DE2126232A1

DE2126232A1 - Cancer and pregnancy diagnostic serum - from globulins of pregnant women and cancer patients

Info

Publication number: DE2126232A1
Application number: DE19712126232
Authority: DE
Inventors: Chloe Dr. Jerusalem Thal
Original assignee: Hadassah Medical Relief Association, Inc., New York, N. Y. (V.StA.)
Priority date: 1971-03-08
Filing date: 1971-05-26
Publication date: 1972-09-14
Also published as: IL36368A

Abstract

An immune-serum permitting very early diagnosis contains an antibody giving an immuno-specific reaction with the serum of pregnant women and cancer patients. Prepd. by isolating 'T-globulin' from the total globulins from the serum of pregnant women or cancer-patients inoculating mammals with it and obtg. the immune-serum from the blood of the animal. Undesirable antibodies are removed by reaction with a globulin-fraction from the serum of healthy non-pregnant subjects.

Description

"Immunreagenz zur Schwangerschafts-und Krebsdiagnose" Die Erfindung bezieht sich auf ein Iirmunreagenz für die Schwangerschaftsdiagnose sowie zur Diagnose von bösartigen Tumoren, Es wurde gefunden, daß sich aus dem Blutserum von schwangeren Frauen und ebenso aus dem Blutserum von Krebskranken eine Substanz isolieren lässt, die bei der Beimpfung von Tieren als Antigen wirkt, und dass das von den so beimpftem Tieren gewonnene Scrum antikörper enthält, welche mit dem Serum der zu untersuchenden Person eine Immunreaktion ergeben, falls Schwangerschaft oder Krebserkrankung vorliegt, wahrend in abwesenheit dieser Zustände die Reaktion ausbleibt. Die Immunreaktion kann mittels bekannter immunologischer Methoden im Serum der Testperson durchgeführt werden, z.B. durch Agglutination, Fällung, Elektrophorese und drgleichen. "Immune Reagent for Pregnancy and Cancer Diagnosis" The Invention refers to an Iirmun reagent for pregnancy diagnosis as well as diagnosis of malignant tumors, it has been found to arise from the blood serum of pregnant women Women and also has a substance isolated from the blood serum of cancer patients, which acts as an antigen in the inoculation of animals, and that of those so inoculated Scrum antibodies obtained from animals contain antibodies that match the serum of the to be examined Give the person an immune reaction if they are pregnant or have cancer, while in the absence of these states there is no reaction. The immune response can be carried out using known immunological methods in the test person's serum e.g. by agglutination, precipitation, electrophoresis and the like.

Das aus dem als Ausgangsmaterial verwendeten Serum gewonnene Antigen ist eiweissartiger natur und scheint den Globulinen nahezustehen, Es werde vorlaufig als "T-Globulin" bezeichnet.The antigen obtained from the serum used as the starting material is of a protein-like nature and seems to be close to the globulins, it is provisional referred to as "T-globulin".

Diese Bezeichnung wird auch nachstehend verwendet.This term will also be used below.

Bisherige Versuche haben gezeigt, dass die Diagnose mittels des erfindungsgemässen Immunreagenzes das Vorliegen von bösartigen Tumoren schon in einem früheren Stadium anzeigen kann als jede bisher bekannte Methode. Aucrl die Schwangerschaftsdiagnose länst sich filt diesem reagenz sehr frühzeitig durch fuhren.Experiments to date have shown that the diagnosis by means of the Immune reagent, the presence of malignant tumors at an earlier stage can display than any previously known method. Aucrl the pregnancy diagnosis This reagent can be filted very early on.

