DE2206085B2

DE2206085B2 - Verfahren zur automatischen identifizierung, auszaehlung und groessenbestimmung der verschiedenen zellen in koerperfluessigkeiten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2206085B2
Application number: DE19722206085
Authority: DE
Inventors: Irving M. Dr. Columbia; Trowe Neil M.; Clemens Jules R.; Potomac; Stillman Md. (V.St.A.)
Original assignee: Wheeler International, Inc., Washington, D.C
Priority date: 1971-02-10
Filing date: 1972-02-09
Publication date: 1976-04-22
Also published as: DE2206085A1; SU682157A3; IT980984B; CA968989A; NL7201733A; FR2126813A5; JPS5414957B1; SE395359B; US3864571A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Identifizierung, Auszählung und Größenbestif7imung der verschiedenen Zellen in Körperflüssigkeiten, der ein fluorchromatischer Farbstoff zugegeben wird, der bei Primärbestrahlung mit einer Strahlungsquelle hoher Energie in Abhängigkeit von den zellularen Materialien eine charakteristische Sekundärfluoreszenz-Strahlung aussendet, die mittels Strahlungsdetektoren aufgefangen und gemessen wird und zur Unterscheidung der einzelnen Zellen dient.

Desweiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens.

Veränderungen der Gesamtanzahl der Leukocyten und ihrer relativen Größen sind von beträchtlicher Bedeutung für einen Arzt, da sie Maßangaben für

die Reaktion des Körpers gegen schädliche Agenzien darstellen. In vielen Fällen ist es möglich, auf Grund der Veränderungen der Quantitäten spezifischer Leukocyten, das beeinflussende Agens zu identifizieren. Es ist deshalb von zunehmender Wichtigkeit, in der Lage zu sein, schnelle und genaue Untersuchungen von Körperflüssigkeiten, besonders hinsichtlich weißer Blutzellen, durchzuführen Während übliche Methoden entwickelt wurden, um Hämatrocyten, Hämoglobin und Gesamt-Leukocyten-Beträge auf eine

schnelle und einigermaßen genaue, halbautomatische Weise durchzuführen, wobei die Methode zur Identifizierung und zur genauen Zählung jeder der verschiedenen Leukocylen-Typen ein vorwiegend manuell durchgeführtes Verfahren ist.

Bei den gegenwärtig durchgeführten Verfahren zur Zählung der Leukocylen wird ein Blut-Film auf einen Mikroskop-Objektträger aufgetragen, indem ein Tropfen frischen, nicht zersetzten Bluts benutzt wird. Die Probe wird mit Wright's-Farbstoff eingefärbt und

zur Betrachtung unter einem Mikroskop eingetrocknet. Die verschiedenen Leukocyten-Typen stellen verschiedene Erscheinungsformen bei der Beleuchtung mit weißem Licht und bei Betrachtung unter einem Mikroskop dar, so dab ein geübter Techniker in der

Lage ist, eine individuelle Zählung jedes Zeil-Typs durch visuelle Identifikation der verschiedenen Leukocylen vorzunehmen. Normalerweise wird auf diese Art eine Summe von 100 Leukocyten in einem Flüssigkeitstropfen gezählt, der aus einer größeren

Probe stammt, die dem Patienten entnommen wurde. Die Quantität jedes ausgezählten Zelltyps wird als Anteil der Summe von 100 gezählten Zellen ausgedrückt, selbst wenn der normale Zellen-Zählbetrag 4000 bis 11 000 Zellen/mm³ beträgt. Wenn man vor-

aussetzt, daß der Flüssigkeitstropfen, der zum Auftragen auf den Objektträger gebracht wird, vor gleichförmiger Gestalt ist, ist es zwingend nötig, daß eier präparierte Auftrag auf solche Weise hergestelll

wird, daß der Auftrag bis zur Dicke einer Zelle auseinanderlauft. Dabei muß Sorge getragen werden, daß der Auftrag nicht den Rand des Objektträgers erreicht. Wenn dies nämlich eintritt, werden die großen Zellen am Rand des Auftrags und die kleineren Zellen in der Mitte des Auftrags konzentriert sein. Eine genaue Auszählung eines Auftrags dieser Art ist schwierig. Auch beim Einfärben selbst können sich viele Fehler ergeben. Einer der häufigsten Fehler besteht darin, einen Puffer für das Färben zu benutzen, der entweder zu alkalisch oder zu sauer ist. Das Puffer-Färbemittel-Gemisch muß nämlich neutral sein. Wenn der Puffer entweder zu sauer oder zu alkalisch ist, ist die Möglichkeit der Bestimmung der Morphologie der Leukocyten in großem Maß vermindert in Folge der uneinheitlichen Einfärbung des Kerns. Diese manuelle Methode erfordert ungefähr 15 min und ist Gegenstand vieler anderer Fehler in der Weise, daß die abschließende Auszählung nur innerhalb von J 25"/o genau ist, selbst wenn sie sogar von einem experimentell erfahrenen Pathologen durchgeführt wird.

Zur Automatisierung dieses Auszählverfahrens ist dafür der sogenannte »Technikon-Prozeß« entwickelt worden, der die Lichtabsorptionscharaktcrisliken der Zellen ausnutzt. Bei diesem Verfahren wird das Blut durch vier getrennte Kanäle in ein Umlauf-Fluß-System geleitet. In jedem der Kanäle wird ein anderer Farbstoff eingeführt. Dieser Farbstoff wird von den verschiedenen Zellen aufgenommen, und der Betrag des durch die Zellen geleiteten Lichts wird mit dem Betrag des Lichts verglichen, der durch reines Äthylen-Glykol hindurchgeht. Auf diese Weise ist es möglich, die meisten der Leukocyten zu identifizieren, mit Ausnahme der Lymphocyten. für die ein besonderes Untersuchungsverfahren erforderlich ist. Die Neutrophilen unterscheiden sich beim Untersuchen außerdem von den Eosinophilen durch ihren relativen Säuregehalt. Um die Leukocytcn-Zählung in eine brauchbare Form zu bringen, werden bei diesem erwähnten Verfahren eine Summe von 10 000 Zellen gezählt und alle Leukocyten, je nach Typ, in Anteile (Prozentsätzen) erfaßt. Diese Geräte dafür sind aufwendig, teuer und kompliziert im Vergleich zur gegenwärtig üblichen manuellen Methode. Ihre hauptsächliche Nützlichkeit besteht in ihrer größeren Kapazität und ihrer größeren Uiiici>uuiung>geschwindigkeit.

