erforderlich ist, daß eine Flüssigkeit in die Poren der Membran eindringt. Obgleich der Eindringdruck eine Funktion der Eigenschaften der verwendeten Flüssigkeit, wie der Oberflächenspannung, ist, werden Membranmaterialien besonders bevorzugt, die Eindringdrücke von Null oder in der Nähe davon aufweisen.Polyvinylidene difluoride membranes are not naturally wettable with water, but they can be made so by appropriate surface treatment. Microporous polyvinylidene difluoride membranes that have been rendered hydrophilic are commercially available, for example from Pall Corporation under the trade name FLUORODYNE and from Millipore Corporation as hydrophilic DURAPORE . As discussed above, wettability or liquophilicity is a function of the critical surface energy the structure and surface tension of the liquid. Wettability can also be expressed as the penetration pressure required for a liquid to penetrate the pores of the membrane. Although penetration pressure is a function of the properties of the liquid used, such as surface tension, membrane materials that have penetration pressures of or close to zero are particularly preferred.
Wie vorstehend erwähnt, besitzen als Indikatormedium geeignete Membranen große Oberflächen, typischerweise von 2 bis 12 m²/g oder sogar darüber. Diese Eigenschaft ermöglicht es, daß eine größere Menge oder eine höhere Konzentration an Reaktant im Indikatormedium immobilisiert wird. Demgemäß lassen sich höhere Empfindlichkeiten unter Verwendung der erfindungsgemäßen diagnostischen Vorrichtung erzielen.As mentioned above, membranes suitable as indicator media have large surface areas, typically from 2 to 12 m²/g or even more. This property allows a larger amount or a higher concentration of reactant to be immobilized in the indicator medium. Accordingly, higher sensitivities can be achieved using the diagnostic device of the invention.
Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Polyamiden gehören in Alkohol unlösliche Nylonarten des im US-Patent 4,340,479 beschriebenen Typs. Wie vorstehend erwähnt, handelt es sich bei einem Membranmaterial dieser Druckschrift, das für die Erfindung besonders geeignet ist, um eine mikroporöse, hydrophile Nylon-Membran (Nylon 66), die von der Firma Pall Corporation unter der Handelsbezeichnung BIODYNE vertrieben wird.Preferred polyamides for use in the present invention include alcohol-insoluble nylons of the type described in U.S. Patent 4,340,479. As previously mentioned, one membrane material of that patent that is particularly suitable for use in the invention is a microporous hydrophilic nylon membrane (Nylon 66) sold by Pall Corporation under the trade name BIODYNE.
Ferner gehören zu den bevorzugten Polyamid-Membranen der Erfindung hydrophile, mikroporöse, hautlose, in Alkohol unlösliche Polyamid-Membranen mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften der in den US-Patenten 4,707,266 und 4,702,840 beschriebenen Typen. Diese hydrophilen, mikroporösen, in Alkohol im wesentlichen unlöslichen Polyamid-Membranen mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften werden durch gemeinsames Vergießen eines in Alkohol unlöslichen Polyamidharzes mit einem wasserlöslichen, die Membranoberfläche modifizierenden Polymeren mit funktionellen polaren Gruppen gebildet. Wie die bevorzugten hydrophilen, mikroporösen Nylonmembranen, bei denen keine kontrollierten, oberflächenmodifizierten polaren Gruppen vorhanden sind, sind die erfindungsgemäß als Indikatormedium oder Testfeld verwendeten Polyamid-Membranen ebenfalls hautlos, d.h. sie sind durch durchgehende Poren charakterisiert, die sich von einer Oberfläche zur anderen erstrecken und im wesentlichen von gleichmäßiger Größe und Form sind. Gegebenenfalls können Materialien mit konischen, durchgehenden Poren, d.h. Poren, die auf einer Oberfläche der Folie größer sind und sich in Richtung zur gegenüberliegenden Oberfläche der Folie verengen, verwendet werden.Further preferred polyamide membranes of the invention include hydrophilic, microporous, skinless, alcohol-insoluble polyamide membranes with controlled surface properties of the types described in U.S. Patents 4,707,266 and 4,702,840. These hydrophilic, microporous, substantially alcohol-insoluble polyamide membranes with controlled surface properties are formed by co-casting an alcohol-insoluble polyamide resin with a water-soluble membrane surface modifying polymer having functional polar groups. Like the preferred hydrophilic, microporous nylon membranes that do not contain controlled, surface-modified polar groups, the polyamide membranes used as an indicator medium or test pad in the present invention are also skinless, i.e., they are characterized by continuous pores that extend from one surface to the other and are of substantially uniform size and shape. Optionally, materials with tapered, continuous pores, i.e., pores that are larger on one surface of the film and narrow toward the opposite surface of the film, can be used.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäß geeigneten Polyamid-Membranen mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften verwendeten oberflächenmodifizierenden Polymeren umfassen Polymere, die wesentliche Anteile an chemisch funktionellen Gruppen, wie Hydroxyl-, Carboxyl-, Amin- und Imingruppen, enthalten. Als Ergebnis enthalten die Membranen an ihren Oberflächen hohe Konzentrationen an funktionellen Gruppen, wie Hydroxyl, Carboxyl, Amin, Imin oder eine Kombination von beliebigen der vorerwähnten Gruppen, die nicht miteinander reagieren. Diese Polyamid-Membranen mit kontrollierten Oberflächeneigenschaften besitzen höhere Konzentrationen an Carboxyl- oder Imingruppen an ihren Oberflächen als die übrigen bevorzugten, vorstehend beschriebenen, in Alkohol unlöslichen, mikroporösen, hydrophilen, hautlosen Polyamid-Membranen, die keine kontrollierten Oberflächeneigenschaften besitzen, d.h. Membranen, die