DE2334930A1 - Verfahren zur synthese von peptiden nach der n-carboxyanhydrid-methode am wasserloeslichen traeger arginyl-polyaethylenimin - Google Patents

Verfahren zur synthese von peptiden nach der n-carboxyanhydrid-methode am wasserloeslichen traeger arginyl-polyaethylenimin

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Description

Peter Ffaender, ? Stuttgart-Steckfeld 70, gteinwaldstr. 64-
Hartmut Blecher, 7 Stuttgart-Degerloeh, Kauzenhecke 15
Verfahren zur Synthese von Peptiden nach der N-Garboxyanhydrid-Methode am wasserlöslichen Träger Arginyl-Polyäthylenimin
(Verzeichnis der Literaturstellen s. S.9 und 10)
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur schrittweisen Anknüpfung einzelner, bestimmter Aminosäuren an den wasserlöslichen Träger Arginyl-Polyäthylenimin. Nach Erreichen der gewünschten Sequenz am Träger wird die gebildete Peptidkette enzymatisch abgespalten. Nach Abspaltung der Peptidkette wird diese noch enzymatisch von carboxyl— endständigem Arginin befreit. Alle Reaktionsschritte finden in wässriger Lösung statt:
a) Die Darstellung des Trägers Arginyl-Polyäthylenimin aus Polyäthylenimin und dem N-Carboxyanhydrid von Arginin
b) Die schrittweise Anknüpfung der einzalnen Aminosäuren an den Träger mit Hilfe der N-Carboxyanhydride der einzelnen Aminosäuren v
c) Die nach jedem Anknüpfungsschritt erfolgende Reinigung des Produktes durch Dialyse
d) Die enzymatisch^ Abspaltung der nach der gewünschten Anzahl von Angliederungsschritten fertigen Peptidkette durch Trypsin
509 807/1OSS
e) Die enzymatische Abspaltung des carboxylendständig an der Sequenz stehenden Arginine durch Carboxypeptidase B.
Zu a) ;
Zur Synthese von Ärginyl-Polyäthylenimin werden die bekannten Verfahren der Darstellung der N-Carboxyanhydride von Aminosäuren [1, 2 ] und deren Umsetzung mit Aminosäuren zu Peptiden in wässrig-alkalischer, mit Natrium- oder Kalium-Borat-gepufferter Lösung bei O bis 20 G , insbesondere bei 1 bis· 2 0C, bei pH-Werten von 7 bis 11, insbesondere bei pH 10,2 und bei hohen Rührgeschwindigkeiten, insbesondere bei 10 000 Umdrehungen/min, benützt f3, 4-, 5, 6J · Als Polyäthylenimin kann jedes käufliche, voll wasserlösliche Produkt mit Molekulargewichten über 10 000 verwendet werden, z.B. "Polymin P" ® der Fluka AG, Buchs, Schweiz.
Zu b) .
Die Anknüpfung der einzelnen Aminosäuren erfolgt miU Hilfe der freien oder an den Drittfunktionen geeignet geschützten N-Carboxyanhydride der Aminosäuren.
Die Reinigung durch Dialyse des Arginyl-Polyäthylenimins und der durch schrittweise Anknüpfung von Aminosäuren gewonnenen Zwischenprodukte erfolgt in einer handelsüblichen Apparatur, z.B. AMICON Hallow-Fiber Dialysis and/or Concentration Unit DC-2 der Firma AMICON, Oosterhout, Holland ("Ultrafiltration with Diaflo Membrane" Selbstverlag AMICON, 1972, Oosterhout, Holland).
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Die enzymatisch^ Abspaltung der fertigen Peptidkette vom Polymeren erfolgt mit Tosylph.enylalaninchlorketon-beh.andeltem Trypsin bei O bis 50 0C1 insbesondere bei 27 °0, in 10 min. bis 24 Stdn., insbesondere in 2 Stdn. und pH-Werten von 7 bis 9» insbesondere bei pH 8,0. Über Spaltungen von Peptiden mit Trypsin s.Lit. [ 7] ·
Die enzymatisch^ Abspaltung des carboxylendständigen Arginins erfolgt nach bekannten Verfahren mit Oarboxypeptidase B bei 27 0G in Λ Std. bei pH 7,5. Über die Spaltung von Peptiden mit Carboxypeptidase B s. Lit. Γ δ j .