Durch die USA.-Patcntschrift 34 97 690 ist ein Verfahren zur Zählung und Erfassung von biologischen Zellen, insbesondere Körperzellen, bekanntgeworden, die mittels eines fluorchromatischen Farbstoffs eingefärbt werden, danach mit einer Strahlungsquelle bestrahlt werden und die Sekundärstrahlen-Emission der Zellen zur Identifizierung derselben aufgefangen wird. Als fluorchromatischer Farbstoff wird dabei Acridin-Orange oder Euchrysin verwendet. Die Zellgröße wird dabei fotoelektrisch durch einen sogenarntcn Streueffekt bestimmt, wobei die Sekundärst!ahlen-Emission nur integral aufgefangen wird. Alternativ dazu kann die Zellgröße auch durch die Messung der Änderung des elektrischen Widerstands der Zellen mittels FcrnschabtasttechnikcTi bestimmt werden. Die elektrischen Signale werden danach mittels eines Computers verarbeitet und die dazugehörigen Zellen bestimmt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren der eincancs ccnanntcn Gatlunc zu schaffen, bei dem zur Identifizierung. Auszählung und Glutenbestimmung der einzelnen Zellen nur deren Sekundärstrahlcn-Emission verwendet wird, wobei jede einzelne Zelle bestimmt werden kann.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht darin, daß erfindungsgemäß die Zellen einer cingcfärbtcn Probe von mindestens 1 mm' Körperflüssigkeit in eine Einzelzell-Aiiordnung hintereinander ausgerichtet werden und eine Relativbewegung der Körperflüssigkeit

ίο bezüglich der Strahlungsquelle erzeugt wird, die mindenstens eine vereinigte, co-planare Slrahlungs-Mcßeinrichtung aufweist und eine Strahlung der Wellenlänge zwischen 0.30 und 30 u aussendet, wobei die einzelnen Zellen während ihrer Hintcreinandcr-An-Ordnung und ihrer Relativbewegung bestrahlt und die Sekundärstrahlung fortlaufend aufgefangen wird, die von den sub-zellularen Materialien jeder Zelle ausgesandt wird, diese Werte für jede Zelle an eine Logik-Einrichtung weitcrgclcitcl werden, in der die

no Zelle auf der Basis ihrer Gcsamtgestalt und der relativen Beträge des sub-zellularcn Materials bestimmt wird, für jeden Leukocyten-Typ eine separate Zelleinrichtung in Tätigkeit gesetzt wird, wenn ein Leukocyte eines bestimmten Typs auf die erwähnte Wcise identifiziert ist und die vorerwähnten Schritte wiederholt werden, bis im wesentlichen alle Leukocyten in der Probe den co-planaren Strahlungsdetektor passiert haben und identifiziert sind.

Weitere erfindungsgemäße Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Untcransprüchen 2 bis 8 gekennzeichnet.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Strahlenquelle, z. B. in Form einer Quecksilberdampflampe "oder einer Lichtquelle, ein Trichterrohr, ein Betätigungsventil, einen Durchfluß-Mengenregler, eine Pumpe, ein Kapillar-Rohr mit einer Meßkammer, ein Linsensystem, mehrere Fotodetektoren, einen Digitalzähkir, einen oder mehrere Filter und eine Druckeinrichtung aufweist.

Weitere erfindungsgemäße Ausgestaltungen dei Vorrichtung sind in den Unieransprüchcn H) bis 2S gekennzeichnet.

In vorteilhafter Weise ist es bei der Anwendung des crfindungsgemäuen Verfahrens und der Vorrichtung möglich, bei der Untersuchung einer flüssiger Rlniprr\lir> unwohl automatisch irden Tvn wriRei Blutzcllen zu identifizieren als auch genaue Zählun gen aller Lymphocyien, polymorphonuklearer Neu trophile, Eosinophile, Monocytcr, und Basophile (dii 5 Grundtypen der Leukocyten oder weißen Blutzel len) vorzunehmen, wobei als zusätzlicher Vorteil eini Auszählung der Blut-Plateletten als auch eine Aus zählung der Rcticulocyten (frische jugendliche rot Zellen) möglich ist. Desweitcren ist es vorteilhafter weise möglich, die Größe einer jeden Zelle zu be stimmen.

Im einzelnen hat sich gezeigt, daß die verschiede nen, genannten Leukocyten-Typen sich mit einer fluoreszierenden Farbstoff, wie z. B. Acridin-Oranci verbinden. Nach dem, Einfärben zeigt dann das Nu klear-Maierial dieser Zellen, nämlich jedes cytopla« matische Körnchen (ebenso wie die Nuclcoli un Vakuolen) und die Blut-PlatcleUcn ihr eigenes, ehr rakteristisches Fluoreszieren, wenn es einer UHn violctt-Bestrahlung ausgesetzt wird. Die Korpuskel (weiße Zellen oder Platcletten) senden entweder mi nochromatische oder polychromatische Fluoreszein

Strahlung aus. Die Lympliocyten. Monoeyten und Platclettcn zeigen in erster Linie monochromatische Eigenschaft, während die Granulocytcn einschließlich der Neutrophilen, Eosinophilcn. Basophilen und der unentwickelten Zellen, ebenso wie einige abnorme Zellen polychromatisch fluoreszieren. Wenn das Nuklcar-Material dieser Zellen mit einem Fluoreszcnz-Farbstoff, wie z. B. Acridin-Orange, eingefärbt und einer LJllraviolclt-Lichtquelle ausgesetzt wird, zeigt es spezifische Ausstrahlungen im Wellenlängenbercich zwischen 0,4 und 0,6 u und das cytoplasmatische Material zwischen 0,6 und 0,7 <<. Andere Farbstoffe und Strahlenquellen ergeben Emissionen im Wellenlängenbereich zwischen 0,3 und 30 u, vorausgesetzt daß die Strahlenquelle mit kleinerer Wellenlänge, als denen der erwähnten strahlt, und daß das Energieniveau ausreichend hoch ist, um die Moleküle innerhalb der Zellen anzuregen.

Weiterhin hat sich gezeigt, daß die Messung der Zeit für das Auftreten einer jeden der Fluoreszenz-Strahlungs-Wellcnlängc ein Maß für den Zcll-Durchmesser und die Quantität der Fluoreszenz-Energie bildet, die von spezifischen Teilen der Zelle abgestrahlt wird. Durch Vergleichen dieser Werte miteinander und mit dem gesamten Zeil-Durchmesser ist es möglich, jeden der vorerwähnten Zeil-Typen auf schnelle, genaue Weise, und zwar automatisch, zu unterscheiden.

