DE2326028A1 - Mikrobiologischer wachstumsdetektor - Google Patents

Description

Patentanwalt DIPL.-PHYS. DR. W. LANGHOFF Rechtsanwalt B. LANGHOFF*

a MÜNCHEN 81 · WISSMANNSTRASSE 14 . TELEFON 932774 ■ TELEGRAMMADRESSE: LANGHOFFPATENT MÜNCHEN

München., den 22. Mai 1973 Unser Zeichen: 55-1235

William G. Glenn und Mildred H, Glenn, IOO65 Windstream, Apt, 3, Columbia_s Maryland, USA .

Mikrobiologischer Wachstumsdetektor

Die Erfindung betrifft einen mikrobiologischen Wachstumsdetektbr zum Einbetten unter direkter Berühimng in eine mikrobiologische Wachs-tumssubstanz und zur visuellen Anzeige eines mikrobiologischen Wachstums in derselben.

Der mikrobiologische Wachstumsdetektor der Erfindung ist insbesondere am^endbar zum Einbetten in Lebensmittel oder andere Stoffe, in denen ein mikrobiologisches Wachstum au"ftreten kann.

Es ist bekannt, daß die Lebensvorgänge von Bakterien, Pilzen, Hefen und dergleichen₉mit anderen Worten also von Mikroorganismen, gasförmige Stoffwechsel-Nebenprodukte erzeugen, insbesondere Kohlendioxid. Diese gasförmigen Stoffwechsel-Nebenprodukte der mikrobiologischen Lebensvorgänge stammen aus vielen komplizierten biochemischen und Enzymreaktionen auf molekularem Niveau. Diese Wechselwirkung verursacht einen Abbau und eine Umwandlung verfügbarer Substanzen und Substrate, z.B. von Proteinen, Kohlehydraten und dergleichen, wie sie in Lebensmitteln, pharmazeutischen Stoffen und mikrobiologischen

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' Ständiger allgemeiner Vertreter nach § 46 PßtAnwO. zugelassen bei dor» Landgarlchtsn München I und II.

Wachstums- und Nährsubstanzen vorhanden sind,- aus denen die le.benden Substanzen Energie, Nahrung sowie das thermodynamik ehe und chemische Gleichgewicht für ihre Vermehrung und den wesentlichen Stoffwechsel beziehen. Der Mechanismus der Zersetzung und Synthese bei verschiedenen mikrobiologischen Lebensformen ist an sich bekannt ο Zum Beispiel ergeben transaminase Reaktionen bei Proteinen.Aminosäuren ₃ Alpha-Keto-Säuren und gasförmiges Ammoniak. Der fermentative Abbau von Substraten durch Bakterienwachstum'führt zu einer Spaltung von Brenztraubensäure in Oxalessigsäure unter Freisetzung von Kohlendioxid. Bei der Transmethylierung (übergang von Methylgruppen) wird Azethylen in Äthylen umgewandelt, etwa bei der Stickstoffbi'ndung durch Bodenbakterien. Bei der Entcarboxylierung greifen bestimmte Enzyme die Carboxylgruppen von Aminosäuren an und erzeugen ein Amin und gasförmiges Kohlendioxid= Sowohl aerobe als auch anaerobe Mikroorganismen haben viele dieser Stöffwechselabläufe gemeinsam. Außerdem können streng anaerobe Organismen., zum Beispiel Clostridia sp, unter geeigneten Bedingungen Kombinationen von Aminosäuren (Analin-Glycin) entaminieren und sowohl gasförmiges Ammoniak als auch Kohlendioxid freisetzen. Die Feststellung dieser gasförmigen Stoffwechsel-Nebenprodukte bei einem mikrobiologischen Wachstum ist bereits Gegenstand zahlreicher Forschungstätigkeit gewesen, und es kann gesagt werden, daß diese mikrobiologischen Formen vermehrungsfähig sind und daher leben.

Die Feststellung von gasförmigen Nebenprodukten bei mikrobiologischem Wachstum ist besonders brauchbar bei der Bestimmung, ob Lebensmittel noch für den menschlichen Genuß geeignet sind oder nicht. Derartige Bestimmungen sind auch insbesondere anwendbar, um festzustellen ob ein mikrobiologisches Wachstum in einer Nährsubstanz aufgetreten ist, wie es etwa für wissenschaftliche Forschungen und in klinischen Laboratorien verwendet wird. Bei Nahrungsmitteln handelt es sich im wesentlichen um die Feststellung der Anwesenheit giftiger Bakterien,

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zum Beispiel Salmonellen, Staphylokokken, Streptokokken, Escherichia coli usw.. Es sei erwähnt, daß die Stoffwechselvorgänge nicht krankheitserregender Bakterien, -zum Beispiel der verschiedenen in Milch vorkommenden Bakterien, ähnliche Stoffwechselnebenprodukte ergeben. Obwohl die Bestimmung eines mikrobiologischen Wachstums für wissenschaftliche Arbeiten von besonderer Bedeutung ist, bildet doch die Peststellung des Wachstums von. nichtpathogenen Formen in Lebensmittelnein Anzeichen dafür, ob diese durch Zeitablauf oder Temperaturbeeinflussung für den menschlichen Genuß schon unbrauchbar geworden sind. Es wird allgemein angenommen, daß die Anwesenheit einer großen Anzahl von Bakterien, selbst nichtpathogener-Art, ernsthafte Zweifel an der Brauchbarkeit und Gesundheitsverträglichkeit von Lebensmittelnaufkommen läßt. ,Die Peststellung eines merklichen mikrobiologischen Wachstums in Lebensmitteln kann daher als ein zuverlässiger Indikator angesehen werden dafür, daß das betreffende Nahrungsmittel wahrscheinlich verdorben ist und für den Verbrauch nicht mehr geeignet 1st.

Es sind bereits verschiedene Verfahren bekannt, um den Bakterienzustand von Lebensmittel visuell anzuzeigen. Gemäß einem dieser bekannten Verfahren (US-PS 2 485 566) wird ein kleines Stück Papier, das mit einer neutralen oder schwach alkalischen Lösung eines pH-Indikators imprägniert ist, beigegeben, wobei das Papier mit einer Nährlösung gesättigt oder beschichtet wird und mit nicht giftigen, kälteresistenten, säurebildenden Bakterien geimpft wird. Die Indikatorpackung wird sodann versiegelt und in den Nahrungsmittelbehälter gelegt. Falls das Ganze darnach eine genügend lange Zeit einer hohen Temperatur ausgesetzt wird, vermehren die Bakterien in der Indikatorpackung sich genügend, so daß sie soviel Säure bilden, daß die Farbe des Indikatorfarbstoffes umschlägt, wodurch angezeigt wird, daß ein ähnliches Bakterienwachstum auch in dem Nahrungsmittel selbst aufgetreten sein könnte. Dieser bekannte Wachstumsindikator ist offensichtlich beschränkt

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auf gekühlte oder tiefgekühlte Nahrungsmittel und ergibt keine Anzeige eines Bakterien- oder sonstigen mikrobiologischen Wachstums innerhalb des Nahrungsmittels selbst. Außerdem ist es erforderlich, daß die Bakterien in großer Nähe zu dem Nahrungsmittel liegen.