Der Vorteil des N-Carboxyanhydrid—Arginin-Polyäthylenimin— Verfahrens liegt darin, daß
I. alle Schritte des Verfahrens in wässriger Lösung ausgeführt werden können,
II. die durch das sog. Merrifield-Verfahren [9» 10] auftretenden Diffusionsprobleme in organischen Lösungsmitteln im gequollenen Synthese-Harz und der mechanische Verschleiß dieses Harzes nicht eintreten können,
III. die hohe Reaktivität der N-Carboxyanhydride gegenüber den meisten Peptidsyntheseverfahren kurze Reaktionszeiten ergibt,
IV. die nach jedem Anknüpfungsschritt durch Dialyse erfolgende Zwischenreinigung das Auftreten von Fehlsequenzen und Ausbeuteverluste - insbesondere gegenüber Nichtträger-Verfahren - verringert,
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V. die absolut spezifisch und schonend arbeitende enzymatische Ablösung der Peptidkette durch keine andere rein chemische Methode , vgl. z.B. lit.M1J»erreicht wird und damit auch auf jeder Synthesestufe sine Ausbeute- und Sequenz-Kontrolle erlaubt,
VI. in den meisten Fällen durch geeignete Wahl des Molekulargewichts des Polymeren die abgespaltene Peptidkette wegen ihres kleineren Molekulargewichts durch Dialyse von zurückbleibendem Polymeren und Trypsin getrennt werden kann,
VII. es gegenüber der mit Polyäthylenglykol als Träger und daher mit alkaliempfindlichen Aminosäureester-Bindungen arbeitenden "liquid-phase" - Methode Γ12, 13] auch bei pH 11 noch ohne Peptidspaltung abläuft.
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Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Synthese des Peptids Alanyl-tryptophyl-Isoleucin durch Darstellung des Peptids Alanyl-tryptophyl-isoleucyl-Arginin am Träger, sowie dessen enzymatischer Abspaltung vom Träger durch Trypsin und der Abspaltung des carboxylendstandigen "Träger"-Arginins durch Carboxypeptidase B.
Synthese von Arginyl-Polyäthylenimin (s. Schema 1) ·
Xn einer mit Kühlmantel, Bodenhahn und vier vertikal angeordneten Glasrippen, mit Thermometer und pH-Meter ausgestatteten Glasapparatur von ca. 300 ml Inhalt werden 2,581 g (60 mMol) Polyäthylenimin (1) - 72 Stdn. in einer AMICON Ultrafilt-rationszelle Typ 202 an einer AMICON PM 10-Membran mit 2x41 bidest. Wasser von Polymeren mit MoI.-Gew. ^ 10 000 befreit - in I50 ml 0,4 molarem Boratpuffer gelöst. Nach Abkühlung auf O0C (Außenkühlung -3O0C) wird der pH 10,2 mit 4-normaler Natronlauge eingestellt. 2 Tropfen n-Octanol werden als Entschäumer zugesetzt und bei *1O 000 Umdrehungen/Min, des Ultra-Turrax mit TG 45 Mischkopf der Firma Janke und Kunkel, .Staufen, 10 ml einer Lösung in absolutem Dimethylformamid von N-Carboxyanhydrid des Argininhydrobromid (2) [ aus 5,474 g (14,06 mMol) alpha-Carbobenzoxy-L-Argininhydrobromid 1 durch einen Tropftrichter in 3 Min. eingetragen. Der pH wird 5 Min. mit 4-normaler Natronlauge auf 10,2 - 0,1 gehalten, dann mit 10 #iger Schwefelsäure auf pH 3,0 und nach 0,5 Min. auf pH 7,0 mit 4-normaler Natronlauge eingestellt· Zur Entfernung von
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Wasser, Octanol und Dimethylformamid wird lyophilisiert, dann wieder in 200 ml Wasser gelöst und gegen 3 χ 4- 1 Wasser an einer Hollow-Fiber-Patrone H1 DF 10 der Firma AMICON ,Oosterhout, Holland, im Dialyse-Modus 24 Stdn. ultrafiltriert. Lyophilisation des Ultrafiltrats und 12-stdg. Vakuumtrocknung bei 20 Torr/650C ergeben 7,002 g eines arginylierten Polyäthylenimin-sulfats (3). Gravimetrische Sulfatbestimmung ergibt einen Sulfatgehalt von 30,4 #, woraus sich ein Arginylierungsgrad von 50,4 Gewichts-# bzw. 16,05 Mol # berechnet. Da 9»63 mMol N-Carboxyanhydrid des Ärgininhydrobromid mit 60 mMol Polyäthylenimin zum Ärginyl-Polyäthylenimin reagieren, folgt daraus eine statistische Beladung jeder 6. - 7· Stickstoffunktion (jeder 2. Aminogruppe) des Polymers mit Arginin.