Das T-Globulin kann auf verschiedenen Uegen in einer für diagnostische Zwecke brauchbaren konzentration und @einheit ge-@onnen werden.The T-globulin can be used in different ways for diagnostic purposes Purposes of useful concentration and unity can be achieved.

werden h@r kleinere Mengen, benotigt, so genügt eine an sich bekannte zweidimensionale Elektrophorese in Agar, Das T-Globulin verteilt sich dabei im Agar. Dieses wird dann in kleine Stücke zerschnitten und emulgiert, z.B. in Paraffinöl, gegebenenfalls unter Zusatz von Emulgatoren. Die Emulsion T'fird als Impfstoff verwendet.If smaller quantities are required, a known one is sufficient two-dimensional electrophoresis in agar, the T-globulin is distributed in the agar. This is then cut into small pieces and emulsified, e.g. in paraffin oil, optionally with the addition of emulsifiers. The emulsion T'f is used as a vaccine.

Für dic Herstellung grosserer Mengen wird angereichertes T-Globulin erfindungsgemäss dadurch hergestellt, dass eine das T-Globul.in enthaltende wässrige Ausgangslösung mit Perchlorsäure versetzt wird. Der dadurch erzeugte @ieserschlag wird von der überstehenden Flüssigkeit getrennt und in Wasser oder physiologischer Rochsalzlösung ausp@@diert, wo@ach die Suspension durch Z@gabe von Alkalihydroxyd oder Alkalicarbonat auf ein pH von 7 gebracht wird. Ungelöste Feststoffe werden dann abgetrennt, vorzugsweise durch Zentrifugieren, dann in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und das pH der Suspension :ird auf 8,0 gestellt. danach wird die überstehende Flüssigkeit von Ungelöstem abgetrennt. Die klare Flüssigkeit enthalt das T-Globulin.For the production of larger quantities, enriched T-globulin is used produced according to the invention in that an aqueous T-globulin containing Starting solution is mixed with perchloric acid. The resulting @ieserschlag is separated from the supernatant and placed in water or physiological Rochsalzlösung ausp @@ diert, where @ also the suspension by adding alkali hydroxide or alkali carbonate is brought to a pH of 7. Undissolved solids become then separated, preferably by centrifugation, then in water or Suspended physiological saline solution and the pH of the suspension: ird to 8.0 posed. then the supernatant liquid is separated from undissolved material. the clear liquid contains the T-globulin.

Ein weiterer Anteil an T-Globulin kann dadurch wonnen werden, dass die im letzten Verfahrensschritt abgetrennten Feststoffe mit Wasser bei pH 8,0 gewaschen werden und das Waschwasser der klaren, das T-Globulin enthaltonden Flüssigkeit zugegeben wird.A further proportion of T-globulin can be gained through the fact that the solids separated off in the last process step are washed with water at pH 8.0 and the wash water is added to the clear liquid containing the T-globulin will.

Diese Flüssigkcit enthält nur geringe l.engen von Verunreini-@urgen, überwiegend andere Eiweisstoffe. Sie wird nachstehend als "T-Globulin-Lösung" hezeichnet.This liquid contains only small amounts of impurities, predominantly other proteins. It is hereinafter referred to as "T-globulin solution".

Die Ausgangslösung wird vorzugsweise durch Auflösung des Niederschlags erhalten, der durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu dem Serum erhalten wird, das von krebskranken oder von schwangeren Frauen herstammt.The starting solution is preferably made by dissolving the precipitate obtained by adding ammonium sulfate to the serum obtained from cancer or pregnant women.

kit dem T-Globuli@ konnen Kaninchen, Zielen oder andere Versuckstiere geimpft werden. Für diesen Zweck lassen sich sowohl die Oelemulsionen als .uch die wässrigen Lösungen verwenden. Die Impfung erfolgt in der Regel intramuskulär. Die Immunisierungszeit beträgt etwa einer @onat. Danach wird den Tier Blut ertnommen und daraus in bek@nnter Weise das Serum gewonnen. Dieses Immunserum kann unmitteller als Immunreagenz verwendet oder etwa in bekannter ;leise zu diagnostischen Eräparaten verarbeitet werden, etwa durch @eber@lchen von Latexteilchen oder Erythrozyten mit dem Immunserum.kit the T-Globuli @ can be used by rabbits, targets or other animals to suckle be vaccinated. For this purpose, both the oil emulsions and the use aqueous solutions. The vaccination is usually given intramuscularly. the Immunization time is about one month. Then blood is taken from the animal and from it the serum obtained in a well-known way. This immune serum can be more immediate Used as an immune reagent or in a more familiar form; quietly to diagnostic Eräparaten processed, for example by @eber @ lchen from latex particles or Erythrocytes with the immune serum.

