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Die Erfindung betrifft ein Kit bestehend aus einem Probenhalter und einer dazugehörigen Basis zur Anordnung auf einem Goniometerkopf.
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Die Struktur vieler Proteine konnte erst mittels der Kristall-Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu kleinen organischen oder anorganischen Molekülen wie Zucker oder Salzen, die meist einfacher auskristallisieren, bilden die oft sehr großen Protein-Moleküle nur unter ganz bestimmten Bedingungen Kristalle, die in langen Versuchsreihen ermittelt werden müssen.
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Die Kristallisation beginnt im Allgemeinen mit einer Proteinlösung in relativ hoher Proteinkonzentration von 2 bis 50 mg/ml. Dieser Lösung werden Reagenzien zugesetzt, die die Proteinkonzentration langsam erhöhen und somit zu einer spontanen Kristallisation führen sollen. Sind die Bedingungen optimal, bilden sich Nukleationskeime, von denen aus das Wachstum des Proteinkristalls fortschreiten kann. In der Praxis sieht es so aus, dass in einem ersten Screening, beispielsweise in einer sogenannten 96-Well Mikrotiterplatte, eine Reihe von Bedingungen getestet werden, wobei die Bedingungen in den einzelnen Kavitäten (Wells) leicht variiert werden. Bedingungen in denen Kristallisationskeime gebildet wurden, werden anschließend systematisch optimiert. Ein für die Röntgenstrukturanalyse brauchbarer Kristall sollte in mindestens zwei Raumdimensionen 0,1 bis 0,2 mm groß sein.
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Es gibt zwei grundsätzlich verschiedene Methoden zur Kristallisation von größeren Biomolekülen mittels Dampfdiffusion, die „sitting-drop“- und die „hanging-drop“-Methode. Bei der hanging-drop-Methode werden wenige (ein bis zwei) Mikroliter der Protein-Lösung mit einem gleichen Volumen einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt und luftdicht verschließt. Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels enthält als der Tropfen, tritt im Laufe der Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die Proteinkonzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht sich sukzessive.
Eine alternative Methode ist eine bei der man Stofftransport mittels Diffusion über eine Phasengrenze ausnutzt: Proteinlösung und Fällungsmittellösung werden in einer Kapillare über eine gemeinsame Phasengrenze miteinander in Kontakt gebracht. Das Fällungsmittel mit seiner viel kleineren Teilchengröße diffundiert dabei durch die Grenzfläche in die Proteinlösung. Eine weitere Methode ist das Batch-Verfahren. Hier muss sich die Lösung bereits im Nukleationsbereich befinden. Probe und Fällungsmittelgemisch werden unter einer isolierenden Ölschicht miteinander zu einem Tropfen vermischt. Dieser Vorgang bedarf einer mikroskopischen Observation um Kristallisationskeime zu identifizieren, die sich über Wochen und Monate erstrecken kann. Diese Vorgehensweise ist heute weitgehend automatisiert und so genannte Screening Kits mit einer großen Anzahl verschiedener Präzipitationsmittel sind kommerziell erhältlich.
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Für die Kristallstrukturaufklärung benötigt man Einkristalle. Viel häufiger jedoch als diese entstehen entweder ein amorpher Niederschlag (Präzipitat) oder auch Kristalle, die nicht für eine derartige Untersuchung geeignet sind. Entscheidende Parameter wie z.B. pH-Wert, „salting in“, „salting out“, lonenstärke, organische Lösungsmittel (Dielektrizitätskonstante) und die Temperatur werden bei den Kristallisationsansätzen variiert.
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Neben der Züchtung von Proteineinkristallen ist auch deren Probenpräparation im Vergleich zu anorganischen Kristallen aufwändiger. Die meist sehr fragilen Proteinkristalle zerfallen leicht unter mechanischem Druck aber auch bei Änderung äußerer Parameter, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, relativer umgebender Feuchtigkeit. Zur Präparation werden die Kristalle manuell, also im Wesentlichen mechanisch oder durch spülen vereinzelt und, beispielsweise mit einer Schlaufe, einem sogenannten Loop, auf einem Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf präpariert. Da die Aufnahme von Röntgendiffraktionsbildern am Einkristall üblicherweise bei Temperaturen um 100 Kelvin stattfindet, bedarf es eines weiteren Manipulationsschrittes. Der auf den Loop montierte Proteinkristall, circa 50% aus Wasser bestehend, muss vor der Montage auf das Goniometer und der Exposition mit Röntgenstrahlung bei 100 Kevin mit einem Frostschutzmittel behandelt werden.