aus dem bevorzugten Polyamidharz hergestellt sind, aber nicht mit einem oberflächenmodifizierenden Polymeren gemeinsam vergossen worden sind.The surface-modifying polymers used to make the polyamide membranes with controlled surface properties useful in the present invention include polymers containing substantial amounts of chemically functional groups such as hydroxyl, carboxyl, amine and imine groups. As a result, the membranes contain on their surfaces high concentrations of functional groups such as hydroxyl, carboxyl, amine, imine or a combination of any of the foregoing groups which do not react with one another. These polyamide membranes with controlled surface properties have higher concentrations of carboxyl or imine groups on their surfaces than the other preferred alcohol-insoluble, microporous, hydrophilic, skinless polyamide membranes described above which do not have controlled surface properties, i.e., membranes made from the preferred polyamide resin but which have not been co-cast with a surface-modifying polymer.
Die verwendeten Membranen können nach beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren zur Abscheidung und/oder zur Bindung von Reagenzien daran behandelt werden. Wie vorstehend angegeben, kann das Reagenz ionischer, molekularer oder makromolekularer Natur sein. Bei Verwendung eines diagnostischen Hilfsmittels zur Erzeugung einer sichtbaren Veränderung, kann es sich bei dem Reagenz um eine Substanz oder eine Kombination von Substanzen handeln, die ursprünglich farblos sind und die bei Umsetzung mit einem geeigneten Material eine optisch meßbare Reaktion ergeben. Weitere mögliche Variationen umfassen die Verwendung von geeigneten Markierungen, d.h. daß beispielsweise zwischen dem abgeschiedenen Reagenz und dem zu testenden Material ein Komplex oder eine Verbindung gebildet wird, die nach einer beliebigen bekannten Technik, z.B. durch eine enzymatische Substratmarkierung oder dgl., markiert ist.The membranes used can be treated by any method known to those skilled in the art for depositing and/or binding reagents thereto. As stated above, the reagent can be ionic, molecular or macromolecular in nature. When using a diagnostic tool to produce a visible change, the reagent can be a substance or combination of substances that are initially colorless and that, when reacted with a suitable material, produce an optically measurable reaction. Other possible variations include the use of suitable labels, i.e., for example, forming a complex or compound between the deposited reagent and the material to be tested, which is labeled by any known technique, e.g. by enzymatic substrate labeling or the like.
Die Behandlung des Indikatormediums oder Testfelds (Membran) der diagnostischen Vorrichtung mit einem oder mehreren geeigneten Reagenzien kann zu dem Zeitpunkt vorgenommen werden, zu dem die diagnostischen Tests durchgeführt werden. Speziell können das oder die Testreagenzien unmittelbar vor dem Kontakt der Testvorrichtung mit der die zu analysierende Probe enthaltenden Flüssigkeit versetzt werden, beispielsweise durch Auftupfen des oder der Reagenzien auf die auf dem Trägerelement befestigte Membran. Jedoch wird erwartet, daß die Erfindung am stärksten auf diagnostische Vorrichtungen (eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung) Anwendung findet, die durch Behandlung des Indikatormediums oder Testfeldmaterials mit einem oder mehreren Testreagenzien zur Immobilisierung von einem oder mehreren Testreagenzien darauf und durch anschließende Zubereitung der individuellen diagnostischen Vorrichtungen aus einem Teil des so behandelten Materials hergestellt worden sind. Beispielsweise kann ein Band oder Endlosstreifen einer Membran mit dem oder den Reagenzien behandelt werden. Anschließend wird diese Membran auf das als Trägerelement verwendete Material aufgebracht, wonach individuelle diagnostische Vorrichtungen hergestellt werden. Diese Vorgehensweise wird im nachstehenden Beispiel 1 näher beschrieben. Zu weiteren Varianten gehören: (1) Auflegen eines behandelten Bands einer Membran auf die Oberseite eines zweiten, breiteren unbehandelten Bands der gleichen Membran, um ein kontrolliertes Hintergrundmedium vor der Herstellung der individuellen diagnostischen Vorrichtungen bereitzustellen, und (2) Auflegen eines Streifens des oder der Reagenzien auf ein Band der Membran, um den kontrollierten Hintergrund innerhalb eines einzigen Membranstücks bereitzustellen.Treatment of the indicator medium or test field (membrane) of the diagnostic device with one or more suitable reagents may be carried out at the time the diagnostic tests are carried out. In particular, the test reagent(s) may be added immediately before contact of the test device with the liquid containing the sample to be analyzed, for example by dabbing the reagent(s) onto the membrane attached to the support member. However, the invention is expected to have the greatest application to diagnostic devices (a preferred embodiment of the invention) which are prepared by treating the indicator medium or test field material with one or more test reagents for immobilizing one or more test reagents thereon and then preparing the individual diagnostic devices from a portion of the material so treated. For example, a ribbon or continuous strip of membrane may be treated with the reagent(s). This membrane is then applied to the material used as a support element, after which individual diagnostic devices are prepared. This procedure is described in more detail in Example 1 below. Other variations include: (1) placing a treated ribbon of membrane on top of a second, wider untreated ribbon of the same membrane to provide a controlled background medium prior to preparing the individual diagnostic devices, and (2) placing a strip of the reagent(s) on a ribbon of membrane to provide the controlled background within a single piece of membrane.