Bei einem anderen bekannten Indikator zum Anzeigen von verdorbenen Lebensmitteln in Behältern (US-PS 3 0β7 015) wird eine Indikatorscheibe aus porösem Papier verwendet, welches mit einer schwachen Lösung eines alkalischen Materials und einem geeigneten Indikatorfarbstoff getränkt ist.. Die Indikatorscheibe ist von dem Nahrungsmittel durch eine Diffusionsscheibe aus porösem Pergamentpapier getrennt. Es ist noch ein perforierter Rückschutz vorhanden, der zwischen der Pergamentpapierscheibe und dem Nahrungsmittel liegt. Ein derartiger Wachstumsdetektor wird in eine Wandung des Nahrungsmittelbehälters gelegt, so daß man erkennen kann, wenn durch Erzeugen von Kohlendioxid die Indikatorscheibe einen Farbumschlag zeigt. Ein derartiger Wachstumsindikator erfordert nicht nur eine Papierscheibe und eine alkalische Benetzungslösung, sondern ist auch verhältnismäßig kostspielig, hat eine geringe Lagerfähigkeit und darf nicht in Berührung mit den Nahrungsmitteln selbst kommen, insbesondere dann nicht, wenn es sich, um saure Produkte handelt, bei denen die Genießbarkeit überwacht werden soll. Die bekannte Indikatorscheibe ist im wesentlichen für Milch geeignet. Eine Verwendung für saure Nahrungsmittel ist nicht vorgesehen und es ist auch nicht dargelegt, wie dies geschehen könnte. Die Absicht, zu verhindern, daß das Wasser in der Milch oder dem Nahrungsmittel durch die Diffusionsscheibe hindurchgelangt und daß die großen Farbstoffmoleküle oder Kaliumhydroxid oder dergleichen durch die Diffusionsscheibe hindurchgelangen, läßt sich auf diese Weise nicht verwirklichen, so daß die Unbrauchbarkeit dieses Wachstumsanzeigers auf der Hand liegt.

Es ist ferner ein länglicher Indikatorstift bekannt, der

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mit einem chemischen Indikator-Agens imprägniert oder beschichtet ist (US-PS 2-626 855). Dieser Indikatorstift wird in das zu prüfende Nahrungsmittel gesteckt, wobei das Indikatoragens bei Anwesenheit von substituierten Aminen oder anderen Aminö-Kondensationsprodukten, wie sie etwa bei Fäulnis oder aufgrund eines sauren pH-Wertes auftreten oder bei Reduktionsbedingungen aufgrund des verdorbenen Nahrungsmittels selbst, einen Farbumschlag zeigt. Die Verwendung dieses Indikatorstiftes erfordert die direkte Berührung zwischen dem Indikatoragens und dem zu prüfenden Nahrungsmittel. Dieser Stift läßt sich daher nicht verwenden als Beipack zu einem-Nahrungsmittel selbst, da auch während einer nur zeitweiligen Berührung notwendigerweise etwas Indikatorsubstanz ausgelaugt wird und von dem Nahrungsmittel aufgenommen wird. Eine weitere Schwierigkeit liegt darin, die Indikatorstifte so zu behandeln, daß sie einen genügend scharfen Farbumschlag zeigen, ohne daß zu viel Indikatorsubstanz in das Nahrungsmittel gelangt. Ferner darf der Indikatorstift seine Wirksamkeit nicht verlieren, wenn er über längere Zeit der umgebenden Atmosphäre ausgesetzt wird.

Aus diesen Gründen sind die bisher bekannten Wachstumsindikatoren nur mehr oder weniger beschränkt brauchbar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen mikrobiologischen Wachstumsdetektor zu schaffen, der sich über längere Zeit in dauernder Berührung mit einem Nahrungsmittel halten läßt, ohne auf dieses eine schädliche.oder sogar giftige Wirkung auszuüben.'

Die Lösung dieser Aufgabe ist gegeben durch eine Indikatorlösung, die von Stoffwechsel-Nebenprodukten des mikrobiologischen Wachstums verfärbt wird, und durch eine für Basen und Säuren undurchlässige, für das Stoffwechsel-Nebenprodukt jedoch durchlässige Umhüllung für die Indikatorlösung,

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Ein derartiger Wachstums-Detektor läßt sich in direkte Berührung mit dem zu überwachenden Nahrungsmittel bringen, etwa auf die Oberfläche desselben oder in einem begrenzten Luftraum oberhalb eines abgepackten Nahrungsmittels oder dergleichen, und läßt sich im Ofen oder in einem Autoklaven behandeln oder kochen, entsprechend der gewünschten Zubereitungs- oder Konservierungsart des Nahrungsmittels.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird als Indikatorlösung Alizarin^rot S verwendet, welches einen Farbumschlag von rot nach gelb bei Anwesenheit von Kohlendioxid zeigt, und diese Indikatorlösung ist in .einer zusammengesetzten Umhüllung aus einem Kunststoffilm untergebracht, welcher besondere Permeabilitätseigenschaften hat, wie weiter unten noch beschrieben ist. Ein derartiger Wachstumsdetektor eignet —en mikrobiologischen Wap.h in Nahrungsmitteln wie Babykost, Dosensuppen, in Dosen abgepacktem Gemüse, für Selbsteingemachtes und dergleichen.

Gemäß.einer anderen Ausführungsform wird als Indikatorlösung eine frostbeständige Mischung oder Verbindung verwendet, welche sich besonders eignet für Gefriergut und dergleichen, um ein mikrobiologisches Wachstum bei niedrigen Temperaturen sowie bei Umgebungstemperatur festzustellen.

Die Erfindung ist im folgenden anhand schematischer Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen ergänzend beschrieben.

Figur 1 ist eine Draufsicht auf einen Wachstumsdetektor nach der Erfindung.

Figur 2 ist ein Schnitt längs der Linie 2-2 von Figur 1.

Der Wachstumsindikator nach der Erfindung umfaßt ein Indikator-

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material, welches auf eines oder mehrere Stoffwechsel-Nebenprodukte von Mikroorganismen anspricht, um einen sichtbaren Farbumschlag des Indikatormaterials zu erzeugen. Dieses selbst befindet sich in einer Umhüllung, welche für die gasförmigen Nebenprodukte durchlässig ist, jedoch undurchlässig für das Indikatormaterial und für irgendwelche Bestandteile des Stoffes, in dem das mikrobiologische Wachstum festgestellt werden soll, so daß keine fehlerhafte Anzeige auftreten und eine richtige Anzeige nicht verhindert werden kann.

Der in Figur 1 dargestellte mikrobiologische Wachstumsdetektor umfaßt eine Umhüllung 10, die einen Behälter für Indikatorlösung 11 bildet. Die Umhüllung besteht aus zwei Umhüllungshälften 20 aus einem Kunststoff, welche entlang ihres Randes 14 miteinander-dicht verbunden sind. Die Form und der Umriß der Umhüllung für die Indikatorlösung können natürlich beliebig gewählt werden. Die Umhüllung kann z.B. aus Stücken kreisförmiger oder flacher Rohre bestehen, die lediglich an den Enden versiegelt zu werden brauchen. Der Umriß kann z.B. kreisförmig, quadratisch oder in jeder anderen gewünschten Form gewählt sein.

