CH620520A5

CH620520A5 - Reagents for detecting antinuclear factors

Info

Publication number: CH620520A5
Application number: CH1274675A
Authority: CH
Inventors: Hans-Harald Dr Sedlacek; Hans Dr Schweinsberg; Fritz Dr Behrens
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-10-02
Filing date: 1975-10-01
Publication date: 1980-11-28
Also published as: IT1042984B; ATA749975A; DE2447025A1; DK442675A; AT355226B; JPS5161629A; NL7511361A; FR2287043A1; BE834134A; FR2287043B1; IE41739L; LU73486A1; IE41739B1; GB1520646A; FI752742A; SE7510969L

Description

Die Erfindung betrifft Reagenzien zum Nachweis von antinukleären Faktoren, ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzien sowie deren Verwendung in der klinischen Diagnostik. The invention relates to reagents for the detection of antinuclear factors, a method for producing these reagents and their use in clinical diagnostics.

Antikörper gegen die als Nuklearfaktoren bezeichneten Kernsubstanzen werden bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen des Bindegewebes, insbesondere bei Kollagen-Krankheiten wie Polyarthritis rheumatica, Sklerodermie, Lupus erythematodes visceralis (LE), Dermatomyositis und Periarteriitis nodosa, gefunden. Antibodies against the core substances called nuclear factors are found in various autoimmune diseases of the connective tissue, in particular in collagen diseases such as rheumatoid arthritis, scleroderma, lupus erythematosus visceralis (LE), dermatomyositis and periarteritis nodosa.

Diese Antikörper können gegen verschiedene Antigene wie Desoxyribonukleinsäure (DNS), Nukleoproteine, DNS-Histone (oft als Nukleoproteine angesehen), die Ribonukleinsäure (RNS) in den Nukleolen oder gegen Antigene gerichtet sein, die mit physiologischer Kochsalzlösung aus den Zellkernen extrahierbar sind (Sm-Antigen). These antibodies can be directed against various antigens such as deoxyribonucleic acid (DNA), nucleoproteins, DNA histones (often viewed as nucleoproteins), the ribonucleic acid (RNA) in the nucleoli or against antigens that can be extracted from the cell nucleus with physiological saline solution (Sm- Antigen).

Zu ihrem Nachweis werden unterschiedliche Methoden wie Anti-Globulin-Konsumptionstest, Komplementbindungsreaktion, Präzipitationsreaktion, passive Hämagglutinationsreak-tion, Latex-Teste, immunhistologische und immunzytologische Verfahren angewandt. Various methods such as anti-globulin consumption test, complement fixation reaction, precipitation reaction, passive hemagglutination reaction, latex tests, immunohistological and immunocytological methods are used to detect them.

Von den vorstehend aufgeführten Nachweismethoden von Antikörpern gegen Kernsubstanzen haben sich die immunhisto-logischen und die immunzytologischen Tests, insbesondere jene, die zur Sichtbarmachung der positiven Reaktion Fluoreszenzfarbstoffe verwenden, aus folgenden Gründen besonders bewährt: Of the above-mentioned detection methods for antibodies against core substances, the immunohistological and immunocytological tests, especially those which use fluorescent dyes to visualize the positive reaction, have proven particularly useful for the following reasons:

a) Sie zeichnen sich durch hohe Sensibilität und Spezifität aus. a) They are characterized by high sensitivity and specificity.

b) Sie erfassen Antikörper gegen alle o.a. Kernantigene und erlauben daher eine Differenzierung nach dem Muster und dem Grad der Fluoreszenz. b) You detect antibodies against all of the above Core antigens and therefore allow differentiation according to the pattern and the degree of fluorescence.

c) Die Tests können realtiv leicht durchgeführt werden. c) The tests can be carried out realistically easily.

