DE2535279C3

DE2535279C3 - Method for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample

Info

Publication number: DE2535279C3
Application number: DE19752535279
Authority: DE
Inventors: Harold East Brunswick NJ. Bates (V-StA.)
Original assignee: Center for Laboratory Medicine, Metuchen, N.J. (V.St.A.)
Priority date: 1974-08-08
Filing date: 1975-08-07
Publication date: 1977-06-16

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren des Thyroid-Hormongehalts einer Blutserumprobe.The invention relates to a method for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample.

Die Serum- und Plasma-Proteine, im wesentlichen Albumin, Alpha-. Beta- und Gamma-Globulin. Fibrinogen u. dgl., haben die Eigenschaft. Substanzen wie Thyroid-Hormone im Blutstrom an sich /u binden.The serum and plasma proteins, essentially albumin, alpha. Beta and Gamma Globulin. Fibrinogen and the like have the property. Substances such as thyroid hormones bind to / u in the bloodstream.

Gemäß dem Stand der Technik wird eine Blutserumprobe auf verschiedenerlei Art behandelt, um diese Komponenten aus dem Serum-Protein abzutrennen. Im allgemeinen sind derartige Abtrennungsverfahren nur unvollständig und erfordern die Anwendung eines Prozentfaktors auf die gewonnenen analytischen Daten, um die vollständige Analyse zu erstellen.According to the prior art, a blood serum sample is treated in various ways in order to obtain it Separate components from the serum protein. In general, such separation processes are only incomplete and require the application of a percentage factor to the analytical data obtained, to do the full analysis.

So sind zum Beispiel Thyroid-Hormone. Thyroxin und Triiodothionin üblicherweise im Serum von menschlichem Blut vorhanden und an thyrobindendes Protein gebunden, wie z. B. Alpha-Globulin, das als Thvroxinbindendes Globulin (TBG) bekannt ist. Lim die Thyroid-Hormone von ihrem Binde-Protein zu trennen, ist es üblich, mit einem Alkohol, wie z. B. Methanol, Äthanol oder Butanol, Tetrahydrofuran od. dgl. zu extrahieren. Andere Verfahren verwenden Säuren, wie z. B. verdünnte Salzsäure mit einem pH-Wert von etwa 1,5. Sobald das Thyroid-Hormon mittels solcher Verfahren extrahiert ist, und zwar normalerweise bis zu einem Anteil von nur 65-75 Prozent von dem Gesamtanieil, muß das extrahierte Hormon sorgfältig von der übrigen Probe abgetrennt werden, um nachfolgende Wiederbindung oder sonstige Bindung an das Protein zu verhindern. Die gemäß dem Stande der Technik verwendeten Verfahren benutzen als Trennmittel z. B. die Ultra-Zentrifugierung, die Absorption auf einem anorganischen, sorbierenden Material, Dcxtrangel-Extraktionskolonnen u. dgl.Take thyroid hormones, for example. Thyroxine and triiodothionine commonly present in the serum of human blood and bound to thyrobinding protein, such as e.g. B. Alpha globulin known as thvroxin binding globulin (TBG). To separate the thyroid hormones from their binding protein, it is common practice to use an alcohol such as alcohol. B. methanol, ethanol or butanol, tetrahydrofuran or the like. To extract. Other methods use acids such as. B. dilute hydrochloric acid with a pH of about 1.5. Once the thyroid hormone is extracted by such methods, usually up to as little as 65-75 percent of the total amount, the extracted hormone must be carefully separated from the remainder of the sample for subsequent rebinding or other binding to the protein impede. The methods used according to the prior art use as a release agent z. B. ultra-centrifugation, absorption on an inorganic, sorbent material, Dcxtrangel extraction columns and the like.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Analysieren des Thyroid-Hormongehalts einer Blutserumprobe ist demgegenüber durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs angegebenen Verfahrensschritte gekennzeichnet. The method of the invention for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample is in contrast, characterized by the process steps specified in the characterizing part of the claim.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die komplette Trennung der obenerwähnten Komponenten von ihren bindenden Proteinen durch Anwendung des proteolytisi. ien Enzyms, Pepsin, erreicht. Dieses Verfahren trennt nicht nur das zu analysierende Material vollständig von seinem bindenden Protein, sondern zerstört im wesentlichen die verbleibenden Bindekräfte des Proteins und vermeidet damit, in den meisten Fällen und für die meisten analytischen Verfahren, dieWith the method according to the invention, the complete separation of the above-mentioned components is achieved of their binding proteins by applying the proteolytisi. ien enzyme, pepsin, is achieved. This method not only completely separates the material to be analyzed from its binding protein, but essentially destroys the remaining binding forces of the protein and thus avoids, in most cases and for most analytical procedures that