Das Einschließen des Indikatormaterials in die Umhüllung geschieht beispielsweise durch Wärmeversiegelung, Anwendung eines Lösungsmittels als Bindemittel oder auf andere Art, wie es zum Verbinden von Kunststoffen bekannt ist. Polyäthylen läßt sich z.B. durch Wärme versiegeln, Polyester kann durch ein Lösungsmittel verbunden werden, etwa mittels Benzylalkohol, und andere Materialien lassen sich mit den verschiedenartigsten-Klebstoffen miteinander verbinden. Im vorliegenden Fall wird eine Wärmeversiegelung vorzugsweise angewendet, um Bas Eindringen möglicherweise giftiger Substanzen in die Wachstumsgrundlage zu verhindern, obwohl auch ungiftige Klebstoffe und dergleichen angewendet werden können.

Die Umhüllung 10 ist vorzugsweise durchsichtig.oder durchscheinend, so daß der Farbumschlag des Indikatormaterials

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leicht ohne Öffnen der Umhüllung feststellbar ist. Letztere muß für gasförmige Stoffwechsel-Nebenprodukte durchlässig sein, damit der Farbumschlag eintreten kann, etwa für Kohlendioxid. Da die Kohlendioxidkonzentration in der Umgebungs-Taft gewöhnlich verhältnismäßig klein ist, so ergibt der Zusatz einer geringen Menge von Kohlendioxid eine verhältnismäßig größere anteilige Konzentrationserhöhung als z.B. die Zugabe von Stickstoff, da die Stickstoffkonzentration in der Atmosphäre fast 80 % beträgt. Das Material der Umhüllung sollte auch beständig sein gegenüber den bei der Behandlung von Nahrungsmitteln vorkommenden Temperaturen, etwa beim Eindosen oder Frieren von Nahrungsmitteln, wobei Temperaturen von wenigstens 95 bis 120° C und Drücke von etwa 1,1 Bar während einer Stunde oder länger auftreten können.

Wie in Figur 2 dargestellt ist, ist die Umhüllung aus mehreren Schichten zusammengesetzt, nämlich einer inneren Schicht 24 und einer äußeren Schicht 22. Die innere Schicht hat eine Stärke von etwa 40 Mikron und besteht aus Polyäthylen, und die äußere Schicht hat eine Dicke von 10 Mikron und besteht aus einem Polyester (Polyäthylenterephthalat). Eine derartige Umhüllung hat sich für die Zwecke der Erfindung als besonders geeignet erwiesen. Die innere Polyäthylenschicht ermöglicht eine Wärmeversiegelung der Umhüllung und hat eine besonders niedrige Durchlässigkeit für Wasser verbunden mit einer hohen Durchlässigkeit für Kohlendioxid und andere Gase. Die äußere Schicht aus Polyester.verbessert die Haltbarkeit der Umhüllung bei höheren Temperaturen, wie sie etwa bei der Behandlung von Nahrungsmitteln auftreten können, und ergibt eine hohe Zug- und Reißfestigkeit. Eine derartige Umhüllung hat eine geringe Wasserdiffusionsgeschwindigkeit und ermöglicht die Herstellung eines Wachstumsdetektors mit befriedigender Lagerfähigkeit. Bei der Behandlung eines derartigen Wachstumsdetektors in einem Drucktopf ist die Geschwindigkeit des Wasserverlustes um 50 % geringer gegenüber den nicht in einem Drucktopf behandelten Proben, so daß sich

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eine erhöhte LagerfShigkeit und Lebensdauer ergibt»

Dieser Wachstumsdetektor spricht praktisch nur auf gasförmige Stoffwechsel-Nebenprodukte mikrobiologischen Wachstums an und nicht auf Änderungen des pH-Wertes in dem Wachstumsgrundstoff. Die erforderliche Isolierung der Indikator-Lösung von den sauren und basischen Bestandteilen des Grundstoffes wird erreicht durch Wahl des Materials der Umhüllung, welche eine bestimmte Undurchlässigkeit gegenüber Säuren und Basen haben muß, um eine Beeinflussung der Indikatorlösung durch diese Substanzen zu vermeiden« Diese Undurchlässigkeit läßt sich natürlich nicht vollständig erreichen. Es reicht Jedoch, was im Folgenden vorausgesetzt ist, daß das Material der Umhüllung so weit undurchlässig gegenüber Säuren und Basen ist, daß der-pH-Wert des Nahrungsmittels oder dergleichen keinen Einfluß auf die Indikatorlösung während der vorgesehenen Lagerfähigkeit oder Lebensdauer des Wachstumsindikators hat. *

Es sei erwähnt>■ daß die Durchlässigkeit für Kohlendioxid von Polyäthylen hundertmal größer ist als von Polyester. Demgemäß wird die Gesamtdurchlässigkeit der mehrschichtigen Umhüllung ganz wesentlich von Änderungen der Dicke der Polyesterschicht bestimmt. Eine verhältnismäßig geringe Änderung der Dicke von 2,5 bis 5 Mikron verringert die Gesamtdurchlässigkeit der mehrschichtigen Umhüllung gegenüber Kohlendioxid sosehr, daß diese für eine frühzeitige Erkennung verdorbener Nahrungmittel nicht mehr brauchbar ist. Andererseits ergibt eine Verringerung der Dicke der Polyesterschicht zur Erhöhung der Kohlendioxiddurchlässigkeit eine Erhöhung der Empfindlichkeit des Wachstumsdetektors, wobei die Empfindlichkeit für manche Anwendungsfälle jedoch schon zu groß ist, v/Ie weiter unten noch erläutert ist, und auch die Durchlässigkeit der Umhüllung für Säuren zu, stark wird,, so daß eine vorzeitige Farbverschiebung der Indikatorlösung bei Verwendung von sauren Lebensmitteln auftreten kann und dadurch die Lebens-

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dauer des Wachstumsdetektors herabgesetzt ist. Änderungen der Dicke des Polyäthylenfilms haben natürlich auch einen Einfluß, auf die Eigenschaften der mehrschichtigen Umhüllung, jedoch in einem weit geringeren Ausmaß als Änderungen der Dicke der Polyesterschicht«

Es können zur Realisierung der Erfindung natürlich auch andere Stoffe verwendet werden, die für Kohlendioxid durchlässig sind und für Säuren und Basen undurchlässig, Z.B. läßt sich anstelle von Polyäthylen auch Polypropylen verwenden, insbesondere dort, wo höhere Temperaturen auftreten, da die Versiegelungsfestigkeit von Polyäthylen dann an der Grenze liegen könnte. Polypropylen ist allerdings etwas teurer.