In den bekannten Verfahren werden als Antigene verwendet: In the known methods, the following are used as antigens:

1. Frische Kryostatschnitte von Versuchstierorganen oder menschlichem Gewebe. 1. Fresh cryostat sections from experimental animal organs or human tissue.

2. Frische menschliche Zellen, z.B. Buccalzellen, Leukozyten und dergleichen. 2. Fresh human cells, e.g. Buccal cells, leukocytes and the like.

3. Gewebekulturzellen menschlichen oder tierischen Ursprungs. 3. Tissue culture cells of human or animal origin.

4. Stabilisierte Kalb-Thymozyten. 4. Stabilized calf thymocytes.

Um eine Extraktion wasserlöslicher Nukleoproteine (Sm-Protein) zu vermeiden, werden die Organschnitte oder Zellen in der Regel auf dem Objektträger nach geeigneten Methoden, z.B. mit Aceton, fixiert. Bei der Durchführung der Tests geht man im allgemeinen so vor, dass man das auf Antikörper zu untersuchende Patientenserum in unterschiedlichen Verdünnungen auf die Präparate aufträgt, inkubiert und abwäscht, danach mit einem mit fluoreszierendem Farbstoff, beispielsweise Fluoreszein-Isothiocyanat-(FITC)- oder Peroxydase-markiertem Antiserum gegen menschliche Immunglobuline überschichtet, erneut inkubiert und auswäscht. Die spezifisch gebundenen Antikörper werden durch Untersuchungen der Präparate auf Fluoreszenz oder histochemische Farbreaktion bei mikroskopischer Beobachtung erkannt. In order to avoid extraction of water-soluble nucleoproteins (Sm protein), the organ sections or cells are usually placed on the slide using suitable methods, e.g. fixed with acetone. When carrying out the tests, the procedure is generally such that the patient's serum to be tested for antibodies is applied to the preparations in different dilutions, incubated and washed, then with a fluorescent dye, for example fluorescein isothiocyanate (FITC) or peroxidase -labelled antiserum against human immunoglobulins, incubated again and washed out. The specifically bound antibodies are recognized by examining the preparations for fluorescence or histochemical color reaction under microscopic observation.

Ein wesentlicher Nachteil bei der Verwendung der frisch zuzubereitenden Antigene ist ihre geringe Haltbarkeit bei Raum- oder kühlschrank-Temperatur. Der Untersucher ist damit gezwungen, sich stets frisches Material zu beschaffen oder eine Lagerung bei Temperaturen zwischen - 20 bis-30° C oder tiefer vorzunehmen. Die Nachteile wirken sich insbesondere bei der kommerziellen Herstellung entsprechender Reagenzien aus, da der Versand bei Gefriertemperaturen erfolgen muss, um die Antigenität nicht zu beeinträchtigen. A major disadvantage when using the freshly prepared antigens is their short shelf life at room or refrigerator temperature. The examiner is thus forced to always obtain fresh material or to store it at temperatures between - 20 to 30 ° C or lower. The disadvantages have an impact in particular on the commercial production of corresponding reagents, since they must be shipped at freezing temperatures in order not to impair the antigenicity.

Die Verwendung von Gewebekulturzellen hat gegenüber anderem Antigenmaterial gewisse Vorteile, da die Einheitlichkeit des Antigenmaterials gut zu gewährleisten ist. Die Gewebekulturzellen sind in jeder gewünschten Menge herstellbar. Die Züchtung kann auf Objektträgern direkt vorgenommen werden. Nachteilig ist auch hier, dass diese Zellen bei Temperaturen unter 0° C gelagert werden müssen. In bestimmten Fällen wird zusätzlich die Aufbewahrung in Glyzerin empfohlen. Das Glyzerin ist vor der Verwendung der Objektträger als Reagenzien abzuwaschen. Dabei hat sich gezeigt, dass das Sm-Antigen, welches zum Nachweis der sogenannten gesprenkelten Fluoreszenz erforderlich ist, verloren geht. The use of tissue culture cells has certain advantages over other antigenic material, since the uniformity of the antigenic material can be easily guaranteed. The tissue culture cells can be produced in any desired amount. Breeding can be done directly on slides. It is also disadvantageous here that these cells must be stored at temperatures below 0 ° C. In certain cases, storage in glycerine is also recommended. Wash off the glycerin before using the slides as reagents. It has been shown that the Sm antigen, which is required to detect the so-called speckled fluorescence, is lost.