Notwendigkeit des Entfernens der jeweiligen abgetrennten Substanz aus der Reaktionsmischung. Au3erdem wird jegliche verbleibende Enzym-Aktivität, falls solche irgendeine Wirkung auf das nachfolgende Analyse-Verfahren haben sollte, sehr leicht dadurch zerstört, daß die Bedingungen der Reaktionsmischung verändert werden. Dies geschieht dadurch, daß die Mischung auf einen pH-Wert eingestellt wird, bei welchen das Enzym inaktiv ist.Necessity of removing the particular separated substance from the reaction mixture. Also, any remaining enzyme activity, if any such should have any effect on the subsequent analysis procedure, very easily by doing so destroyed that the conditions of the reaction mixture are changed. This happens because the Mixture is adjusted to a pH value at which the enzyme is inactive.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.The invention is explained in more detail below using an exemplary embodiment.

Man stellt mittels einer wäßrigen hydrochlorigen Säure gleiche Teile eines auf Thyroid-Hormone zu analysierenden Blutserums und einer Pepsin-Lösung mit einem Pepsin-Gehalt von etwa 10 000 bis etwa 80 000 Pepsin-Einheiten pro ml auf einen pH-Wert von 1.0 ein. Nach einer Inkubation bei Raumtemperaturen auf 22 bis 27°Celsius über eine Zeitdauer von 30 Minuten oder bei einer Temperatur von 37 bis 45° Celsius über eine Zeitdauer von 10 Minuten sind alle Thyroid-Hormone von den bindenden Proteinen freigesetzt, und alle Bindungen der thyrobindenden Proteine sind zerstört. Dies wird mittels der folgenden experimentellen Proben gezeigt. Equal parts of a blood serum to be analyzed for thyroid hormones and a pepsin solution with a pepsin content of about 10,000 to about 80,000 pepsin units per ml are adjusted to a pH of 1.0 using an aqueous hydrochloric acid. After incubation at room temperature to 22 to 27 ° Celsius for a period of 30 minutes or at a temperature of 37 to 45 ° Celsius for a period of 10 minutes, all thyroid hormones are released from the binding proteins, and all bindings of the thyrobinding proteins are destroyed. This is shown using the following experimental samples.

Ein" menschliches Serum, das 2,4 Mikrogramm^g)/ Thyroxin pro 100 ml enthält, wurde mit bekannten Mengen von !.-Thyroxin angereichert. Die derart angereicherte Serum-Probe wurdn behandelt nut gleichen Volumenicilen einer Pepsin-Lösung, die zwischen 10 000 und 80 000 Pepsin-Einheiten pro ml enthielt, eingestellt mittels verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1.0. Sodann überließ man die Proben bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 30 Minuten der Inkubation. Den Proben wurde ein Barbitur-Puffer bei einem pH-Wert von 8.b beigefügt. Die gepufferten Lösungen wurden sodann durch das auf konkurrierender Proteinbindung (CPB) beruhende bekannte Verfahren auf Thyroxin geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben:A "human serum containing 2.4 micrograms ^ g) / thyroxine per 100 ml contains, has been fortified with known amounts of! .- thyroxine. Wurdn The thus enriched serum sample treated nut same Volumenicilen a pepsin solution containing between 10 Containing 000 and 80,000 pepsin units per ml, adjusted to a pH value of 1.0 with dilute hydrochloric acid, the samples were then left to incubate at room temperature for a period of 30 minutes. Value of 8.b. The buffered solutions were then tested for thyroxine by the known competitive protein binding (CPB) method. The results are shown in Table I below:

Table I.