Ein weiterer Voricil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, daß diese automatisch die Quantität der Fluoreszenz-Energie mißt, die von den spezifischen Teilen einer Zelle ausgestrahlt werden und daß die Vorrichtung die Zeit des Auftretens dieser Abstrahlungen bestimmt. Während des Erscheinens einer Zelle bestimmt die Gesamtheit der Röhren dieser Ausstrahlungen den Anteil der ausgestrahlten Fluoreszenz einer Teil-Wellenlänge. Ausgehend von diesen Anteilen und dem Zeil-Durchmesser führt die Vorrichtung automatisch eine Bestimmung des Zeil-Typs durch. Dieses Identitätsmcrkmal wird dann eine Zähleinrichtung und anschließend an eine Auswertecinrichtung wcitergeleitet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlich, die vorhandenen Erythrocyten (roten Blutzeilen) zu zerstören, wie z. B. durch Anwendung eines Desinfektionsmittels, da die Erythrocyten mit Ausnahme der Reliculocyten keinerlei Fluoreszenz-Charakteristiken aufweisen.

Weiterhin wurde gefunden, daß Zellen, die sich in flüssigem Zustand befinden, identifiziert und ausgezählt werden können durch Anwendung eines Durchlauf-Prozesses, bei dem die Zellen in Einzelreihe hintereinander den Strahlengang der Strahlungsenergie passieren und Fotodetektoren vorgesehen sind, um die Fluoreszenz-Emissionen einzelner Teile der sich bewegenden Zelle zu messen. Deshalb ist eine Vorbereitungszeit für die Probe effektiv nicht erforderlich, da keine Mikroskop-Objektträger präpariert werden müssen. Eine typische Probe von 1 mm¹ wird in weniger als 30 see, sogar von ungeübten Personen, durchgeführt.

Die Erfindung wird an Hand von Zeichnungen im einzelnen näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 und la eine schcmatischc Darstellung der einzelnen Einrichtungen und der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung,

F i g. 2a, 2b, 2c und 2d drei Ansichten bzw. Schnitte der Meßkammer,

F i g. 3 eine Ansicht der Fotodetektor-Einrichtung, F i g. 4 ein Blockschaltbild des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem Verfahrensschritt, bei dem die Blut-Probe, die so behandelt wurde, daß sie Sekundär-Fluoreszenz ermöglicht, begonnen hat. durch die Meßkammer zu fließen.

F i g. 5a und 5b schematische Darstellungen einer weiteren Ausführungsform eines clektro-optischen Abiastsystems, das benutzt werden kann.

ίο Fig. 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6f und 6g Darstellungen der typischen Leukocyten, die bei dem in der Beschreibung erwähnten Beispiel identifiziert werden, und

F i g. 7a. 7b, 7c und 7d verschiedene Ausführungsformen von Zell-Identifizierungs-Einriehtungen.

Eine Flüssigkeitsprobe wird dem Patienten entnommen, ein oder mehrere Tropfen Färbemittellösung hinzugefügt und gegebenenfalls mit einer Pufferlösung verdünnt. Die Probe wird in eine Misch- und Durchlaufeinrichtung gebracht, die in einer Ausführungsform ein Rohr mit einer außerhalb des Gehäuses angeordneten öffnung aufweist. Innerhalb des Gehäuses verengt sich das Rohr auf einen kleineren Durchmesser von ungefähr 40 //, so daß die einzelncn Korpuskeln einzeln reihenweise hintereinander den Strahlengang einer Strahlungsenergie-Quelle passieren, deren Intensität ausreichend groß ist, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die Fluoreszenz-Emissionen jeder Zelle werden durch geeignete Filter geleitet oder nach einer weiteren Ausführungsform gebündelt und von einem Prisma reflektiert oder mittels eines Beugungsgitters gebrochen, entsprechend den Wellenlängen von jeder der ausgestrahlten Farbe und anschließend von Fotozellen erfaßt. Fotodetekioren, wie z. B. Fotodioden oder Fotoverstärkerzellen werden vorgesehen, um die von Teilen der Zelle beim Vorbeiwandern abgestrahlten Emissionen zu empfancen. Die Wellenlänge der Strahlungen wird erfaßt und die Dauer der Strahlung jeder Welle bei jeder Wellenlänge gemessen. Diese fotoelektrischen Impulse werden dann dazu benutzt, die Korpuskel-Gestalt zu ermitteln. Die Zeiten des Auftretens individueller Wellenlängen werden summiert und diese Beträce als Meßwert der Quantität von Nuklear- und cytoplasmatischer Fluoreszenz benutzt. Die Identifikation jedes Korpuskels wird mit Hilfe von Logik-Kreisen vorgenommen, so daß anschließend an die Identifikation die genaue Zählur.g vorgenommen wird, um die Gesamtsumme zu erhalten. Wenn die Gesamtsumme aller Leukocyten einen Wert von 10 000 erreicht oder sobald eine fixierte Menge der Flüssigkeit (z. B. 1 mm³) getestet ist, werden die Zähleinrichtungen gestoppt und die relativen Anteile jedes Typs automatisch berechnet. Die Plateletten-Zähleinrichtung funktioniert in ähnlichei Weise.

Die Funktion der Strahlungsquellen-Einheit be steht darin, einen intensiven und scharf gebündelter Energie-Strahlengang zu erzeugen, der auf die Meß kammer geworfen wird, so daß die weißen Blutzellei bestrahlt und angeregt werden, zu !uminiszieren wenn sie die Einrichtung passieren. Wie aus Fig.' zu sehen ist, kann diese Einrichtung aus einer Queck silbcrdampflampe 6 zur Erzeugung einer intensive; Ultraviolett-Strahlung bestehen. Das Licht der Lam pe wird gesammelt und von der Sammellinse 7 ge bündelt. Es wird dann durch den Filterleil der Sam mcllinse 7 ccführt, der die Wärme- und alle sichtba

ίο

ren Wellenlängen absorbiert und das Ultraviolett-Licht mit minimaler Schwächung durchläßt. Bei der vorgeschlagenen Vorrichtung gemäß Fig. 5a trifft das Ultraviolett-Licht auf einen Bildformenden Schlitz 65 von ungefähr 0,120 ■ 2,400 mm auf. Dieser Schlitz 65 wird dann auf die Kapillare 63 bzw. auf die Meßkammer 8 fokussiert mittels einer fiOfachcn Fokuslinse 62, die ein Bild von 2 ■ 40 μ erzeugt, und zwar mit der Längsachse des Schlitzes senkrecht zur Achse des Kapillar-Rohrs 5.

