DE2233844A1

DE2233844A1 - Verfahren und vorrichtungen zur geschlechtsbeeinflussung der nachkommen durch trennung der x- von den y-chromosomtragenden spermien von saeugetieren

Info

Publication number: DE2233844A1
Application number: DE2233844A
Authority: DE
Inventors: Joerg Knaack
Original assignee: VVB TIERZUCHT PARETZ
Current assignee: VVB TIERZUCHT PARETZ
Priority date: 1971-08-04
Filing date: 1972-07-10
Publication date: 1973-03-22
Also published as: FR2186832A5; DD100380A3; AT323463B; NL7210395A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vorrichtungen zur Geschlechtsbeeinflussung der Nachkommen durch Trennung der X- von den Y- chromosomtragenden Spermien

von Säugetieren.

Bekannt sind Verfahren zur !Trennung der X- von den Y-chromosomtragenden Spermien, bei denen mittels Zentrifugation, Sedimentation, Flotation oder Elektrophorese eine experimentelle Trennung der verschiedenen Spermientypen versucht wurde, ferner sind Versuche "bekannt, bei denen mit Wirkstoffen eine Geschlechtsbeeinflussung auf biochemischem Wege oder durch die Kombination mehrerer Trennungsverfahren angestrebt wurde.

Nachteil dieser bekannten Verfahren ist, daß eine Geschlechtsbeeinflussung über die Trennung der geschlechts-

spezifischen Spermientypen oder sonstige Einflußnahme auf den tierischen Organismus nicht in ausreichendem Maße gelang. Die erzielten Abweichungen vom Standardgeschlechtsverhältnis (50 io zu 50*$) waren zu gering. Bei Wiederholung der bekannten Verfahren und "bekannter Laborversuche gab es keine sicheren Ergebnisse einer Ge-Bchlechtsverschiebung. Andere bekannte Verfahren sind überhaupt nicht reproduzierbar. Alle Verfahren ließen sich bisher nicht in die Praxis übertragen. Weiter wurde bei allen Verfahren nach der Isolierung der geschlechtsspezif'ischen Spermientypen eine Verminderung der Pertilität der Spermien beobachtet.

Die Ursachen hierfür liegen in den bisher, zur Anwendung gekommenen Verfahren und den verwendeten Vorrichtungen selbst.

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Außerdem sind alle bekannten Verfahren und die Handhabung der bekannten Vorrichtungen arbeitsaufwendig und kompliziert, βο da3 sie für eine industriemäßige Benutzung nicht in Betracht kommen. Ein weitererNacuteil wird in den sehr aufwendigen Aufbereitungstechniken, der für die einzelnen Trennungsverfahren erforderlichen Medien, gesehen.

Der Zweck der Erfindung besteht darin, der landwirtschaft ein gut reproduzierbares Verfahren und Vorrichtungen zur willkürlichen Geschlechtsbeeinflussung von Säugetiernachkommen zur Verfugung zu stellen. Durch eine gerichtete Geschlechtsbestimmung werden bei der Produktion von und mit Säugetieren bedeutende volkswirtschaftliche Möglichkeiten erschlossen. Mit der Vergrößerung der Selektionsbasis sowohl bei männlichen als auch bsi weiblichen Tieren kann die Selektionsintensität erhöht und der aüchterische Fortschritt in einem kürzeren Zeitraum verwirklicht werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Mangel und Nachteile der bekannten Verfahren und Vorrichtungen zu beseitigen, indem ein Verfahren und Vorrichtungen zur Trennung der X- von den Y- chromosomtragenden Sperraien im Ejjakulat eines Säugetiers zur Verfugung gestellt werden, bei deren Anwendung die Befruchtungsfähigkeit der Spermien erhalten bleibt und durch die Verwendung vorteilhafter Zusammensetzungen der Trennungsmedien der gewünschte Trennungseffekt der Spermientypen dabei wesentlich begünstigt wird.