Das Immunreagenz ergibt eine spezifische Immunreaktion mit dem Serum von schwangeren Frauen sowie von Krebskranken. Wenn indessen das T-Globulin nicht ganz rein, sondern mit anderen Eiweisstoffen verunreinigt war, so wirken auch diese als Antigene und das Tier entwickelt entsprechende Antikörper. Um diese zu entfernen, ist es zweckmässig, das Irsrlunserum zunächst mit Gesamtglobulin zu reagieren, d aus dem Serum einer gesunden, nicht schwangeren Person gewonnen wurde. Der @ierdurch erzeugte @iederschlag wird entfernt. Das Immunserum ist dann praktisch rein.The immune reagent gives a specific immune reaction with the serum of pregnant women as well as cancer patients. If, however, the T-globulin doesn't was completely pure, but contaminated with other proteins, these also work as antigens and the animal develops appropriate antibodies. To remove these, it is advisable to first react the Irsrlun serum with total globulin, i was obtained from the serum of a healthy, non-pregnant person. The @ierdurch generated @regulation is removed. The immune serum is then practically pure.

BEISPIEL 1 200 ml Sammelserum von mehreren Krebskranken wird mit 100 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der Globulinniederschlag wird abzentrifugiert und in 200 ml sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthält 36 mg/ml Biweise.EXAMPLE 1 200 ml of serum collected from several cancer patients is mixed with 100 ml of a saturated aqueous ammonium sulfate solution are added. The globulin precipitate is centrifuged off and dissolved in 200 ml of sterile distilled water. The solution contains 36 mg / ml bi-wise.

Sie wird schnell in eine gekühlte lösung von 12 ml 70-72%iger wässriger Perchlorsäure in 12 mol wasser eingetragen. er dabei entstehende weisse @iederschlag wird abzentrifugiert, Die klare Flüssigkeit enthält kein Einciss und wird vorworfen. Die abzentrifugierten Reststoffe werden in 40 ml Wasser suspendiert und das pH der Suspension wird mit eine 20 ml n-Natronlauge auf 7,0 gestellt, Hierbei entsteht eine millchige Suspension, die mit einer Geschwinoigkeit von 3000 U@drehungen je Minute während 30 Minuten zentrifugiert wird. Die @bgegessene Flüssigkeit enthält etwa 3 mg/ml Eiweiss, aber kein T-Globutin. Die abgeschiedenen Feststoffe werden erneut in 40 ml Wasser suspendiert, die Suspension wird zunächst mit 40 ml Wasser versetzt, das mit n-Natronlauge auf pH 10,0 gestellt wurde, dann langsam mit 4 ml n-Natronlauge versetzt üs pH der Suspension soll dann 8,0 betragen. Die Suspension wird zentrifugiert, die dabei erhaltene Flüssigkeit enthält 23 mg/ml Eiweiss, in der Hauptsache T-Globulin, das aber geringfügige mengen von anderen Globulinen enthält, Eine weitere Menge T-Globulin kann durch Suspendieren der Feststoffe in 40 ml Wasser vom pH 8,0 und Zentrifugieren der Suspension gewonnen werden, wobei die erhaltene Flüssigkeit 9 mg/ml fast reinen T-Globulins enthält.It is quickly immersed in a cooled solution of 12 ml of 70-72% aqueous Perchloric acid entered in 12 mol of water. he resulting white @deposit is centrifuged off, the clear liquid does not contain any Einciss and is accused. The centrifuged residues are suspended in 40 ml of water and the pH of the The suspension is adjusted to 7.0 with a 20 ml n-sodium hydroxide solution, which results a milly suspension that rotates with a speed of 3000 U @ each Minute is centrifuged for 30 minutes. The eaten liquid contains about 3 mg / ml protein, but no T-globutin. The deposited solids are resuspended in 40 ml of water, the suspension is first mixed with 40 ml of water added, which was adjusted to pH 10.0 with n-sodium hydroxide solution, then slowly with 4 ml N-sodium hydroxide solution added and the pH of the suspension should then be 8.0. The suspension is centrifuged, the resulting liquid contains 23 mg / ml protein, in the main thing is T-globulin, but it contains small amounts of other globulins, An additional amount of T-globulin can be obtained by suspending the solids in 40 ml of water from pH 8.0 and centrifugation of the suspension are obtained, the obtained Liquid contains 9 mg / ml of almost pure T-globulin.