Es gibt viele mögliche Energiequellen, die verwendet werden können, um das zellulare Material zum Luminiszieren anzuregen, wie z. B. Wärmestrahlung oder thermische Emission, die durch Heizspulen oder Flammen erzeugt werden. Auch elektrische Flammenbögen können freien Elektronen eine so große Geschwindigkeit verleihen, daß sie aus den Molekülen austreten. Die Bombardierung des Zellularmaterials mit Elektronen oder Ionen, z. B. mit Elektronenkanonen oder Ionen-Beschleunigern, kann dann vorgenommen werden, wenn die Probe als Zielscheibe für energiereiche Elektronenströme dient, die hohe Spannung haben, und/oder es werden große Magnetfelder in einem Vakuum erforderlich, um genügend große Energie-Niveaus zu erzeugen.

Die Bombardierung mit ΛΓ-Strahlen ist theoretisch durchführbar, jedoch ist diese Strahlenquelle zu groß und zu teuer. Große Energie bei einem vernünftigeren Niveau und Art als ^-Strahlen können durch Laser-Strahlen zu Stande kommen.

Jedes (bei Weißglut erzeugte) Licht großer Intensität, das fokussiert werden kann, kann verwendet werden, um ein ausreichendes Energie-Niveau zu gewährleisten für die Absorption durch das Molekül, so daß die Elektronen freigegeben werden, um das Zellmaterial zu bestrahlen. Die bevorzugte Strahlungsquelle ist jedoch Ultraviolett-Licht, das mit Quecksilberdampf- oder Xenon-Lampen erzeugt werden kann, leicht fokussierbar ist und das hauptsächlich im Wellenlängen-Bereich zwischen 0,30 und 0,50 it strahlt, um Fluoreszenzstrahlen zwischen 0,40 und 0,75 /ι bei verschiedenen Materialien zu erzeugen.

Sekundärfiuoreszenz- und -Phosphoreszenz eueugen Luminiszenz mittels elektromagnetischer Strahlungsenergie, vermascht durch die A.bsorption höherer Energie von Strahlungsquellen außerhalb. Wenn die Emission der Absorption der Strahlungsenergie innerhalb 10~⁸sec folgt, so ist sie als Fluoreszenz-Emission chat akterisiert. Wenn die Halbwertzeit (die Zeit, um die Hälfte ihrer Anfangsintensität zu erreichen) größer als 10~⁸sec ist, so ist sie als Phosphoreszenz-Emission charakterisiert.

Fluoreszenz-Techniken können bedeutend sensitiver als Absorptions-Techniken sein. Bei der Absorptions-Spektrometrie wird der Wert log (E/E-I) gemessen, wobei E die Energie des einfallenden Strahls und / die absorbierte Energie bedeuten.

Bei geringen Konzentrationen ist / sehr klein und der log-Betrag nähert sich dem Wert Null, was es schwierig macht, ihn genau zu messen. Bei der Fluoreszenz wird eine Direktmessung der emittierten Strahlung vorgenommen. Da die Fluoreszenzstrahlung mit Wellenlängen erfolgt, die verschieden von denen der Erregungsstrahlung sind, kann die Erregung verstärkt werden, um meßbare Fluoreszenz zu erzeugen. Ein Vergleich der Absorption bei der Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Spektrometrie von C e t ο r e I 1 i unter anderem veröffentlicht im Journal of Chemical Education, Bd. 45, 2 (1968) zeigt die verbesserte Sensitivität der Fluoreszenz-Techniken auf. K a 11 e t und G u r k i η Optical Spectra. Bd. 4, 4 (1970) bezeichnen die Fluoreszenz-Techniken als 1000- bis lOOOOmal sensitiver als Absorptionstechniken.

Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenz ist ihre Spezifizierbarkeit. Während mehrere Materialien

jo Energie bei ähnlichen Wellenlängen absorbieren können, sind sie nicht in der Lage, individuell zu fluoreszieren, sondern fluoreszieren nur, wenn sie vermischt bzw. kombiniert werden, oder sie fluoreszieren mit verschiedenen Wellenlängen. Phosphoreszenz fügt eine weitere Dimension dadurch hinzu, daß der zeitliche Verlauf der Emission auch dazu benutzt werden kann, Emissionen mit gleichen Wellenlängen zu separieren.

Die schematische Verfahrens-Darstellung nach

ίο F i g. 1 enthält die Proben-Einfülleinrichtung, die Durchlaufeinrichtung und eine Auswerte-Einrichtung. Vor dem Einfüllen der Probe werden ein oder mehrere Tropfen des Fluoreszenz-Farbstoffs einem Blut-Sammelrohr zugeführt, das ungefähr 1 ml Blut enthält, das mit einem Anti-Gerinnungsmittel vermischt ist. Beispielsweise wird die Ausgangslösung der Fluoreszenz-Farbe dadurch präpariert, daß 100 mg Acridin-Orange (ein Diaminoacridin) 50 ml Äthylalkohol (Äthanol) zugefügt werden. Die Blut-Probe wird in das Trichterrohr 1 eingefüllt, das in F i g. 1 gezeigt ist, und zwar bis zu 1 mm³. Nach dem Mischen und Vibrieren wird die Probe mittels eines Betätigungsventils 2 entleert. Die Probe wird bis zu einem Betrag durchgezogen, der durch die Einstellung des Durchfluß-Mengenreglers 3 auf der Pumpe 4 bestimmt ist. Die Flüssigkeit wird in das Kapillar-Rohr 5 gedrückt, das einen Durchmesser von ungefähr 40 κ, also nur etwas größer als die größte Zelle, aufweist. Die Probe wird durch das Kapillar-Rohr 5 mit konstanter Geschwindigkeit gedrückt. Die Zellen passieren in Einzelreihe hintereinander die Meßkammer 8, wo jede Zelle am UV-Fokuspunkt vorbeiwandert. Ein abgemessenes Volumen Blut, ζ. Β. 1 mm³, das das Kapillar-Rohr nach unten durchwandert, wird dazu benutzt, um die Anzahl der Leukocyten-Typen/ mm³ 711 bfstimmpn Fin hinlnoisch ahhanbares Benetzungsmittel- und Reinigungsmittel mit speziellen Blut- und Fettlösungsingredienzen wird dann dazu benutzt, das Gerät vor der nächsten Probenuntersuchung zu reinigen. Die Blut- und Waschlösung wird in eine Sammeleinrichtung ausgeleert, die mit einer Ablaufeinrichtung verbunden sein kann.