Die Auswahl des Indikatormaterials 11 richtet sich nicht nur nach der Umgebung, in die die Umhüllung eingebettet werden soll, sondern auch nach der Art der gasförmigen Stoffwechsel-Nebenprodukte, von denen das Indikatormaterial beeinflußt werden soll, und von der Konzentration dieses Gases in dem Indikatormaterial, bei dem ein Farbumschlag eintreten soll. Die Gaskonzentration hängt wiederum von einer Anzahl Faktoren ab_s nämlich der Art der Mikroorganismen, die das Gas erzeugen, der Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen, der Permeabilität, Absorption und Adsorption der Wachstumsgrundlage für das erzeugte Gas, dem Volumen des zwischen der Wachstumsgrundlage (Nahrungsmittel) und dem Behälter eingegrenzten Luft, der Permeabilität der Umhüllung für das Gas, und zahlreicher anderer Faktoren. Wie bereits oben erwähnt₉ ist das am meisten auftretende Gas Kohlendioxid. Wenn dieses in einer wässrigen Indikatorlösung vorhanden ist, entsteht Kohlensäure, welche

wiederum den pH-Wert der Indikatorlösung verringert. Brauchbare Indikatorlösungen sind solche, bei denen ein deutlich sichtbarer Farbumschlag bei einer geringen Verschiebung der Azidität der Indikatorlösung auftritt»

Das Indikatormaterial kann eine flüssige Lösung sein_s welche

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die erforderlichen Parbänderungseigenschaften und andere physikalische Eigenschaften aufweist. Je weniger Indikatorlösung pro Oberflächeneinheit der Umhüllung verwendet wird, desto empfindlicher kann der Wachstumsdetektor gemacht werden, wobei jedoch zu bedenken ist, daß eine Verringerung der Indikatorlösung die Brauchbarkeitsdauer des Wachstums-detektors verkürzt.

Es hat sich herausgestellt, daß eine doppelschichtige Umhüllung mit einer 10 Mikron dicken Polyesterschicht und einer üO Mikron dicken Polyäthylenschicht und einer Oberfläche von etwa 1000 mm² möglichst 1000 Milligramm Indikatorlösung enthalten sollte. Die Wasserverlustgeschwindigkeit mit einer derartigen Polyester-Polyäthylen-Umhüllung bei einer Temperatur von 22 bis 27° C, 50 bis 90 % relativer Luftfeuchte und 730 bis 790 mm Hg Luftdruck betrug bei einer Füllung der Umhüllung mit 1000 Milligramm Indikatorlösung und der oben angegebenen Oberflächengröße etwa 60 Milligramm pro m und Stunde. Wenn eine derartige mehrschichtige Umhüllung in einen Autoklaven gebracht wird bei einer Temperatur von 120° C und einem Druck von 1,1 Bar während 20 Minuten, wird die Wasserverlustge- '

schwindigkeit auf einen Wert von 30^ Milligramm pro' m und Stunde reduziert. Umgerechnet auf 1000 Milligramm der Indikator-

lösung und eine Fläche von 1000 mm beträgt die Wasserverlustgeschwindigkeit dann 0,7 Milligramm pro Tag. Unter diesen Bedingungen ist ein Wasserverlust von 500 Milligramm (0,5 ml) annehmbar, wobei zwar die Indikatorlösung dann konzentrierter wird, jedoch noch wirksam arbeitet, so daß eine Brauchbarkeit sdauer von 700 Tagen-erzielt wird.

Die Brauchbarkeitsdauer des Wachstumsdetektors nach der Erfindung wird in wesentlichem Maße beeinflußt durch die Wasserverlustgeschwindigkeit aus der Indikatorlösung in die' Umgebung der Umhüllung, wenn diese in einen Behälter gebracht wird, in dem sich eine mikrobiologische Wachstumsgrundlage befindet. Änderungen des osmotischen Druckes des Wassers

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gegenüber den verschiedenen Medien, die in Berührung mit der Umhüllung stehen, verursachen entsprechende Änderungen des Wasserverlustes, so daß unterschiedliche Nahrungsmittel oder dergleichen auch unterschiedliche Wasserverlustgeschwindigkeiten zur Folge haben. Je höher die Wasserkonzentration in der Wachstumsgrundlage ist, desto geringer ist die Wasserverlustgeschwindigkeit und desto länger die Brauchbarkeitsdauer des Wachstumsdetektors.

Es wurde gefunden, daß Lösungen von etwa 0,01 bis 0,08 % Alizarin'.Rot S (Natriumalizarinsulfonat), im Folgenden ARS genannt, in destilliertem Wasser für die Zwecke der Erfindung geeignet sind. Ein Optimum an Eigenschaften ergibt sich bei einem Wert von 0,0¹I % ARS, wie weiter unten noch erläutert ist. Diese Indikatorlösung hat einen pH-Wert von etwa 6 bis 6,2 und einen sehr scharfen Farbumschlag von rot nach gelb über den pH-Bereich von etwa 6,0 bis 4,6 in Gegenwart von Kohlendioxid. Es wurden Giftigkeitsversuche durchgeführt mit 0,04 prozentiger ARS-Lösung an schweizerischen Albino-Mäusen, wobei sich herausgestellt hat, daß diese Lösung bei intravenöser Anwendung, bei Einbringung in den Bauchfellraum oder oral oder Kombinationen dieser Möglichkeiten nicht giftig ist.

Eine andere Indikatorlösung, die viele ähnliche Eigenschaften mit der 0,04 prozentigen ARS-Lösung gemeinsam hat, ist Bromcresol-grün-Lösung, im Folgenden BCG-Lösung genannt, welche durch Auflösen von 52,17 Milligramm BCG in einem Liter destillierten Wasser hergestellt wird. Der pH-Wert dieser Lösung ist 6,0. BCG zeigt einen 'Farbumschlag von blau nach hellgrün bei Anwesenheit von Kohlendioxid.

Es lassen sich auch noch andere Indikatoren verwenden, jedoch ergibt der ARS-Indikator die deutlich sichtbarste Farbänderung, ist wirtschaftlich, stabil in -dem Temperaturbereich zwischen Gefriergut, und Behandlungstemperaturen

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von Nahrungsmitteln in Dosen und scheint vollständig ungiftig in .den in Frage kommenden Konzentrationen zu sein. Der Nachteil von BCG besteht im wesentlichen darin, daß der Farbumschlag bei Anwesenheit von Kohlendioxid nicht so ausgeprägt ist. Es läßt sich auch Bromcresol purpur (BCP) verwenden, um eine pH-Verschiebung zwischen 6,8 und 5>2 anzuzeigen, jedoch ist die Anzeige nicht so deutlich wie bei Verwendung von ARS.

Eine abgeänderte Indikator-Lösung, die sich insbesondere für Gefriergut eignet oder für Anwendung bei niedrigen Temperaturen, verx^endet eine "Mischung von 30 bis 90 % Glyzerin in destilliertem Wasser. Derartige Mischungen gefrieren bei den üblichen Tiefgefriertemperaturen im Haushalt nicht. Je nach dem Wasseranteil in der Indikatorgrundlösuhg werden Konzentrationen von ARS oder BCP zwischen 0,01 und 0,08 % verwendet. Bei Anwendung von BCP ist der ursprüngliche pH-Wert der Lösung etwa 6,4 oder höher, wobei "die Empfindlichkeit des Indikators gegenüber Kohlendioxid mit zunehmendem pH-Wert abnimmt.

Es können auch Indikatorlösungen mit höheren oder niedrigeren Konzentrationen der Indikatorsubstanz verwendet werdend Bei Verringerung der Konzentration wird jedoch die Intensität des Farbumschläges entsprechend verringert, so daß dieser möglicherweise nicht mehr deutlich genug wahrnehmbar ist. Bei Erhöhung der Indikatorkonzentration wird zwar die Farbintensität ebenfalls erhöht, jedoch wird durch die Pufferwirkung der Indikatorsubstanzen der für einen Farbumschlag erforderliche Betrag an Kohlendioxid vergrößert„ Natürlich nimmt dann aucH der Preis eines derartigen Wachstumsdetektors zu.

