DE19900135A1

DE19900135A1 - Methods of determining the temperature of a single cell in a cell sample or tissue biopsy and method of using the same

Info

Publication number: DE19900135A1
Application number: DE1999100135
Authority: DE
Inventors: Sanford M Simon
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-01-07
Filing date: 1999-01-05
Publication date: 1999-08-05
Also published as: GB9900118D0; GB2333153A; JPH11258159A

Description

FIELD OF THE INVENTION

Die Erfindung betrifft allgemein ein neues Verfahren zur Bestimmung der Temperatur einer einzelnen Zelle oder einer Gruppe von Zellen in einer Gewebeprobe. Verfahren des Einsetzens dieses Verfahrens zur Diagnose sind ebenfalls umfaßtThe invention relates generally to a new method to determine the temperature of a single cell or a group of cells in a tissue sample. Procedure of This method of diagnosis is also used includes

BACKGROUND OF THE INVENTION

Lebende Zellen benötigen eine stabile Stoffwechselge schwindigkeit. Daher unterliegt sowohl in Zellen als auch in den Organismen, welche die Zellen enthalten, eine solche Regulation einer strengen Kontrolle. Ungefähr 50% der gesamten Energie in den Kohlenhydraten wird zu ATP umgewan delt, und der Rest wird als Wärme freigesetzt [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1989)]. Das ATP wird dann wieder während des Wachstums zur Biosynthese verwendet und wird andernfalls für Arbeit verwendet, und die Energie wird als Wärme freigesetzt. Die Freisetzung dieser Wärme wird verwendet, um den Körper in der Form von Temperatur aufzuwärmen. Ein Unvermögen, auf dem Niveau eines Organis mus ein stabiles Stoffwechselniveau aufrechtzuerhalten, ist ein pathologischer Zustand, welcher als Fieber bezeichnet wird - ein Anstieg bei der Temperatur eines Organismus. Variationen bei den Stoffwechselniveaus werden bei einer Vielzahl von pathologischen Zuständen angetroffen, ein schließlich während bakterieller oder viraler Infektionen, bei Krebs und bei der allgemeinen Aufzehrung, welche wäh rend einer Sepsis oder Kachexie angetroffen wird. Living cells need a stable metabolism dizziness. Therefore, both in cells as well in the organisms that contain the cells Regulation of strict controls. About 50% of the all energy in the carbohydrates is converted to ATP delt, and the rest is released as heat [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1989)]. The ATP will then used for biosynthesis again during growth and is otherwise used for work and energy is released as heat. The release of this heat is used to the body in the form of temperature warm up. An inability at the level of an organ must maintain a stable metabolic level a pathological condition called fever becomes - an increase in the temperature of an organism. Variations in metabolic levels are found in one Variety of pathological conditions encountered finally during bacterial or viral infections, cancer and general consumption, which is is found during sepsis or cachexia.

Die Temperatur eines Organismus wird oft als Anzeichen für die Gesundheit des Organismus angesehen. Selbst geringe Abweichungen bei der Temperatur können einen pathologischen Zustand anzeigen. Jedoch kann die Temperatur einer einzel nen Zelle aufgrund der Beschränkung der derzeitigen Techno logie nicht getestet werden. Somit ist es bisher nicht bekannt, in welchem Ausmaß die zelluläre Temperatur mit der Zeit innerhalb einer Zelle oder zwischen zwei verschiedenen Zellen variiert. Basierend auf Studien von großen Zellpopu lationen gibt es jedoch gute Gründe anzunehmen, daß einige pathologische Zustände nachweisbar sein könnten, indem die Temperatur auf dem Niveau von einzelnen Zellen gemessen wird.The temperature of an organism is often used as an indication considered for the health of the organism. Even minor ones Deviations in temperature can be pathological Show condition. However, the temperature of a single cell due to the limitation of current techno logic cannot be tested. So it is not so far known to what extent the cellular temperature with the Time within a cell or between two different ones Cells varied. Based on studies of large cell popu However, there are good reasons to assume that some pathological conditions could be detectable by the Temperature measured at the level of individual cells becomes.

Der zelluläre Metabolismus kann als die Bilanz für alle enzymatischen Reaktionen betrachtet werden, welche in der Zelle auftreten. Innerhalb dieses Zusammenhangs wird die folgende exotherme Aktivität als die Strahlung eines schwarzen Körpers angesehen, d. h. die Wärme, welche wir testen, wenn wir die Temperatur der Zelle messen. Frühere Untersuchungen der biologischen Stoffwechselaktivität haben die Kalorimetrie verwendet, welche auf dem Niveau eines gesamten Organismus oder wenigstens eines einzelnen Organs eingesetzt wird. Die Mikrokalorimetrie kann für so geringe Mengen wie 10 Zellen angewendet werden. Jedoch gibt es ern ste Beschränkungen bei der Grenze der derzeitigen Technolo gie, um die Wärmeproduktion von einzelnen Zellen aufzulösen [Kemp, Thermal and Energetic Studies of Cellular Biological Systems, A.M. James, Herausg. (Bristol: Wright), S. 147-166 (1987)]. Die empfindlichste Technik, welche auf die Messung des Stoffwechsels in Tumorzellen angewendet wird, ist der Cartesische Tauchapparat, welcher hunderte von Zellen auf lösen kann [Lutton und Kopac, Cancer Res., 31: 1564-1569 (1971)]. Diese Technik ist jedoch noch zu grob, um eine heterogene Population von Zellen aufzulösen, und sie macht eine Trennung der Zellen nötig. Ein Großteil der normalen Zellphysiologie ist ein dynamischer Prozeß, welcher eine zelluläre Wechselwirkung in einer dreidimensionalen Matrix nötig macht. Viele Zellaktivitäten werden durch Zell-Zell- Kontakte modifiziert. All dieses geht verloren, wenn die Zellen getrennt werden. Neuere Techniken wurden entwickelt, um Metaboliten wie z. B. ATP, Glucose und Lactat in lebenden Zellen zu messen [Hossman et al., Acta Neuropathologica, 69: 139-147 (1986); Okada et al., Journal of Neurosurgery, 77: 917-926 (1992)]. Diese Techniken benutzen einen photo graphischen Film [Hossman et al., 1986, Supra; Okada et al., 1992, supra] oder photonenzählende Kameras [Tamulevi cius und Streffer, British Journal of Cancer, 72: 1102-1112 (1995)] und haben eine beträchtliche Heterogenität beim Stoffwechsel in Tumoren gezeigt, wenn diese mit einer Auf lösung von einem Millimeter Raumauflösung getestet wurden.The cellular metabolism can act as the balance sheet for everyone enzymatic reactions are considered, which in the Cell occur. Within this context, the following exothermic activity as the radiation of a viewed black body, d. H. the warmth we test when we measure the temperature of the cell. Former Have studies of biological metabolic activity uses calorimetry, which is at the level of a entire organism or at least one individual organ is used. Microcalorimetry can be so low Amounts like 10 cells are applied. However, there are restrictions on the limit of current technology to dissolve heat production from individual cells [Kemp, Thermal and Energetic Studies of Cellular Biological Systems, A.M. James, ed. (Bristol: Wright), pp. 147-166 (1987)]. The most sensitive technique, based on the measurement the metabolism used in tumor cells is the Cartesian diving apparatus, which has hundreds of cells on it [Lutton and Kopac, Cancer Res., 31: 1564-1569 (1971)]. However, this technique is still too rough to use dissolve heterogeneous population of cells, and makes them a separation of the cells is necessary. Much of the normal Cell physiology is a dynamic process, which one cellular interaction in a three-dimensional matrix makes necessary. Many cell activities are caused by cell-cell Modified contacts. All of this will be lost if the Cells are separated. Newer techniques have been developed to metabolites such as B. ATP, glucose and lactate in living Measure cells [Hossman et al., Acta Neuropathologica, 69: 139-147 (1986); Okada et al., Journal of Neurosurgery, 77: 917-926 (1992)]. These techniques use a photo graphic film [Hossman et al., 1986, Supra; Okada et al., 1992, supra] or photon-counting cameras [Tamulevi cius and Streffer, British Journal of Cancer, 72: 1102-1112 (1995)] and have considerable heterogeneity in Metabolism in tumors is shown when these have an on solution of a millimeter spatial resolution were tested.

Unglücklicherweise gibt es derzeit eine Anzahl von wichtigen Problemen, welche nicht angegangen werden können, da der Metabolismus einer einzelnen Zelle nicht bestimmt werden kann. Beispielsweise können wir derzeit keine hete rogenen Populationen von Zellen untersuchen und die Aktivi tät der einzelnen Zellen statt des Durchschnitts der Mischung auflösen. Beispielsweise besteht ein Tumor aus Krebszellen, normalen Zellen und eingedrungenen Immunzel len, welche jeweils mit sehr unterschiedlichen Geschwindig keiten metabolisieren. In diesem Fall kann die Messung des durchschnittlichen Metabolismus des Tumors nicht den tat sächlichen Metabolismus der einzelnen Zellen widerspiegeln. Bei den meisten Zellen ist die aerobe Atmung für fast die gesamte Produktion von ATP verantwortlich, wobei die anae robe Glykolyse für den Rest aufkommt. Es wurde vor über fünfzig Jahren festgestellt, daß die anaerobe Atmung bei Ascites-Tumorzellen in Bezug auf Nichttumorzellen wesent lich erhöht ist [Warburg et al., The Metabolism of Tumors, Herausg. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S. 129-170 (1930a); Warburg et al., The Metabolisin of Tumors, Herausg. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S. Unfortunately, there are currently a number of important problems that cannot be addressed, because the metabolism of a single cell is not determined can be. For example, we cannot currently see one investigate rogene populations of cells and the activi of the individual cells instead of the average of the Dissolve the mixture. For example, there is a tumor Cancer cells, normal cells and invaded immune cells len, each with very different speeds metabolize. In this case, the measurement of the average tumor metabolism did not do that reflect neutral metabolism of the individual cells. For most cells, aerobic breathing is for almost that responsible for the entire production of ATP, the anae robe glycolysis comes up for the rest. It was over before fifty years ago found that anaerobic breathing at Ascites tumor cells with respect to non-tumor cells is increased [Warburg et al., The Metabolism of Tumors, Ed. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S. 129-170 (1930a); Warburg et al., The Metabolisin of Tumors, Ed. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S.

