DE2535279B2

DE2535279B2 - PROCEDURE FOR ANALYZING THE THYROID HORMONE CONTENT OF A BLOOD SERUM SAMPLE

Info

Publication number: DE2535279B2
Application number: DE19752535279
Authority: DE
Inventors: Harold East Brunswick N.J. Bates (V.StA.)
Original assignee: Center for Laboratory Medicine, Metuchen, N.J. (V.St.A.)
Priority date: 1974-08-08
Filing date: 1975-08-07
Publication date: 1976-10-28
Also published as: JPS5221891A; DE2535279A1; FR2281569B3; BE832234A; FR2281569A1; SE7508819L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren des Thyroid-Hormongehalts einer Blutserumprobe.The invention relates to a method for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample.

Die Serum- und Plasma-Proteine, im wesentlichen Albumin, Alpha-, Beta- und Gamma-Globulin, Fibrinogen u. dgl., haben die Eigenschaft, Substanzen wie Thyroid-Hormone im Blutstrorn an sich zu binden.The serum and plasma proteins, essentially albumin, alpha, beta and gamma globulin, fibrinogen and the like, have the property of binding substances such as thyroid hormones in the bloodstream.

Gemäß dem Stand der Technik wird eine Blutserumprobe auf verschiedenerlei Art behandelt, um diese Komponenten aus dem Serum-Protein abzutrennen. Im allgemeinen sind derartige Abtrennungsverfahren nur unvollständig und erfordern die Anwendung eines Prozentfaktors auf die gewonnenen analytischen Daten, um die vollständige Analyse zu erstellen.According to the prior art, a blood serum sample is treated in various ways in order to obtain it Separate components from the serum protein. In general, such separation processes are only incomplete and require the application of a percentage factor to the analytical data obtained, to do the full analysis.

So sind zum Beispiel Thyroid-Hormone, Thyroxin und Triiodothionin üblicherweise im Serum von menschlichem Blut vorhanden und an thyrobindendcs Protein gebunden, wie z. B. Alpha-Globulin, das als Thyroxinbindendes Globulin (TBG) bekannt ist. Um die Thyroid-Hormone voi. ihrem Binde-Protein zu trennen, ist es üblich, mit einem Alkohol, wie z. B. Methanol, Äthanol oder Butanol, Tetrahydrofuran od. dgl. zu extrahieren. Andere Verfahrer verwenden Säuren, wie z. B. verdünnte Salzsäure mit einem pH-Wert von etwa 1.5. Sobald das Thyroid-Hormon mittels solcher Verfahren extrahiert ist, und zwar normalerweise bis zu einem Anteil von nur 65-75 Prozent von dem Gesamtanteil, muß das extrahierte Hormon sorgfältig von der übrigen Probe abgetrennt werden, um nachfolgende Wiederbindung oder sonstige Bindung an das Protein zu verhindern. Die- gemäß dem Stande der so Technik verwendeten Verfahren benutzen als Trennmittel ζ. B. die Ultra-Zentrifugi'jrung, die Absorption auf einem anorganischen, sorbierenden Material, Dextrangel-Extraktionskolonnen u. dglFor example, thyroid hormones, thyroxine, and triiodothionine are commonly found in human serum Blood present and bound to thyrobinding protein, such as B. Alpha globulin, which binds as thyroxine Globulin (TBG) is known. To get the thyroid hormones voi. to separate their binding protein, it is common to use an alcohol such as B. methanol, ethanol or butanol, tetrahydrofuran or the like. To extract. Other processors use acids such as B. dilute hydrochloric acid with a pH of about 1.5. Once the thyroid hormone is extracted through such procedures, usually up to Only 65-75 percent of the total, the extracted hormone must be carefully be separated from the rest of the sample for subsequent rebinding or other binding to to prevent the protein. The methods used according to the state of the art are used as release agents ζ. B. Ultra-Zentrifugi'jrung, the absorption an inorganic sorbent material, dextran gel extraction columns and the like