Synthesen am polymeren Träger (s. Schema 2) Synthese von Isoleucyl-arginyl-Polyäthylenimin (5)
0,395 g Arginyl-Polyäthylenimin O) (0,80 mMol Arginin, 30,4 % Sulfat) werden analog der Synthese von Arginyl-Polyäthylenimin (3) mit 0,157 g gepulvertem N-Carboxyanhydrid von Iso leucin (4) (1,0 mMolr Molverhältnis Isoleucin : Arginin = 1,25 : 1 ) umgesetzt und 24 Stdn. bis zur negativen Ninhydrinreaktion des Ultrafiltrats dialysiert. Anschließend wird die Lösung in einer AMICON Ultrafiltrationszelle vom Typ 202 an einer AMICON PM 10-Membran auf
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20 ml konzentriert, mit 0.4- molarem Borat-Puffer auf 150 ml verdünnt und direkt zu 7 umgesetzt.
Synthese von Tryptophyl-isoleucyl-arginyl-Polyäthyleii·-
5 wird mit 0.230 g (1.0 mMol) gepulvertem N-Carboxyanhydrid von Tryptophan (6) analog der Synthese von Arginyl-Polyäthylenimin (J) umgesetzt und zur Reaktion mit N-Carboxyanhydrid von Alanin (8) vorbereitet.
Synthese von Älanyl-tryptophyl-isoleucyl-arginyl-Poly-
äthylenimin (9)
7 wird mit 0.115 S (1.0 mMol) gepulvertem N-Carboxyanhydrid von Alanin wie in der Synthese von 5 umgesetzt. Nach der Ultrafiltration wurde lyophilisiert.
Enzymatische Abspaltung des Peptids vom Träger (s.Schema 2)
Alanyl-tryptophyl-isoleucyl-Arginin (10)
Tryptophyl-isoleucyl-ffrginin (11) f
5 x 5*25 mg 9 werden in 0,5 ml 0,02 M CaOl2 in 0,05 M Tris-Puffer pH 8,0 gelöst und mit 1,0 mg Tosylphenylaüaninchlorketonbehandeltem Trypsin , gelöst in 0*01 ml
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0.001 M HOl, 2 Stdn. bei 27 0O inkubiert. Die Ansätze werden lyophilisiert , in 0.2 ml Methanol gelöst und auf 5 Diinnschiclit-Ghromatographie-Kieselgel-Plartten (0,2 mm Schichtdicke) mit dem Fließmitterl Butanol/Eisessig/Wasser (4:1 : 2 v/v) aufgetrennt, Elution der Bande mit R^ 0,39 ergab je 0,27 mg 10, der Bande mit R^= 0r43 je 0,32 mg 11, wie TJV-spektroskopisch bei 280 nm bestimmt wurde.
GesamtausbeuW an 10 : 31,8 #
Gesamtausbeute) an 11 : 37·8 #
Enzymatisch^ Abspaltung des Brücken-Arginins vom Peptid
(Schema 2)
1 mg (1,84 χ 10 Mol) Alanyl-tryptophyl-isoleucyl-Arginin (10) und 1 mg D-Phenylalanin, als Inhibitor für die zu ca. 1 % in Carboxypeptidase B vorhandene Carboxypeptidase A, werden in 0.4 ml 0,025 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst und mit 12,7 mikro-Graram Carboxypeptidase B Γ 0,1 ml Lösung aus 0,02 ml Carboxypeptidase B"—■ Suspension der Firma Merck AG (0,13 mg Carboxypeptidase B) in 1,02 ml LiCl 10 % ] 1 Std. bei 27 0C inkubiert. Nach Lyophilisation wird durch Dünnschichtchromatographie mit dem Fließmittel Butanol/Eisessig/ Wasser (4:1 : 2) in Alanyl-tryptophyl-Isoleucin (12; Rf= 0,61) und Arginin (13) aufgetrennt.
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Literaturverzeichnis
M. Weinert, Κ· Kircher, D. Brandenburg und H. Zahn
Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 352, 719 (1971) [2 ] Pfaender, P., Kuhnle, E., Krahl, B·, Backmansson, A"., Gnauck, 6. und Blecher, H.
Hoppe Seyler's Z. Physiol· Chem., 354;, 267 0973) [ 3 ] H. G. Denkewalter, H. Schwam, R. Strachan, T. E. Beesley, D. F. Veber, E. F, Schoenewaldt, H. Bqrkemeyer,