254-265 (1930b)]. Dieses führte zu der Hypothese, daß die aerobe Atmung bei Tumorzellen geschädigt war [Warburg, Science, 123: 309-314 (1956)]. Als in den dazwischenliegen den Jahren mehr über den Stoffwechsel in Erfahrung gebracht wurde, wurde gefunden, daß die aerobe Atmung bei Tumorzel len normal ist, die anaerobe Atmung aber erhöht ist. Der Mechanismus, welcher für diesen Anstieg bei der anaeroben Atmung verantwortlich ist, ist derzeit nicht bekannt. Ein Hauptbegrenzungsfaktor beim Verstehen des Mechanismus ist die Unfähigkeit, die relativen Stoffwechselniveaus von ein zelnen Zellen zu testen. Wie oben erwähnt wurde, ist ein besonderes Problem, daß die Tumoren aus einer Mischung von normalen, bösartigen und Immunzellen bestehen. Die gegen wärtige Technologie erlaubt nur die Messung des durch schnittlichen Stoffwechsels dieser gemischten Population von Zellen. Ein zweites Problem ist die beträchtliche Hete rogenität, sogar innerhalb der Tumorzellen. In Tumoren ist beispielsweise die Oxygenierung oft geschwindigkeitsbe schränkend für das Tumorwachstum [Kallinowski et al., J. Cel. Physiol., 138: 183-191 (1989)]. Somit wird bei schnell wachsenden Tumoren das Wachstum durch die Angiogenese, das Wachstum neuer Blutgefäße für die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, begrenzt.254-265 (1930b)]. This led to the hypothesis that the aerobic respiration was damaged in tumor cells [Warburg, Science, 123: 309-314 (1956)]. As in between learned more about metabolism over the years was found that aerobic respiration in tumor cells len is normal, but anaerobic breathing is increased. Of the Mechanism responsible for this increase in anaerobic Breathing is responsible is currently unknown. A The main limiting factor in understanding the mechanism is the inability to measure the relative metabolic levels of a to test individual cells. As mentioned above, is a particular problem that the tumors from a mixture of normal, malignant and immune cells exist. The against Current technology only allows the measurement of the average metabolism of this mixed population of cells. A second problem is the considerable hete rogenicity, even within the tumor cells. In tumors for example, oxygenation is often speed-dependent restricting tumor growth [Kallinowski et al., J. Cel. Physiol., 138: 183-191 (1989)]. So at fast growing tumors growth through angiogenesis, the Growth of new blood vessels for the supply of oxygen and Nutrients, limited.

Die Chemotherapie ist ein wirkungsvolles Werkzeug, das verwendet wird, um Tumoren zu bekämpfen. Jedoch entwickeln Tumorzellen häufig eine Resistenz gegenüber Chemotherapeu tika. Diese Resistenz wird als eine verminderte Empfind lichkeit gegenüber einem breiten Spektrum von chemothera peutischen Mitteln beobachtet, und solche Zellen wurden als multiresistent bezeichnet [Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3497-3504 (1994)]. Obwohl diese Zellen ursprünglich als "Superzellen" angesehen wurden, welche in der Lage sind, jeglicher therapeutischen Herausforderung zu widerstehen, gibt es nun einen wachsenden Beweis dafür, daß multiresistente Zellen sich der Chemotherapie entziehen, indem sie sich mehr wie normale Zellen benehmen; und in mancher Hinsicht scheinen diese Zellen eine "umgekehrte" Transformation bei ihren Eigenschaften durchgemacht zu haben [Biedler et al., Cancer & Metastasis Reviews, 13: 191-207 (1994)]. Wenn die chemotherapeutischen Arzneimittel entfernt werden, kehren diese Zellen zu ihren aggressiven bösartigen Eigenschaften zurück. Es ist nicht bekannt, was mit dem Stoffwechsel von multiresistenten Zellen während dieser Periode passiert. Indirekte Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Niveau der anaeroben Atmung bei diesen Zellen zu den Niveaus zurückgekehrt ist, welche bei nicht trans formierten Zellen angetroffen werden [Miccadei et al., Oncology Research, 8: 27-35 (1996)]. Daher besteht ein Bedarf, den Stoffwechsel von einzelnen Zellen zu messen, welche multiresistent sind, um zu diagnostizieren, wann sich Tumoren aus ihrer ruhigen multiresistenten Phase in ein bösartigeres Stadium verlagern. Weiterhin besteht ein Bedarf, ein Verfahren zur Messung der Temperatur von ein zelnen Zellen zur Verfügung zu stellen, um die metaboli schen Änderungen zu bestimmen, welche entweder bei normalen oder Tumorzellen auftreten. Zusätzlich besteht ein Bedarf für eine Methodik zur Messung der Temperatur einer Zelle aus einer frischen Biopsie von lebendem Gewebe, um das Gewebe schnell auf das Vorliegen von Tumorzellen hin zu diagostizieren.Chemotherapy is an effective tool that is used to fight tumors. However develop Tumor cells often have resistance to chemotherapeu tika. This resistance is called a diminished sensation versus a wide range of chemothera therapeutic agents, and such cells were identified as designated multi-resistant [Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3497-3504 (1994)]. Although these cells were originally regarded as "super cells", which in are able to face any therapeutic challenge resist, there is now growing evidence that multi-resistant cells evade chemotherapy, by acting more like normal cells; and in in some ways these cells seem an "inverse" Undergone transformation in their properties too have [Biedler et al., Cancer & Metastasis Reviews, 13: 191-207 (1994)]. If the chemotherapeutic drugs removed, these cells return to their aggressive ones malignant properties. It is not known what with the metabolism of multi-resistant cells during this period happens. Indirect results indicate this out that the level of anaerobic respiration in these cells has returned to the levels that are not at trans formed cells are found [Miccadei et al., Oncology Research, 8: 27-35 (1996)]. Therefore there is a Need to measure the metabolism of individual cells, which are multi-resistant to diagnose when tumors from their calm multi-resistant phase shift to a more malicious stage. There is also a Need a method for measuring the temperature of a to provide individual cells to the metaboli to determine which changes either in normal or tumor cells appear. There is also a need for a methodology for measuring the temperature of a cell from a fresh biopsy of living tissue to get the Tissue quickly towards the presence of tumor cells diagnose.

Die Emission fast aller Fluorophore wird durch die Tem peratur beeinflußt, jedoch wurde die Verwendung von Fluoro phoren, die für die Temperatur besonders empfindlich sind, zuerst von Kolodner et al., [Appl. Phys. Lett. 40: 782-784 (1982); Appl. Phys. Lett. 42: 782-784 (1983)] als eine Tech nik zur Kalibrierung der Temperatur verwendet. Kolodner verwendete einen Fluorophor, Eu(TTA)₃, welcher in ein Poly mer, PMMA, eingebettet war, um Temperaturauflösungen von 0,07°K und eine Raumauflösung von 10 µM zu erreichen. Die ser temperaturempfindliche Fluorophor konnte somit verwen det werden, um Temperaturen zu quantifizieren. The emission of almost all fluorophores is influenced by the temperature, but the use of fluorophores, which are particularly sensitive to the temperature, was first described by Kolodner et al., [Appl. Phys. Lett. 40: 782-784 (1982); Appl. Phys. Lett. 42: 782-784 (1983)] was used as a technique for calibrating the temperature. Kolodner used a fluorophore, Eu (TTA) ₃ , which was embedded in a polymer, PMMA, to achieve temperature resolutions of 0.07 ° K and a spatial resolution of 10 µM. This temperature sensitive fluorophore could thus be used to quantify temperatures.

Eine Vielzahl von Fluorophoren, einschließlich Eu(TTA)₃, wurde in verschiedenen Lösungsmitteln und Polyme ren solubilisiert und verwendet, um Flugzeugflügel in dem Labor von John P. Sullivan (Pursue University, siehe Tabel le 1, modifiziert ausgehend von [Campbell et al., 1994, supra]) "anzustreichen". Die Änderung bei der Fluoreszenz kann verwendet werden, um beispielsweise die Temperaturän derungen des Flugzeugflügels in einem Windkanal zu überwa chen. Bisher wurden temperaturempfindliche Fluorophore in der Diagnostik mit integrierten Schaltkreisen verwendet [Kolodner et al., Appl. Phys. Lett. 42: 117-119 (1983)], um einen Grenzflächenübergang bei einem zweidimensionalen Flü gel festzustellen und um die Wechselwirkung zwischen den Vorderkantenwirbeln und der Oberfläche eines Deltaflügels sichtbar zu machen [Campbell et al., beim 6. Internat. Symp. über die Anwendungen der Lasertechnik auf die Strö mungslehre, Lissabon, Portugal (1992); Campbell et al., Temperature Measurement Using Fluorescent Molecules, Abstract (1992); Campbell et al., Temperature Sensitive Fluorescent Paint Systems, 18: 94-2483 (1994); Hamner et al., A Scanning Laser System for Temperature and Pressure Sensitive Paint, 32: 94-0728 (1994)].A variety of fluorophores, including Eu (TTA) ₃ , have been solubilized in various solvents and polymers and used to make aircraft wings in the laboratory of John P. Sullivan (Pursue University, see Table 1, modified from [Campbell et al. , 1994, supra]) "to be painted". The change in fluorescence can be used, for example, to monitor the temperature changes of the aircraft wing in a wind tunnel. So far, temperature-sensitive fluorophores have been used in diagnostics with integrated circuits [Kolodner et al., Appl. Phys. Lett. 42: 117-119 (1983)] to determine an interface transition in a two-dimensional wing and to visualize the interaction between the leading edge vertebrae and the surface of a delta wing [Campbell et al., At the 6th Internat. Symp. On the applications of laser technology to fluid mechanics, Lisbon, Portugal (1992); Campbell et al., Temperature Measurement Using Fluorescent Molecules, Abstract (1992); Campbell et al., Temperature Sensitive Fluorescent Paint Systems, 18: 94-2483 (1994); Hamner et al., A Scanning Laser System for Temperature and Pressure Sensitive Paint, 32: 94-0728 (1994)].