Im Folgenden sind Beispiels für kältebeständige Indikatorlösungen angegeben:

1. Man vermische 35 Milliliter destilliertes Wasser und 3_S33

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mg BCP. Hierzu werden 15 Milliliter Glyzerin gegeben, so daß eine 30 prozentige Glyzerinlösung mit einer Konzentration von 0,0066 % BCP und einem pH-Wert von 7,0 entsteht.

2. Man vermische 15 Milliliter destilliertes Wasser und 1,675 Milligramm BCP. Hierzu werden 10 Milliliter Glyzerin gegeben. Man erhält 25 Milliliter einer ¹JO prozentigen Glyzerinlösung mit einem Anteil von 0,068 Prozent BCP und einem pH-Wert von 7,0.

3. Man vermische 15 Milliliter destilliertes Wasser und 2,010 Milligramm BCP. Hierzu werden 15 Milliliter Glyzerin gegeben. Man erhält 30 Milliliter einer 50 prozentigen Glyzerinlösung, die 0,0067 Prozent BCP enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat.

Mikrobiologische Wachstumsdetektoren nach der Erfindung lassen si'ch in oder auf die Oberfläche einer Wachstumsgrundlage legen, etwa Nahrungsmittel, und zwar während oder unmittelbar nach dem Füllen eines Behälters mit dem Nahrungsmittel. Der Wachstumsdetektor wird sodann mit dem Nahrungsmittelbehälter bearbeitet und in diesem eingeschlossen. Wenn die Verarbeitung nicht richtig erfolgt oder wenn Mikroorganismen später in den Behälter hineingelangen, etwa weil dieser nicht ganz dicht ist, später beschädigt wird in der Fabrik oder beim Transport, oder dergleichen, und wenn ein derartiger Behälter ein zeitlich und temperaturmäßiges Schicksal hat, welches zu einem Wachstum von Mikroorganismen führt, so wird Kohlendioxid erze-ugt als Stoffwechsel-Nebenprodukt eines derartigen Wachstums. Da de.r Partlaldruck des Kohlendioxids in dem Behälter steigt, wandert Kohlendioxid durch die Umhüllung des Wachstumsdetektors und reagiert mit der Indikatorlösung, wobei Kohlensäure entsteht und der pH-Wert der Indikatorlösung verringert wird, so daß sich die Farbe des Indikators verändert, Falls als Indikator

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ARS verwendet ist, erfolgt ein markanter Farbwechsel von rot nach gelb, wodurch angezeigt wird, daß der Inhalt des Behälters wahrscheinlich zum Verzehr nicht mehr geeignet ist. . . :

Alternativ können derartige Wachstumsdetektoren auch vom Verbraucher selbst den Nahrungsmittelbehältern beigegeben werden nach dem öffnen derselben und nach Gebrauch eines Teiles der Nahrungsmittel. Sie können auch allen hergestellten Nahrungsmitteln, z.B. Kartoffelsalat, Kohlsalat, Eiersalat, Krabbensalat oder dergleichen beigefügt werden. Falls der Inhalt des Behälters Mikroorganismen aufgenommen hat und das Wachstum derselben so weit fortgeschritten ist, daß Kohlendioxid als Stoffwechsel-Nebenprodukt erzeugt wurde., tritt ein Farbumschlag der Indikatorlösung ein, wodurch die vermutliche Unbrauchbarkeit der restlichen Nahrungsmittel angezeigt wird.

Es ist bekannt, daß bei der Verarbeitung von Nahrungsmitteln zahlreiche Fruchtsäuren und dergleichen verflüchtigen. Der Wachstumsindiktator nach der Erfindung wird von derartigen flüchtigen Fruchtsäuren nicht beeinflußt, auch nicht von organischen und anorganischen Säuren, da die Umhüllung undurchlässig dafür ist.

Mikrobiologische Wachstumsdetektoren nach der Erfindung ergeben eine visuelle Anzeige eines mikrobiologischen Wachstums aufgrund der Erzeugung von Kohlendioxid, und zwar unabhängig vom pH-Wert der Wachstumsgrundlage, selbst wenn der Wachstumsindikator in direkter Berührung mit einer Wachstumsgrundlage ist, deren pH-Wert wesentlich niedriger ist als der pH-Wert des Indikatormaterials beim FärbUmschlagspunkt.

Erfindungsgemäße Wachstumsindikatoren lassen sich verwenden in Verbindung mit potentiellen Wachstumsgrundlagen, die durch unterbrochenen oder seltenen' Gebrauch verderben können, etwa

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Babynahrung und Haustiernahrung. Ein weiteres Anwendungsgebiet sind verschiedene Wachstumsgrundlagen, etwa biologische Seren, pharmazeutische Produkte und dergleichen, bei denen ähnliche Bedingungen auftreten können wie bei Nahrungsmitteln.

Die Empfindlichkeit des Wachstumsdetektors hängt von einer Anzahl von Variablen ab. Sie wird z.B. nicht nur von der Dicke der Polyesterschicht der Umhüllung beeinflußt, sondern auch von der Art und Dicke des Materials der anderen Schicht der Umhüllung, von der Konzentration und dem pH-Wert sowie der Art der Indikatorlösung und von der Beziehung zwischen dem Volumen der Inikatorlösung und der Oberfläche der Umhüllung.

Die Empfindlichkeit des Wachstumsdetektors wird vorzugsweise an die beabsichtigte Verwendungsart angepaßt. Wachstumsdetektoren für die überwachung biologischer Kulturen für Forschungszwecke können verhältnismäßig empfindlich sein. Wenn jedoch lediglich der Grad des bakteriellen Wachstums als Maß für die Genießbarkeit eines Nahrungsmittels festgestellt werden soll, kann eine schwächere Empfindlichkeit angebracht sein.

Das Bakterienniveau, bei dem Nahrungsmittel gewöhnlich als gesundheitsschädlich angesehen werden, liegt bei etwa 10 Bakterien pro Gramm des Nahrungsmittels oder höher. Bei einem Bakteriengehalt von 10_ oder weniger pro Gramm des Nahrungsmittels sieht man dieses im allgemeinen als geeignet für den Verbrauch an. Oft enthalten manche gesundheitsfördernden Nahrungsmittel eine große Anzahl nichtpathogener Bakterien, ζ '.Β. Buttermilch, Sauerrahm oder ähnliche Milchprodukte. Wenn ein Wachstumsindikator hierfür auf einen zu niedrigen Anzeigepegel eingestellt ist, könnte vorgetäuscht werden, daß das betreffende Produkt für den Verbrauch nicht geeignet ist. Andererseits würde dem Verbraucher wenig gedient

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sein durch einen Indikator, der nur dann anspricht, wenn der Bakteriengehalt so hoch ist, daß er durch das Aussehen, den Geruch oder den Geschmack festgestellt werden kann. Man erkennt aus den folgenden Beispielen mikrobiologische Wachstumsdetektoren zum zuverlässigen Anzeigen eines Verderbens von Nahrungsmitteln, bevor dieses dem Verbraucher sonst ohne Hilfsmittel offensichtlich wird.

