DE2447025A1 - REAGENT FOR THE DETECTION OF ANTINUCLEAR FACTORS AND A METHOD FOR STABILIZING THEM - Google Patents
REAGENT FOR THE DETECTION OF ANTINUCLEAR FACTORS AND A METHOD FOR STABILIZING THEMInfo
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Description
BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT. Marburg (Lahn) Aktenzeichen: HOE 7V B 025 = Ma 204 ·BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT. Marburg (Lahn) File number: HOE 7V B 025 = Ma 204
Datum: ' 30.September 1974 Dr.Li/Fo " *' --'Date: 'September 30, 1974 Dr.Li/Fo "*' - '
Reagens zum Nachweis von antinukieären Faktoren und ein Verfahren zu dessen StabilisierungAntinuclear Factor Detection Reagent and Method to stabilize it
Die Erfindung betrifft Reagenzien zum Nachweis von antinuk]eären Faktoren und ein Verfahren zur Konservierung der antig&nen Eigenschaften von Zellkernbestandteiüen in Gewebekulturzellen, die zum Nachweis von antinukleärcn Faktoren verwendet werden.The invention relates to reagents for the detection of antinuclear cells Factors and a method for preserving the antigenic properties of cell nucleus components in tissue culture cells that can be used to detect antinuclear factors.
Antikörper gegen die als Nuklearfaktoren bezeichneten Kernsubstanzen werden bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen des Bindegewebes, insbesondere bei Kollagen-Krankheiten wie Polyarthritis rheumatica, Sklerodermie, Lupus erythematodes visceralis (LE), Dermatomyositis und Periarteriitis nodosa, gefunden.Antibodies against the core substances known as nuclear factors are used in various autoimmune diseases of the connective tissue, especially for collagen diseases such as rheumatic polyarthritis, scleroderma, lupus erythematosus visceralis (LE), dermatomyositis and periarteritis nodosa.
Diese Antikörper können gegen verschiedene Antigene wie Desoxyribonukleinsäure (DNS), Nukleoproteine, DNS-Histone (oft als Nukleoproteine angesehen) , die Ribonukleinsäure (P.NS) in den Nukleolen oder gegen Antigene gerichtet sein, die mit physiologischer Kochsalzlösung aus den Zellkernen extrahierbar sind (Sm--Antigen) .These antibodies can be raised against various antigens such as deoxyribonucleic acid (DNA), nucleoproteins, DNA histones (often as Nucleoproteins), the ribonucleic acid (P.NS) in the Nucleoli or be directed against antigens associated with physiological Saline solution can be extracted from the cell nuclei (Sm - antigen).
Zu ihrem Nachweis werden unterschiedliche Methoden wie Anti-Globulin-Konsumptionstest, Koinplementbindungsreaktion, Präzipi--. tationsreaktion/ passive Kämagglutinationsreaktion, Latex-Teste, immunhistologische und immü^z^t&t&gls^Sie- FearfahrenDifferent methods such as anti-globulin consumption test, Koinplementbindungsreaktion, Precipi-. tation reaction / passive kämagglutinationreaktion, latex tests, immunohistological and immune ^ z ^ t & t & gls ^ Sie- Fearfahren
BAD ORJßiNALBAD ORJßiNAL
609 θ. 15/0713609 θ. 15/0713
/O/O
- 2 - HOE 7A/B 025- Ma 204- 2 - HOE 7A / B 025- Ma 204
Von den vorstehend aufgeführten Nachweismethoden von Antikörpern gegen Kernsubstanzen haben sich die immunhistologischen und die immunzytologisehen Teste, insbesondere jene, die zur Sichtbarmachung der positiven Reaktion Fluoreszenzfarbstoffe verwenden, aus folgenden Gründen besonders bewährt: ·Of the above-mentioned detection methods of antibodies against core substances, the immunohistological and the immunocytological tests, especially those for visualization use fluorescent dyes for the following reasons:
a) Sie zeichnen sich durch hohe Sensibilität und Spezifität aus.a) They are characterized by high sensitivity and specificity.
b) Sie erfassen Antikörper gegen alle o.a. Kernantigene und erlauben daher eine Differenzierung nach dem Muster und dem Grad des Fluoreszenz.b) You record antibodies against all of the above core antigens and allow hence a differentiation according to the pattern and degree of fluorescence.
c) Die Teste können relativ leicht durchgeführt werden.c) The tests can be carried out relatively easily.