Die versinigte T-Globulinlösung kann durch Wasserentzug konzentriert werden zoB durch Kontakt mit Polyvinylpyroliden.The dissolved T-globulin solution can be concentrated by removing water are for example caused by contact with polyvinylpyrolides.

Die vereinigten festen Zentrifugierückstände enthalten 6 g Eiweiss, aber praktisch kein T-Globulin.The combined solid centrifugation residues contain 6 g Protein, but practically no T-globulin.

Aus insgesamt 7,2 g aus dem Serum gefälltem Gesamtglobulin werden 2,2 g T-Globulin erhalten. Statt des destillierten Wassers kann in diesem Verfahren physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.A total of 7.2 g total globulin precipitated from the serum becomes 2.2 g of T-globulin were obtained. Instead of distilled water you can use this method physiological saline solution can be used.

BEIS@I@@ 2 Als Tier für die Gewinnung des Immunserung wird ein junges, erwachseh@@ Kanlnchen von etwa 2 kg Gewicht verwemlet.BEIS @ I @@ 2 As an animal for the production of the immune system, a young, grown up tubules weighing about 2 kg.

Das T-Globulin ist in der Form ciner nach Beispiel 1 erhaltenen wässrigen Lösung, die durch Konzentrieren auf einen Biweissgehalt von 2,5 mg/ml gebracht wurde. 6 ml der T-Globulin-Lösung werden mit 6 ml vollständigem Adjuvans nach Freund vermischt.The T-globulin is in the form of an aqueous obtained according to Example 1 Solution which was brought to a whiteness content of 2.5 mg / ml by concentration. 6 ml of the T-globulin solution are mixed with 6 ml of Freund's complete adjuvant.

Mittels dieses Impfstoffes wird eine erste Beimpfung von insgesamt 2 ml ctn zwei verschiedenen Stellen des Körpers vorgenommen; die Impfung wird innerhalb von einer Woche noch zweimal mit gleichen Mengen wiederholt. Datiach bleibt das Tier während einer Woche in Ruhe. In der 3. Woche erfolgen wieder drei Beimpfungen wie in der estern Woche. Insgesamt erhält das Tier also eine Menge von 15 mg T-Globulin, Zehn Tage nach der letzten Beimpfung wird dem Tier eine Blutprobe (2-5 ml) zur Prüfung aus dem Ohr entnommen. Aus der Blutprobe wird das Immunserum gewonnen und an dem Serum einer Versuchsperson mit bekanntem Krankheitszustand (Krebs) ausprobiertO Im allgemeinen gibt das Immunserum zu diesem Zeitpunkt eine für diagnostische Zwecke ausreichende Immunreaktion.By means of this vaccine an initial inoculation of a total of 2 ml ctn made at two different locations on the body; the vaccination will be within Repeated twice over a week with the same amount. That stays that way Animal at rest for a week. In the 3rd week there are again three inoculations like last week. In total, the animal receives an amount of 15 mg T-globulin, Ten days after the last inoculation, the animal is given a blood sample (2-5 ml) for testing taken from the ear. The immune serum is obtained from the blood sample and used on the Serum from a test person with a known disease state (cancer) triedO Generally the immune serum gives one at this point for diagnostic purposes adequate immune response.