Ein geeignetes Verfahren zur Bindung von Reagenzien von molekularer Natur, insbesondere von Makromolekülen und ganz besonders solcher von biologischer Natur, ist im US-Patent 4,693,985 beschrieben. Dieses Patent beschreibt ein Verfahren zum Immobilisieren einer Vielzahl von biologisch aktiven Substanzen als Akzeptormoleküle auf aktiven Membranen. Die in diesem Patent beschriebenen, akzeptorgebundenen Membranen, sind dazu in der Lage, eine Vielzahl von biologisch aktiven Verbindungen, insbesondere Liganden, an den Akzeptormolekülen zu immobilisieren und zu binden. Die Verwendung derartiger Reaktionsschichten oder Membranen ermöglicht das Testen von Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, und dgl. Es ermöglicht auch das Testen von speziellen Substanzen durch chemische Assays oder Immunoassays, z.B. von solchen, bei denen eine spezielle Markierung verwendet wird, wie einer Markierung, die eine Enzymaktivität oder Radioaktivität anzeigt oder elektromagnetische Energie absorbiert und/oder emittiert, z.B. eine fluoreszierende Markierung. Die Makromoleküle, die als Reagenzien verwendet und an die Oberflächen der mikroporösen Membran gebunden werden oder die zur Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung bestimmt werden, umfassen im allgemeinen Materialien biologischer Natur und besitzen häufig eine proteinartige Natur. Zu den Reagenzien oder Akzeptormolekülen, die direkt an die Reaktionsschicht oder den zu testenden Liganden gebunden sind, gehören Immunoglobuline oder Antikörper (entweder polyklonal oder monoklonal), antigene Substanzen, Apoproteine, Rezeptoren, Glykoproteine, Lectine, Kohlenhydrate, Hormone, Enzyme, Trägerproteine, Heparin, Koagulationsfaktoren, Enzymsubstrate, Inhibitoren, Kofaktoren, Nucleinsäuren und dgl.A suitable method for binding reagents of a molecular nature, particularly macromolecules and most particularly those of a biological nature, is described in US Patent 4,693,985. This patent describes a method for immobilizing a variety of biologically active substances as acceptor molecules on active membranes. The acceptor-bound membranes described in this patent are capable of immobilizing and binding a variety of biologically active compounds, particularly ligands, to the acceptor molecules. The use of such reaction layers or membranes enables the testing of body fluids such as blood, serum, plasma, urine, saliva, and the like. It also enables the testing of specific substances by chemical assays or immunoassays, e.g. those using a special label, such as a label indicating enzyme activity or radioactivity or absorbing and/or emitting electromagnetic energy, e.g. a fluorescent label. The macromolecules used as reagents and bound to the surfaces of the microporous membrane or intended for use in the device of the invention generally comprise materials of a biological nature and are often proteinaceous in nature. The reagents or acceptor molecules bound directly to the reaction layer or to the ligand to be tested include immunoglobulins or antibodies (either polyclonal or monoclonal), antigenic substances, apoproteins, receptors, glycoproteins, lectins, carbohydrates, Hormones, enzymes, carrier proteins, heparin, coagulation factors, enzyme substrates, inhibitors, cofactors, nucleic acids, etc.