Die Zitierung von irgendwelchen Referenzen hierin soll te nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, daß eine solche Referenz für die vorliegende Anmeldung als "Stand der Tech nik" verfügbar ist.The citation of any references herein is intended to be te should not be interpreted as a concession that such Reference for the present application as "State of Tech nik "is available.

SUMMARY OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung stellt in ihrer breitesten Ausführungsform ein Mittel zum Messen der Temperatur einer Zelle unter Verwendung eines temperaturempfindlichen Fluo rophors zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung setzt eine Stoffwechselsonde ein, welche ein festes Substrat umfaßt, das einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält. Wenn der Fluorophor mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert der Fluorophor ein nachweisbares Fluores zenzsignal. Wenn eine lebende Zelle auf der Stoffwechsel sonde angeordnet wird, wird die Intensität des Fluoreszenz signals durch die Stoffwechselgeschwindigkeit der Zelle bewirkt.The present invention is at its broadest Embodiment means for measuring the temperature of a Cell using a temperature sensitive fluo rophors available. The present invention uses one Metabolic probe, which comprises a solid substrate, which embedded a temperature sensitive fluorophore in contains a polymer. If the fluorophore with the appropriate ultraviolet, visible or infrared light the fluorophore emits a detectable fluorescence zenzsignal. When a living cell on the metabolism probe is placed, the intensity of fluorescence signals through the metabolic rate of the cell causes.

Vorzugsweise enthält die Stoffwechselsonde einen Fluo rophor, welcher während er in ein Polymer eingebettet ist, in der Nähe einer wäßrigen Lösung für wenigstens eine Stun de bei Anregung mit ultraviolettem Licht bei 37°C und bei ca. pH 7,5 ein stabiles Fluoreszenzsignal emittieren kann. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung verur sacht eine Zelle, welche auf der Stoffwechselsonde angeord net wird, eine 2,5%ige Änderung bei der Intensität des Fluoreszenzsignals pro Grad Celsius Anstieg bei der Tempe ratur.The metabolic probe preferably contains a fluo rophor, which is embedded in a polymer while near an aqueous solution for at least one hour de when excited with ultraviolet light at 37 ° C and at pH 7.5 can emit a stable fluorescence signal. In a particular embodiment of the invention gently a cell, which is arranged on the metabolic probe is a 2.5% change in the intensity of the Fluorescence signal per degree Celsius increase in temperature maturity.

In einer Ausführungsform ist der temperaturempfindliche Fluorophor, welcher in der Stoffwechselsonde enthalten ist, Eu(TTA)₃. In einer anderen Ausführungsform ist das Polymer der Stoffwechselsonde Poly(methylmethacrylat). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Poly(methyl methacrylat) und der temperaturempfindliche Fluorophor ist Eu(TTA)₃. Das feste Substrat der vorliegenden Erfindung kann aus irgendeinem inerten Material gefertigt werden, ist aber vorzugsweise ein Glas oder ein Kunststoff. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform dieses Typs ist das feste Substrat ein Deckgläschen (glass cover slip).In one embodiment, the temperature sensitive fluorophore contained in the metabolic probe is Eu (TTA) ₃ . In another embodiment, the polymer of the metabolic probe is poly (methyl methacrylate). In a preferred embodiment, the polymer is poly (methyl methacrylate) and the temperature sensitive fluorophore is Eu (TTA) ₃ . The solid substrate of the present invention can be made of any inert material, but is preferably a glass or a plastic. In an even more preferred embodiment of this type, the solid substrate is a glass cover slip.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Feststellen der Temperatur einer Zelle zur Verfügung. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein Anordnen einer Zelle auf einer Stoffwechselsonde, welche ein festes Substrat umfaßt, das einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält. Wenn der Fluorophor mit dem richtigen ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert er ein nachweisbares Fluoreszenzsignal. Wenn eine lebende Zelle auf der Stoffwechselsonde angeord net wird, wird die Intensität des Fluoreszenzsignals durch die Temperatur der Zelle bewirkt.The present invention provides a method for Detect the temperature of a cell. A such embodiment includes placing a cell a metabolic probe which comprises a solid substrate, which embedded a temperature sensitive fluorophore in contains a polymer. If the fluorophore is right ultraviolet, visible or infrared light , it emits a detectable fluorescence signal. When a living cell is placed on the metabolic probe net, the intensity of the fluorescence signal is determined by the temperature of the cell.

In einer spezifischen Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Polymer ein nichtaromatisches synthetisches Poly mer. In einer bestimmten Ausführungsform dieses Verfahrens kann der Fluorophor bei Anregung mit ultraviolettem Licht für wenigstens eine Stunde bei 37°C, pH 7,4, ein stabiles Fluoreszenzsignal emittieren.In a specific embodiment of this method the polymer is a non-aromatic synthetic poly mer. In a particular embodiment of this method the fluorophore can excite with ultraviolet light stable for at least one hour at 37 ° C, pH 7.4 Emit fluorescence signal.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zum Feststellen der Stoffwechselaktivität einer Zelle. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein Feststellen der Tem peratur einer Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechselsonde der vorliegenden Erfindung, Anregen des Fluorophors der Sonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nachweisen des Fluo reszenzsignals, wobei die Intensität des Fluoreszenzsig nals, welche nachgewiesen wird, ein Anzeichen für die Tem peratur der Zelle ist. Die gemessene Temperatur wird dann mit der Stoffwechselaktivität der Zelle korreliert. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs ist die Zelle eine Tumorzelle.The present invention also includes a method to determine the metabolic activity of a cell. Such an embodiment includes determining the tem temperature of a cell by placing the cell on a cell Metabolic probe of the present invention, stimulating the Fluorophore of the probe with the appropriate ultraviolet, visible or infrared light and evidence of fluo resence signal, the intensity of the fluorescence sig nals, which is demonstrated, is an indication of the tem temperature of the cell. The measured temperature is then correlates with the metabolic activity of the cell. In a preferred embodiment of this type is the cell a tumor cell.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zum Nachweisen des Vorliegens einer Tumorzelle in einem lebenden Gewebe, welches ein Feststellen der Temperatur der Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechsel sonde der vorliegenden Erfindung (wie oben beschrieben), Anregen des Fluorophors der Stoffwechselsonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nachweisen des Fluoreszenzsignals umfaßt. Die Intensi tät des nachgewiesenen Fluoreszenzsignals kann mit der Tem peratur der Zelle korreliert werden. Von dem Metabolismus von Tumorzellen ist bekannt, daß er signifikant höher ist als der von nicht transformierten Zellen. Die vorliegende Erfindung erlaubt den Nachweis von Tumorzellen mitten unter einer Masse von normalen (z. B. nicht transformierten) Zel len durch ein Bestimmen der Temperatur der Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs wird das lebende Gewebe aus einer Tumorbiopsie erhalten. In einer verwandten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Ver fahren zum Nachweisen des Vorliegens eines anomalen Metabo lismus einer Zelle, welche von gesundem Gewebe umgeben ist (mitten unter einer Masse von normalen Zellen), zur Verfü gung, welches ein Feststellen der Temperatur der Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechselsonde der vorliegenden Erfindung (wie oben beschrieben), Anregen des Fluorophors der Stoffwechselsonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nach weisen des Fluoreszenzsignals umfaßt. Ein Unterschied bei der Temperatur der Zelle in Bezug auf eine Kontrollzelle ist ein Anzeichen dafür, daß die Zelle einen anomalen Meta bolismus durchmacht. In einer solchen Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen für eine Zelle mit einer ultravioletten Schädigung. In einer anderen Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen dafür, daß die Zelle eine Kachexie durchmacht. In einer dritten Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen dafür, daß die Zelle eine Apoptosis durchmacht.The present invention also includes a method to detect the presence of a tumor cell in one living tissue, which is a determination of the temperature of the Cell by arranging the cell on a metabolism probe of the present invention (as described above), Excite the fluorophore of the metabolic probe with the suitable ultraviolet, visible or infrared light and detecting the fluorescence signal. The intensi act of the detected fluorescence signal can with the Tem temperature of the cell can be correlated. From the metabolism tumor cells are known to be significantly higher than that of untransformed cells. The present Invention allows the detection of tumor cells in the middle a mass of normal (e.g. untransformed) cells len by determining the temperature of the cells. In a preferred embodiment of this type is the living Tissue obtained from a tumor biopsy. In a relative Embodiment, the present invention provides a ver drive to prove the presence of an abnormal metabo lism of a cell surrounded by healthy tissue (in the middle of a mass of normal cells) supply, which is a determination of the temperature of the cell by placing the cell on a metabolic probe of the present invention (as described above) the fluorophore of the metabolic probe with the appropriate one ultraviolet, visible or infrared light and night exhibit the fluorescence signal. A difference in the temperature of the cell in relation to a control cell is an indication that the cell has an abnormal meta bolism is going through. In such an embodiment the abnormal metabolism of the cell is an indication of one Cell with ultraviolet damage. In another Embodiment is the abnormal metabolism of the cell Signs that the cell is undergoing cachexia. In a third embodiment is abnormal metabolism the cell an indication that the cell is undergoing apoptosis going through.

In einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Stoffwechselsonde auf einem Mikroskop angeordnet, der Fluorophor wird angeregt und seine Emission wird unter Verwendung des Mikroskops nachgewiesen. In einer solchen Ausführungsform ist das Mikroskop ein konfokales Lasermikroskop, das mit einem Ultraviolettlaser zur Anre gung ausgerüstet ist. In einer anderen solchen Ausführungs form ist das Mikroskop ein Fluoreszenzmikroskop, welches mit einer Hg/Xenon-Lampe mit einem Ultraviolett-Anregungs filter und einem Emissionsfilter im sichtbaren Bereich mit 615 nm ± 10 nm ausgerüstet ist.In a particular embodiment of the present Invention is the metabolic probe on a microscope arranged, the fluorophore is excited and its emission is detected using the microscope. In a In such an embodiment, the microscope is a confocal Laser microscope with an ultraviolet laser is equipped. In another such execution the microscope is a fluorescence microscope, which with an Hg / Xenon lamp with an ultraviolet excitation filter and an emission filter in the visible range 615 nm ± 10 nm.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zur Herstellung der Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein In-Kon takt-Bringen eines Polymers mit einem temperaturempfindli chen Fluorophor in einem mischbaren Lösungsmittel, worin eine Lösung des Fluorophors und des Polymers gebildet wird. Die Lösung wird als nächstes auf dem festen Substrat ange ordnet, und das Polymer wird dann in das feste Substrat eingebrannt (annealed to).The present invention also includes a method ren for the production of the metabolic probes of the present Invention. Such an embodiment includes an In-Kon clocking a polymer with a temperature sensitive Chen fluorophore in a miscible solvent, wherein a solution of the fluorophore and the polymer is formed. The solution is next placed on the solid substrate arranges, and the polymer is then in the solid substrate branded (annealed to).

Das feste Substrat, welches in diesem Verfahren verwen det wird, ist vorzugsweise ein Glas oder ein Kunststoff. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform dieses Verfahrens ist das feste Substrat ein Deckgläschen. In einer bevorzug ten Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Deckgläschen in eine starke Säure (z. B. 70% Salpetersäure) eingetaucht, bevor der Polymer-Fluorophor auf dem Glasscheibchen ange ordnet wird. In einer anderen Ausführungsform dieses Ver fahrens wird das feste Substrat während des Einbrennens eines Polymers auf dem festen Substrat gedreht.The solid substrate used in this process det is preferably a glass or a plastic. In an even more preferred embodiment of this method the solid substrate is a cover slip. In one preferred The embodiment of this method is the cover slip immersed in a strong acid (e.g. 70% nitric acid), before the polymer fluorophore is attached to the glass pane is arranged. In another embodiment of this ver the solid substrate during baking of a polymer rotated on the solid substrate.

In noch einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist das verwendete Polymer Poly(methylmethacrylat). In noch einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist der temperaturempfindliche Fluorophor Eu(TTA)₃. In noch einer anderen Ausführungsform ist das Lösungsmittel Nitroethan.In yet another embodiment of this process, the polymer used is poly (methyl methacrylate). In yet another embodiment of this method, the temperature sensitive fluorophore is Eu (TTA) ₃ . In yet another embodiment, the solvent is nitroethane.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Typs wird die Stoffwechselsonde durch ein Verfahren hergestellt, wel ches ein In-Kontakt-Bringen einer Lösung von 0,1 mM Poly(methylmethacrylat) in 96% Nitroethan mit 200 mM Eu(TTA)₃ in 96% Nitroethan umfaßt. Die Fluorophor/Polymer lösung wird dann auf einem mit Säure gewaschenen Glas scheibchen angeordnet (welches vorher in 70%ige Salpeter säure eingetaucht wurde, mit destilliertem Wasser gewaschen wurde, mit Ethanol gespült wurde und dann in einem Vakuum ofen getrocknet wurde). Das Glasscheibchen wird dann auf einem Rotor befestigt und gedreht. Das Glasscheibchen wird als nächstes bei 100°C für eine Stunde in einem Vakuumofen gebrannt, um das polymer einzubrennen.In a particular embodiment of this type, the metabolic probe is made by a method which comprises contacting a solution of 0.1 mM poly (methyl methacrylate) in 96% nitroethane with 200 mM Eu (TTA) ₃ in 96% nitroethane . The fluorophore / polymer solution is then placed on a glass plate washed with acid (which was previously immersed in 70% nitric acid, washed with distilled water, rinsed with ethanol and then dried in a vacuum oven). The glass pane is then attached to a rotor and rotated. The glass sheet is next baked at 100 ° C for one hour in a vacuum oven to bake the polymer.

Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden besser durch Bezug auf die folgenden Zeichnungen und die detaillierte Beschreibung gewürdigt werden.These and other aspects of the present invention become better by referring to the following drawings and the detailed description will be appreciated.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Fig. 1 stellt die Änderung der Fluoreszenzintensität mit der Temperatur für Eu(TTA)₃/PPMA dar. Die Anregungswel lenlänge war 365 nm und die Emissionswellenlänge war 621 nm. Fig. 1 shows the change in fluorescence intensity with temperature for Eu (TTA) ₃ / PPMA. The excitation wavelength was 365 nm and the emission wavelength was 621 nm.

Die Fig. 2A und 2C sind Zellen, wie sie in dem Bei spiel beschrieben werden, sichtbar gemacht durch Absorpti onsspektroskopie.Visualized onsspektroskopie Figs. 2A and 2C are cells as described in the case of play by Absorpti.

Die Fig. 2B und 2D stellen Fluoreszenzdifferenzspek tren dar, welche aus den Zellen der Fig. 2A bzw. 2C erhalten wurden, nach der Zugabe von FCCP. Die Zellen wur den bei 355 nm angeregt, und die Emission wurde bei 614 nm überwacht. FIGS. 2B and 2D fluorescence difference Spek tren represents, which were obtained from the cells of FIGS. 2A and 2C, after the addition of FCCP. The cells were excited at 355 nm and the emission was monitored at 614 nm.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwen dung einer Stoffwechselsonde, wie sie hierin beschrieben ist, zur Verfügung, um die Temperatur und/oder metabolische Änderungen einer einzelnen Zelle oder einer Gruppe von Zel len zu überwachen. Die Zelle kann entweder von anderen Zel len losgelöst sein oder ein Teil einer Zellprobe sein. Wenn die Zelle eine Tumorzelle ist, hilft eine solche Überwa chung bei dem Verständnis der Zellbiologie von Tumorzellen. Die Stoffwechselsonden und die damit zusammenhängende Methodik der vorliegenden Erfindung können ebenfalls ver wendet werden, um zu bestimmen, ob Tumorzellen in einer frischen Biopsie von lebendem Gewebe vorhanden sind, in einem Zeitrahmen, welcher erlauben würde, daß die Diagnose während der Tumorbiopsie erhalten wird. Auf diese Weise könnte die Analyse der Biopsie unmittelbar nach der Entfer nung des Gewebes durchgeführt werden, was dem praktizieren den Arzt erlaubt, unmittelbar eine Entscheidung zu treffen, ob weiteres Gewebe entfernt werden muß, oder alternativ um zu bestimmen, daß keine weitere Operation nötig ist. Ein solches Verfahren hat viele Vorteile gegenüber der gegen wärtigen Technologie, welche eine anfängliche Biopsie nötig macht, dann typischerweise eine 7- bis 10-tägige Untersu chung des Gewebes, auf welche in vielen Fällen ein weiterer chirurgischer Eingriff folgt. Somit erlaubt die vorliegende Erfindung, daß der praktizierende Mediziner einen chirurgi schen Eingriff durchführt und sofort auf die Gewebeanalyse reagiert, wodurch eine weitere Verschlechterung des Gewebes während der Zeitspanne der Analyse verhindert wird.The present invention provides methods of use a metabolic probe as described herein is available to the temperature and / or metabolic Changes to a single cell or group of cells len to monitor. The cell can either be from another cell len detached or be part of a cell sample. If if the cell is a tumor cell, such monitoring helps in understanding the cell biology of tumor cells. The metabolic probes and the related Methodology of the present invention can also be used be used to determine whether tumor cells are in a fresh biopsy of living tissue are present in a time frame that would allow the diagnosis is obtained during tumor biopsy. In this way could analyze the biopsy immediately after removal Tissue can be performed, which the practice allows the doctor to make a decision immediately, whether more tissue needs to be removed or alternatively to determine that no further surgery is necessary. A such procedure has many advantages over the counter technology that requires an initial biopsy then typically do a 7-10 day study tissue, on which in many cases another surgery follows. Thus, the present allows Invention that the medical practitioner a surgical intervention and immediately on the tissue analysis responds, causing further tissue deterioration is prevented during the period of the analysis.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Verfahren zum Feststellen der Temperatur einer Zelle unter Verwendung der Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung. Die Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung umfassen ein festes Substrat, welches einen temperaturempfindlichen Flu orophor enthält, der in ein Polymer eingebettet wurde. Wenn der Fluorophor mit dem geeigneten ultravioletten, sichtba ren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert er ein nachweisbares Fluoreszenzsignal. Dieses Fluoreszenzsignal wird durch die Stoffwechselgeschwindigkeit einer Zelle bewirkt, welche auf der Stoffwechselsonde angeordnet ist. Somit kann durch ein Anregen des Fluorophors mit dem geeig neten Licht und dann einem Nachweisen der Intensität des Fluoreszenzsignals die Temperatur der Zelle bestimmt wer den. The present invention also encompasses methods to determine the temperature of a cell using the metabolic probes of the present invention. The Metabolic probes of the present invention include solid substrate, which has a temperature sensitive flu contains orophore that has been embedded in a polymer. If the fluorophore with the appropriate ultraviolet, visible or infrared light is emitted, it emits detectable fluorescence signal. This fluorescence signal is determined by the metabolic rate of a cell causes which is arranged on the metabolic probe. Thus, by exciting the fluorophore with the appropriate neten light and then a proof of the intensity of the Fluorescence signal determines the temperature of the cell the.