Es wurde ein Verfahren zur Geaohleohtsbeeinflussung durch Trennung der X- von den Y- chromosomtragenden Spermien gefunden, bei dem durch die Verdünnung des Spermas mit einem Medium geringer lonanstärk© und geringer fähigkeit eine Trennung in zwei Chargen mittels

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elektrischer Kräfte und chemiacher Einwirkungen durchführbar ist. Weiterhin wurde gefunden, daß das Sperma auch in nativem oder unverdünntem Zustand mittels elektrischer Kräfte trennbar ist. In beiden Fällen enthalten jeweils bestimmte Chargen die Spermien vom Y-Typ und andere Chargen die Spermien vom X-Typ. Auf diesem Weje wird Sperma von Säugetieren wie Rinder, Schafe, Pferde, Schweine, Kaninchen und Ziegen getrennt. Dieser Trennungsvorgang wird dadurch erreicht, daß in vorteilhafter Weise in erfindungsgemäßen Apparaturen zu trennende Spermienpopulationen kontinuierlich an Elektroden vorbeigeführt werden und daß die Trennung weiterhin durch ein Magnetfeld und Medien, in denen die Spermien sich während de3 Trennungsvorganges befinden, begünstigt wird.

Die Erfindung wird nachstehend an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die zugehörigen Zeichnungen zeigen:

Figur 1: eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Trennung bei Verwendung von Trennmedien,

Figur 2: eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Trennung bei Verwendung von Trägermedien.

Beispiel 1:

Es wurde gefunden, daß die beiden Spermientypen der Säugetiere auf der Grundlage ihres Volumendimorphismus und ihrer elektrisch negativen Membranoberflächenladung voneinander trennbar sind, wenn die Spermien durch ein hohes elektrostatisches und hohes magnetisches Feld strömen. Für die Abweichung geladener Partikel von der geraden Bahn durch ein elektrisches Feld kommt die nachfolgende Näherung zur Anwendung:

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QE QE Q

χ — .-, t — »·'* zj^ . " K,

'ClJJ-. V ² 3 /V_K ^l

Hierin ist;

t = Zeit

Q = ladung des Partikels

K = Konstanten

Ξ = Elektrische Feldstärke

r„ - Radius des Partikels

Lr - Volumen des Partikels

γ> = Viskosität des Suspensionsmittels

Υ = Wegstrecke

t hängt von der Strömungsgeschwindigkeit ab und ist konstant.

Die Trennung der Spermientypen hängt vom Volumendimorphismus und der Streuung der ladung ab. Bisherige Messungen und die praktischen Ergebnisse ergaben, daß die Ladung aller Spermien gleich, jedoch ein meßbarer Volumendimorphismus nachweisbar ist. Die Reinheit der Trennung ist somit nur von der Streuung der Volumina abhängig. Das Anwendungsbeispiel bezieht sich in der Berechnung auf eine Kugelgestalt der Partikel. Bei der realen Gestalt der Spermien weichen die Ergebnisse nicht wesentlich von den errechneten ab. Es wurde gefunden, daß bei völligem Fehlen der Bewegungsfähigkeit der Spermien eine Trennung in voluraendifferente Spermientypen durchführbar ist und daß diese nach Besamung ein unterschiedliches Geschlechtsverhältnia ergeben. Die Zellgröße sowie das Volumen der Spermien ist der Fähigkeit, das betreffende Gesohlecht zu determinieren, direkt proportional,

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An das Ejakulat werden folgende raikro- und makroakopisohe Minimalforderungen gestellt:

V (Volumen) = 2,0 ml

V ?o (Vorwärtabeweglichkeit) = 60

M (Massenbewegung) - nicht unter ++ Spermienkonzentration: 10 A{ 1"

Nach einer mik.ro- und makroskopiaohen Untersuchung mit an sich bekannten Methoden werden zur Durchfuhrung des Verfahrens die Spermienpopulationen mit einem Medium mit einer Dichte zwischen 1,00 und 1,300 g χ cm ^J und einer-Viskosität von»= <5,00 cP, gemessen bei 20⁰C, verdünnt. Anschließend erfolgt die Kühlung der verdünnten Spermienpopulation auf -2⁰O. Diese Temperatur wird während des Trennungsvorganges in den Vorrichtungen beibehalten. Nach Versetzen mit einem Trennungs- oder Trägermedium strömen die Spermienpopulationen bei konstantem Druck oder Sog durch ein elektrisches und magnetisches Feld, um die geschlechtsspezifischen Spermientypen zu isolieren. Nach einer Äquilibrierungszeit erfolgt die Pelletierung der gesahlechtsspezifischen Spermientypen.