Die hier vorgeschlagene Durchlaufeinrichtung kann durch Benutzung einer geschwindigkeitsregulierbarer

Düsenspriize, wie z. B. der Sage Nr. 237-1, abgeändert werden. Die Sage-Düsenspritze mit einem Hamilton-Düsen-System weist Leistungen zwischen 0,f bis 1,0 ιΛ und einen Durchsatz von 0,069 bis 1,7 //1/ min auf. Die Proben können mit dem Düsensysterr aus dem vermaßlen Sammelrohr durchgezogen werden, nachdem der Fluoreszenz-Farbstoff zugefüg worden ist. Die angetriebene Düsenspritze wird danr auf die »Sage«-Pumpe gesetzt. Ein Schalter wird betätigt, und 30 see oder wenig später ist die Zeil

Zählung beendet. Regulierbare Einheiten und Zwil lingseinheiten sind ebenso brauchbar. Eine Zwillings einheit kann dazu dienen, um eine größere Düsen spritze des Reinigers zum Auswaschen der Durch

fluteinrichtung nach jedem Versuch aufzunehmen.

Eine andere Ausführungsform weist eineManostat-Mikropipctte auf. Dieses Flüssigkeitsvcrteilungsgerät weist einen Mikrometerantrieb auf, der mit einem direkt lesenden Digitalzähler gekoppelt ist. Der Digitalzähler kann elektrisch mit der Schreibeinrichtung verbunden sein, um genaue Volummessungen zu gewährleisten. Die Mikropipette wird ähnlich den Düsenspritzen gefüllt und liefert genaue Werte des verteilten Volumens und zwar mit sehr großer Genauigkeit. Die Meßwerte sind genau bis zu 0,1% des verteilten Volumens.

An Stelle eines festen Rohrs oder einer teuren, hypodermatischen Düsenspritze kann für jede Probe eine verfügbare Düsenspritze benutzt werden. Die Probe wird aus ihrem Sammelbehälter mittels der verfügbaren Düsenspritze gezogen und in die Einfüllöffnung einer automatischen Zuführpipette eingeführt. Die Pipette ist in Grade eingeteilt, um exakte Messungen zu gestatten. Die Pipette führt der Meßkammer eine kalibrierte Menge der Probe zu. Die Bedienungsperson setzt den Meßvorgang in Gang, indem sie einen Schalter betätigt, der die Pumpe anstellt. Die Probe wird durch die Pipette gezogen und als exakter Betrag gemessen. Nach der Durchführung der Messung wird die Pipette für den nächsten Versuch gereinigt.

An Stelle einer Pumpe zum Durchziehen der Probe in und durch das Kapillar-Rohr bzw. die Meßkammer kann auch komprimierte Luft benutzt werden, die von einer innerhalb des Systems angeordneten Pumpe oder von einem außerhalb angeordneten Kompressor erzeugt wird.

Die elektrisch-optische Einrichtung, die in F i g. 1 gezeigt ist, weist ein Linsensystem 9, das ähnlich dem eines Standard-Mikroskops für biologische Zwecke ausgebildet ist, auf, um das Bild einer fluoreszierenden Zelle zu vergrößern, und einen Filter auf, um die UV-Strahlung auszusondern und die fluoreszierenden Wellenlängen durchzulassen. Eine Sammellinse 10 in F i g. 1 wird dazu benutzt, die emittierten Strahlungen zu sammeln und auf ein Beugungsgitter oder ein Prisma 12 zu leiten. Die einzelnen Wellenlängen werden durch das Prisma 12 mit spezifischen Winkeln reflektiert. Fotodetektoren 13 werden nach physikalischen Grundsätzen angeordnet, um die einzeinen weiieniängen zu ertauben. Dci Ausgang einer jeden Fotozelle 13 wird verstärkt und der Elektronik-Einrichtung weiter geleitet, wo die Signale aufbereitet werden, um die Charakteristiken zu extrahieren, die die verschiedenen Typen von Zellen in der Flüssigkeitsprobe identifizieren. Ein Fiuß-Diagramm bzw. Blockschaltbild dieses Vorgangs wird in F i g. 4 gezeigt. Digitalrechner 16 empfangen die Identifizierungssignale und setzen die Zeiltypenrechner sowie die Gesamtzellenrechner in Gang. Elektrische Kreise führen eine mathematische Umwandlung einzelner Zeiltypenzählungen zu Gesamtsummen der Zellen durch, um den Prozentanteil einer jeden £XlliypC «Ul UlC DUCIfilUl. αΠ ijvii i->i ι^κ_ι ii ZU ijC" rcchnen.

Eine vergrößerte Darstellung der Schlitzöffnungen in der Meßkammer wird in F i g. 2 gezeigt. Fig. 2a ist eine Ansicht von oben auf das Meßrohr 41, das aus Quarz besteht und das die UV-Strahlung aus der Strahlenquelle durchläßt. Eine große öffnung 42 wird bei diesem Beispiel dazu benutzt, die ganze Zelle bzw. die ganzen Zellen insgesamt zu bestrahlen. Der einzelne Schlitz 43, durch den die Fluoreszenz-Emissionen hindurchgehen, ist schmal, ungefähr 2 bis 40 κ breit. Die Fluoreszenz-Ausstrahlungen, die von dem Prisma gebrochen werden, erscheineu als drei parallele Banden 52 auf der Seite der Fotodetektoren 51, wie in F i g. 3 zu sehen ist. Die Fotozellen 51 sind ausgebildet und angeordnet, um die physikalische Position jeder primären, einzelnen Wcllenlängenbande an die von den Zellen bei Rückkehr in ihren Ausgangszustand ausgestrahlte Energie anzupassen.

Wenn die Quelle der Fluoreszenz-Strahlung die Zelle selbst ist, wird die Energie in alle Richtungen ausgestrahlt, wobei sie sich einer punktförmigen Lichtquelle annähert, öffnungen können in der Horizontalebene der UV-Quelle in jeder Stellung angeordnet werden, ausgenommen natürlich die Stelle, an der die Lichtquelle selbst angebracht ist. Ebenso kann die Strahlung in einigem Abstand oberhalb

ao oder unterhalb dieser Ebene erfaßt werden, doch ist die beste Anordnung der öffnungen die dreier gemeinsamer senkrechter Positionen in der Horizontalebene der UV-Quelle.