Es ist darauf hinzuweisen, daß eine Vielzahl von diagnostischen Vorrichtungen zum Testen von Flüssigkeit für den Nachweis der Anwesenheit einer Substanz in dieser Flüssigkeit verwendet werden können. Beispielsweise kann die diagnostische Vorrichtung oder der Teststreifen einen länglichen Streifen oder Trägerelement mit einer zur Handhabung ausreichenden Steifigkeit und ein Testfeld oder Indikatormedium, das am Ende oder in der Nähe eines Endes des Trägerelements, d.h. nahe dem Ende, das dem zur Handhabung vorgesehenen Ende gegenüberliegt, befestigt ist, umfaßt. Alternativ kann ein zweites Testfeld oder Indikatormedium auf der Seite des Trägerelements befestigt werden, die der Seite, auf der bereits ein Testfeld oder Indikatormedium befestigt ist, gegenüberliegt.It should be noted that a variety of diagnostic devices can be used to test fluid to detect the presence of a substance in that fluid. For example, the diagnostic device or test strip may comprise an elongated strip or support member having sufficient rigidity to facilitate handling and a test pad or indicator medium secured to or near one end of the support member, i.e., near the end opposite the end intended for handling. Alternatively, a second test pad or indicator medium may be secured to the side of the support member opposite the side to which a test pad or indicator medium is already secured.
Ferner kann ein Testfeld oder Indikatormedium, das beispielsweise die halbe Breite des Trägerelements aufweist, an einem unbehandelten Hintergrundmedium für Vergleichszwecke, d.h. als Basislinie oder Referenz, befestigt werden.Furthermore, a test field or indicator medium, which has, for example, half the width of the carrier element, can be attached to an untreated background medium for comparison purposes, i.e. as a baseline or reference.
Ferner kann eine Öffnung in der Nähe von einem Ende des länglichen Streifens oder Trägerelements ausgebildet sein, an dem das Testfeld oder Indikatormedium befestigt wird. Eine derartige Anordnung erleichtert das Eindringen von Flüssigkeit und das Spülen.Furthermore, an opening may be formed near one end of the elongated strip or support member to which the test pad or indicator medium is attached. Such an arrangement facilitates liquid penetration and flushing.
Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich um eine Testvorrichtung, in der eine Öffnung im Trägerelement ausgebildet ist, in der ein zusammengesetztes Testfeld oder Indikatormedium, das durch zwei oder mehr Schichten charakterisiert ist, befestigt ist. Bei einer derartigen Anordnung kann es sich bei der einen Schicht um ein unbehandeltes Medium, die als Referenz oder Basislinie dient, handeln, während es sich bei der anderen Schicht um das behandelte Testfeld oder Indikatormedium handelt. Beim Betrieb kann eine derartige Anordnung optisch zunächst an einer Seite, d.h. der Referenz- oder Basislinienseite, und sodann auf der anderen Seite abgelesen werden. Das erfindungsgemäß verwendete längliche Trägerelement kann aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt sein und verschiedene Formen aufweisen. Das Material besitzt typischerweise eine längliche, rechteckige Gestalt, beispielsweise mit 6,4 cm (2,5 Zoll) bis 10,2 cm (4 Zoll) Länge und 0,5 cm (0,2 Zoll) bis 1,0 cm (0,4 Zoll) Breite. Vorzugsweise handelt es sich um einen Polyester- oder Celluloseacetat-Film von beispielsweise 0,2 mm (8/1000 Zoll) bis 0,4 mm (15/1000 Zoll) Dicke.Another embodiment is a test device in which an opening is formed in the support member in which a composite test pad or indicator medium characterized by two or more layers is secured. In such an arrangement, one layer may be an untreated medium serving as a reference or baseline, while the other layer is the treated test pad or indicator medium. In operation, such an arrangement may be optically read first on one side, i.e., the reference or baseline side, and then on the other side. The elongated support member used in the invention may be made from a variety of materials and may have various shapes. The material typically has an elongated rectangular shape, for example, 6.4 cm (2.5 inches) to 10.2 cm (4 inches) long and 0.5 cm (0.2 inches) to 1.0 cm (0.4 inches) wide. Preferably it is a polyester or cellulose acetate film, for example 0.2 mm (8/1000 inch) to 0.4 mm (15/1000 inch) thick.
Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Polypropylen oder dgl. Im Grunde bestehen die Kriterien für die Auswahl des Trägerelements in der Gewährleistung einer ausreichenden Steifigkeit, die die Handhabung der Testvorrichtung ermöglicht, und darin, daß keinerlei Wechselwirkung mit der Testflüssigkeit besteht, d.h., daß es inert ist.Another possibility is to use polypropylene or similar. Basically, the criteria for selecting the support element are to ensure sufficient rigidity to allow the handling of the test device and that there is no interaction with the test liquid, i.e. that it is inert.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von erläuternden und nichtbeschränkenden Beispielen näher beschrieben.The invention is described in more detail below using illustrative and non-limiting examples.
Eine Vorrichtung zum Waschen und quantitativen Nachweis des Antikörpers für das Rinderhormon Glucagon wird auf folgende Weise hergestellt.A device for washing and quantitatively detecting the antibody to the bovine hormone glucagon is prepared in the following manner.