Die Trennungs- oder Trägermedien sind isotonische Flüssigkeiten geringer Leitfähigkeit, geringer Ionenstärke, von hohem spezifischen Widerstand und mit einem pH-Wert zwischen 5,8 und 6,8 bei 2 O⁰O. Die Medien sind inagesamt so beschaffen, daß sie die Befruchtungsfähigkeit der Spermien nicht beeinträchtigen und nach erfolgter Trennung der Populationen in gGschlechtsapezlfisahe Spermientypen eine Pelletierung der Fraktionen ermöglichen. Bevorzugt werden Kombinationen von Laktose - Eidotter - Glyzin - Glyzerin-Lösungen.

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Die Kühlung der Spermaauspension erfolgt stufenweise. Das verdünnte Sperma wird in einer Kühlzelle oder in einem Kühlschrank auf + 5⁰G "bis + 3⁰O gekühlt. Nach Vorkühlung der Tennungsapparatur auf - 2⁰O erfolgt die Füllung derselben.

Beträgt die Temperatur der Suspension im Trennungsapparat - 2⁰O, werden die elektrostatischen und magnetischen Felder angelegt und die Ablenkung der Spermientypen beginnt. Das mit Träger- oder Trennungsmedien versetzte Sperma strömt mit konstanter Geschwindigkeit und unter gleichbleibenden Druckverhältnissen durch die Trennungsapparatur und wird durch Ablenkbügel und Diaphragmen so an den Elektroden vorbeigeleitet, daß keine Turbulenz entsteht. Die parallel zur Strömungsrichtung liegenden Elektroden erzeugen ein hohes elektrostatisches Feld mit einer Feldstärke von vorzugsweise >50 ?. cm-

Dieses elektrostatische Feld verursacht die Ablenkung der verschiedenen Spermientypen* Ein anschließendes homogenes Magnetfeld mit einer magnetischen Feldstärke von >15000 Gauß erhöht die Aktivität der Spermien und sorgt für die Resttrennung.

Die von der geraden Bahn abgelenkten geladenen Partikel werden in mehrere Kapillaren geleitet und getrennt nach X- und Y- chromosomtragenden Spermien aufgefangen und gesammelt. Das Trennungs- oder fPrägermedium und die indifferenten Spermien fließen in gerader Richtung aus der Trennungsapparatur heraus.

Die Zeit der Trennung kann zwisohen 60 und 3600 see. variieren. Kürzere JFr ennungasr it en verringern den Reinheitsgrad der Fraktionen»

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Das während der Trennung vorhandene hohe elektrostatische und das hohe magnetische Feld und die Temperatur von - 2⁰C beeinträchtigen die Fertilität der Spermien nicht.

Für die Ermittlung des Volumendimorphismus werden 0,2 /u 1 getrenntes Sperma entnommen. Das Volumen der Spermientypen wird mit einem bekannten elektronischen Impulszähigerät ermittelt. Beträgt der Volumenunterschied zwischen den X- und Y- chromosomtragenden Spermientypen mehr als 10 #, so sind die Fraktionen für die Besamung geeignet. Je größer die ermittelte Volumendifferenz, je höher ist der Reinheitsgrad der Trennung. Gleichzeitig wird die Spermienkonzentration ermittelt. Es werden J · 10 /M 1 gefordert. Sind diese Bedingungen erfüllt, erfolgt nach vier "bis fünf Stunden Äquilibrierungszeit die Pelletierung der getrennten Fraktionen.

Beispiel 2:

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Trennung von Spermienpopulationen in X- und Y- ohromosomtragende Spermientypen bei Verwendung von einem Trennmedium.

Frisch e Okuliertes Sperma wird mit einem Trennungsmedium auf eine Konzentration von 3 · 10 //i 1 ver dünnt. Diese Spermasuspension wird nach Kühlung und Vorkühlung der Trennungsvorrichtung über einen Einfüll stutzen 3 in ein Trennrohr 1, welohes von einem Wassermantel 2 umgeben ist, geleitet.

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Ein von einem Synchronmotor angetriebener Kolben 6 bewegt die Spermiensuspension bei konstanter Strömungsgeschwindigkeit und konstantem Druok durch den Innenraum 9 des Trennrohres 1 hin zu einer Kapillare 4. Parallel zu ihrer Längsrichtung sind um die Kapillare 4 Elektroden 7 zur Erzeugung eines hohen elektronischen Feldes angeordnet. Die Kapillare 4 geht in Strömungsrichtung in ein oder mehrere Y-förmige Endstücke 5 über.