Die visuelle Anzeige eines verdorbenen Zustandes von Nahrungs-

6 Q mitteln bei einem Gehalt von 10 bis ICK Bakterien pro Gramm ermöglicht die Anwendung von colorimetrischen Techniken, um die Wachstumsgeschwindigkeit bei einem viel niedrigeren Bakteriengehalt festzustellen. Die Feststellung, daß eine Bäkterienverseuchung vorhanden ist, läßt das Nahrungsmittel oder dergleichen für den Verbrauch ungeeignet erscheinen zu einem vorhersagbaren künftigen Zeitpunkt, und zwar viel früher, ohne daß ein Farbumschlag erforderlich ist, der auch einem ungeübten Betrachter deutlich wird. Es sind zahlreiche Farbkomparatoren in der analytischen Mikrobiologie bekannt, die für die Zwecke der Erfindung voll anwendbar sind, etwa in Nahrungsmittelfabriken für eine interne Qualitätskontrolle. Man braucht dabei nicht an dem Endprodukt das volle Bakterienwachstum abzuwarten, um eine FärbverSchiebung feststellen zu können. Außerdem kann der Einschluß eines mikrobiologischen Wachstumsdetektors in eine Dose oder dergleichen dem Verbraucher eine zusätzliche Sicherheit bieten, daß der Inhalt der Dose seit Verlassen der Fabrik nicht verdorben ist. .·

Im Folgenden sind einige Beispiele angegeben, bei denen eine Umhüllung aus Polyester-Polyäthylenschichten verwendet ist, und zwar mit einer Dicke der Polyesterschicht von etwa 10 bis 11 Mikron und der Polyäthylenschicht von etwa 33 bis 41 Mikron. Die in diesen Beispielen verwendeten Bakterien stammen aus üblichen Laborkulturen der ATCC (American type culture collection).

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Beis£iel_l

Ein Wachstumsdetektor nach der Erfindung wird hergestellt durch Einfüllen von 0,75 bis 1 Milliliter 0,04 prozentiger ARS-Lösung in eine Umhüllung aus Polyester-Polyäthylen ge-

maß den Figuren 1 und 2 mit einer Oberfläche von 1000 mm . Es wurden etwa 100 Gramm der folgenden Nahrungsmittel jeweils in zwei Sch-raubverschlußgläser eingefüllt:

Hühnercremesuppe

Kartoffeicremesuppe

Selleriecremesuppe

Gemüsesuppe

Minestrone

Kalbfleisch mit Gemüse als Babykost Schinken mit Gemüse als Babykost Schinken mit Gemüse als Kleinkindkost

Ein Glas jedes dieser Nahrungsmittel wurde im Ofen behandelt und versiegelt. Das andere Glas wurde mit Escherichia·coil geimpft und versiegelt und bei 37° C stehengelassen. Als Folge zeigte die Indikatorlösung in allen geimpften Proben einen Farbumschlag nach gelb oder orange-gelb nach 2 1/2 bis 3 Tagen, während die Indikatorlösung in den nicht geimpften Gläsern unverändert blieb.

Beisgiel_2

Es wurde ein Indikatorpaket hergestellt mit 0,75 bis 1 Milliliter einer-0,04 prozentigen ARS-Lösung in einer Umhüllung aus Polyester-Polyäthylen mit einer Oberfläche von

ρ
etwa 1000 mm . Das Indikatorpake.t wurde sodann in einem Glas versiegelt, welches 0,!-normale Salzsäure mit einem pH-Wert von 1,2 enthielt. Nach 160 Tagen war noch keine sichtbare Änderung der Indikatorlösung eingetreten. Dies zeigt deutlich,,

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daß die Anzeige von dem pH-Wert der Wachstumsgrundlage nicht abhängt.

Beisp_iel_3_

Es wurden 24 Indikatorpakete hergestellt aus einem Polyester-Polyäthylen-Laminat und mit etwa 1 Milliliter Bromcresol-grün (BCG)-Lösung gefüllt, die durch Mischen von 1,5 Milliliter 0,04 prozentiger BCG-Lösung in Wasser und 10 Milliliter destillierten Wassers hergestellt worden war. Es wurden Jeweils 100 Gramm einer Pilzsuppe in jedes der 12 Gläser eingefüllt. In die übrigen 12 Gläser wurden jeweils 90 Gramm einer Hühnerfleisch-Babynahrung eingefüllt. Etwa 65 crn^ im oberen Teil der Gläser blieb frei von Nahrungsmitteln. In jedes der Gräser wurde ein Indikatorpaket gesteckt. Für jedes Nahrungsmittel wurden zwei Gläser als Kontrollgläser abgesondert, in einem Drucktopf bei 120° C während 20 Minuten behandelt und sodann mit Paraffin versiegelt. Die übrigen Gläser wurden mit etwa 100 bis 1750 Bakterien der Art Salmonella typhimurium geimpft, versiegelt und sodann bei Raumtemperatur aufbewahrt. In allen Fällen zeigte die BCG-Indikatorlösung einen Farbumschlag von blau bis hellgrün in den geimpften Gläsern nach Ablauf von 8 Tagen, während bei den Kontrollgläsern kein Farbumschlag eintrat. Die Bakterienzählung bei den geimpften Gläsern ergab am Ende des 8. Tages eine Bakteriendichte von 3 x 10^ bis 4,8 χ 10^ Bakterien pro Gramm. Der anfängliche pH-Wert der Proben lag zwischen etwa 5,4 und 6.,2, während der letzte pH-Wert bei den geimpften Gläsern zwisc.hen etwa 5,1 und 6,0 lag und bei den Kontrollgläsern unverändert war.

Beis£iel_4

Es wurden jeweils drei Proben von 46 verschiedenen Suppen abgenommen mit einem anfänglichen pH-Wert zwischen etwa 4,2 und 6,5. Diese Suppen waren in Drehverschlußgläsern abgefüllt. Die Indikatorpakete enthielten 1 Milliliter 0,04

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prozentiger ARS-Lösung und waren in die Gläser eingebracht. Diese wurden sodann bei 120° C und einem Druck von 1,1 Bar etwa 20 Minuten lang behandelt und sadann versiegelt. Nach 16O Tagen zeigte sich keine Änderung in der Farbe der Indikatorlösung.

Beispiel 5

Es wurden jeweils vier Proben von 44 Suppen in Drehverschluß- ■ gläsern präpariert, wobei jede Probe etwa 100 Gramm enthielt. Zwei Proben jeder Suppe wurden mit Salmonella typhimurium geimpft und die übrigen Proben mit Staphylococcus aureus. Der Wachstumsdetektor enthielt in einer Umhüllung aus Polyester-Polyäthylen-Laminat ein Milliliter einer 0,04 prozentigen ARS-Lösung. In jedem Glas war ein Indikatorpäckchen eingelegt. Die Proben wurden sodann versiegelt und bei Raumtemperatur 8 bis 10 Tage lang aufbewahrt. Am Ende dieser Zeit war die Farbe sämtlicher Wachstumsdetektoren nach gelb umgeschlagen.

Die Impfungen erfolgten mit 10 bis 56 Salmonellen pro 100 Gramm und mit 47 bis 87 Staphylokokken pro 100 Gramm. Der anfängliche pH-Wert der Suppen lag zwischen 6,4 und 4,9, und der pH-Wert am Ende der Behandlungsdauer zwischen 5,9 und 4,5. Die größte pH-Wert-Änderung war ein Abfall von 1,55 Einheiten, nämlich von 6,25 auf 4,7. Bei zwei Suppen trat kein wesentlicher pH-Wert-Abfall während des Versuches auf. Die zuletzt ausgeführte Bakterienplattenzählung ergab 2,8 χ 10 bis 9,6 χ ίο" Bakterien pro Gramm der Suppe.