Eine IMMUNODYNE -Membran (Handelsprodukt der Firma Pall Corporation, wie vorstehend angegeben) mit einer Porengröße von 0,2 um und einer BET-Oberfläche von 8,44 m²/g wurde zunächst gemäß den nachstehenden Angaben in kontrollierter Weise mit Glucagon beladen. 100 mg Glucagon (Produkt Nr. 345995 der Firma Calbiochem Inc.) wurden in 1 ml einer 0,1 n wäßrigen Natriumhydroxidlösung gelöst. 10 ul dieser Lösung wurden sodann zu 100 ml einer Lösung eines 0,01 m Natriumphosphatpuffers (pH-Wert 7,0) mit einer Konzentration an 0,15 in Natriumchlorid (nachstehend als "phosphatgepufferte Kochsalzlösung" oder "PBS" bezeichnet) versetzt, wobei eine Lösung mit einem Gehalt an 10 ug/ml Glucagon erhalten wurde. Ein Stück Immunodyne der Abmessungen 7,6 cm (3 Zoll) x 20,3 cm (8 Zoll) wurde in 10 ml dieser Lösung getaucht. Die Membran wurde unmittelbar nach dem Kontakt mit der Lösung benetzt, was anzeigt, daß die Flüssigkeit das Hohlraumvolumen der Membran in ihrer Gesamtheit ausfüllte und sämtliche inneren Porenflächen kontaktiert wurden. Man ließ die Membran 1 Stunde in Kontakt mit der Lösung, um eine chemische Bindung herbeizuführen. Anschließend wurde die Membran 1/2 Stunde bei 40ºC in einem Trockenschrank getrocknet. Sodann wurde die Membran 1 Stunde in 15 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,5 g Casein pro 100 ml PBS getaucht, zweimal mit aufeinanderfolgenden Portionen von 25 ml PBS unter Bewegen gewaschen und erneut 1/2 Stunde bei 40ºC in einem Trockenschrank getrocknet.An IMMUNODYNE membrane (commercial product of Pall Corporation, as specified above) with a pore size of 0.2 µm and a BET surface area of 8.44 m2/g was first loaded with glucagon in a controlled manner as follows. 100 mg of glucagon (product no. 345995 from Calbiochem Inc.) was dissolved in 1 ml of a 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution. 10 µl of this solution was then added to 100 ml of a solution of 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) at a concentration of 0.15 in sodium chloride (hereinafter referred to as "phosphate buffered saline" or "PBS") to obtain a solution containing 10 µg/ml of glucagon. A piece of Immunodyne measuring 7.6 cm (3 in.) x 20.3 cm (8 in.) was immersed in 10 ml of this solution. The membrane was wetted immediately after contact with the solution, indicating that the liquid filled the entire void volume of the membrane and that all of the internal pore surfaces were contacted. The membrane was left in contact with the solution for 1 hour to induce chemical bonding. The membrane was then dried in an oven at 40ºC for 1/2 hour. The membrane was then immersed in 15 ml of a solution containing 0.5 g of casein per 100 ml of PBS for 1 hour, washed twice with successive portions of 25 ml of PBS with agitation, and again dried in an oven at 40ºC for 1/2 hour.
Eine 180 mm breite Rolle eines 254 um (10 mil) dicken Celluloseacetatfilms wurde auf einer Seite mit einem 32 mm breiten Streifen von MA-27, einem Acryl-Haftkleber der Firma Adhesive Research, Inc., beschichtet. Der Streifen wurde mit einem Beschichtungsgewicht von 3,2 g/m² (0,95 oz/yd²) in der Mitte des Films bei Verlaufen in Längsrichtung oberhalb der Rolle bei deren Abwickeln aufgebracht. Um die Struktur während der Handhabung zu schützen, wurde die Klebstoffschicht mit einer Schutzschicht aus Abziehpapier bedeckt, das auf beiden Seiten silikonisiert war, um ein leichtes Entfernen oder Abziehen vom Klebstoff vorzunehmen. Nach der anschließenden Entfernung des Abziehpapiers wurde ein 32 mm breiter Streifen der mit Glucagon beladenen IMMUNODYNE -Membran auf ein 20,3 cm (8 Zoll) langes Stück des beschichteten Celluloseacetatfilms direkt über den 32 mm breiten Klebstoffstreifen aufgebracht. Das IMMUNODYNE wurde sodann mit einem Druck von etwa 140 g/cm² (2 psi) gegen den Film gepreßt, um eine gleichmäßige Bindung des Films ohne Beschädigung der Porenstruktur des IMMUNODYNE zu gewährleisten.A 180 mm wide roll of 254 µm (10 mil) thick cellulose acetate film was coated on one side with a 32 mm wide strip of MA-27, an acrylic pressure sensitive adhesive from Adhesive Research, Inc. The strip was applied at a coating weight of 3.2 g/m² (0.95 oz/yd²) in the center of the film, running lengthwise above the roll as it was unwound. To maintain the structure during To protect the adhesive layer from handling, the adhesive layer was covered with a protective layer of release paper that was siliconized on both sides to facilitate easy removal or peeling of the adhesive. After subsequent removal of the release paper, a 32 mm wide strip of glucagon-loaded IMMUNODYNE membrane was applied to a 20.3 cm (8 inch) long piece of coated cellulose acetate film directly over the 32 mm wide adhesive strip. The IMMUNODYNE was then pressed against the film with a pressure of approximately 140 g/cm² (2 psi) to ensure uniform bonding of the film without damaging the pore structure of the IMMUNODYNE.