W. J· Paleveda, T. JT. Jacob und R. Hirschraann
J. Amer. Chem. Soc, 88,-3163 (1966) [4J R. G. Denkewalter, D. F. Veber, F. W. Holly und
R. Hirschmann
J. itaer. Chem. Soc. 91» 502 (1969) [5 ] R· S. Dewey, E. F. Schoenewaldt, H. Joshua, W. J.
Paleveda, H. Schwam, H. Barkemeyer, Byron H. Ärison,
D. F. Veber, R. G. Strachan, J, Milkowski, R. G. Denkewalter, R. Hirschmann
J. Org. Chem. 36 (1), 49 (1971) [ 6 J "Syntheses of polypeptides and their derivates* with N-carboxy-amino-acid-anhydride or N-thio-carboxyamino-acid-anhydride in water" Merck and Co., Inc., HoIl. Patent Nr. 6.609.246 , (1967)
[ 7 ] G. Schöllmann und E. Shaw, Biochemistry j?, 252 (1963) [ 8 ] E. C. Wolff, E. W. Schirmer und J· E. Folk
J. Bicsi. Chem. 237, 3094 (1962)
509807/1086
[ 9 ] R. B. Merrifield
J. Amer. Chem. Soc. §5, 214-9 (1963) [10J Mäher, J,J·, Furey, M. E., Greenberg, L, J.
Tetrahedron Lett. 16, 1581, (1972) [11 ] E. Wunsch
Angewandte Chemie, 83, 20, 773 (197D [i2J Bayer, E, und Mutter, M»
Nature 237, 512 (1972) [13] Bayer, E.
Nachr. Chem. Technik 20, 495 (1972)
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Claims (1)

  1. - 11 Patentansprüche
    Verfahren zur Ausführung von Peptidsynthesen nach der N-C'arboxyanhydrid-Methode am wasserlöslichen Träger Ärginyl-Polyäthylenimin, dadurch. gekenn — ze'ichnet, daß ein wasserlöslicher Träger Arginyl-Polyäthylenimin durch Synthese aus Arginin-N-Carboxy/anhydrid-Hydrobromid und Polyäthylenimin hergestellt, durch Dialyse gereinigt und durch schrittweises Anknüpfen von Aminosäuren über deren drittfunktionsgeschützte oder drittfunktionsungeschützte N-Carboxyanhydride und jeweils erfolgende Zwischenreinigung eine Peptidkette gewünschter Sequenz an diesem Träger angeheftet wird,und diese Peptidkette anschließend enzymatisch mit Trypsin von Polyäthylenimin befreit wird.
    Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß aus Polyäthylenimin mit Arginin-N-Garboxyanhydrid-Hydrobromid eine wasserlösliche Verbindung Arginyl-Polyäthylenimin bei Temperaturen von 0-200G, insbesondere 1 bis 20C, bei hohen Rührgeschwindigkeiten, insbesondere von 10 000 Umdrehungen/Min. , bei pH-Werten von 7 bis 11, insbesondere bei pH 10,2 , mit einem wesentlich über 5000 liegenden Molekulargewicht hergestellt wird. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß die unter Anspruch 2· gekennzeichnete Verbindung Arginyl-Polyäthylenimin mittels Dialyse, z.B. durch Diaflo®- Ultrafilter gegen Wasser von niedermolekularen Verunreinigungen unterhalb Molekulargewicht 50Oo befreit wird.
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    4. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß die nach den Ansprüchen 2. und 3· gekennzeichnete Verbindung mit dem N-Carboxyanhydr.id einer Aminosäure umgesetzt wird, derart, daß die gewünschte Sequenz Aminosäure-Ärginin-Polyäthylenimin aufgebaut wird.
    5. Verfahren nach Anspruch 2., dadurch gekennzeichnet, daß die unter Anspruch 4. synthetisierte Verbindung mittels Dialyse gegen Wasser von niedermolekularen Verunreinigungen unterhalb Molekulargewicht 5000 befreit wird.
    6· Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß die Verfahren aus den Ansprüchen 4. und 5· bis zum Erreichen der gewünschten Sequenz Aminosäure — ... - Amino säure,.-Ar ginin-Polyäthyl en imin wiederholt werden.
    7. Verfahren nach Anspruch 1«, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Ansprüchen 5· oder 6. erhaltenen Verbindungen zur Abspaltung des Polyäthylenimins bei 0 bis 5O0C, insbesondere bei 27°C, und bei pH 7 bis 9, insbesondere bei pH 8,0 , 10 Min. bis 24 Stdn., insbesondere 2 Stdn«, mit Trypsin behandelt werden.
    8. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß das aus Anspruch 7· erhaltene Gemisch aus PoIyäthylenimin, Trypsin und dem Jeweiligen Peptid z.B. durch AMICON Diaflo ® - Ultrafilter oder durch Gelchromatographie an Sephadex ^ von Polyäthylenimin und Trypsin befreit wird.
    509807/1086
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0996627A4 (de) * 1997-01-08 2002-01-02 Proligo L L C Verfahren zur flüssig phasen synthese von oligonukleotiden und peptiden

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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