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Analysieren ss des Thyroid-Hormongehalts finer Blutserumprobe ist demgegenüber durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs angegebenen Verfahrensscbritte gekennzeichnet. The method according to the invention for analyzing ss the thyroid hormone content of a blood serum sample, on the other hand, is determined by that in the characterizing part of the Claim specified procedural steps.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die («> komplette Trennung der obenerwähnten Komponenten von ihren bindenden Proteinen durch Anwendung des proteolylischen Enzyms, Pepsir, erreicht. Dieses Verfahren trennt nicht nur das zj analysierende Material vollständig von seinem bincenden Protein, sondern <>s zerstört im wesentlichen die verbleibenden Bindekräftc des Proteins und vermeidet damit, in den meisten Fällen und für die meisten analytischen Verfahren, die Notwendigkeit des Entfernens der jeweiligen abgetrennten Substanz aus der Reaktionsmischung. Außerdem wird jegliche verbleibende Enzym-Aktivität, falls solche irgendeine Wirkung auf das nachfolgende Analyse-Verfahren haben sollte, sehr leicht dadurch zerstört, daß die Bedingungen der Reaktionsmischung verändert werden. Dies geschieht dadurch, daß die Mischung auf einen pH-Wert eingestellt wird, bei welchen das Enzym inaktiv ist.With the method according to the invention, the («> complete separation of the above-mentioned components of their binding proteins through the use of the proteolylic enzyme, pepsir. This method not only completely separates the material to be analyzed from its binding protein, but <> s essentially destroys the remaining binding forces of the protein and thus avoids, in most cases and for most analytical procedures, the need to remove the respective severed Substance from the reaction mixture. It also removes any remaining enzyme activity, if so such should have any effect on the subsequent analysis procedure, very easily by doing so destroyed that the conditions of the reaction mixture are changed. This happens because the Mixture is adjusted to a pH value at which the enzyme is inactive.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.The invention is explained in more detail below using an exemplary embodiment.

Man stellt mittels einer wäßrigen hydrochlorigen Säure gleiche Teile eines auf Thyroid-Hormone zu analysierenden Blutserums und einer Pepsin-Lösung mit einem Pepsin-Gehalt von etwa 10 000 bis etwa 80 000 Pepsin-Einheiten pro ml auf einen pH-Wert von 1,0 ein. Nach einer Inkubation bei Raumtemperaturen auf 22 bis 27° Celsius über eine Zeitdauer von 30 Minuten oder bei einer Temperatur von 37 bis 45° Celsius über eine Zeitdauer von 10 Minuten sind alle Thyroid-Hormone von den bindenden Proteinen freigesetzt, und alle Bindungen der thyrobindenden Proteine sind zerstört. Dies wird mittels der folgenden experimentellen Proben gezeigt.Equal parts of a thyroid hormone are added using an aqueous hydrochloric acid analyzing blood serum and a pepsin solution with a pepsin content of about 10,000 to about 80,000 Pepsin units per ml to a pH of 1.0. After incubation at room temperature to 22 to 27 ° Celsius for a period of 30 minutes or at a temperature of 37 to 45 ° Celsius for a By 10 minutes, all of the thyroid hormones are released from the binding proteins, and all of them Bonds of the thyrobinding proteins are destroyed. This is done using the following experimental samples shown.

Ein menschliches Serum, das 2,4 Mikrogramm^g)/ Thyroxin pro 100 ml enthält, wurde mit bekannten Mengen von L-Thyroxin angereichert. Die derart angereicherte Serum-Probe wurde behandelt mit gleichen Volumenteilen einer Pepsin-Lösung, die zwischen 10 000 und 80 000 Pepsin-Einheiten pro ml enthielt, eingestellt mittels verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0. Sodann überließ man die Proben bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 30 Minuten der Inkubation. Den Proben wurde ein Barbitur-Puffer bei einem pH-Wert von 8,6 beigefügt. Die gepufferten Lösungen wurden sodann durch das auf konkurrierender Proteinbindung (CPB) beruhende bekannte Verfahren auf Thyroxin geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben:A human serum that is 2.4 micrograms ^ g) / Thyroxine per 100 ml has been fortified with known amounts of L-thyroxine. That kind of Enriched serum sample was treated with equal parts by volume of a pepsin solution that contained between 10,000 and 80,000 pepsin units per ml, adjusted by means of dilute hydrochloric acid a pH of 1.0. The samples were then left at room temperature for a period of 30 minutes Minutes of incubation. A barbitur buffer at pH 8.6 was added to the samples. The buffered solutions were then modified by competitive protein binding (CPB) based known procedures tested for thyroxine. The results are given in Table I below:

Table I.