Daher sollen die folgenden Begriffe, wenn sie hierin erscheinen, die unten aufgeführten Definitionen aufweisen:Therefore, the following terms are used when used herein appear with the definitions below:

Wie hierin verwendet, umfaßt eine "Stoffwechselsonde" ein festes Substrat, welches einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält, worin, wenn der Fluorophor mit der geeigneten Lichtwellenlänge angeregt wird (z. B. ultraviolett, sichtbar oder infrarot), der Fluo rophor ein nachweisbares Fluoreszenzsignal emittiert und worin, wenn eine lebende Zelle (allein, oder als ein Teil einer Zellprobe) auf der Stoffwechselsonde angeordnet wird, das Fluoreszenzsignal aufgrund der Wärme, welche von der Zelle emittiert wird (z. B. wie als die Temperatur und/oder der metabolische Zustand der Zelle gemessen wird), poten ziert wird (d. h. steigt oder fällt).As used herein, a "metabolic probe" includes a solid substrate that is temperature sensitive Contains fluorophore embedded in a polymer, wherein if the fluorophore is excited with the appropriate light wavelength becomes (e.g. ultraviolet, visible or infrared), the fluo rophor emits a detectable fluorescence signal and what if a living cell (alone, or as a part a cell sample) is placed on the metabolic probe, the fluorescence signal due to the heat emitted by the Cell is emitted (e.g. as as the temperature and / or the metabolic state of the cell is measured) is adorned (i.e. rises or falls).

Wie hierin verwendet, kann ein "festes Substrat" aus irgendeinem festen Material gefertigt werden, vorzugsweise einem Kunststoff, Metall oder Glas, und noch bevorzugter, einer Glaslinse.As used herein, a "solid substrate" can be made from any solid material, preferably a plastic, metal or glass, and more preferably a glass lens.

Wie hierin verwendet, umfaßt "ca. pH 7,5" pH 7,0 bis pH 8,0.As used herein, "about pH 7.5" includes pH 7.0 to pH 8.0.

Bei einer Anwendung der vorliegenden Erfindung wird die Temperatur einer Zelle bestimmt, welche aus einer Zellprobe von einem Patienten erhalten wurde, der in dem Verdacht stand, an Kachexie zu leiden. Kachexie ist ein Krankheits zustand, welcher den Körper auszehrt und oft tödlich endet. Kachexie, welche durch den Tumornekrosefaktor ausgelöst wird, ist mit einer erhöhten Produktion von Milchsäure ver bunden und es wird angenommen, daß sie das Ergebnis der Aktivierung eines nutzlosen Substratzyklus zwischen Fructo se-6-phosphat und Fructose-1,6-biphosphat ist. Dieser ver brennt das zelluläre ATP [Zentella et al., Cytokine, 5: 436-447 (1993)]. Somit ist eine Bestimmung einer erhöhten Tem peratur für Zellen, welche von einem Patienten erhalten wurden, der in dem Verdacht steht, eine Kachexie zu haben, mit der Diagnose einer Kachexie konsistent.In an application of the present invention, the Temperature of a cell determines which one from a cell sample was obtained from a patient suspected of having was suffering from cachexia. Cachexia is a disease condition that wears out the body and often ends in death. Cachexia, which is triggered by the tumor necrosis factor is associated with an increased production of lactic acid bound and is believed to be the result of Activation of a useless substrate cycle between fructo se-6-phosphate and fructose-1,6-biphosphate. This ver burns the cellular ATP [Zentella et al., Cytokine, 5: 436-447 (1993)]. Thus a determination of an increased tem temperature for cells received from a patient suspected of having cachexia consistent with the diagnosis of cachexia.

Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Mechanismus eines induzierten Fiebers durch das entzündliche Makrophagenprotein sondiert werden. Das Fieber kann in Tieren durch einen Faktor hervorgerufen werden, welcher von Makrophagen freigesetzt wird: das entzündliche Makrophagenprotein [Myers et al., Neurochemical Research, 18: 667-673 (1993)]. Während bekannt ist, daß dieser Faktor die Nahrungsaufnahme durch das Tier moduliert, ist derzeit noch nicht bekannt, wo oder wie diese Wirkungen auf die Zellen aufweisen, um den Stoffwechsel zu erhöhen und die Temperatur zu erhöhen. Somit kann die Bestimmung, welche bestimmten Zellen (oder Zelltypen) die überschüssige Wärme emittieren, die das Fieber verursacht, erreicht werden, indem die Temperatur der einzelnen Zellen (oder des Zell typs) festgestellt wird.In another aspect of the present invention the mechanism of an induced fever can be caused by the inflammatory macrophage protein to be probed. The fever can be caused in animals by a factor which is released by macrophages: the inflammatory Macrophage protein [Myers et al., Neurochemical Research, 18: 667-673 (1993)]. While it is known that this factor the animal's food intake is currently modulated not yet known where or how these effects on the Have cells to increase metabolism and the Increase temperature. Thus the determination of which certain cells (or cell types) have excess heat emit that causes the fever to be achieved by the temperature of each cell (or cell typs) is determined.

Unter einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfin dung wird die Temperatur von kultivierten Zellen bestimmt. In einer solchen Ausführungsform werden Populationen von Brusttumorzellen verwendet. In einer weiteren solchen Aus führungsform werden arzneimittelresistente Brusttumorzellen verwendet. In noch einer anderen Ausführungsform werden nicht transformierte Brustzellen verwendet. In einer bevor zugten Ausführungsform werden zwei dieser Zelltypen verwen det. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform werden alle drei Zelltypen verwendet. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform kommen die Brusttumorzellen aus einer humanen Quelle. In einer besonderen Ausführungsform werden braune Fettgewebszellen aus der Tumorzellinie HIB 1B verwendet.In a special aspect of the present invention The temperature of cultured cells is determined. In such an embodiment, populations of Breast tumor cells used. In another such Aus Drug-resistant breast tumor cells are the form of management used. In yet another embodiment not transformed breast cells used. In a before preferred embodiment, two of these cell types are used det. In an even more preferred embodiment all three cell types used. In a preferred embodiment the breast tumor cells come from a human Source. In a special embodiment, brown Adipose tissue cells from the HIB 1B tumor cell line were used.

In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird ein Scheibchen des Brustgewebes als die Quelle von Zellen verwendet. Ein Scheibchen von der Brust umfaßt Fettzellen (welche mit großen Fettglobuli gefüllt sind, die sehr niedrige Stoffwechselniveaus aufweisen) und Duktuszellen, welche aktiv metabolisieren und sezernieren. Die Grundgeschwindigkeit des Stoffwechsels der Tumorzellen ist signifikant höher als die von "normalen" Zellen. Tests unter Verwendung einer Oberflächentemperaturmessung von Hauttumoren zeigen eine Temperaturdifferenz (bei Belich tung) von bis zu 3,3°C.In a further embodiment of this aspect of Invention is a slice of breast tissue as that Source of cells used. A slice from the chest includes fat cells (which are filled with large fat globules which have very low metabolic levels) and Ductus cells, which actively metabolize and secrete. The basic rate of tumor cell metabolism is significantly higher than that of "normal" cells. Testing using a surface temperature measurement of Skin tumors show a temperature difference (in Belich tion) of up to 3.3 ° C.

In der gegenwärtigen medizinischen Praxis wird heraus geschnittenes Gewebe, welches während einer Biopsie erhal ten wurde, für histologische Tests präpariert, welche 7-10 Tage dauern. Somit befindet sich der Patient nicht mehr im Operationsraum, wenn die Ergebnisse bestimmt werden. Daher muß oft eine nachfolgende Operation angesetzt werden. Das Verfahren des Feststellens der Temperatur von Zellen in den Scheibchen unter Verwendung der Methodik der vorliegenden Erfindung erlaubt, daß die Zellen in den Gewebescheibchen sofort getestet werden, wobei ein standardmäßiges Fluores zenzmikroskop verwendet wird, um zu bestimmen, ob es loka lisierte "Hot spots" einer Stoffwechselaktivität (d. h. Zel len, welche größere als die normalen Mengen an Wärme emit tieren) als einen Fingerzeig für Tumorzellen gibt. Solche Bestimmungen erlauben dem Chirurgen, unmittelbar zu ent scheiden, ob oder nicht weiteres Gewebe herausgeschnitten werden muß.In current medical practice, it becomes apparent cut tissue obtained during a biopsy was prepared for histological tests, which were 7-10 Take days. Thus the patient is no longer in the Operating room when the results are determined. Therefore a subsequent operation must often be scheduled. The Method of determining the temperature of cells in the Slices using the methodology of the present Invention allows the cells in the tissue slices be tested immediately, using a standard fluores zenzmikoskop is used to determine whether it is loka "Hot spots" of a metabolic activity (i.e. cell len, which emits larger than the normal amounts of heat animals) as a pointer to tumor cells. Such Determinations allow the surgeon to withdraw immediately decide whether or not to cut out more tissue must become.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung umfaßt die Bestimmung der Temperatur/des Metabolismus von einzelnen Zellen, um die Verschiebung von ruhigen multiresistenten Zellen zu dem bösartigeren Zustand hin zu überwachen. In diesem Fall wäre ein Ansteigen der Temperatur mit einer solchen Verschiebung konsistent. Ein solches Überwachen wäre während einer Chemotherapie und insbesondere nach dem Ende einer solchen Behandlung besonders nützlich. Yet another aspect of the invention includes Determination of temperature / metabolism of individuals Cells to shift from calm multi-resistant Monitor cells for the more malignant state. In in this case the temperature would increase with a such shift consistently. Such monitoring would be during chemotherapy and especially after End of such treatment is particularly useful.