Weitere mögliche Ausführungen des optischen Systems ersetzen das Prisma 12 in F i g. 1 durch Filter und sorgen für zusätzliche und größere öffnungen für die Fluoreszenz-Strahlungen. In Fig. 5a, einer Seitenansicht der Meßkammer, liefert die Lichtquelle 60 Ultraviolett-Strahlen, die die Sammellinse 61 passieren, durch den Filter 64, den Schlitz 65 und zum Schluß durch die Fokuslinse 62 geleitet werden, wobei der Schlitz 65 direkt auf der Mittellinie der Kapillare 63 als ein extrem dünner Schlitz von ungefähr 2 · 40 11 abgebildet wird. Die emittierten Strahlungen gehen durch die Filter 66', 68' und 69', bevor sie von jeder der drei Fotozellen erfaßt werden. (I .ediglich eine Fotozelle 67 irt in Fig. 5a gezeigt.) Die Ansicht von oben auf die Meßkammer ist in Fig. 5b gezeigt, wo die Fotodetektor-Einrichtung aus drei Fotozellen 67, 68 und 69 und ihren drei betreffenden Filtern 66', 68' und 69' besteht. Die Fotozellen und Filter sind so nahe wie möglich an der Kapillare 63 angeordnet, um dem größten, festen Winkel der Fluoreszenz-Emissionen der Proben-Zellen gegenüberzuliegen. Die Filter sind Durchiaßfilter und bestehen aus dem Durchlaßfilter 67' für

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laßfilter 69' für Grün. Durch die Anwendung von in physikalischer Hinsicht schmalen Fotozellen können diese in die unmittelbare Nähe der Lichtquelle plaziert werden, wodurch sie einen bedeutenden Bruchteil der Fluoreszenz-Energie sammeln und die Notwendigkeit von Kollektoroptiken vermeiden. Die erforderliche Schärfe für das Abtasten der Blutzellen wird durch das Fokussieren des Schlitzes 65 in der Strahlungsquelleneinheit auf die gewünschte Auflösungsbreite durch die Fokuslinse 62 gewährleistet. Die Fluoreszenz-Strahlungen des angeregten Elements der Zelle können ohne Bild-Optiken und ohne Verlust bei der Zeil Elernerii Auflösung gesammelt werden. Dies ist die bevorzugte Ausführungsform.

Bei anderen Ausführungsformen kann jeder der drei horizontalen Schlitze in eine Zahl kleinerer öffnungen unterteilt werden. Die minimale öffnungsgröße, die gegenwärtig ins Auge gefaßt wird, ist 1,0 u Breite und 1,0// Höhe. Die öffnungen können einzeln mit einem Abstand von 1 // angeordnet werden, so daß ein Maximum von 25 öffnungen an Stelle je-

des horizontalen Schlitzes angebracht werden kann. Um die Strahlungen von jeder Öffnung der Anordnung zu empfangen, kann eine einfache konvexe Abbildungslinse und eine Fotodetektoranordnung benutzt werden, um jede Öffnung aufeinanderfolgend abzutasten. Alternativ kann das Bild der Öffnungsanordnung abgetastet werden, als wenn es durch eine Fixlinse oder einen Spiegel betrachtet würde.

Eine weitere Ausführungsform besteht darin, mehrfach Fotodetektoren und Filter direkt an jedem Visierloch der Mehrfachöffnung anzuordnen. Ein einziger Einbau von gesonderten Fotokathoden kann vorgenommen werden, und zwar in einer Einzel-Anordnung, um jede Visierloch-Öffnung abzustimmen, wodurch ein neues Gerät, nämlich ein N-Fenster-Fotodeteklor, geschaffen ist. Die Ausgänge jeder Fotozelle können elektronisdi abgetastet werden.

Diese kleinen horizontalen, einzeln abgetasteten Öffnungen versorgen die Elektronik-Logik-Kreise mit einem vollständigen Bild jedes Teils jeder fluoreszierenden Zelle, während das Blut vorbei fließt. Die Messung der Zeit des Erscheinens und des Verschwindens jeder Zelle, wenn sie mit der Öffnungsposition in Beziehung gesetzt wird, kann zum Korrigieren jeder sphärischen Verzeichnung des Zellumrisscs benutzt werden, die durch das Hindurchzwängen der Zellen durch enge Öffnungen verursacht ist. Auf diese Weise kann eine dreidimensionale Projektion jeder Zelle aus der Information gewonnen werden, die in den verschiedenen Öffnungen verfügbar ist. Um zusätzliche Ansichten der Zellen zu erhalten, können zusätzliche Öffnungsanordnungen gerade ober- oder unterhalb der ursprünglichen Öffnungen angebracht werden. Mehrfachanordnungen von Mehrfachöffnungen oder -schlitzen gewährleisten größte Genauigkeit mit Hilfe von Verbindungsdaten aller drei Seiten. Das gemeinsame Auftreten kleiner Zellen wie z. B. Plateletten mit regulären Zellen kann dann leicht bestimmt werden.

Die Funktion der Elektronik-Einrichtung dient dazu, die Fotozellenfunktionen durchzuführen, die verschiedenen Typen der Blutzellen zu unterscheiden und Ausgangssignale zu erzeugen, um die Zelltypen zu erfassen und die Zellenzahlen zu ermitteln. Tabelle I zählt die verschiedenen Blutzellentypen auf, die durch dieses Verfahren identifizierbar sind, zusammen mit den Unterscheidungsmerkmalen, die im Rahmen dieser Erfindung dazu benutzt werden, diese Zellen zu klassifizieren. Eine bildhafte Darstellung nach F i g. 6 stellt die fluorchromatisch behandeilen Leukocyten dar, wenn sie einer Ultraviolett-Licluquelle ausgesetzt werden. Das Kernmaterial jeder Zelle verbindet sich mit dem Farbstoff, um grüne

ίο oder gelbe Sekundär-Fluoreszenzstrahlungen abzugeben, wenn es mit Ultraviolett-Licht bestrahlt wird. Die cytoplasmatischen Korpuskeln jeder Zelle verbinden sich mit Farbstoff, um rote Sekundär-Flumeszenzstrahlen abzugeben, wenn sie mit Ultraviolett-Licht bestrahlt werden. Die drei Farbbande werde·: einzeln von Fotozellen 24, 25 und 26 erfaßt, wie in F i g. 4 zu ersehen ist.

Die einzelnen Ausgänge der drei Fotozellen 101, 102 und 103 werden alle gesammelt und in Farb-Quantitäts-Inipulse durch Signalumformungskreise 104, 105 und 106 umgesetzt, die in Fig. 7a dargestellt sind. Das Auftreten eines jeden Ausgangssi;>nals der Fotozellen zeigt den Beginn oder das Eide einer Fluoreszenzstrahlung innerhalb des Bandcndurchlasses des Filters an. Diese Ausgangssignalc bestimmen das Zeitintervall und den Intensitäisspiegtl, mit dem ein Teil oder die Ganzheit des Korpuskularbereichs auf einer spezifischen Wellenlänge gestrahlt hat. Der »OR«-Pfad 107 ist mit dem Impuls-

3.0 generator 108 verbunden, der mit dem Durchsat/-mengenregler synchronisiert ist und der die Zeit mißt, die die gesamte Zelle im Blickfeld ist, um den Zelldurchmesser D zu ermitteln. Die einzelnen Farb-Quantitäts-Impulse werden mit dem Zelldurchmcsser D in variablen Impuls-Amplituden-Generatoren 109, 110 und 111 verknüpft, um den Anteil der Fluoreszenz-Energie (des Rotfilters R, des Gelbfilters >' oder des Grünfilters G) zu ermitteln, der von jeder Zelle ausgestrahlt wird. In F i g. 7d vergleichen Identifizierungs-Logik-Kreise jeden Anteil des Farbniveaus und des Zelldurchrnessers, um jeden Zclliyp zu identifizieren, da diese Faktoren die primären Unterscheidungsmerkmale darstellen. (Siehe Tabelle 1 der Zell-Charakteristika.)