ThyroxinThyroxine Thyroxin-Thyroxine Prozent-Percent- berechnetcalculated PrüfwcrteCheck values RückBack gewinnungextraction (Hg/100 ml)(Hg / 100 ml) (iig/IOOml)(iig / IOOml) 2,42.4 2,52.5 104104 7,47.4 7,37.3 9999 12,412.4 12,612.6 101101 17,417.4 17,217.2 9999

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen ganz deutlich, daß die Pepsin-Digestion alle thyrobindenden Proteine zerstört und das gesamte gebundene Thyroxin freisetzt.The results presented above clearly show that pepsin digestion is all thyrobing Destroys proteins and releases all bound thyroxine.

Es wurden jeweils mit A, B, C und D gekennzeichnete Reagenzgläser benutzt, um den Einfluß vom hinzugefügten destillierten Wasser auf die Bindung von ^12r"'l-Thyraxin auf das Serum Protein nachzuweisen, ferner den Einfluß von verdünnter Salzsäure von einem pH-Wert von 1,0 auf die Bindung von ^I2fll-Thyroxin auf Serum-Protein, die Wirkung einer sauren Pepsin-Lösung auf die Bindung von ¹²⁵I-Thyroxin auf Serum-Protein und die Wirkung einer sauren Pepsin-Lösung auf die Bindung von ^I25l-Thyoxin auf Wasser. Test tubes labeled A, B, C and D were used to demonstrate the influence of the added distilled water on the binding of ^12r "'l-thyraxine to the serum protein, as well as the influence of dilute hydrochloric acid with a pH of 1.0 on the binding of ^I2fl l-thyroxine to serum protein, the effect of an acidic pepsin solution on the binding of ¹²⁵ I-thyroxine to serum protein and the effect of an acidic pepsin solution on the binding of ^I25 l- Thyoxine on water.

Die Inhalte der Reagenzgläser sind in der folgenden Tabelle Il wiedergegeben:The contents of the test tubes are shown in the following table II:

Table II

Glas AGlass A Glas BGlass B Glas CGlass C Glas DGlass D Normale menschliche SeraNormal human sera 0.3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml ¹²³U-Thyroxin ¹²³ U-thyroxine 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml Destilliertes WasserDistilled water 0.3 ml0.3 ml —- —- 0,3 ml0.3 ml Verdünnte Salzsäure (pH 1,0)Diluted hydrochloric acid (pH 1.0) __ 0.3 ml0.3 ml —- —- Pepsin (3,000 Einheiten pro 0,3 ml, in verdünnterPepsin (3,000 units per 0.3 ml, in dilute —- —- 0,3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml Salzsäure, pH 1,0)Hydrochloric acid, pH 1.0)

Die vier Reagenzgläser wurden bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 30 Minuten der Inkubation ausgesetzt. Am Ende der Inkubation wurden 4,0 ml eines Natrium-BarbiUir-Puffers (0,075 M, pH 8,6) hinzugefügt und mit den Inhalten eines jeden Reagenzglases vermischt. Die Radioaktivität jedes Reagenzglases wurde mit einem Gammazähler gemessen. Sämtliche Reagenzgläser zeigten denselben Grad von Radioaktivität, nämlich 64 600 Ausschläge pro Minute. Jedes Reagenzglas wurde sodann in einen Amicon-Ultrafütrations-Kegel mit einem Zentrifugierrohr überführt. Die Rohre wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur und bei 2,200 g zentrifugiert. Das gesamte Ultrafiltrat wurde aufgefangen und die Radioaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben:The four test tubes were incubated at room temperature for a period of 30 minutes exposed. At the end of the incubation, 4.0 ml of a sodium BarbiUir buffer (0.075 M, pH 8.6) was added and mixed with the contents of each test tube. The radioactivity of each test tube was measured with a gamma counter. All test tubes showed the same level of radioactivity, namely 64,600 rashes per minute. Each test tube was then placed in an Amicon ultrafiltration cone transferred with a centrifuge tube. The tubes were left on for 45 minutes at room temperature and centrifuged at 2,200 g. All of the ultrafiltrate was collected and the radioactivity measured. The results are given in Table III:

Table IH

Radioaktivität
vor Ultrafiltration radioactivity
before ultrafiltration

Radioaktivität
nach Ultrafiltration radioactivity
after ultrafiltration

(cpm)(cpm)

Thyroxin (1) Bindung (5)Thyroxine (1) Binding (5)

Glas A
Glas B
Glas C
Glas DGlass A
Glass B
Glass C
Glass D

64,600
64.600
64.600
64,60064,600
64,600
64,600
64,600

490
29,245
63,555
63,365490
29.245
63.555
63,365

99,9599.95

54,6054.60

1,621.62

1,911.91

mit destilliertem Wasser aufgefüllt und auf einen End-pH-Wert eingestellt, sofern erforderlich.topped up with distilled water and adjusted to a final pH value, if necessary.

Ein gewöhnliches für radioimmunologische AnalysenA common one for radioimmunological analysis

is geeignetes Reagenzglas kann dann mit der Vorratslösung überzogen werden. Es werden nun 0,1 ml eines zu prüfenden Serums hinzugefügt, der Inhalt im Reagenzglas gemischt, für eine Zeitdauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur der Inkubation ausgesetzt, neutralisiert, und sodann mittels bekannter Verfahren der Prüfung auf Thyroxin ausgesetzt. Es können auch Tabletten hergestellt werden, die das Enzym, die Säure sowie nicht reagierende Füllstoffe wie z. B. Laktose u. dgl. enthalten. Eine derartige Zusammensetzung ist im folgenden beschrieben:A suitable test tube can then be coated with the stock solution. 0.1 ml of a serum to be tested is then added, the contents are mixed in the test tube, incubated for a period of 30 minutes at room temperature, neutralized and then tested for thyroxine using known methods. Tablets can also be made which contain the enzyme, acid and non-reactive fillers such as e.g. B. Lactose and the like. Contain. Such a composition is described below:

Die Ergebnisse zeigen ganz klar, daß die Thyroxin-Bindungen des Serum-Proteins durch Inkubieren des Serum-Proteins bei einem pH-Wert von 1,0 über eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 3000 Pepsin-Einheiten vollständig zerstört sind. Dies beruht auf der Erkenntnis, daß die Radioaktivität des Wassers und des pepsinbehandelten Serum-Ultra-Filtrats im wesentlichen dieselben waren. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, daß die Salzsäure-Lösung bei einem pH-Wert von 1,0 ohne Zusatz von Pepsin nur teilweise die Thyroxin-Bindungen zerstören kann.The results clearly show that the thyroxine linkages of the serum protein can be broken down by incubating the Serum protein at pH 1.0 for 30 minutes at 3000 pepsin units are completely destroyed. This is based on the knowledge that the radioactivity of the water and the pepsin-treated Serum ultrafiltrates were essentially the same. The results also show that the Hydrochloric acid solution at a pH value of 1.0 without the addition of pepsin only partially breaks the thyroxine bonds can destroy.