Fällt diese aber zu schwann zus, so wird elne Booster-Impfung gegeben. Zeigt der Test, dass das Immunserum die gewünschte Stärke hat, so wird dem Tier durch Herzpunktion das gesamte Blut entzogen, etwa 150 ml. Das Blut wird für etwa 24 Stunden bei etwa 4°C aufbewahrt und dann zentrifugiert.If this is too weak, a booster vaccination is given. If the test shows that the immune serum has the desired strength, the animal will the entire blood is withdrawn by cardiac puncture, about 150 ml. The blood is removed for about Stored for 24 hours at about 4 ° C and then centrifuged.

Zur @efreiung des so erhaltenen Serums von unerwünschten Antikörpern, d.h. solchen, die keine speziflsche Immunreaktion mit dem Serum von Schwangeren oder Krebskranken geben, wird wie folgt verfahren : Aus dem Blutserum einer gesunden, nicht schwangeren Person wird mit Ammoniumsulfat das Gesamtglobulin gefällt, der Riedorschlag wird gewaschen und in soviel wasser suspendiert, dass die Suspension 20 mg/ml Eiweiss enthält. Mit dieser Suspension wird das Immunserum in Berührung gebracht, und zwar etwa im Verhältnis von 1 Haumteil der Suspension je 5 Raumteile des Serume. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 37°C bebrütet.To remove unwanted antibodies from the serum obtained in this way, i.e. those that do not have a specific immune reaction with the serum of pregnant women or cancer patients, the procedure is as follows: From the blood serum In a healthy, non-pregnant person, ammonium sulfate will make total globulin precipitated, the Riedorschlag is washed and suspended in so much water that the suspension contains 20 mg / ml protein. With this suspension the immune serum brought into contact, about in the ratio of 1 Haumteil the suspension 5 parts of the serum each. The mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C.

Das Serum rrird dann zentrifugiert, und die Feststoffe werden abgetrennt. Die klare Flüssigkeit ist reines Immunsorum.The serum is then centrifuged and the solids are separated. The clear liquid is pure immunosorum.

BEISPIEL 3 Rote BlutköryEierchen werden dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, es wird filtriert und 1 cm3 des fest gepackten Filterrückstandes wird in 40 ml einer auf pH 7,2 gepufferten physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension hat eine Blutkörparkonzentration von 2,5%. Eine Mischung von je 20 ml dieser Suspension und einer 0,005%igen, auf pH 7,2 gepufferten Gerbsäurelösung in physiologischc-.r Kochsalzlösung wird 10 Minuten lang auf 370C gehalten und scdann zentrifugiert. Die dabei anfallenden Feststoffe werden wiederum in einer solcher Merge physiologischer Mochsalslösung suspenoiert, dass die Suspension eine Bl@t@örperchenkonsentration von 2,5% ergibt, Die Suspension wird auf 5°C gehalten und innerhalb von 18 Stunden mit T-Globulin-Antikörperserum überzogen.EXAMPLE 3 Red blood cell eggs are physiologically tested three times Washed sodium chloride solution, it is filtered and 1 cm3 of the tightly packed filter residue is suspended in 40 ml of a pH 7.2 buffered physiological saline solution. The suspension has a blood cell concentration of 2.5%. A mix of 20 ml of this suspension and a 0.005% tannic acid solution buffered to pH 7.2 in physiological saline solution is kept at 37 ° C. for 10 minutes and then scd centrifuged. The resulting solids are in turn in one of these Merge of physiological Mochsalslösung suspends that the suspension has a concentration of lobules of 2.5% results, the suspension is kept at 5 ° C and within 18 hours coated with T-globulin antibody serum.