In einer bestimmten Ausführungsform wird eine Zell- oder Gewebebiopsie auf einer Stoffwechselsonde angeordnet und dann mit einem konfokalen Lasermikroskop erfaßt, das mit einem Ultraviolettlaser zur Anregung ausgerüstet ist, was gleichzeitige Emissionsmessungen von dem temperaturemp findlichen Fluorophor erlaubt. In einer weiteren solchen Ausführungsform wird die Erfassung mit einem Fluoreszenz mikroskop durchgeführt, das mit einer Hg/Xenon-Lampe mit einem Ultraviolett-Anregungsfilter und einem Emissionsfil ter im sichtbaren Bereich ausgestattet ist.In a particular embodiment, a cell or tissue biopsy arranged on a metabolic probe and then with a confocal laser microscope, the is equipped with an ultraviolet laser for excitation, what simultaneous emission measurements from the temp sensitive fluorophore allowed. In another one Embodiment does the detection with a fluorescence microscope performed using a mercury / xenon lamp an ultraviolet excitation filter and an emission fil ter in the visible area.

Wie oben erwähnt wurde, ist ein bevorzugter Fluorophor Eu(TTA)₃, welcher ein Anregungsmaximum von 360 nm aufweist und ein Emissionsmaximum von 614 nm aufweist. Noch bevor zugter wird Eu(TTA)₃ mit dem Polymer Poly(methylmeth acrylat), (PMMA), kombiniert und in ein festes Substrat eingebrannt, um eine Stoffwechselsonde zu bilden. Jedoch werden andere geeignete Kombinationen durch die vorliegende Erfindung abgedeckt. Solche möglichen Kombinationen sind beispielhaft in Tabelle 1 dargestellt. Diese und andere Kombinationen können getestet werden, um ihre Eignung zu bestimmen, als Komponenten der Stoffwechselsonde zu dienen. Insbesondere sind die Schlüsselkriterien zur Auswahl einer Fluorophorverbindung die, daß der Fluorophor: (i) eine maximale Änderung der Fluoreszenz bei einer Änderung der Temperatur bei 37°C zeigt; (ii) die Fähigkeit aufweist, in einem Polymer und abseits von der wäßrigen Lösung eingebet tet zu werden; und (iii) für lebende Zellen nicht toxisch ist. Somit kann ein solches Testen das Bestimmen der Emp findlichkeit des Fluorophors auf Temperaturänderungen bei 37°C, die Stabilität des Fluorophors in einer wäßrigen Umgebung, die Stabilität des Fluorophors während des Ein bettens in das Polymer und die Beständigkeit des Fluoro phors gegenüber einem Ausbleichen durch Licht (eine solche Beständigkeit wird für Langzeitbeobachtungen und anschlie ßende Kalibrierungen benötigt) umfassen. Je größer die Emp findlichkeit des Fluorophors gegenüber einer Temperaturän derung bei 37°C ist, je größer seine Stabilität unter den oben erwähnten Bedingungen ist, einschließlich einer Resi stenz gegenüber dem Ausbleichen durch Licht, desto mehr ist der Fluorophor als ein Bestandteil der Stoffwechselsonde geeignet. In ähnlicher Weise wird das Polymer so ausge wählt, daß es eine optimierende Wirkung auf den temperatur empfindlichen Fluorophor aufweist. Schließlich muß die Flu orophor/Polymer-Kombination mit den lebenden Zellen kompa tibel sein, d. h. sie sollten die Lebensfähigkeit der Zellen nicht nachteilig beeinflussen. In dem nachfolgenden Bei spiel werden diese und/oder andere Faktoren beschrieben.As mentioned above, a preferred fluorophore is Eu (TTA) ₃ , which has an excitation maximum of 360 nm and an emission maximum of 614 nm. Even before that, Eu (TTA) _{3 is combined} with the polymer poly (methyl methacrylate), (PMMA), and baked into a solid substrate to form a metabolic probe. However, other suitable combinations are covered by the present invention. Examples of such possible combinations are shown in Table 1. These and other combinations can be tested to determine their suitability to serve as components of the metabolic probe. In particular, the key criteria for choosing a fluorophore compound are that the fluorophore: (i) exhibits a maximum change in fluorescence with a change in temperature at 37 ° C; (ii) has the ability to be embedded in a polymer and away from the aqueous solution; and (iii) is non-toxic to living cells. Thus, such testing can determine the sensitivity of the fluorophore to temperature changes at 37 ° C, the stability of the fluorophore in an aqueous environment, the stability of the fluorophore during embedding in the polymer, and the resistance of the fluorophore to light fading (Such consistency is required for long-term observation and subsequent calibrations). The greater the sensitivity of the fluorophore to a temperature change at 37 ° C, the greater its stability under the conditions mentioned above, including a resistance to fading by light, the more the fluorophore is suitable as a component of the metabolic probe. Similarly, the polymer is chosen so that it has an optimizing effect on the temperature sensitive fluorophore. Finally, the fluorophore / polymer combination must be compatible with the living cells, ie they should not adversely affect the viability of the cells. In the following example, these and / or other factors are described.

Die vorliegende Erfindung kann besser durch Bezug auf das folgende nicht beschränkende Beispiel verstanden wer den, welches als beispielhaft für die Erfindung angegeben wird. Das folgende Beispiel wird dargestellt, um die bevor zugten Ausführungsformen der Erfindung vollständiger darzu stellen. Es sollte jedoch nicht so ausgelegt werden, daß es den breiten Umfang der Erfindung beschränkt.The present invention can be better understood by reference to FIG the following non-limiting example understood who the one that is given as an example of the invention becomes. The following example is presented to the before preferred embodiments of the invention more fully put. However, it should not be construed to be limits the broad scope of the invention.

EXAMPLE Determination of suitable fluorophores and polymers for a metabolic probe introduction

Mehrere Kriterien wurden aufgestellt, um einen geeigne ten Fluorophor und ein Polymer für die Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung auszuwählen. Beispielsweise ist die Empfindlichkeit des Fluorophors für Temperaturänderun gen bei 37°C ein wichtiges Kriterium, wobei eine größere Empfindlichkeit wünschenswert ist. In ähnlicher Weise wird der Fluorophor im Hinblick auf seine Stabilität in einer wäßrigen Umgebung ausgewählt, da eine lebensfähige Zelle in einer wäßrigen Umgebung am stabilsten ist. Zusätzlich wird ein Fluorophor im Hinblick auf seine Stabilität während seiner Einbettung in ein Polymer ausgewählt. Beispielsweise müssen die Zellproben durch eine Dicke des Polymers von ungefähr 50 nm von dem Fluorophor getrennt werden, um sicherzustellen, daß Änderungen der Fluoreszenz eine Folge der Temperaturemission von der Zelle sind, und nicht von einer Sezernierung eines Proteins, Metaboliten oder Ions, welche die Eigenschaften des Fluorophors modifizieren könn ten.Several criteria were set up in order to find a suitable one fluorophore and a polymer for the metabolic probes of the present invention. For example the sensitivity of the fluorophore to temperature changes at 37 ° C an important criterion, with a larger one Sensitivity is desirable. In a similar way the fluorophore in terms of its stability in one aqueous environment selected because a viable cell in is most stable in an aqueous environment. In addition, a fluorophore in terms of its stability during selected to be embedded in a polymer. For example the cell samples must be made by a polymer thickness of about 50 nm from the fluorophore to ensure that changes in fluorescence result of the temperature emission from the cell, and not from a secretion of a protein, metabolite or ion, which can modify the properties of the fluorophore ten.

Weiterhin wird ein Polymer ausgewählt, welches die Eigenschaften unseres temperaturempfindlichen Fluorophors optimiert. Ein solches Polymer sollte im Hinblick auf die relative Beständigkeit gegenüber einem Ausbleichen durch Licht (eine Eigenschaft, welche für Langzeitbeobachtungen und nachfolgende Kalibrierungen nötig ist) ausgewählt wer den. Weiterhin sollten ein Polymer und der Fluorophor mit lebenden Zellen kompatibel sein, um sicherzustellen, daß das Polymer und der Fluorophor die Lebensfähigkeit der Zelle nicht nachteilig beeinflussen.Furthermore, a polymer is selected, which the Properties of our temperature sensitive fluorophore optimized. Such a polymer should be considered in terms of relative resistance to fading Light (a property that is suitable for long-term observation and subsequent calibrations are required) who is selected the. Furthermore, a polymer and the fluorophore should be included living cells to be compatible to ensure that the polymer and the fluorophore the viability of the Do not adversely affect the cell.