Das 20,3 cm (8 Zoll) lange Stück des beschichteten Celluloseacetats mit dem darauf angebrachten IMMUNODYNE -Streifen wurde in Streifen von 90 mm Länge und 8 mm Breite geschnitten, wobei das IMMUNODYNE sich auf einer Seite eines Streifenendes befand und Abmessungen von 16 mm (Länge) und 8 mm (Breite) aufwies.The 20.3 cm (8 inch) piece of coated cellulose acetate with the IMMUNODYNE strip attached was cut into strips 90 mm long and 8 mm wide, with the IMMUNODYNE on one side of one end of the strip and measuring 16 mm (length) and 8 mm (width).
Die Vorrichtung von Beispiel 1 wurde zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit des Antikörpers gegenüber dem Rinderhormon Glucagon in fötalem Kälberserum verwendet. Die Anwesenheit eines Antikörpers gegenüber einer der eigenen Ausscheidungen des Tiers würde dabei als Anzeichen für eine Autoimmunerkrankung gelten. Typische Beispiele für derartige Erkrankungen sind rheumatoide Arthritis und Lupus erythematodes. Der Nachweis und die quantitative Bestimmung von Antikörpern in fötalem Kälberserum ist in den Beispielen 2 bis 5 erläutert.The device of Example 1 was used to detect and quantify the presence of the antibody to the bovine hormone glucagon in fetal calf serum. The presence of an antibody to one of the animal's own excretions would be considered an indication of an autoimmune disease. Typical examples of such diseases are rheumatoid arthritis and lupus erythematosus. The detection and quantification of antibodies in fetal calf serum is explained in Examples 2 to 5.
Das Ende von einer der gemäß den Angaben in Beispiel 1 hergestellten Vorrichtungen mit dem Membranindikatormedium oder -Testfeld wurde 90 Minuten in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an 1,5 ml fötalem Kälberserum getaucht. Nach Herausnahme aus dem Serum wurde die Vorrichtung unter Bewegen (jeweils 1 Minute) dreimal nacheinander in 1,5 ml-Portionen PBS mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100, einem nicht-ionogenen polyethoxylierten Nonylphenol-Detergens der Firma Rohm NS Haas Co. gewaschen. Sodann wurde es (jeweils 1 Minute) in zwei aufeinanderfolgenden 1,5 ml- Portionen PBS bewegt. Anschließend wurde die Vorrichtung 90 Minuten in 1,5 ml PBS mit einem Gehalt an 190 000 Zählimpulsen pro Minute ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Produkt Nr. NEX 155 der Firma New England Nuclear) getaucht. Nach Herausnahme aus dieser Lösung wurde die Vorrichtung unter Bewegen (jeweils 1 Minute) in drei aufeinanderfolgenden 1,5 ml-Portionen PBS mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100 gewaschen.The end of one of the membrane indicator medium or test pad devices prepared as in Example 1 was immersed in a test tube containing 1.5 ml of fetal calf serum for 90 minutes. After removal from the serum, the device was washed with agitation (1 minute each) three times in successive 1.5 ml portions of PBS containing 0.1% Triton X-100, a non-ionic polyethoxylated nonylphenol detergent from Rohm NS Haas Co. It was then agitated (1 minute each) in two successive 1.5 ml portions of PBS. The device was then immersed in 1.5 ml of PBS containing 190,000 counts per minute 125I-labeled goat anti-rabbit IgG (product number NEX 155 from New England Nuclear) for 90 minutes. After removal from this solution, the device was washed with agitation (1 minute each) in three successive 1.5 ml portions of PBS containing 0.1% Triton X-100.
Die auf der Vorrichtung verbleibende Radioaktivität wurde nach üblichen Verfahren unter Verwendung eines γ-Strahlenzählgeräts LKB/Wallace Mini Gamma Modell Nr. 1275 gemessen. Es ergaben sich 2019 cpm (Zählimpulse pro Minute) an restlicher γ-Aktivität. Diese Daten sind in Tabelle I tabellenförmig zusammengestellt, was auch für die Daten der nachstehenden Beispiele 3 bis 5 gilt.The radioactivity remaining on the device was measured by standard procedures using an LKB/Wallace Mini Gamma Model No. 1275 gamma ray counter. The result was 2019 cpm (counts per minute) of residual gamma activity. These data are tabulated in Table I, as are the data in Examples 3 through 5 below.