Das Ueberziehen geschicht derart, dass 1 ml der Suspension zu zu einer Mischung von 1 ml Serum und 4 ml auf pH 6,3 gepufferter physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und dadurch das Gemisch mit physiologischer Kochsalzlösung soweit verdünnt wird, dass der Eiweissgehalt der Suspension etwa 0,1 bis 10 mg/ ml beträgt. Durch Vorversuche wird die zur Erzielung der gewünschten Eiweisskonzentration erforderliche Verdünnung bestimmt.The coating layer in such a way that 1 ml of the suspension is added to a mixture of 1 ml serum and 4 ml physiological saline solution buffered to pH 6.3 added and thereby the mixture is diluted with physiological saline solution is that the protein content of the suspension is about 0.1 to 10 mg / ml. By Preliminary tests are required to achieve the desired protein concentration Dilution determined.

BEISPIEL 4 Eine etwa 11%ige Suspension von im Handel erhältlichem Eolyvinyl-Toluol-Latex (Teilchengrösse etwa 0,77 µ) oder Polystyrol-Latex (Teilchengrösse etwa 0,81 µ) ird mit etwa der 10-fachen Menge Wasser verdiinnt, dann durch Papier filtriert und weiter derart verdünnt, dass nach wiederum 1:100-facher Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung, die mit Borat oder Glykokoll auf pH 8,2 gepuffert ist, die @tische Dichte einem 6%igen Durchgang bei einer Wellenlänge von 6500 # im Coleman Universalspectrophotometer entspricht.EXAMPLE 4 An approximately 11% suspension of commercially available Eolyvinyl toluene latex (particle size about 0.77 µ) or polystyrene latex (particle size about 0.81 µ) is diluted with about 10 times the amount of water, then through paper filtered and further diluted in such a way that after again 1: 100-fold dilution with physiological saline solution, which is buffered to pH 8.2 with borate or glycocolla is, the @tic density is a 6% pass at a wavelength of 6500 # in the Coleman Universal Spectrophotometer.

Die Suspension wird dann mit soviel T-Globulin-Arltikörperserum vermischt, dass die schliessliche Eiweisskonzentration des Gemisches 0,25 mg/ml entspricht0The suspension is then mixed with as much T-globulin body serum as that the final protein concentration of the mixture corresponds to 0.25 mg / ml0

Claims

A N S P R Ü C H E>) Process for the production of an immune reagent for pregnancy and cancer diagnosis, characterized in that one from the Serum from pregnant women or from cancer patients one / total globulin precipitate generated and from this a globulin-like substance ("T-globulin") isolated, then inoculated a mammal with an emulsion or aqueous solution of T-globulin and after immunization, blood is removed from the animal and the immune serum is obtained from it.

2) Method according to claim 1, characterized in that the immune serum by reaction with a globulin fraction recovered from the serum of others, obtained from a non-pregnant person, is cleared of undesired antibodies0

3) method according to claim 1 or 2, characterized in that the from the blood In-room serum obtained from the animal is processed into diagnostic preparations, s.B. by coating latex particles or erythrocytes with the serum0

4) Procedure according to claim 1 or characterized in that the total globulin precipitate Dissolves in water and from the solution with perchloric acid one containing the T-globulin Precipitation crzet, then the precipitate, if necessary after intermediate Cleansing, dissolves in slightly alkaline water and containing the T-globulin Separates solution from the solids.

5) modification of the method according to claim 4, characterized in that that in all or some process steps physiological saline solution instead used by water.

6) immune reagent for pregnancy and cancer diagnosis, characterized in that that it contains immune serum, its antibodies with the serum of pregnant women or give cancer sufferers a specific immune reaction.

7) immune reagent according to claim 5, characterized in that it is the Contains immune serum from an animal, which nlit from the serum of pregnant women or ? -Globulin obtained from cancer patients was vaccinated.