Es wurde nun gefunden, dass die Haltbarkeit des Antigenmaterials in den Gewebekulturzellen entscheidend verlängert werden kann, wenn das Gewebekulturpräparat zusammen mit einem Trockenmittel in einem luftdichten Behälter verschlossen aufbewahrt wird. It has now been found that the shelf life of the antigen material in the tissue culture cells can be significantly extended if the tissue culture preparation is kept sealed in an airtight container together with a desiccant.

Gegenstand der Erfindung sind demnach Reagenzien der in Patentanspruch 1 definierten Art sowie weiterhin ein Verfahren wie in Patentanspruch 5 definiert. The invention accordingly relates to reagents of the type defined in claim 1 and also to a method as defined in claim 5.

Die Fixierung erfolgt dabei zweckmässigerweise mit an sich bekannten, dafür verwendeten flüchtigen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, in an sich bekannter Weise. Die anschliessende Trocknung wird zweckmässigerweise bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur bis etwa 50° C an der Luft oder im Vakuum ausgeführt. The fixation is expediently carried out in a manner known per se using volatile organic solvents, such as acetone, which are known per se. The subsequent drying is expediently carried out at room temperature or at a slightly elevated temperature up to about 50 ° C. in air or in vacuo.

Als Trockenmittel kommen allgemein die in der chemischen Technik zur Wasserdampfbindung verwendeten Stoffe in Frage, insbesondere solche, deren Wasserpartialdruck über dem frischen Trockenmittel bei 25° C weniger als 2 X10-1 Torr beträgt, beispielsweise CaCl2, CaO, A1203, Anhydrit oder P2Os. Ein direkter Kontakt der Präparate mit dem Trockenmittel ist dabei zu vermeiden. The substances used in chemical engineering for water vapor binding are generally suitable as desiccants, in particular those whose water partial pressure above the fresh desiccant at 25 ° C. is less than 2 × 10-1 Torr, for example CaCl2, CaO, A1203, anhydrite or P2Os. Avoid direct contact of the preparations with the desiccant.

Als Zellen können alle Zellarten verwendet werden, die dem Fachmann als Reagenzien zum Nachweis der Antinuklear-faktoren geeignet erscheinen und die bislang dafür in frischer Form zubereitet und auf Objektträger fixiert wurden. Besonders geeignet sind für die beispielhaft herausgegriffene Diagnose der Lupus erythematodes-Erkrankung Nierenzellen von All cell types can be used as cells which appear to the person skilled in the art to be suitable as reagents for the detection of the antinuclear factors and which have so far been prepared for this in fresh form and fixed on microscope slides. Kidney cells from are particularly suitable for the exemplary diagnosis of lupus erythematosus disease

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lü lü

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25 25th

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jungen Hamstern, sogenannte BHK-Zellen, Kaninchennierenzellen, menschliche Amnionzellen, HeLa-Zellen oder andere permanente Zell-Linien bzw. in Kultur gehaltene Zellstämme. Bevorzugt werden BHK-21 -Zellen verwendet, die im einzelnen von N. Stoker und I. Macpherson beschrieben wurden (Nature 203, (1964), 1355 bis 1357). young hamsters, so-called BHK cells, rabbit kidney cells, human amniotic cells, HeLa cells or other permanent cell lines or cell strains kept in culture. BHK-21 cells, which have been described in detail by N. Stoker and I. Macpherson (Nature 203, (1964), 1355 to 1357), are preferably used.