Eine weitere Vorrichtung von Beispiel 1 wurde gemäß den Angaben in Beispiel 2 behandelt, mit der Ausnahme, daß das fötale Kälberserum 0,004 ul pro 1 ml eines handelsüblichen Präparats von Kaninchen-anti- (Rinderglucagon)-IgG (Produkt Nr. 969133 der Firma Calbiochem) enthielt. Beim Zählen der restlichen Radioaktivität ergab die Vorrichtung 2302 cpm.Another device from Example 1 was treated as described in Example 2, except that the fetal calf serum contained 0.004 µl per 1 ml of a commercial preparation of rabbit anti- (bovine glucagon) IgG (Calbiochem Product No. 969133). When the residual radioactivity was counted, the device yielded 2302 cpm.
Eine dritte, gemäß Beispiel 1 hergestellte Vorrichtung wurde gemäß Beispiel 2 behandelt, mit der Ausnahme, daß das fötale Kälberserum 0,04 ul Kaninchen-anti-(Rinderglucagon)-IgG pro 1 ml fötalem Kälberserum enthielt, d.h. das fötale Kälberserum wies die 10-fache Antikörperkonzentration des fötalen Kälberserums von Beispiel 3 auf. Beim Zählen der restlichen Radioaktivität ergab die Vorrichtung 2893 cpm.A third device prepared according to Example 1 was treated according to Example 2, except that the fetal calf serum contained 0.04 µl of rabbit anti-(bovine glucagon) IgG per 1 ml of fetal calf serum, i.e., the fetal calf serum had 10 times the antibody concentration of the fetal calf serum of Example 3. When counting the residual radioactivity, the device yielded 2893 cpm.
Eine vierte, gemäß Beispiel 1 hergestellte Vorrichtung wurde gemäß Beispiel 2 behandelt, mit der Ausnahme, daß das fötale Kälberserum 0,4 ul Kaninchen-anti-(Rinderglucagon) IgG pro 1 ml des fötalen Kälberserums enthielt, d.h. das fötale Kälberserum wies die 100-fache Konzentration des fötalen Kälberserums von Beispiel 3 auf. Beim Zählen der restlichen Radioaktivität ergab die Vorrichtung 5747 cpm. Tabelle I Vorrichtung von Beispiel Antikörperkonzentration (ul/ml) Zählimpulse/MinuteA fourth device prepared according to Example 1 was treated according to Example 2 except that the fetal calf serum contained 0.4 µl of rabbit anti-(bovine glucagon) IgG per 1 ml of the fetal calf serum, ie, the fetal calf serum had 100 times the concentration of the fetal calf serum of Example 3. When the residual radioactivity was counted, the device yielded 5747 cpm. Table I Device of Example Antibody concentration (ul/ml) Counts/minute
Die Daten in Tabelle I zeigen, daß es eine besondere Übereinstimmung zwischen der auf der Vorrichtung gezählten Radioaktivität und der Menge an anti-Glucagon-Antikörper im fötalem Kälberserum gibt. Eine derartige 1:1-Entsprechung ermöglicht es, die Radioaktivität als Anzeige für die Konzentration des anti-Glucagon-Antikörpers im Serum heranzuziehen, was zeigt, daß das analytische Verfahren quantitativ ist.The data in Table I show that there is a particular correspondence between the radioactivity counted on the device and the amount of anti-glucagon antibody in fetal calf serum. Such a 1:1 correspondence enables radioactivity to be used as an indicator of the concentration of anti-glucagon antibody in serum, which shows that the analytical procedure is quantitative.
Eine Vorrichtung wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Porengröße des IMMUNODYNE -Membran-Indikatormediums oder -Testfelds 5,0 um und die Oberfläche 3,24 m²/g betrugen. Diese Vorrichtung wurde sodann gemäß Beispiel 2 behandelt. Beim Zählen der restlichen Radioaktivität ergaben sich 1698 cpm. Dieser Wert ist in Tabelle II zusammen mit den Daten der vorstehenden Beispiele 2 und 3 und des nachstehenden Beispiels 7 aufgeführt.A device was prepared as in Example 1, except that the IMMUNODYNE membrane indicator medium or test pad had a pore size of 5.0 µm and a surface area of 3.24 m2/g. This device was then treated as in Example 2. The residual radioactivity was counted as 1698 cpm. This value is shown in Table II along with the data from Examples 2 and 3 above and Example 7 below.