Zur Erzeugung eines hohen magnetischen Feldes am Ende der Kapillare 4 sind - um 90° zur Anordnung der Elektroden 7 versetzt - Elektromagnete 8 angeordnet. Nachdem die Spermiensuspension den Innenraum 9 des Trennrohres 1 verläßt, beginnt in dem elektrostatischen Feld in der eigentlichen Trennungszone 10 die Ablenkung der X- und Y- ehromosomtragenden Sperraientypen von ihrer geraden Bahn. Das anschließende homogene Magnetfeld erhöht die Aktivität der Spermien und sorgt für eine Resttrennung. Die duroh das elektrostatische und magnetische Feld und die begünstigenden Eigenschaften des Trennungsmediums von der geraden Bahn abgewichenen unterschiedlichen Spermientypen verlassen über ein oder mehrere Y-förmige Endstücke 5 die Trennungsvorriohtung und werden in Auffangbehältern gesammelt, einer vier- bis fünfstündigen ÄCLuilibrierungszeit unterzogen und in bekannter Weise pelletiert.

Beispiel 3:

Figur 2 zeigt eine sohematisohe Darstellung einer Vorrichtung zur Trennung von Spermienpopulationen in

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X- und Y- ohromosomtragende Sperraientypen bei Verwendung eines Trägermediums. Frisoh ejakuliertes Sperma wird in bekannter Weise vorverdünnt und gekühlt. Das in Beispiel 1 erwähnte Trägermedium und eine erfindungagemäße Trennungsvorriohtung werden gleichfalls auf die Temperatur der Spermasuspension gekühlt.

In einem Trennrohr 1 sind paarweise Elektroden hinter Diaphragmen 3 aο angeordnet, daß für eine Eingangskapillare 4 zwei oder mehrere Ausgangskapillaren 5 und die zwischen den Diaphragmen 3 strömende,"mit dem Trägermedium versetzte Spermasuspension genügend Spielraum vorhanden ist und zwischen den Diaphragmen 3 keine Turbulenz entsteht. Das Trennrohr 1 ist mit einem Wassermantel 6 umgeben. Zur Erzeugung eines homogenen magnetischen Feldes sind um 90 zur Anordnung der Elektroden 2»versetzt zwei oder mehrere Elektromagnete angeordnet. Aus mit dem Trennrohr 1 in Verbindung stehenden Behältern wird in das Trennrohr 1 das Trägerraedium 7 und über die Eingangskapillare 4 die Spermasuspension bei konstanter Strömungsgeschwindigkeit und konstantem Druck in den Innenraum des Trennrohres 1 geleitet. Zur Vermeidung von Turbulenz und zum Zweck der Stabilisierung der Eingangskapillare 4 sind Ablenkbügel mit den Diaphragmen 3 ifl Verbindung gebracht. Im Innenraum, also zwischen der Eingangskapillare 4 und den Ausgangskapillaren 5, befindet sich die eigentliche Trennungszone 8. Unter den Einwirkungen des elektrostatischen und magnetischen Feldes werden hier die geladenen Partikel von ihrer geraden Bahn abgelenkt.

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Je naoh gewünschtem Reinheitsgrad der zu trennenden X- iuehI Y-chromos eintragenden Spermientypen sind eine Vielzahl von Ausgangskapillaren 5 in ein oder mehreren Ebenen angeordnet. Das indifferente Sperma und daa Trägermedium verlassen in gerader Bahn daa Trennrohr 1. Sind im Innenraum des Trennrohres 1 nur eine geringe Anzahl von Auagangskapillaren 5 angeordnet, so gelangt Restsperma zusammen mit dem Trägermedium und dem indifferenten Sperma in die Zone 9. Durch Anlegen eines zusätzlichen Magnetfeldes kann hier nochmals die Aktivität der Spermien erhöht werden und eine Resttrennung erfolgen. Zu diesem Zwecke werden an das Trennrohr 1 eine Vielzahl in einer Ebene liegender Kapillaren angeordnet. Das so in mehreren Fraktionen gesammelte Sperma wird einer vier- bis fünfstündigen Äquilibrierungszeit unterzogen and in bekannter Weise pelletiert.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gesohleohtsbeeinflussung durch Trennung der X- von den Y-ohromosomtragenden Spermien von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß Spermienpopulationen in nativem oder unverdünntem oder verdünntem Zustand einer an sich "bekannten mikro- und makroskopischen Untersuchung unterzogen, anschließend gekühlt, in Trennungsapparaturen durch elektrostatische und magnetische Felder und unter besonderer biochemischer Einwirkung von Trägerund Trennungsmedien in X- und Y-chromosomtragende Spermien vorgetrennt und getrennt, gesammelt, äq.uilibriert und anschließend pelletiert werden.

2» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es anwendbar ist für die Trennung der Spermien von Säugetieren wie Rinder, Schweine, Schafe, Pferde, Kaninchen und Ziegen.

3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Träger-, Trennungs- und Verdümringsmedien isotonische Flüssigkeiten geringer leitfähigkeit und geringer lonenstärke sind, einen hohen spezifischen Widerstand, eine Viskosität von Yi β < 5,00 oP, gemessen bei 20° 0 und einen pH-Wert zwischen 5,8 und 6,8 bei -20⁰C aufweisen und insgesamt so beschaffen sind, daß die Befruohtungsfähigkeit der Spermien während des Trennungsvorganges und danach nicht beeinträchtigt, die Trennung vorteilhafv beeinflußt wird und die Pelletierung der getrennten Spermientypen gegeben ist.

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4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Trennungs- oder/und Trägermedien versetzten Spermienpopulationen vor dem Einbringen in Trennungsapparaturen auf eine Temperatur unter -1⁰C gekühlt und gleiche Temperatur
während des TrennungsVorganges in und um die Trennungsapparatur besteht und das Gemisch aus Sperma und erwähnten Medien unter konstanter Geschwindigkeit und konstantem Druck durch die Apparaturen
strömt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abweichung der geladenen Spermien von der geraden Bahn durch ein hohes elektrostatisches Feld, mit einer Feldstärke von vorzugs-

_1
weise >50 V . cm , ein homogenes magnetisches

Feld, mit einer Feldstärke von >15,000 Gauß erfolgt und die Abweichung und Trennung durch die erwähnten Medien in Verbindung mit dem Einfluß der elektrostatischen und homogenen Magnetfelder begünstigt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in unterschiedliche Spermientypen bereits getrennten oder vorgetrennten Fraktionen durch Anbringen eines weiteren Magnetfeldes nochmals aktiviert und so einer Resttrennung unterzogen werden.

7. Verfahren nach den Anöprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der TrennungsVorgang zwischen

60 und 3ο600 see. variiert und di« erhaltenen Fraktionen eine* vier- biß fünfstündigen Ägjuilibrierungszeit unterzogen werden.

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8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger- oder Trennungsniedien so mit konstanter Geschwindigkeit und gleichbleibendem Druck in die Trennunggvorrichtungen ein- und durch diese hindurohströmen und die Innenräume der Trennungsvorrichtungen in vorteilhafter Weise so gestaltet sind, daß keine Turbulenz der Suspensionen entsteht.

9. Vorrichtung zur Geschlechtabeeinflussung durch Trennung der X- von den Y-chromosomtragenden Spermien von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Trennrohr (1), das von einem Wassermantel (2) umgeben ist, in seinen Innenraum (9) ein Einfüllstutzen

(3) führt und von dem Innenraum (9) eine Kapillare

(4) herausführt und diese in ein oder mehrere Y-förmige Endstücke (5) übergeht und um die Kapillare (4) Elektroden (7) und E-Magnete (8) und im Innenraum (9) ein über Synchronmotor bewegbarer Kolben (6) angeordnet sind.

10. Vorrichtung zur Geschlechtsbeeinflussung durch Trennung der X- von den Y-chromosomtragenderi Spermien von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Trennrohr (1), Elektroden (2) hinter Diaphragmen (3) und zwischen diesen, das Ende einer Eingangskapillare (4) und eine Vielzahl von Ausgangskapillaren (5) angeordnet sind, das Trennrohr (1) von einenTWassermantel (6) und um 90° versetzt zur Anordnung der Elektroden (2) von Ε-Magneten umgeben ist.