Beisp_iel_6

Es wurden kleiner Wachstumsdetektoren hergestellt mit 0,2 Milliliter 0,04 prozentiger ARS-Lösung in einer Polyester-

2 Polyäthylen-Umhüllung mit etwa 200 mm Membranoberfläche. Sodann wurden Candida albicans (Hefe) und Aspergillus spp. getrennt zweifach auf Schrägflächen von Sabaraud dextrose agar

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gestrichen gemäß den üblichen mikrobiologischen Techniken. Ein derartiger Mini-WachstUmsdetektor wurde in jedem Kopfraum ( etwa 5 Milliliter) oberhalb der Agar-Schrägflache . gelegt und das Rohr dann dicht verschlossen. In jedem Fall trat ein Farbumschlag des Indikators von rot nach gelb auf nach Ablauf von 72 bis $6 Stunden bei einer Temperatur von 37° C, während ähnlicheMinidetektoren, die auf getrennte sterile Kontrollflächen aus den gleichen Substanzen gelegt worden waren, rot blieben. Da die mikrobiologischen Formen von Hefen, Schimmel und Pilzen ebenso wie Bakterien einen interzellulären Stoffwechsel haben, der zur Erzeugung von Kohlendioxid führt, läßt sich die Erfindung auch für die überwachung des Wachstums derartiger Stoffe verwenden.

Beispiel_7

Es wurden Wachstumsdetektoren verwendet mit 1,0 Milliliter 0,04 prozentiger ARS-Lösung in einer Polyester-Polyätihylen-Umhüllung., deren Oberfläche 1000 mm betrug. Bei diesem Versuch, der mehrere Male mit Abänderungen wiederholt wurde«, wurden die Wachstumsdetektoren entweder in einen begrenzten Raum gebracht, in dem sich anorganisch erzeugtes Kohlendioxid befand, oder in einen Raum, der Kohlendioxid enthielt, welcher durch den Stoffwechsel des Wachstums von Bakterien auf Nahrungsmitteln entstanden war. Wenn die Farbe der Wachstumsdetektoren umgeschlagen war, was etwa nach ¹J Stunden bei dem anorganisch erzeugten Kohlendioxid und nach 1 bis mehreren Tagen bei dem organisch erzeugten Kohlendioxid auftrat, bei letzterem abhängig von der ursprünglichen Anzahl der Bakterien, dem Nahrungsmittel, der Temperatur und dergleichen, wurden die Wachstumsdetektoren entfernt und der umgebenden Atmosphäre ausgesetzt. In allen Fällen zeigte sich, daß der Farbumschlag dabei "wieder rückgängig gemacht wurde und die ursprüngliche rote Farbe entstand. Durch diese Versuche zeigte sich, daß die Wachstumsdetektoren das Kohlendioxid als Gas feststellen, und zwar wegen seines höheren Partialdruckes innerhalb des

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abgeschlossenen Raumes im Vergleich zu der umgebenden Atmosphäre, und daß das Kohlendioxidgas in derselben wie'der freigegeben wird, so daß die Farbe wieder von gelb nach rot zurückgeht. Dies zeigt auch, daß bei der Anwendung der Erfindung für die Nahrungsmittelverarbeitung verflüchtigte anorganische und organische Säuren (z.B. Essigsäure, Zitronensäure, Fumarsäure und dergleichen) bei der Ofenbehandlung der Nahrungsmittel an sich wohl einen Farbumschlag der Indikatorlösung von rot nach gelb bewirken würden, jedoch nicht durch die Membran hindurchgelassen werden, durch die vielmehr nur Gas, nämlich Kohlendioxid, hindurchtritt.

Beisp_iel_8

Es wurden Wachstumsdetektoren hergestellt mit 0,3 bzw. 1,0 Milliliter 0,04 prozentiger ARS-Lösung mit einem pH-Wert von 6,2. Als Umhüllung wurde ein Polyester-Polyäthylen-Laminat mit 300 bzw. 1000 mm² Oberfläche verwendet.

Es wurde ein Wachstumsdetektor in jeweils eine Anzahl. Gläser mit Makaroni, Rindfleisch und Schinken-Babynahrung gebracht. Die Kontrollgläser wurden verschlossen und in einem Drucktopf behandelt. Die restlichen Gläser wurden mit etwa 7,2 Bakterien pro Gramm des Typs Salmonella typhimurium geimpft, sodann verschlossen und auf Raumtemperatur gehalten.

Die prozentuale Lichtdurchlässigkeit T wurde sodann bei Jeder Indikatorlösung spektrofotometrisch bei einer Wellenlänge von 620 Millimikron gemessen und prozentual verglichen mit den im Drucktopf behandelten Kontrollproben. Dabei ergaben sich die folgenden Versuchsergebnisse:

Einwirkungszeit	Indikator	- A	25	Bakterien/gr
	Volumen	10,	3	Plattenzählung
	Milliliter	7,	9
23	0,3	121	2,57 x 105 *
23	1,0		2,2 χ 105
	309849/

33	O	,3	15	,3*
33	1	,0	16	,3
45	1	,0	19	,5*

²^ Durchschnitt aus drei Proben.

Hierzu sei bemerkt, daß eine prozentuale Durchlässigkeit von 10 % oder mehr von einem ungeübten Auge feststellbar ist und leicht durch Verwendung einer Parbvergleichskarte bestimmt werden kann« Der Wachstumsdetektor nach der Erfindung läßt sich also für die Peststellung mikrobiologischen Wachstums bei Bakteriendichten unter 10 Bakterien pro Gramm verwenden. Dies zeigt auch, daß derartige Bestimmungen in weniger als 2k Stunden nach dem Auftreten der Verseuchung durchgeführt werden können, so daß sich die Erfindung in vielen Nahrungsmittelfabriken zur Qualitätskontrolle überall dort anwenden läßt, wo nur eine begrenzte Prüfzeit zur Verfügung steht.

Beispiel_9 . .

Es wurden k Membranumhüllungen hergestellt aus einem Kunststoff i Im -Laminat mit einer Polyesterschicht von 12 Mikron Dicke und einer Polyäthylenschicht von 50 Mikron Dicke. Die Umhüllung wurde mit 0,04 prozentiger ARS-Lösung gefüllt gemäß den unten stehenden Daten.