Eine Vorrichtung wurde gemäß Beispiel 6 hergestellt. Diese Vorrichtung wurde sodann gemäß Beispiel 3 behandelt. Beim Zählen der restlichen Radioaktivität ergaben sich 1640 cpm. Tabelle II Vorrichtung von Beispiel IMMUNODYNE -Porengröße, um Antikörperkonzentration (ul/ml) Zählimpulse/Minute Oberfläche¹ (m²/g) ¹Gemessen nach einer standardmäßigen BET-Technik gemäß den Angaben in "Automated Instrument for Adsorption Desorption Isotherms", von J. E. Shields und S. Lowell, American Laboratory, November 1984, S. 81, unter Verwendung eines Autosorb-1 Modell Sorptometer der Firma Quantachrome.A device was prepared according to Example 6. This device was then treated according to Example 3. The residual radioactivity was counted to be 1640 cpm. Table II Device of Example IMMUNODYNE Pore Size to Antibody Concentration (µl/ml) Counts/minute Surface Area¹ (m²/g) ¹Measured by a standard BET technique as described in "Automated Instrument for Adsorption Desorption Isotherms," by JE Shields and S. Lowell, American Laboratory, November 1984, p. 81, using a Quantachrome Autosorb-1 Model Sorptometer.
Die Tabelle II erläutert den erkennbaren Radioaktivitätsunterschied der Vorrichtungen der Beispiele 2 und 3, was zeigt, daß bei Herstellung einer diagnostischen Vorrichtung unter Verwendung eines 0,2 um IMMUNODYNE -Indikatormediums oder -Testfelds der Immunoassay empfindlich genug war, um die Anwesenheit von Antikörper in einer geringen Konzentration, z.B. 0,004 ul/ml, nachzuweisen. Im Gegensatz dazu wurde bei einer Vorrichtung mit einem 5,0 pm IMMUNODYNE -Indikatormedium oder -Testfeld (Beispiele 6 und 7) kein signifikanter Unterschied zwischen der Vorrichtung, die einer Antikörperkonzentration von 0 ausgesetzt war, und der Vorrichtung, die einer Konzentration von 0,004 ul/ml ausgesetzt war, nachgewiesen. Demzufolge konnte bei Verwendung eines 5,0 um IMMMUNODYNE - Trägers eine Antikörperkonzentration von nur 0,004 ul/ml nicht nachgewiesen werden. Dies zeigt, daß für den Glucagon-Antikörper-Immunoassay eine Porengröße von 0,2 um im Membranträger gegenüber einer Porengröße von 5,0 um bevorzugt wird, was auf die erhöhte Empfindlichkeit des sich ergebenden Assays zurückzuführen ist. In diesem Fall weist das größte Reagenz des Immunoassay-Systems molekulare Abmessungen auf und es ist zu erwarten, daß es vollkommen in die Porenstruktur sowohl der 0,2 um- als auch der 5,0 um-Membranträger eindringen kann. Es wird angenommen, daß die erhöhte Empfindlichkeit des mit dem 0,2 um-Träger durchgeführten Immunoassays auf die größere Oberfläche dieses Trägers im Vergleich zur Oberfläche des 5,0 um Trägers zurückzuführen ist, d.h. 8,44 m²/g gegenüber 3,24 m²/g.Table II illustrates the discernible radioactivity difference of the devices of Examples 2 and 3, showing that when a diagnostic device was prepared using a 0.2 µm IMMUNODYNE® indicator medium or test pad, the immunoassay was sensitive enough to detect the presence of antibody at a low concentration, e.g., 0.004 µl/ml. In contrast, for a device using a 5.0 µm IMMUNODYNE® indicator medium or test pad (Examples 6 and 7), no significant difference was detected between the device exposed to 0 antibody concentration and the device exposed to 0.004 µl/ml concentration. Thus, when a 5.0 µm IMMUNODYN - support, an antibody concentration as low as 0.004 µl/ml could not be detected. This indicates that for the glucagon antibody immunoassay, a pore size of 0.2 µm in the membrane support is preferred over a pore size of 5.0 µm, due to the increased sensitivity of the resulting assay. In this case, the largest reagent of the immunoassay system is of molecular dimensions and is expected to be able to penetrate completely into the pore structure of both the 0.2 µm and 5.0 µm membrane supports. It is believed that the increased sensitivity of the immunoassay performed with the 0.2 µm support is due to the larger surface area of this support compared to the surface area of the 5.0 µm support, i.e. 8.44 m²/g versus 3.24 m²/g.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch zum Nachweis von Antikörpern gegenüber vollständigen Zellen sowie von Antikörpern gegenüber biologischen Molekülen verwendet werden. In derartigen Fällen müssen die Poren des Membranträgers in der Vorrichtung groß genug sein, um ein Eindringen der Zellen (Antigen) in den Träger zu ermöglichen. Auf diese Weise kann die maximale Empfindlichkeit gegenüber dem Antikörper erreicht werden. Ist die Porengröße zu gering, um ein Eindringen des Antigens zu ermöglichen, so lassen sich sehr geringe Mengen an Antikörper nicht nachweisen.The device according to the invention can also be used to detect antibodies to whole cells and antibodies to biological molecules. In such cases, the pores of the membrane carrier in the device must be large enough to allow the cells (antigen) to penetrate the carrier. In this way, the maximum sensitivity to the antibody can be achieved. If the pore size is too small to allow the antigen to penetrate, very small amounts of antibody cannot be detected.
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