Tabelle I

Überlebens-Charakteristika cingefärbler Blutzellen bei Fiuoreszep.z-Strahlung

Zeil-Typ

Fluoreszenz- Abgestrahlte Farbe in %

Durchmesser

in ,υ. Grün Gelb

Rot

Lymphocyten (L)
Monocyten (M)
Neutrophile (N)
Eosinophilc (E)
Basophile(B)
Plalcletten (P)
Lymphoid Abnormale
Granulocytisch Abnormale
Reticiilocyten

Typische Logik-Kreise zur Durchführung der

7	r	bis	15 :	- 25
16	bis	20	• 25
10	bis	15	• 25
IO	bis	15 ■	25
10	bis	15	■ 25
I	bis	5	0
20			25
15			■ 25
5	bis	10	0
	halten	die

25	■ 10
25	< 25
25	■ 25
25	■ 25
10	10 bis 25
0	50
25	• 25
25	■ 25
0	■ 25

»OR«-Verbindung 112 und die »AND«-

Identifikation werden in Fig. 7b und 7c gezeigt. Die 65 Verbindung 113 die Impulse, die von den Irnpuls-Charakteristika von Tabelle I werden als Bcstim- generatoren 109, 110 und 111 erzeugt werden und mungsmcrkmalc benutzt, um die Identifizierung der
verschiedenen Zellen zu erleichtern. In F i g. 7c er-

führen ihre Funktion durch, um monochromatische Lymphoid-Zellcn von polychromatischen granuloey-

tischen Zellen zu unterscheiden. Anomalien jeder Type werden auf der Basis des Zelldurchmessers mit Hilfe der AND-Verbindungen 114 und 115 festgestellt. Eine monochromatische Zelle ist eine solche, bei der nur eine Farbe 25"/o der Summe aller anderen Farben übersteigt und jede andere Farbe einen geringeren Anteil als 25°/« hat. Eine polychromatische Zelle ist eine solche, bei der zwei oder mehr Farben jede einzeln 25°/o übersteigen. Die Bestimrnungsregeln. die von allen Indentifizierungs-Logik-Kreisen befolgt werden, sind aus Tabelle I ersichtlich, die die individuellen Zellcharakteristika in empirischen Ausdrücken beschreibt.

Monochromatische Zellen sind entweder Lymphocyten, Monocyten, Reticulocytcn oder Plateletten. Die Indikation, daß eine monochromatische Zelle beim Kombinieren mit dem Zclldurchmesser existiert, wird an die Logik-Kreise 120, 121. !22. 125 und 126 weitergcleilet. um festzustellen, ob eine lymphocyte, eine Monocyte, eine Reticulocyte oder tin Platelet! in der Meßkammer erschienen ist. Eine L.\mphocyte wird dadurch identifiziert, daß sie sowohl monochromatisch Grün-Eigenschaften aufweist und zwischen 7 und 15» im Durchmesser ist. Eine Monocyle wird dadurch identifiziert, daß sie monochromatisch Grün-Eigenschaften aufweist und zwischen 16 und 20 /ι im Durchmesser ist. Eine Retieuloc\ te ist monochromatisch Rot und weist einen Durchmesser zwischen 5 und Kl» auf. Ein Platelett wird dadurch identifiziert, daß es monochromatisch Rot ist und einen Durchmesser von weniger als 5 μ aufweist. Die polychromatischen Zellen sind entweder Neutrophile, Eosinophile oder Basophile. Eosinophile werden leicht auf Grund dessen identifiziert, daß sie mehr als 25".» Gelb und mehr ;.!s 25% Rot sind. Basophile werden auf Grund dessen identifiziert, daß sie geringelt· Quantitäten Rot in ihrem Fluoreszen/-Bereich als Neuirophile aufweisen, wie in Tabelle ! zu ersehen ist. Dies, zusammen mit einem Durchmesserbereich zwischen 10 und 15 <<, identifiziert jedes Basphil. Ein Neutrophil wird dadurch uleniifiziert. daß es mehr als 25"/« Grün und mehr als 25" .·, Rot im Fluoreszenz-Bereich aufweist und e^icn Durchmesser zwischen 10 und 15 » hat.

In F i u. 1 wird die Ausgabeeinrichtung gezeiüt. die einen kleinen IJniendrucker aufweist, der die Digitalsignale von den Rechnern erhall. Die Gi^niianzahl der weißen Zellen und Plateietieii wi:.i zusammen mit dem tatsächlichen Diffcrenzbetrag. nun:· lieh der Anzahl jeder gezahlten Zelltype und ihin relativen prozentualen Anteile am Gesamiheinig ausgedruckt.

Diese Einrichtung kann cmc Kalhodenstrah!n>hr< oder zumindest ein Digiial-Zahlrcehenwerk fin iedi Zelltypc sein oder ireendcii.· anderes, koninK !viel verwendbares Gerät.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

22 60 Patentansprüche:

1. Verfahren zur automalischen Identifizierung, Auszählung und Größtnbestimmung der verschiedenen Zellen in Körperflüssigkeiten, der ein fluorchrümatischer Farbstoff zugegeben wird, der bei Primärbestrahlung mit einer Strahlungsquelle hoher Energie in Abhängigkeit von den zellularen Materialien eine charakteristische Sekundärfluoreszenz-Strahlung aussendet, die mittels Strahlungsdetektoren aufgefangen und gemessen wird u:id zur Unterscheidung der einzelnen Zellen dient, dadurch gekennzeichnet, daü die Zellen einer eingefärbten Probe von mindestens 1 mm³ Körperflüssigkeit in eine Einzelzell-Anordnufi!.' hintereinander ausgerichlef werden und eine Relativbewegung der Körperflüssigkeit bezüglich der Strahlungsquelle erzeugt wird, die mindestens eine vereinigte, co-planare Strahlungs-Meßeinrichtung aufweist und eine Strahlung der Wellenlänge zwischen 0,30 und 30 ;/ aussendet, wobei die einzelnen Zellen während ihrer Hintereinanderanordnung und ihrer ReIativbewegung bestrahlt und die Sekundärstrahlung forllaufend aufgefangen wird, die von den subzellularen Materialien jeder Zelle ausgesandt wird, diese Werte für jede Zelle an eine Logik-Einrichtung wcitergele'tet werden, in der die Zelle auf der Basis ihrer Gesamtgestalt und der relativen Beträge des sub-zellularen Materials bestimmt wird, für jeden Leukocyten-Typ eine separate Zähleinrichtung in Tätigkeit gesetzt wird, wenn eine Leukof\te eines bestimmten Typs auf 3b die erwähnte Weise identifiziert ist und die vorerwähnten Schritte wiederholt werden, bis im wesentlichen alle Leukozyten in der Probe den coplanaren Strahlungsdetektor passiert haben und identifiziert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial auf solche Art behandelt wird, daß mindestens eine Charakteristik, entweder des Kern- oder des cytoplasmatischen Materials herausgehoben wird, während der Teil der Zelle, der von dem einen Material eingenommen wird, das eine hervorstechende Charakteristik aufweist, klar von den übrigen Teilen der Zelle unterschieden werden kann, der Anteil des Materials, der in Folge der erwähnten Behandlung hervorsticht, automatisch bestimmt wird, die gesamte Gestalt des Zellkörpers bestimmt wird, die Zellen auf Grund der erwähnten Beziehung zwischen der Gesamtgestalt und dem Teil der Zelle, der von mindestens einem Material mit hervorstechender Eigenschaft eingenommen wird, automatisch identifiziert werden und mindestens die kumulative Anzahl jeder, der in der erwähnten Weise identifizierten Zelle dargestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial eingefärbt wird, um mindestens eine physikalische Charakteristik, entweder des Kern- oder des cyloplasmatischen Materials hervorzuheben.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß das erwähnte Färbungsmittel Acridin-Orange ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Tropfen einer Lösung von 100 mg Acridin-Orange auf 50 ml Äthylalkohol einem ml Blut zugefügt wird, das mit einem Anii-Gerinnungsmittel ve 1 mischt ist.

ή. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß bei der Unterscheidung der Zellen auf der Basis der größten Querschnitlsfläche und der Ermittlung des relativen Anteils der Zelle, der von Kern- oder cytoplasmatischem Materia! eingenommen wird, die Zellen durch die Beziehung zwischen den Bereichen, die vom Kernmaterial, dem cyloplasmatischen Material und der gesamten Zelle eingenommen werden, auiomaiisch identifiziert werden, wobei zumindest die Anzahl jeder Zelltype bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß beim Auszählen weißer Zeiten einer Körperflüssigkeit die Probe einer Zähleinrichtung übermittelt wird, wodurch die verschiedenen Zelltypen automatisch unterschieden werden, diese Information einer Totalisator-Einrichtung zugeführt und schließlich an eine Ausgabe-Einrichtung weitergeleitet wird, wobei die vorgeschlagene Vorrichtung die Differenzierung der Zellen auf der Basis der relativen Beträge des Kern- und Cytoplasma-Materials und der Zellgestalt durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß UV-Energie auf einen Teil der Probe geleitet wird, der im wesentlichen aus einer Zelle besteht und daß die charakteristische Sekundärstrahlung des gesamten, eingefärbten sub-zellularen Materials auf eine co-planare Detektor-Einrichtung geleitet, die äußere Gestalt der identifizierten Zeile bestimmt und diese Information einem Logik-Kreis zugeführt wird, in dem die Zelle identifiziert wird.

9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Strahlenquelle, z. B. in Form einer Quecksilberdampflampe (6) oder einer Lichtquelle (60), ein Trichtenohr (1), ein Betätigungsventil (2), einen Durchfluß-Mengenregler (3). eine Pumpe (4), ein Kapillar-Rohr (5) mit einer Meßkammer (8), ein Linsensystem (9), mehrere Fotodetektoren (13), einen Digitalzähler (16), einen oder mehrere Filter (64, 66, 66', 67', 68', 69') und eine Druckeinrichtung (17) aufweist.

10. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Lichtquelle (6, 60) UV-Licht aussendbar ist.

11. Vorriditung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektorcinrichtung co-planai zur Lichtquelle (6, 60) ausgerichtet ist.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung aus einei Fotozelle (13) besteht.

13. Vorrichtung /ur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß vor ilen Fotozellen (13) bzw. (67 68, 69, 51) mehrere Filter (66, 66', 68, 64) angeordnet sind.

14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter drehbar angebracht sind.

15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der einzelne Fotodetektor eine mit vielen Öffnungen versehene Fotozelle ist.

J-3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch I bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Einzel-Fotodetektor eine Mehrzahl folosensitiver Bereiche aufweist.

17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung aus mehr als einer Fotozelle besteht.

18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung aus einer mit Vielfachöffnungen versehenen Fotozelle besteht

19. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung aus einer Fotozelle mit einer N-Fenster-Mehrfachfenster-Anordnung besteht.

20. Vorriduung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung aus einer Vielzahl von Detektoren besteht, die relativ zueinander angeordnet sind, um die Bestimmung der volumctrischen Beziehungen zwischen den sub-zellularen Materialien zu ermöglichen.

21. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß drei Detektoren orthogonal angeordnet sind.

22. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede Detektor-Einrichtung aus einer Gruppe von drei horizontal angeordneten Schlitzen besteht, die entsprechend den aufzufangenden Strahlungen der Probe angebracht sind.

23. Vorrichtung zur Durchfühl ung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung eine Mehrzahl horizontal angeordneter Schlitze aufweist.

24. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung eine einzelne Gruppe von drei Schlitzen aufweist, die einsprechend den von der Probe ausgesandten Strahlen angeordnet sind.

25. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung drei vertikal angeordnete Schlitze aufweist.

26. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8. dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der bestrahlten Probe und der Detektor-Einrichtung eine Reflektions- bzw. Brechungs-Einrichtung zum Trennen der charakteristischen Wellenlängen angeordnet ist.

27. Vorrichtung zur Durchführung dos Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Einrichtung bzw. Einrichtungen auf einer Mehrzahl von Niveauhöhen. relativ zur Ebene der Strahlungsquelle, angeordnet sind.

28, Vorrichtung zur Durchführung des Veriahrens nach Anspruch ! bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fotodetektoren innerhalb eines Bandes angeordnet sind, das in der Ebene der Strahlungsquelle liegt, wobei die Breite des erwähnten Bandes nicht größer als der Durchschnitts-Umfang der kleinsten Leukocyten-Zelle ist.