Materials and methods Coating coverslips with temperature sensitive Chen fluorophores materials

Farbstoff: Europiumthenoyltrifluoracetonat, abgekürzt als Eu(TTA)₃ Colorant: Europium thenoyl trifluoroacetonate, abbreviated as Eu (TTA) ₃

oder EuTTA (Advanced Materials, New Hill, NC)
Polymer: Poly(methylmethacrylat), abgekürzt als PMMA (Aldrich, Milwaukee, WI 18,226-5)
Lösungsmittel: 96% Nitroethan (Aldrich, Milwaukee, WI 13.020-6) or EuTTA (Advanced Materials, New Hill, NC)
Polymer: poly (methyl methacrylate), abbreviated as PMMA (Aldrich, Milwaukee, WI 18.226-5)
Solvent: 96% nitroethane (Aldrich, Milwaukee, WI 13.020-6)

Mixing dye / polymer

Die Standardkonzentration des Polymers (PMMA) in dem Lösungsmittel (Nitroethan) betrug 0,1 mM (100 mg PMMA in 5 ml Nitroethan). Verschiedene Konzentrationen von Eu(TTA)₃ wurden verwendet. Das beste Fluoreszenzsignal war das mit 200 mM Eu(TTA)₃ in Lösungsmittel (100 mg EuTTA in 5 ml Nitroethan). Die Farbstoff/Polymermischung wurde mit einem Magnetrührer gerührt, bis sie vollständig gelöst war, und dann durch einen Filter mit 0,45 µm Porengröße filtriert (Gelman Sciences, Acrodisc 13CR PTFE), wonach eine völlig klare Lösung zurückblieb. Um Probleme mit einer Hydratisie rung zu minimieren, wurden der Farbstoff und das Polymer unter N₂ gelagert und das Lösungsmittel wurde mit Moleku larsieben gelagert.The standard concentration of the polymer (PMMA) in the solvent (nitroethane) was 0.1 mM (100 mg PMMA in 5 ml nitroethane). Different concentrations of Eu (TTA) ₃ were used. The best fluorescence signal was that with 200 mM Eu (TTA) ₃ in solvent (100 mg EuTTA in 5 ml nitroethane). The dye / polymer mixture was stirred with a magnetic stirrer until completely dissolved and then filtered through a 0.45 µm pore size filter (Gelman Sciences, Acrodisc 13CR PTFE), leaving a completely clear solution. To minimize hydration problems, the dye and polymer were stored under N ₂ and the solvent was stored with molecular sieves.

Die Dicke der Schicht kann eingestellt werden, indem die Polymerkonzentration (je höher, desto dicker) und die Rotationsgeschwindigkeit (je langsamer, desto dicker) vari iert werden.The thickness of the layer can be adjusted by the polymer concentration (the higher, the thicker) and the Rotation speed (the slower the thicker) vari be.

Preparation of the coverslips

Alle Deckgläschen wurden in Salpetersäure mit Säure gewaschen. Die Deckgläschen wurden für 5 Minuten in 70%ige Salpetersäure eingetaucht, mit dH₂O gespült, mit 95% Etha nol gespült und dann in einem Vakuumofen bei 100°C getrock net. Die Säurewäsche war nötig, damit das Polymer-Fluoro phor fest und stabil auf dem Glas verankert blieb.All coverslips were washed in nitric acid with acid. The coverslips were immersed in 70% nitric acid for 5 minutes, rinsed with dH ₂ O, rinsed with 95% ethanol, and then dried in a vacuum oven at 100 ° C. The acid wash was necessary so that the polymer fluorophore remained firmly and stably anchored on the glass.

Rotationsbeschichtungsverfahren. Das Deckgläschen wurde auf einem Rotor befestigt und mit der Polymer/Fluorophor/Lösungs mittelprobe bedeckt. Das Deckgläschen wurde mit einer typischen Geschwindigkeit von 600 Upm für 1 Minute rotiert. Das Deckgläschen wurde dann für eine Stunde bei 100°C in einem Vakuumofen gebrannt, um das Polymer einzu brennen. Spin coating process. The cover slip was made attached to a rotor and with the polymer / fluorophore / solution medium sample covered. The cover slip was made with a typical speed of 600 rpm for 1 minute rotates. The cover slip was then left for an hour Burned 100 ° C in a vacuum oven to absorb the polymer burn.

Charakterisierung der Beschichtungen. Die Beschichtun gen auf den Deckgläschen wurden durch mehrere Verfahren charakterisiert. Die Homogenität wurde unter einem Phasen kontrastmikroskop getestet, wobei ein 20×- oder ein 40×- Objektiv verwendet wurde. Die Homogenität wurde ebenfalls unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Diaphot) getestet, wobei ein 40×-Objektiv verwendet wurde, oder auf einem kon fokalen Lasermikroskop (Ultima, Meridian Instruments, Oke mos, MI), wobei ein 60×-Objektiv verwendet wurde. Die Absorption der beschichteten Deckgläschen wurde bei 365 nm mit einem Diodenarrayspektrophotometer (Milton Roy Spectro nic, Array 3000) getestet. Die Temperaturempfindlichkeit der verschiedenen Mischungen von Fluorophoren, Polymeren, Lösungsmitteln wurde anfangs in einer Küvette mit einer kontrollierten Temperatur in einem Fluoreszenzspektrofluo rimeter (Aminco Bowman 2, SLM Aminco) getestet. Die Deck gläschen wurden geschnitten und bei einem Winkel von 45 Grad in die mit Wasser gefüllten Küvetten eingepaßt. Diese Konfiguration wurde verwendet zur Bestimmung von:
Characterization of the coatings. The coatings on the coverslips were characterized by several methods. The homogeneity was tested under a phase contrast microscope using a 20 × or a 40 × objective. Homogeneity was also tested under a fluorescence microscope (Nikon Diaphot) using a 40 × objective or on a confocal laser microscope (Ultima, Meridian Instruments, Oke mos, MI) using a 60 × objective. The absorption of the coated coverslips was tested at 365 nm with a diode array spectrophotometer (Milton Roy Spectronic, Array 3000). The temperature sensitivity of the various mixtures of fluorophores, polymers, solvents was initially tested in a cuvette with a controlled temperature in a fluorescence spectrofluorimeter (Aminco Bowman 2, SLM Aminco). The coverslips were cut and fitted into the water-filled cuvettes at an angle of 45 degrees. This configuration was used to determine:

- the optimal excitation and emission spectrum a recording of excitation and emission samples gene;
- the speed of light fading and the stability of the layer in water (tested by recording the average fluorescence signal nals over time); and
- the temperature coefficient (change in intensity per degree), which is recorded by recording the changes the fluorescence intensity during temperature changes of normally 1 ° C.

Cell growth on the cover bottles

Zellen der humanen Brusttumorlinie MCF-7 wurden auf den Beschichtungen wachsen gelassen. Die Wachstumsgeschwindig keit auf den Beschichtungen war etwas langsamer als auf der Polystyroloberfläche der Kulturschalen, aber die Lebensfä higkeit war höher als 80%.Cells from the MCF-7 human breast tumor line were transferred to the Coatings grow. The growth rate The speed on the coatings was somewhat slower than on the Polystyrene surface of the culture dishes, but the life ability was higher than 80%.

Cell culture

Die MCF-7/ADR-Zellen sind eine Zellinie, die gegenüber Chemotherapeutika resistent ist und welche von einem huma nen Brustkarzinom abgeleitet ist. Sie werden in modifizier tem Eagle-Medium mit Phenolrot, Rinderinsulin 10 µg/ml und L-Glutamin und 10% FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% pCO₂ (Forma Scientific, OH) aufrechterhalten. Zusätzlich werden die MCF-7/ADR-Zellen kontinuierlich in 0,8 µM Adriamycin gehalten.The MCF-7 / ADR cells are a cell line which is resistant to chemotherapeutic agents and which is derived from a human breast carcinoma. They are maintained in modified Eagle medium with phenol red, bovine insulin 10 µg / ml and L-glutamine and 10% FBS in a humidified incubator at 37 ° C and 5% pCO ₂ (Forma Scientific, OH). In addition, the MCF-7 / ADR cells are continuously kept in 0.8 µM adriamycin.

Die Zellen werden in einem Olympus-Fluoreszenzmikroskop beobachtet, welches mit einer Xenon-Lampe, einem Uniblitz- Verschluß (Vincent and Associates, Rochester NY) und Fil terrädern auf der Anregungs- und Emissionsseite ausgestat tet ist. Das Verschließen der Lichtquelle wird mit einem Computer gesteuert. Ein Filterhalter wurde hergestellt, um die 450 nm- und 490 nm-Anregungsfilter zu halten. Die Daten werden auf einer gekühlten ladungsgekoppelten Vorrichtung Hamamatsu 4972 (Hamamatsu Photonics) gesammelt und mit einer Software digitalisiert, welche von National Instru ments Lab View geschrieben wurde. Die Zellen werden in einer Kammer mit kontrollierter Temperatur bei einer kon stanten Perfusion von Medium sichtbar gemacht.The cells are viewed in an Olympus fluorescence microscope observed which with a xenon lamp, a Uniblitz Closure (Vincent and Associates, Rochester NY) and Fil equipped on the excitation and emission side is. The light source is closed with a Computer controlled. A filter holder was made to to hold the 450 nm and 490 nm excitation filters. The data are on a cooled charge coupled device Hamamatsu 4972 (Hamamatsu Photonics) collected and with software digitized by National Instru Lab View was written. The cells are in a chamber with controlled temperature at a con constant perfusion of medium made visible.