In den bekannten Verfahren werden als Antigene verwendet:In the known methods, the following antigens are used:
1. Frische Kryostatschnitte von Versuchstierorganen oder menschlichem Gewebe.1. Fresh cryostat sections of laboratory animal or human organs Tissue.
2. Frische menschliche Zellen z.B. Buccalzellen, Leukozyten u.a.2. Fresh human cells e.g. buccal cells, leukocytes, etc.
3. Gewebekulturzellen menschlichen oder tierischen Ursprungs.3. tissue culture cells of human or animal origin.
4. Stabilisierte Kalb-Thymozyten.4. Stabilized calf thymocytes.
Um eine Extraktion wasserlöslicher Nucleoproteine (Sm-Protein) zu vermeiden, werden die Organschnitte oder Zellen in der Regel auf dem Objektträger nach geeigneten Methoden, z.B. mit Aceton fixiert. Das auf Antikörper zu untersuchende Patientenserum wird in unterschiedlichen Verdünnungen auf die Präparate aufgetragen, inkubiert und abgewaschen. Danach wird mit einem ir.it fluoreszierendem Farbstoff, beispielsweise Fluoreszein-Isothiocyanat-(FITC-) oder Peroxydase-markiertem Antiserum gegen menschliche. Immunglobuline -überschichtet, erneut inkubiert und gewaschen. Die spezifisch gebundenen Antikörper werden durchTo perform an extraction of water-soluble nucleoproteins (Sm protein) To avoid this, the organ sections or cells are usually placed on the microscope slide using suitable methods, e.g. with acetone fixed. The patient serum to be examined for antibodies is applied to the preparations in different dilutions, incubated and washed off. Then an ir.it fluorescent dye, for example fluorescein isothiocyanate (FITC) or peroxidase-labeled antiserum against human. Immunoglobulins overlaid, incubated again and washed. The specifically bound antibodies are through
.609815/0713.609815 / 0713
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Untersuchung-der Präparate auf Fluoreszenz oder histochemische Farbreaktion bei mikroskopischer Beobachtung erkannt.Examination of the specimens for fluorescence or histochemistry Color reaction detected under microscopic observation.
Ein wesentlicher Nachteil bei der Verwendung der frisch zuzubereitenden Antigene ist ihre geringe Haltbarkeit bei Raum- oder Kühlschrank-Temperatur. Der Untersucher ist damit gezwungen, sich stets frisches Material zu beschaffen oder eine Lagerung bei Temperaturen zwischen -20 bis -30°C oder tiefer vorzunehmen. Die Nachteile wirken sich insbesondere bei der kommerziellen Herstellung entsprechender Reagenzien aus, da der Versand bei Gefriertemperaturen erfolgen muß, um die Antigenität nicht zu beeinträchtigen.A major disadvantage of using the freshly prepared Antigens are their short shelf life at room or refrigerator temperature. The examiner is thus forced to to always obtain fresh material or to store it at temperatures between -20 to -30 ° C or lower. The disadvantages are particularly evident in the commercial production of the corresponding reagents, since shipping is also important Freezing temperatures must be done in order not to antigenicity affect.