Thyroxin
berechne!Thyroxine
calculate!

(μρ/lOOml)(μρ / lOOml)

Thyroxin-Prüfwerte Thyroxine test values

(Hg/100 ml)(Hg / 100 ml)

Prozent Rück
gewinnungPercent return
extraction

2,52.5

7.37.3

12,612.6

17.217.2

104
99104
99

101
99101
99

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen ganz deutlich, daß die Pepsin-Digestion alle thyrobindenden Proteine zerstört und das gesamte gebundene Thyroxin freisetzt.The results presented above clearly show that pepsin digestion is all thyrobing Destroys proteins and releases all bound thyroxine.

Es wurden jeweils mit A. B. Cund Dgekennzeichnete Reagenzgläser benutzt, um den Einfluß vom hinzugefügten destillierten Wasser auf die Bindung von ¹-⁵I-Thvroxin auf das Serum Protein nachzuweisen, ferner den Einfluß von verdünnter Salzsäure von einem pH-Wert von 1.0 auf die Bindung von ^i:hl-Thyroxin auf Serum-Protein, die Wirkung einer sauren Pepsin-Lösung auf die Bindung von '"!-Thyroxin auf Serum-Protein und die Wirkung einer sauren Pepsin-Lösung auf die Bindung von '"I-Thyroxin auf Wasser.In each case used with AB C and Dgekennzeichnete test tubes to determine the effect of the added distilled water to the binding of ¹ - prove ⁵ I-Thvroxin to the serum protein, further the influence of dilute hydrochloric acid from a pH value of 1.0 on the binding of ^{i: h} l-thyroxine on serum protein, the effect of an acidic pepsin solution on the binding of '"! -thyroxine on serum protein and the effect of an acidic pepsin solution on the binding of'" I-thyroxine to water .

Die Inhalte der Reagenzgläser sind in der folgenden Tabelle Il wiedergegeben:The contents of the test tubes are shown in the following table II:

Table II

Glas A Glas BGlass A Glass B

Glas CGlass C

Glas DGlass D

Normale menschliche SeraNormal human sera 0,3 ml0.3 ml 0.3 ml0.3 ml 0.3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml ¹²⁵U-Thyroxin ¹²⁵ U-thyroxine 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml 0,005 ml0.005 ml Destilliertes WasserDistilled water 0,3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml Verdünnte Salzsäure (pH !.0)Diluted hydrochloric acid (pH! .0) U,3mlU, 3ml Pepsin (3,000 Einheilen pro 0.3 ml. in verdünnterPepsin (3,000 units per 0.3 ml. In dilute 0,3 ml0.3 ml 0,3 ml0.3 ml Salzsäure, pH 1,0)Hydrochloric acid, pH 1.0)

Die vier Reagenzgläser wurden bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 30 Minuten der Inkubation ausgesetzt. Am Ende der Inkubation wurden 4,0 ml eines Natrium-Barbitur-Puffers (0,075 M, pH 8,6) hinzugefügt und mit den Inhalten eines jeden Reagenzglases vermischt. Die Radioaktivität jedes Reagenzglases wurde mit einem Gammazähier gemessen. Sämtliche Reagenzgläser zeigten denselben Grad von Radioaktivität, nämlich 64 600 Ausschläge pro Minute. Jedes :o Reagenzglas wurde sodann in einen Amicon-Ultrafihrations-Kegel mit einem Zentrifugierrohr überführt. Die Rohre wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur und bei 2,200 g zentrifugiert. Das gesamte Ultrafiltrat wurde aufgefangen und die Radioaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben:The four test tubes were incubated at room temperature for a period of 30 minutes exposed. At the end of the incubation, 4.0 ml of sodium barbiture buffer (0.075 M, pH 8.6) was added and mixed with the contents of each test tube. The radioactivity of each test tube was measured with a gamma counter. All test tubes showed the same level of radioactivity, namely 64,600 rashes per minute. Each: o test tube was then placed in an Amicon ultrafiltration cone transferred with a centrifuge tube. The tubes were left on for 45 minutes at room temperature and centrifuged at 2,200 g. All of the ultrafiltrate was collected and the radioactivity measured. The results are given in Table III:

Table III

Radioaktivität
vor Ultrafiltration radioactivity
before ultrafiltration

(cpm)(cpm)

Radioaktivität
nach Ulti afiltraiion radioactivity
after Ulti afiltraiion

(cpm)(cpm)

Thyroxin (I) Bindung (5)Thyroxine (I) Binding (5)

Glas A
Glas B
Glas C
Glas DGlass A
Glass B
Glass C
Glass D

64.600
64,600
64.600
64.60064,600
64,600
64,600
64,600

490
29,245
63,555
63.365490
29.245
63,555
63,365

99.9599.95

54.6054.60

1.621.62

1.911.91

Die Ergebnisse zeigen ganz klar, daß die Thyroxin-Bindungen des Serum-Proteins durch Inkubieren des Serum-Proteins bei einem pH-Wert von 1,0 über eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 3000 Pepsin-Einheiten vollständig 2'.erstört sind. Dies beruht auf der Erkenntnis, daß die Radioaktivität des Wassers und des pepsinbehandelten Serum-UHra-Filtrats im wesentlichen dieselben waren. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, daß die Salzsäure-Lösung bei einem pH-Wert von 1,0 ohne Zusatz von Pepsin nur teilweise die Thyroxin-Bindungen zerstören kann.The results clearly show that the thyroxine linkages of the serum protein can be broken down by incubating the Serum protein at pH 1.0 for 30 minutes at 3000 pepsin units are completely 2 '. This is based on the knowledge that the radioactivity of the water and the pepsin-treated serum UHra filtrate are essentially the same was. The results also show that the hydrochloric acid solution at a pH of 1.0 without Adding pepsin can only partially destroy the thyroxine bonds.

An proteingebundenes Thyroxin wurde mittels der so Gleichung berechnet:Protein-bound thyroxine was treated with the so Calculated equation:

a — b
prozentgebundenes Thyroxin = HX) a - b
percentage-bound thyroxine = HX)

worin bedeuten, daß „in which mean that "

.·( = Radioaktivität vorder Ultrafiltration,
b = Radioaktivität im Ultrafiltrat.. (= Radioactivity before ultrafiltration,
b = radioactivity in the ultrafiltrate.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in der Praxis auch durch Anwendung einer Vorratslösiing von _fi0 saurer Pepsin-Lösung geschehen. Eine solche Lösung kann wie folgt hergestellt werden:The method according to the invention can also be carried out in practice by using a stock _{solution of} acidic pepsin solution. Such a solution can be made as follows:

Man löst 80 Gramm Pepsin (USP) in etwa 1200 ml destillierten Wassers und stellt auf einen pH-Wert von 1,0 ein durch Hinzufügen von 6,0 Normal HCI. Ferner <,<, können Glycinhydrochlorid, Glutaminsäurehydrochlorid, Asparaginsäurehydrochlorid usw. verwendet werden. Das Volumen der Lösung wird sodann auf 1300 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt und auf einen End-pH-Wert eingestellt, sofern erforderlich.Dissolve 80 grams of pepsin (USP) in about 1200 ml of distilled water and adjust the pH to 1.0 a by adding 6.0 normal HCI. Furthermore <, <, can glycine hydrochloride, glutamic acid hydrochloride, Aspartic acid hydrochloride, etc. can be used. The volume of the solution is then increased to 1300 ml topped up with distilled water and adjusted to a final pH value, if necessary.