Code Volumen und pH-Wert Oberfläche (mm )

3-60 0,3 ml., 6,0 ' 350

3-62 0,3 ml., 6,2 350

1-60 1,0 ml., 6,0 950

1-62 1,0 ml., 6,2 950

Diese Umhüllungen wurden sodann getrennt in jeweils eine 250 Milliliter Seitenarmflasche gehängt,,welche 3,3 Gramm

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gepulvertes Kalziumkarbonat enthielt. Die Flaschen wurden mit Gummistopfen verschlossen und durch den Seitenarm evakuiert während 10 Minuten (20 Liter/min, 0,7 c.f.m.). Nach der Evakuierung wurden 18 Milliliter- verdünnte Schwefelsäure (hergestellt aus 30 Milliliter konzentrierter Schwefelsäure verdünnt mit 500 Milliliter destilliertem Wasser)langsam mit einer Injektionsnadel aus einer Injektionsspritze durch den Seitenarmverschluß in jede Flasche gegeben. Falls angebracht, wurde ein positiver Druck von dem erzeugten Kohlendioxid durch Lockern des oberen Stopfens der Flasche, abgelassen. Wenn die Erzeugung von Kohlendioxid aufgehört hatte, wurden die Stopfen wieder festgedrückt und ein Gummiband als Sicherung herumgelegt und dienten als ein verbessertes Sicherheitsventil. Da Kohlendioxid schwerer als Luft ist, waren die Flaschen mit Kohlendloxidgas gesättigt. Sämtliche Flaschen wurden sodann bei Raumtemperatur (22 - 25° C) gehalten und die Zeit bis zum Farbumschlag gemessen. Die Werte sind:
Code ' Zeit bis zum Farbumschlag

3-60 186 Min.,

3-62 ' beendet nach 96 Stunden, kein Umschlag.

1-60 ' Etwa 3,5 Tage,

1-62 beendet nach 96 Stunden, kein Umschlag

Identische Versuche wurden ausgeführt, jedoch mit einer Umhüllung aus einem Kunststoffilm-Laminat, wobei die Dicke der Polyesterschicht etwa 11,5 Mikron und die Dicke der Polyäthylenschicht· etwa 3*f Mikron betrug. Die Werte sind: Code Zeit bis zum Farbumschlag

3-60 65 Min.

3-62 69 Min.

1-60 315 Min.

i-62 351 Min.

Ein Vergleich dieser Zeiten zwischen den Wachstumsdetektoren

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25 2326029

mit verschiedenen Umhüllungen zeigt deutlich, daß Kohlendioxid wesentlich langsamer durch das dickere Material diffundiert, so daß dieses nur ungünstig oder nicht verwendbar ist als mikrobiologischer Wachstumsdetektor.

Beispiel_10

Hühnerfleisch mit Gemüse, eine Babynahrung mit hohem Eiweißgehalt, wurde als Grundlage für das Wachstum von Bakterien des Typs Salmonella typhimurium verwendet. Es wurden 16 Gläser bereitet mit etwa 90 Gramm des Nahrungsmittels, wobei 15 cnr im oberen Teil des Raumes in vier Bereiche zu vier Einheiten eingeteilt wurde. Jedes der Gläser wurde mit 0,52 Bakterienzellen pro Gramm (insgesamt 46_S8 Zellen pro Glas) geimpft. Vor dem Verschließen wurde ein Wachstumsdetektor mit einer Umhüllung aus 10 Mikron starker Polyesterfolie und 50 Mikron starker Polyäthylenfolie und gefüllt mit 0,04 prozentiger ARS-Lösung mit einem pH-Wert von 6,0 bzw. 6,2 und einem Volumen von 0,3 bzw. 1,0 Milliliter in jedes Glas gelegt. Sämtliche Gläser wurden sodann bei der Umgebungstemperatur von 20 bis 25° C belassen".

Nach 120 Stunden zeigte lediglich der Wachstumsdetektor mit einem Volumen von 0,3 ml und einem pH-Wert von 6,0 einen Farbumschlag nach gelb, wobei die anschließende Bakfeerienauszählung 9,2 χ 10' Organismen pro Gramm ergab. Selbst nach 15 Tagen zeigte sich bei den übrigen Proben noch kein endgültiger Farbumschlag nach gelb.

Hingegen zeigte sich bei Verwendung dünnerer Folie, und zwar einer Polyesterfolie von 10 Mikron Dicke und einer Polyäthylenfolie von 40 Mikron Dicke bei Verwendung der gleichen ARS-Lösung und ähnlich behandelter Nahrungsmittel, jedoch nur mit einem Viertel der Bakterien vom Typ Salmonella typhimurium geimpft, schon nach 5 bis 8 Tagen ein hundertprozentiger Farbumschlag von rot nach gelb. Da selbst in

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15 Tagen lediglich 6 Prozent der Wachstumsdetektoren ( 1/16) mit den dickeren Folien selbst bei höheren Ausgangskonzentrationen der Bakterienimpfung keinen Farbumschlag zeigten, ist ersichtlich, daß die Verwendung einer 12,5 dicken Polyesterschicht in Verbindung mit einer 50 Mikron dicken Polyäthylenschicht als Umhüllung und einer Indikatorlösung von 0,04 prozentiger ARS-Lösung mit einem pH-Wert von 6,0 oder höher in einem Volumen 1,0 Milliliter und bei einer Oberfläche

von 1000 mm keine befriedigenden Ergebnisse zum Sichtbarmachen verdorbener Lebensmittel bringt.

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Claims (13)

1. Patentansprüche

   Mikrobiologischer Wachstumsdetektor zum Einbetten in eine mikrobiologische Wachstumssubstanz und zur visuellen Anzeige eines mikrobiologischen Wachstums in derselben, gekennzeichnet 'durch eine Indikatorlösung, die von Stoffwechsel-Nebenprodukten des mikrobiologischen Wachstums verfärbt wird, und durch eine für Basen und Säuren undurchlässige, für das Stoffwechsel-Nebenprodukt jedoch durchlässige Umhüllung für die Indikatorlösung.
2. 2. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Umhüllung aus transparentem Kunststoff besteht.
3. 3. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch- die Verwendung einer auf Kohlendioxid ansprechenden Indikatorlösung.
4. 4. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Umhüllung eine

   .Wasserdurchlaßgeschwindigkeit von maximal 60 Milligramm

   ρ "

   pro m und h aufweist.
5. 5. Wachstumsdetektor nach Anspruch 2 bis A, dadurch gekennzeichnet , daß die Umhüllung ein Laminat ist mit einer Polyäthylenterephthalatfolie von etwa 10 Mikron Stärke.

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6. 6. Wachstumsdetektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die andere .Schicht des Laminats eine Folie aus -Polyethylen oder Polypropylen ist.
7. 7. Wachstumsdetektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die andere Schicht aus Polyäthylen mittlerer Dichte besteht und eine Dicke von etwa 38 Mikron aufweist.
8. 8. Wachstumsdetektor nach Anspruch JL bis 7, dadurch

   gekennzeichnet , daß die aktive Oberfläche

   2 -

   - der Umhüllung etwa 1000 mm beträgt.
9. 9. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet durch Alizarin Rot S, Bromcresol Grün oder Bromcresol Purpur als Indikator.
10. 10. Wachstumsdetektor nach Anspruch 9.. dadurch gekennzeichnet , daß die Indikatorlösung 0,0^J Prozent Alizarin Rot S enthält.
11. 11. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 bis 10, dadurch geke.η nze. lehnet , daß die Indikatorlösung 30 bis 90 Volumenprozent Glyzerin enthält.
12. 12. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 bis 11, dadurch geken η zeichnet , daß der pH-Wert der Indikatorlösung etwa 6,0 beträgt.
13. 13. Wachstumsdetektor nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß die Indikatorlösung 0,01 bis 0,08 Prozent Alizarin Rot S enthält.

    lh. Wachstumsdetektor nach Anspruch 1 bis 14, gekennzeichnet durch eine feste Indikatorsubstanz.

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