Die Zellen werden mit einer λex von 355 nm und einer λem von 614 angeregt. Wenn das Verhältnis von aufeinander folgenden Bildern aufgenommen wurde, konnten die Zellen nicht nachgewiesen werden. Bei Einschluß von FCCP, einem Protonenionophor, welcher die Protonendurchlässigkeit der Mitochondrien erhöht und somit die Hydrolyse von ATP erhöht, gibt es jedoch eine erhöhte Fluoreszenzemission, die mit einem Anstieg der Temperatur konsistent ist. Der größte Anstieg der Temperatur beträgt ungefähr 100 mK und er wird sehr folgerichtig in dem Wachstumskegel der Zelle beobachtet (Fig. 2B und 2D).The cells are excited with a λex of 355 nm and a λem of 614. If the ratio of successive images was recorded, the cells could not be detected. However, with the inclusion of FCCP, a proton ionophore, which increases the proton permeability of the mitochondria and thus increases the hydrolysis of ATP, there is an increased fluorescence emission which is consistent with an increase in temperature. The greatest increase in temperature is approximately 100 mK and is very logically observed in the growth cone of the cell ( Figures 2B and 2D).

Fluorescence measurements

Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Fluoreszenz mikroskop durchgeführt, welches mit einer Hg/Xenon-Lampe ausgerüstet war, wobei ein Ultraviolett-Anregungsfilter und ein Emissionsfilter verwendet wurden. Eu(TTA)₃ wird bei 360 nm angeregt und emittiert bei 614 nm.The fluorescence measurements were carried out with a fluorescence microscope equipped with an Hg / xenon lamp, using an ultraviolet excitation filter and an emission filter. Eu (TTA) ₃ is excited at 360 nm and emitted at 614 nm.

Results

Wahl der fluoreszierenden Verbindung: Es war notwendig, das gesamte Wasser in dem Lösungsmittel und Polymer zu ent fernen, bevor die Deckgläschen beschichtet wurden. Unglück licherweise beeinträchtigt Wasser nachteilig die Stabilität der Fluorophor/Polymermischung, und viele der häufig ver wendeten Reagenzien, um das Lösungsmittel zu dehydratisie ren, beeinträchtigen ebenfalls nachteilig die Fluorophore. Ein Schlüssel war, einen Fluorophor zu verwenden, welcher ohne nachteilige Wirkungen mit Dehydratisierungsreagenzien behandelt werden konnte. Es stellte sich heraus, daß einer der möglichen Fluorophore (Eu-FOD) größere Änderungen in den Eigenschaften durchmachen würde, wenn wir ihn auf die Deckgläschen brannten. Eu(TTA)₃ wies dieses Problem nicht auf und wurde daher als ein guter Fluorophor ausgewählt.Choice of fluorescent compound: It was necessary to remove all of the water in the solvent and polymer before coating the coverslips. Unfortunately, water adversely affects the stability of the fluorophore / polymer blend, and many of the commonly used reagents to dehydrate the solvent also adversely affect the fluorophores. A key was to use a fluorophore that could be treated with dehydrating reagents without adverse effects. It turned out that if we burned it on the coverslips, one of the possible fluorophores (Eu-FOD) would undergo major changes in properties. Eu (TTA) ₃ did not have this problem and was therefore chosen as a good fluorophore.

Wahl des Polymers: Die Fluorophore, welche untersucht wurden, ändern ihre Fluoreszenz als Reaktion auf die Tempe ratur. Jedoch könnte ihre Fluoreszenz ebenso für bestimmte Proteine, Kohlenhydrate, pH oder ionische Änderungen emp findlich sein. So wird der Fluorophor in ein Polymer einge bettet, das verwendet wird, um die Deckgläschen zu beschichten. Polystyrol war unsere erste Wahl für ein Trä gerpolymer. Es ist stabil gegenüber vielen verschiedenen Behandlungen, es ist nicht toxisch, es kann als ein Substrat für wachsende Zellen verwendet werden. Unglückli cherweise waren die Reaktionseigenschaften von EuTTA auf die Temperatur in dem Polystyrol schwach. Es scheint, als ob die Benzolringe in dem Polystyrol nachteilig mit den Gruppen in dem EuTTA wechselwirkten, was zu einem Verlust an Aktivität führte. Andererseits ist PMMA ein nichtaroma tischer Fluorophor. Von diesem Polymer war bekannt, daß es für UV-Wellenlängen empfindlich ist, welche verwendet wer den, um EuTTA anzuregen. Tatsächlich wird UV-Licht oft ver wendet, um PMMA zu ätzen. Jedoch wurde nach einem Variieren der Konzentrationen von PMMA : EuTTAQ : Lösungs mittel : Dehydratisierungsmittel eine Mischung von EuTTA : PMMA bestimmt, welche auf Deckgläschen sehr stabil ist. Diese Mischung kann ohne nachteilige Wirkungen auf die mechani sche Stabilität in eine Wasserumgebung eingetaucht werden; ihr Fluoreszenzsignal ist für wenigstens eine Stunde wäh rend einer UV-Anregung stabil; Wasser beeinflußt das Fluo reszenzsignal nicht nachteilig; und ihre Fluoreszenz ändert sich um 2,5% bei jedem Grad Änderung in Grad Celsius. Wei terhin ist das Rauschen sehr niedrig (ungefähr 100 : 1), was die Auflösung von Änderungen um 0,01°C erlaubt. Eine gra phische Darstellung der Änderung bei der Fluoreszenzinten sität mit der Temperatur ist in Fig. 1 dargestellt. In Tabelle 1 wird die Eu(TTA)₃/PMMA-Mischung mit Proben von anderen Fluorophor/Polymerpaaren im Hinblick auf ihre maxi male logarithmische Steigung/°C verglichen. Choice of polymer: The fluorophores that have been examined change their fluorescence in response to temperature. However, their fluorescence could also be sensitive to certain proteins, carbohydrates, pH or ionic changes. The fluorophore is embedded in a polymer that is used to coat the cover slip. Polystyrene was our first choice for a carrier polymer. It is stable to many different treatments, it is non-toxic, it can be used as a substrate for growing cells. Unfortunately, the reaction properties of EuTTA to the temperature in the polystyrene were poor. It appears that the benzene rings in the polystyrene adversely interacted with the groups in the EuTTA, resulting in a loss of activity. On the other hand, PMMA is a non-aromatic fluorophore. This polymer was known to be sensitive to UV wavelengths which are used to excite EuTTA. In fact, UV light is often used to etch PMMA. However, after varying the concentrations of PMMA: EuTTAQ: solvent: dehydrating agent, a mixture of EuTTA: PMMA was determined which is very stable on coverslips. This mixture can be immersed in a water environment without adverse effects on the mechanical stability; their fluorescence signal is stable for at least one hour during UV excitation; Water does not adversely affect the fluorescence signal; and their fluorescence changes 2.5% with every degree change in degrees Celsius. Furthermore, the noise is very low (approximately 100: 1), which allows changes of around 0.01 ° C to be resolved. A graphical representation of the change in fluorescence intensity with temperature is shown in Fig. 1. In Table 1, the Eu (TTA) ₃ / PMMA mixture is compared with samples from other fluorophore / polymer pairs with regard to their maximum logarithmic slope / ° C.

Tabelle 1 Table 1

Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll nicht durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden. Tatsächlich werden den Fachleuten ver schiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu jenen, welche hierin beschrieben sind, aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren klar werden. Sol che Modifikationen sollen in den Umfang der angefügten Ansprüche fallen.The scope of the present invention is not intended to be limited to the specific embodiments described herein be restricted. In fact, the professionals are ver various modifications of the invention, in addition to those described herein from the foregoing Description and the accompanying figures will be clear. Sol che modifications are to be included in the scope of the Claims fall.

Man sollte weiterhin verstehen, daß alle Basengrößen oder Aminosäuregrößen und alle Molekulargewichts- oder Molekularmassenwerte, welche für Nukleinsäuren oder Poly peptide angegeben werden, ungefähre Werte sind und zur Beschreibung dienen.One should also understand that all base sizes or amino acid sizes and all molecular weight or Molecular mass values, which for nucleic acids or poly peptides are given, are approximate values and Serve description.

Verschiedene Veröffentlichungen werden hierin zitiert, auf deren Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.Various publications are cited herein to the disclosure of which reference is hereby made in full becomes.

Claims

1. A method of determining the temperature of a cell comprising:

(a) Placing a cell on a metabolic probe comprising a solid substrate containing a temperature sensitive fluorophore embedded in a polymer, which, when the fluorophore is excited with the appropriate ultraviolet, visible or infrared light, produces a detectable fluorescent signal emitted and wherein, when a living cell is placed on the metabolic probe, the fluorescence signal is caused by the metabolic rate of the cell;
(b) exciting the fluorophore with the appropriate ultraviolet, visible, or infrared light; and
(c) detecting the fluorescence signal, the intensity of the detected fluorescence signal being an indication of the temperature of the cell.

2. The method of claim 1, wherein the polymer is a is non-aromatic synthetic polymer.

3. The method of claim 1, wherein the fluorophore, while embedded in a polymer to an aqueous solution for at least one hour Excitation with ultraviolet light at 37 degrees Celsius, pH 7.5 can emit a stable fluorescence signal.

4. The method of claim 2, wherein the polymer Is poly (methyl methacrylate).

5. The method of claim 4, wherein the fluorophore is Eu (TTA) ₃ .

6. A method of determining metabolic activity a cell which detects the temperature of the Cell by the method of claim 1 and a cor relate the temperature with their metabolic activity includes.

7. The method of claim 6, wherein the cell is a Is tumor cell.

8. A method for determining the presence of an ano paint metabolism in a cell that is healthy Tissue is surrounded, which is a temp rature of the cell by the method according to claim 1 comprises, with a difference in the temperature of the Cell in relation to a control cell an indication is that the cell has an abnormal metabolism going through.

9. The method of claim 8, wherein the living tissue is obtained from a tumor biopsy.

10. The method of claim 8, wherein the abnormal meta bolism of the cell a sign of an ultraviolet Damage, cachexia or apoptosis.