An proteingebundenes Thyroxin wurde mittels der Gleichung berechnet:Protein-bound thyroxine was calculated using the equation:

prozentgebundenes Thyroxin = 100 ·percentage-bound thyroxine = 100

worin bedeuten, daßwhere mean that

a = Radioaktivität vorder Ultrafiltration,
b = Radioaktivität im Ultrafiltrat.a = radioactivity before ultrafiltration,
b = radioactivity in the ultrafiltrate.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in der Praxis auch durch Anwendung einer Vorratslösung von saurer Pepsin-Lösung geschehen. Eine solche Lösung kann wie folgt hergestellt werden:The method according to the invention can also be practiced by using a stock solution of acidic pepsin solution happened. Such a solution can be made as follows:

Man löst 80 Gramm Pepsin (USP) in etwa 1200 ml destillierten Wassers und stellt auf einen pH-Wert von 1.0 ein durch Hinzufügen von 6,0 Normal IICI. Ferner können Glycin hydrochlorid, Glutaminsäurehydroehlorid, Aspaniginsäurchydroehlorid usw. verwendet werden. Das Volumen der Lösung wird sodann auf 1500 mlDissolve 80 grams of pepsin (USP) in about 1200 ml of distilled water and adjust the pH to 1.0 a by adding 6.0 normal IICI. Further can glycine hydrochloride, glutamic acid hydrochloride, Aspanigic acid hydrochloride, etc. can be used. The volume of the solution is then increased to 1500 ml

Pepsin, USPPepsin, USP

Glutaminsäure, Hydrochlorid
LaktoseGlutamic acid, hydrochloride
lactose

1,0 mg
20,0 mg
14,0 mg1.0 mg
20.0 mg
14.0 mg

Die Tabletten werden mit den üblichen Tablettierverfahren hergestellt. Sodann wird eine Tablette in ein Reagenzglas eingeführt, eine Serumprobe hinzugefügt, das Ganze gemischt, neutralisiert, und dann der Prüfung unterworfen.The tablets are produced using the usual tableting processes. Then a tablet is put into a Test tube inserted, a serum sample added, the whole thing mixed, neutralized, and then the test subject.

Um zu zeigen, daß das Verfahren gemäß der Erfindung denselben Genauigkeitsgrad ergibt, wie die bekannten Verfahren bei Anwendung des konkurrierenden Protein-Bindungsverfahrens für L-Thyroxin, wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt:To show that the method according to the invention gives the same degree of accuracy as that known methods using the competitive protein binding method for L-thyroxine carried out the following examinations:

Eine Anzahl von Hypothyroid-, Euthyroid- und Hyperthyroid-Proben von Blutserum wurden sowohl dem vorbekannten Verfahren als auch dem Verfahren gemäß der Erfindung unterworfen. Das vorbekannte Verfahren lieferte folgende Ergebnisse:A number of hypothyroid, euthyroid and hyperthyroid samples of blood serum were both subjected to the previously known method as well as the method according to the invention. The previously known Procedure produced the following results:

1. Ein ml Methanol und 0,5 ml des zu prüfenden Serums wurden in einem Reagenzglas für Radioimmunverfahren vermischt.1. One ml of methanol and 0.5 ml of the serum to be tested were placed in a test tube for radioimmune testing mixed.

2. Die Probe wurde sodann während einer Zeitdauer von 30 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit in einem Wirbelmischer gemischt.2. The sample was then run at full speed for 30 seconds in mixed in a vortex mixer.

3. Die Reagenzgläser wurden über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 1500 χ Schwerkraft in eine Zentrifuge eingespannt.3. The test tubes were placed over a period of 10 minutes at 1500 χ of gravity in a Centrifuge clamped.

4. 0,3 ml des Überstehenden wurde überführt in eine Strahlenprobenphiole, enthaltend 4,0 ml der folgen den Mischung:4. 0.3 ml of the supernatant was transferred to a radiation sample vial containing 4.0 ml of the following the mix:

a) 0,1 ml von '"I-L-Thyroxina) 0.1 ml of '"I-L-thyroxine

b) Natrium Barbitur Puffer(0,075 M -pH 8,6)b) Sodium Barbitur Buffer (0.075 M -pH 8.6)

c) 1,350 menschlichen Serums.c) 1,350 human serum.

5. Jeder Phiole wuirde ein anionischer Membranstreifen beigefügt.5. Each vial would have an anionic membrane strip attached.

6 Die Phiolen wurden verschlossen und bei 33 Umdrehungen pro Minute während genau 30 Minuten bei Raumtemperatur in Drehung versetzt.6 The vials were capped and rotated at 33 revolutions per minute for exactly 30 Minutes at room temperature in rotation.