Ein gewöhnliches für radioimmunologische Analysen geeignetes Reagenzglas kann dann mit der Vorratslösung überzogen werden. Es werden nun 0,1 ml eines zu prüfenden Serums hinzugefügt, der Inhalt im Reagenzglas gemischt, für eine Zeitdauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur der Inkubation ausgesetzt, neutralisiert. und sodann mittels bekannter Verfahren der Prüfung auf Thyroxin ausgesetzt. Es können auch Tabletten hergestellt v/erden, die das Enzym, die Säure sowie nicht reagierende Füllstoffe wie z. B. Laktose u. dgl. enthalten. Eine derartige Zusammensetzung ist im folgenden beschrieben:A conventional test tube suitable for radioimmunological analyzes can then be coated with the stock solution. 0.1 ml of a serum to be tested is then added, the contents are mixed in the test tube, incubated for a period of 30 minutes at room temperature, and neutralized. and then subjected to testing for thyroxine using known methods. Tablets can also be produced which contain the enzyme, the acid and non-reactive fillers such as e.g. B. Lactose and the like. Contain. Such a composition is described below:

Pepsin, USPPepsin, USP

Glutaminsäure. Hydrochlorid
LaktoseGlutamic acid. Hydrochloride
lactose

1.0 mg
20.0 mg
14,0 mg1.0 mg
20.0 mg
14.0 mg

Die Tabletten werden mit den üblichen Tablettierverfahren hergestellt. Sodann wird eine Tablette in ein Reagenzglas eingeführt, eine Seruniprnhc hinzugefügt, das Ganze gemischt, neutralisiert, und dann der Prüfung unterworfen.The tablets are produced using the usual tableting processes. Then a tablet is put into a Test tube inserted, a seruniprnhc added, the whole thing mixed, neutralized, and then put to the test.

Um zu zeigen, daß das Verfahren gemäß der Erfindung denselben Genauigkeitsgrad ergibt, wie die bekannten Verfahren bei Anwendung des konkurrierenden Protein-Bindungsverfahrens für L-Thyroxin, wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt:To show that the method according to the invention gives the same degree of accuracy as that known methods using the competitive protein binding method for L-thyroxine carried out the following examinations:

Eine Anzahl von Hypothyroid-, Euthyroid- und Hyperthyroid-Proben von Blutserum wurden sowohl dem vorbekannten Verfahren als auch dem Verfahren gemäß der Erfindung unterworfen. Das vorbekannte Verfahren lieferte folgende Ergebnisse:A number of hypothyroid, euthyroid and Hyperthyroid samples of blood serum were made using both the prior art method and the method subject according to the invention. The previously known method provided the following results:

1. Ein ml Methanol und 0,5 ml des zu prüfenden Serums wurden in einem Reagenzglas für Radioimmunverfahren vermischt.1. One ml of methanol and 0.5 ml of the serum to be tested were placed in a test tube for radioimmune testing mixed.

2. Die Probe wurde sodann während einer Zeitdauer von 30 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit in einem Wirbelmischer gemischt.2. The sample was then run at full speed for 30 seconds in mixed in a vortex mixer.

3. Die Reagenzgläser wurden über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 1500 χ Schwerkraft in eine Zentrifuge eingespannt.3. The test tubes were placed over a period of 10 minutes at 1500 χ of gravity in a Centrifuge clamped.

4. 0,3 ml des Überstehenden wurde überführt in eine Strahlenprobenphiole, enthaltend 4,0 ml der folgenden Mischung:4. 0.3 ml of the supernatant was transferred to a radiation sample vial containing 4.0 ml of the following Mixture:

a) 0,1 ml von ^I25l-L-Thyroxina) 0.1 ml of ^I25 IL thyroxine

b) Natrium Barbitur Puffer(O,O75 M - pi I 8,6)b) Sodium Barbitur Buffer (O, O75 M - pi I 8.6)

c) 1,350 menschlichen Serums.c) 1,350 human serum.

5. jeder Phiole wurde ein anionischer Membranstreifen beigefügt.5. An anionic membrane strip was added to each vial.