Die erfindungsgemässen Reagenzien sind bei Kühlschranktemperaturen lagerfähig; bei 4° C wird innerhalb von etwa 12 Monaten keine Wertminderung der Reagenzien beobachtet, wohingegen nicht erfindungsgemäss haltbar gemachte Gewebekulturzellen schon nach wenigen Tagen bei gleicher Lagertemperatur keine oder nur eine schwache Fluoreszenz mit antikör-perhaltigen Seren erkennen lassen. The reagents according to the invention can be stored at refrigerator temperatures; At 4 ° C., no decrease in the value of the reagents is observed within about 12 months, whereas tissue culture cells that have not been preserved according to the invention show no or only a weak fluorescence with sera containing antibodies after only a few days at the same storage temperature.

Die Erfindung soll am nachstehend aufgeführten Beispiel näher erläutert werden. The invention is illustrated by the example below.

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Beispiel example

BHK-Zellen werden nach I. Macpherson u. M. Stoker, Virology 16, (1962), 147 bis 151, auf Objektträgern mit markierten Reaktionsfeldern vermehrt. Nach 24 Stunden werden die zellbeladenen Objektträger aus dem Nährmedium entfernt und mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült, danach 10 Sekunden in physiologische Kochsalzlösung eingestellt und mit 5 50%igem (verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung) Aceton und anschliessend mit unverdünntem Aceton abgespült. Die Objektträger werden 2mal je 10 Sekunden in frisches Aceton gestellt und dann 10 Minuten in frischem Aceton fixiert. Nach kurzer Trocknung an der Luft werden die Objektträger einzeln io in Seidenpapier verpackt und in einen durch Verschrauben abzuschliessenden Behälter der Abmessungen 18 X 8 X10 cm eingebracht. Der Boden ist in einer Höhe von 2,5 cm mit Phosphor-Pentoxid bedeckt und das Phosphor-Pentoxid seinerseits zur Vermeidung eines Kontaktes mit den Objektträgern 15 mit Zellullosemull abgedeckt. BHK cells are according to I. Macpherson et al. M. Stoker, Virology 16, (1962), 147 to 151, propagated on slides with marked reaction fields. After 24 hours, the cell-loaded slides are removed from the nutrient medium and rinsed with physiological saline, then placed in physiological saline for 10 seconds and rinsed with 5 50% (diluted with physiological saline) acetone and then with undiluted acetone. The slides are placed twice in fresh acetone for 10 seconds each and then fixed in fresh acetone for 10 minutes. After briefly drying in the air, the slides are individually packed in tissue paper and placed in a 18 X 8 X 10 cm container to be closed by screwing. The bottom is covered at a height of 2.5 cm with phosphorus pentoxide and the phosphorus pentoxide in turn is covered with cellulose gauze to avoid contact with the slides 15.

C C.

Claims

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1. Reagents for the detection of antinuclear factors containing tissue cells fixed on slides, enclosed in a container with a low-water vapor atmosphere.

2. Reagents according to claim 1, characterized in that the tissue cells are tissue culture cells.

2nd

PATENT CLAIMS

3. Reagents according to claim 2, characterized in that the tissue culture cell is the BHK-21 cell.

4. Reagents according to claim 1, characterized in that there is a desiccant in the container, the water partial pressure at 25 ° C is less than 2 X10 "1 Torr.

5. A method for producing a reagent according to claim 1, characterized in that a tissue culture preparation is gently fixed on slides, dried and enclosed together with a desiccant in an airtight container.

6. The method according to claim 5, characterized in that the BHK-21 cell is used as the tissue culture preparation.

7. The method according to claim 5, characterized in that one uses a desiccant with a water partial pressure at 25 ° C of less than 2 X10 "1 Torr.

8. Use of reagents according to claim 1 in clinical diagnostics.

9. Use according to claim 8, characterized in that a reagent according to claim 3 is used for the detection of lupus erythematosus visceralis.