7. Die Streifen wurden entfernt, die Phiolen geöffnet und die Radioaktivität gemessen. Die Messung wurde mit den Standardwerten verglichen.7. The strips were removed, the vials opened and the radioactivity measured. The measurement was compared with the standard values.

Sodann wurden Doppelproben der obenerwähnten Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt:Then duplicate samples of the above samples were made by the method of the present invention treated:

1. Es wurden in ein Reagenzglas für Radioimmun\ erfahren 0,1 ml des Serums und 0.1 ml einer Pepsinlösung in verdünnter Salzsäure von einem pH-Wert von 1.0 eingeführt, mit etwa 3000 Pepsin-Einheiten.1. There were 0.1 ml of the serum and 0.1 ml of one in a test tube for radioimmune experience Pepsin solution in dilute hydrochloric acid from one pH 1.0 introduced, with around 3000 pepsin units.

Tabelle IV
Thyroid-StatusTable IV
Thyroid status

2. Die Reagenzgläser wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.2. The test tubes were left to stand at room temperature for 30 minutes.

3. Dem Reagenzglas wurden sodann 4.0 ml der in Ziffer 4 obenerwähnten Mischung direkt zugeführt.3. 4.0 ml of the in Number 4 above-mentioned mixture fed directly.

4. Siehe Ziffer 5 oben.4. See paragraph 5 above.

5. Siehe Ziffer 6 oben.5. See paragraph 6 above.

6. Siehe Ziffer 7 oben.6. See paragraph 7 above.

Die Ergebnisse dieser vergleichenden Prüfungen sind in der folgenden Tabelle IV wiedergegeben:The results of these comparative tests are given in Table IV below:

Proben- Th>ro\in in Serum Pepsin-DigesiionSample Th> ro \ in in Serum Pepsin Digesiion

Nummer Methanol-IIxtraktion*) (iig/lOO ml ± SD)Number of methanol-II extraction *) (iig / lOO ml ± SD)

Hypothyroid-Serum (weniger als 5 ug/IOO ml)
Fulhyroid (5- 13 .ug/IOO ml)
Hyperthyroid (größer als 13 ug/100 ml)
*) Λ nt lAlniklinnsjjumungki.'!! korrigiert.Hypothyroid serum (less than 5 ug / 100 ml)
Fulhyroid (5- 13 .ug / IOO ml)
Hyperthyroid (greater than 13 ug / 100 ml)
*) Λ nt lAlniklinnsjjumungki. '!! corrected.

18 2.4 ± 1.1 2.0 ± 0.818 2.4 ± 1.1 2.0 ± 0.8

kein nennenswerter Unterschied IW 8.6 ± 2.0 8.> ± 1.7no notable difference IW 8.6 ± 2.0 8.> ± 1.7

kein nennenswerter Unterschiedno significant difference

11 17.8 ± 3.9 16.9 ±11 17.8 ± 3.9 16.9 ±

kein nennenswerter Unterschiedno significant difference

Die Prüfungen /eigen ganz klar, ein!.! bei Dtirchluhrung der Thuoxin-Aiialvse an denselben Proben zum einen mittels Methanol-Extraktion mit Korrektur für Wiedergewinnung und zum anderen miitels Pepsin-Digestinn im wesentlichen dieselben Ergebnisse erzielt wurden.The exams / own very clearly, a!.! on the one hand, when the thuoxin aiialvse is carried out on the same samples by means of methanol extraction with correction for recovery and on the other hand by means of pepsin digestin essentially the same results were obtained.

Claims

Claim:

Method for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample, characterized through the following process steps:

The blood serum sample will contain an effective amount of pepsin at a pH of about 1.0 admixed, the sample is subjected to an incubation for such a period of time and for such a period of time When exposed to temperature, the pepsin is able to make the thyroid hormone binding proteins digest, the mixture is adjusted to a pH value at which the pepsin is inactive, and the mixture is subjected to the test for released thyroid hormone.