6 Die Phiolen wurden verschlossen und bei 33 Umdrehungen pro Minute während genau 30 Minuten bei Raumtemperatur in Drehung versetzt.6 The vials were capped and rotated at 33 revolutions per minute for exactly 30 Minutes at room temperature in rotation.

7. Die Streifen wurden entfernt, die Phiolen geöffnet und die Radioaktivität gemessen. Die Messung wurde mil den Standardwerten verglichen.7. The strips were removed, the vials opened and the radioactivity measured. The measurement was compared with the standard values.

Sodann wurden Doppelproben der obenerwähnten Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt:Then duplicate samples of the above samples were made by the method of the present invention treated:

1. Es wurden in ein Reagenzglas für Radioimmunverfahren 0,1 ml des Serums und 0,1 ml einer Pepsinlösung in verdünnter Salzsäure von einem pH-Wert von 1,0 eingeführt, mit etwa 3000 Pepsin Einheiten.1. It was placed in a test tube for radioimmune testing 0.1 ml of the serum and 0.1 ml of a pepsin solution in dilute hydrochloric acid of one pH 1.0 introduced, with about 3000 pepsin units.

Table IV

2. Die Reagenzgläser wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.2. The test tubes were left to stand at room temperature for 30 minutes.

3. Dem Reagenzglas wurden sodann 4,0 ml der in Ziffer 4 obenerwähnten Mischung direkt zugeführt.3. 4.0 ml of the mixture mentioned in paragraph 4 above was then added directly to the test tube.

4. Siehe Ziffer 5 oben.4. See paragraph 5 above.

5. Siehe Ziffer 6 oben.5. See paragraph 6 above.

6. Siehe Ziffer 7 oben.6. See paragraph 7 above.

Die Ergebnisse dieser vergleichenden Prüfungen sind in der folgenden Tabelle IV wiedergegeben:The results of these comparative tests are given in Table IV below:

Thyroid-SlatusThyroid Slatus

Proben- Thyroxin in Serum Nummer Methanol-Extraktion*)Sample thyroxine in serum number methanol extraction *)

Pepsin-Dieestion /00l SD)Pepsin dieestion / 00l SD)

Hypothyroid-Serum (weniger als 5 iig/100 ml)
Euthyroid (5- ! 3 ug/W0 ml)
Hyperthyroid (größer als 13 μg/100ml)
*) Auf Extraktionsgenauigkeit korrigiert.Hypothyroid Serum (less than 5 µg / 100 ml)
Euthyroid (5-! 3 ug / W0 ml)
Hyperthyroid (greater than 13 μg / 100ml)
*) Corrected for extraction accuracy.

18 2.4 ± 1.1 2.0 ± 0,818 2.4 ± 1.1 2.0 ± 0.8

kein nennenswerter Unterschiedno significant difference

139 8.6 ± 2.0 8.5 ± 1.7 139 8.6 ± 2.0 8.5 ± 1.7

kein nennenswerter Unterschied 11 17.8 ± 3.M Ib.*} ±no notable difference 11 17.8 ± 3.M Ib. *} ±

kein nennenswerter Unterschiedno significant difference

Die Prüfungen /eigen ganz klar, daß bei Durchführung der Thvroxin-AnaKse an denselben Proben /um einen mittels Methanol-Extraktion mit Korrektur für Wiedergewinnung und /um anderen mittels Pepsin-Digestion im wesentlichen dieselben Ergebnisse erzielt wurden.The tests / own very clearly that when performing the thvroxin AnaKse on the same samples / around a by means of methanol extraction with correction for recovery and / to others by means of pepsin digestion essentially the same results were obtained.

Claims

Claim:

A method for analyzing the thyroid hormone content of a blood serum sample, characterized through the following process steps:

The blood serum sample will contain an effective amount of pepsin at a pH of about 1.0 admixed, the sample is subjected to an incubation for such a period of time and for such a period of time. When exposed to temperature, the pepsin is able to make the thyroid hormone binding proteins digest, the mixture is adjusted to a pH value at which the pepsin is inactive, and the mixture is subjected to testing for released thyroid hormone.