Die Verwendung von Gewebekulturzellen hat gegenüber anderem Antigenmaterial gewisse Vorteile, da die Einheitlichkeit des Antigenmaterials gut zu gewährleisten ist. Die Gewebekulturzellen sind in jeder gewünschten Menge hersteilbar. Die Züchtung kann auf Objektträgern direkt vorgenommen werden. Nachteilig ist auch hier, daß diese Zellen bei Temperaturen unter 00C gelagert verdau müssen. In bestimmten Fällen wird zusätzlich die Aufbewahrung •in Glyzerin empfohlen. Das Glyzerin ist vor der Verwendung der Objektträger als Reagenzien abzuwaschen. Dabei hat sich gezeigt, daß das Sm-Antigen, welches zum Nachweis der sogenannten gesprenkelten Fluoreszenz erforderlich ist, verloren geht.The use of tissue culture cells has certain advantages over other antigen material, since the uniformity of the antigen material must be ensured. The tissue culture cells can be produced in any desired quantity. The cultivation can be carried out directly on microscope slides. A disadvantage is also here that these cells must digestion stored at temperatures below 0 0 C. In certain cases, storage in glycerine is also recommended. Wash off glycerine before using slides as reagents. It has been shown that the Sm antigen, which is required to detect the so-called speckled fluorescence, is lost.
Es wurde nun gefunden, daß die Haltbarkeit des Antigenmaterials in den Gewebekulturzellen entscheidend verlängert v/erden kann, wenn das Gewebekulturpräparat zusammen mit einem Trockenmittel in einem luftdichten Behälter verschlossen aufbewahrt wird.It has now been found that the shelf life of the antigen material in the tissue culture cells can be decisively extended, when the tissue culture preparation is kept sealed in an airtight container together with a desiccant.
Gegenstand der Erfindung sind demnach Reagenzien zum Nachweis von antinukleären Faktoren enthaltend auf Objektträgern fixierte Gewebekulturzellen^irgesciiossen in einem Behälter mit einer wasserdampfarmen Atmosphäre.The invention accordingly relates to reagents for the detection of antinuclear factors which are fixed on microscope slides Tissue culture cells are poured into a container with a low water vapor atmosphere.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Konservierung der antigenen Eigenschaften von ZellkernbestandteilenThe invention also relates to a method for preservation the antigenic properties of cell nucleus components
6098 15/0713 ' ·6098 15/0713 '
- 4 - HOE 74/ B 025 - Ma 204- 4 - HOE 74 / B 025 - Ma 204
in Gewebekulturzellen, die zum Nachweis von antinukleären Faktoren verwendet werden, wonach Gewebekulturpraparate auf Objektträgern schonend fixiert, getrocknet mit einem Trockenmittel in einem luftdichten Behälter eingeschlossen werden.in tissue culture cells that are used for the detection of antinuclear factors, after which tissue culture preparations on Slides gently fixed, dried and enclosed in an airtight container with a desiccant.
Die Fixierung erfolgt dabei mit an sich bekannten, dafür verwendeten flüchtigen organischen Lösungsmitteln wie Aceton in ansich bekannter Weise. Die anschliessende Trocknung wird zweckmässig bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur bis etwa 50 C an der Luft oder im Vakuum ausgeführt.The fixation takes place with volatile organic solvents known per se, such as acetone, used for this purpose in a manner known per se. The subsequent drying is expediently carried out at room temperature or slightly elevated temperature up to about 50 C in air or in a vacuum.
Als Trockenmittel kommen die in der chemischen Technik zur Wasserdampfbindung verwendeten Stoffe in Frage, insbesondere solche, deren Wasserpartialdruck über dem frischen Trockenmittel bei 25°C weniger als 2 χ 10~1 Torr beträgt, beispielsweise CaCIp, CaO, Α,ΙρΟ·*, Anhydrit oder P^Oj-. Ein direkter Kontakt der Präparate mit dem Trockenmittel muss vermieden werden.The substances used in chemical engineering to bind water vapor can be used as desiccants, especially those whose partial water pressure above the fresh desiccant at 25 ° C is less than 2 × 10 -1 Torr, for example CaClp, CaO, Α, ΙρΟ *, anhydrite or P ^ Oj-. Direct contact of the preparations with the desiccant must be avoided.
Als Zellen können alle Zellarten verwendet v/erden, die dem Fachmann als Reagenzien zum Nachweis der Antinuklearfaktoren geeignet erscheinen und die bislang dafür in frischer Form zubereitet und auf Objektträger fixiert werden. Besonders geeignet sind für die beispielhaft herausgegriffene Diagnose der Lupus erythematodes-Erkrankung Nierenzellen von jungen Hamstern, sogenannte BHK-Zellen, Kaninchennierenzellen, menschliche Amnionzellen oder HeLa-Zellen. Bevorzugt werden BHK-21-Zellen verwendet, die im einzelnen von N. Stoker und I. Macpherson beschrieben wurden (Nature 203s 1355-1357 (1964)).All cell types can be used as cells which appear to the person skilled in the art to be suitable as reagents for the detection of the anti-nuclear factors and which have hitherto been prepared for this purpose in fresh form and fixed on microscope slides. Kidney cells from young hamsters, so-called BHK cells, rabbit kidney cells, human amnion cells or HeLa cells are particularly suitable for the diagnosis of lupus erythematosus disease, which has been selected as an example. It is preferred to use BHK-21 cells which have been described in detail by N. Stoker and I. Macpherson (Nature 203 s 1355-1357 (1964)).
Das erfindungsgemässe Präparat ist bei Kühlschranktemperaturen lagerfähig; bei 4°C wird innerhalb von etwa 12 Monaten keine Wertminderung des Reagens beobachtet? wohingegen nicht erfindungsgemäss haltbar gemachte Gewebekulturzellen schon nach wenigen Tagen bei gleicher Lagertemperatur keine oder nur eine schwache Fluoreszenz mit antikörperhaltigen Seren erkennen lassen.The preparation according to the invention is at refrigerator temperatures storable; at 4 ° C no depreciation of the reagent is observed within about 12 months? whereas not according to the invention Tissue culture cells that have been preserved are none or only one after a few days at the same storage temperature show weak fluorescence with antibody-containing sera.
Die Erfindung soll am nachstehend angeführten Beispiel näher erläutert werden.The invention is to be explained in more detail using the example given below.
609 815/0713609 815/0713
1IOF 74/ B 025 - Ma 2041IOF 74 / B 025 - Ma 204
BHK-Zellen werden nach I. Macpherson u. M. Stoker, Virology 16, 147-151 (1962), auf Objektträgern mit markierten Reaktionsfeldern vermehrt. Nach 24 Stunden werden die zellbeladenen Objektträger, aus dem Nährmedium entfernt und mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült, danach 10. Sek. in physiologische Kochsalzlösung eingestellt und mit 50%igem (verdünnt mit physiol. NaCl) Aceton und anschließend mit unverdünntem Aceton abgespült. Die Objektträger werden 2 mal j-e 10 Sek. in frisches Aceton gestellt und dann 10 Min. in frischem Aceton fixiert. Nach kurzer Trocknung an der Luft werden die Objektträger einzeln ih Seidenpapier verpackt und in einen durch Verschrauben abzuschließenden Behälter der Abmessungen 18 χ 8 χ 10 cm eingebracht, Der Boden ist in einer Höhe von 2,5 cm mit Phosphor-Pentoxid bedeckt und das Phosphor-Pentoxid seinerseits zur Vermeidung eines Kontaktes mit den Objektträgern mit Zellulosemull abgedeckt .BHK cells are propagated according to I. Macpherson and M. Stoker, Virology 16 , 147-151 (1962), on microscope slides with marked reaction fields. After 24 hours, the cell-loaded slides are removed from the nutrient medium and rinsed with physiological saline solution, then placed in physiological saline solution for 10 seconds and rinsed with 50% (diluted with physiological NaCl) acetone and then with undiluted acetone. The slides are placed in fresh acetone twice for 10 seconds each time and then fixed in fresh acetone for 10 minutes. After briefly drying in the air, the slides are individually wrapped in tissue paper and placed in a container measuring 18 8 χ 10 cm, which can be closed with screws. The bottom is covered at a height of 2.5 cm with phosphorus pentoxide and the phosphorus For its part, pentoxide is covered with cellulose gauze to avoid contact with the microscope slides.
6 0 9-8 1 5 / 0 7 .1 36 0 9-8 1 5/0 7 .1 3
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