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Das Problem besteht demnach im Wesentlich darin, dass Kristalle bei der Probenpräparation zerstört oder beschädigt werden und somit nicht mehr einer Röntgenstrukturanalyse zur Verfügung stehen. Diesem Problem zu begegnen sucht die
WO 2007/089 658 A2 . Darin ist beschrieben einen flexiblen Probenträger in Form einer möglichst dünnen Folie bereitzustellen, auf dem die Kristalle bereits wachsen und somit nicht aus der Mutterlösung entnommen werden müssen.
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Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu bieten, Kristalle zerstörungsfrei auf einem Goniometerkopf zu präparieren und einer röntgendiffraktometrischen Messung zugänglich zu machen.
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Diese Aufgabe wird durch ein Kit bestehend aus einem Probenhalter und einer dazugehörigen, passenden Basis mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs gelöst. Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung einen Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf. Der erfindungsgemäße Probenhalter weist ein äußeres umlaufendes Randelement sowie ein von dem äußeren Randelement beabstandetes inneres umlaufendes Randelement auf. Die beiden Randelemente sind durch zumindest eine Strebe miteinander verbunden. Ferner weist der Probenhalter eine, das äußere Randelement überspannende Deckfolie auf sowie eine das innere Randelement überspannende Probenfolie. Dabei sind die beiden Folien voneinander beabstandet.
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Der erfindungsgemäße Probenhalter hat den Vorteil, dass er neben der Funktion als Probenhalter bei einer röntgenographischen Messung gleichzeitig als Untergrund zum Anzüchten von Kristallen, insbesondere Proteinkristallen, verwendbar ist. Hierbei dient das äußere Randelement als Halterung wenn der Probenhalter auf einem Kristallisationsgefäß, beispielsweise einem Gläschen einem Becher oder einer Kavität, derart angeordnet wird, dass er eine offene Seite des Gefäßes verschließt. Der Probenhalter dient demgemäß als Deckel für das Kristallisationsgefäß, wobei das äußere Randelement auf dem Rand des Gefäßes aufliegt oder diesen umschließt und die Deckfolie die Öffnung des Gefäßes nach außen hin abgrenzt. Das innere Randelement ist auf der, dem Innenraum des Gefäßes zugewandten Seite der Deckfolie angeordnet. Wird im Kristallisationsgefäß eine Mutterlösung zur Kristallzüchtung eingebracht und der Probenhalter erfindungsgemäß als Deckel auf dem Kristallisationsgefäß angeordnet, ist die Probenfolie der Mutterlösung derart zugewandt, dass sich auf der Oberfläche der Probenfolie, im Sinne der „hanging-drop“-Methode, Kristalle bilden. Die entstandenen Kristalle haften auf der Oberfläche, sodass der Probenhalter vom Kristallisationsgefäß entfernt werden und sofort auf einem Goniometerkopf, horizontal oder vertikal angeordnet, montiert werden kann. Der Kristall auf der Folie ist vorteilhafter Weise sofort, d.h. insbesondere ohne weitere Probenpräparation, einer Röntgenmessung zugänglich. Somit bleiben die Kristalle stabil, da sie nicht mechanisch bearbeitet, also weder vereinzelt noch auf einem Probenhalter fixiert, werden müssen. Damit ermöglicht der erfindungsgemäße Probenhalter eine in-situ Analyse der Kristalle ohne weitere manipulative Eingriffe.
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Der Probenhalter weist zudem eine Halterung bzw. eine Handhabung auf, die sich über das äußere Randelement hinaus erstreckt. Diese Halterung dient insbesondere als Griff, ist daher vorzugsweise längserstreckt, und ermöglicht eine leichtere und schonendere Entfernung des Probenhalters nach einer erfolgreichen Kristallisation von dem Kristallisationsgefäß. Die Halterung ist zur formschlüssigen Aufnahme in eine Buchse einer Basis angepasst.
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Die Basis dient zur Anordnung auf einem Goniometerkopf und ist mit einer, an die Halterung des Probenhalters formschlüssig angepassten Buchse versehen, in die die Halterung des Probenhalters einsteckbar ist. Die Basis ist zudem auf der gegenüber der Buchse befindlichen Seite für die formschlüssige Anordnung auf einem Goniometerkopf ausgeformt. Zur Fertigung für die Basis kommen alle Materialien in Betracht, aus denen Formstücke herstellbar sind. In Hinblick auf handelsübliche Goniometerköpfe ist die Basis insbesondere aus magnetisiertem oder magnetisierbarem Metall gebildet.
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Der Probenhalter und die Basis bilden ein Kit, d.h. einen Bausatz aus Teilen, die jeweils komplementär ausgebildet sind und im montierten Zustand zur direkten Anordnung auf einen Goniometerkopf dienen.
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Es folgen bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Probenhalters im Kit. Für alle Ausführungsformen ist jeweils die Basis formschlüssig an die Halterung des Probenhalters angepasst. Alle Ausführungsformen sind kompatibel.
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In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das äußere Randelement eine Kreisform aufweist. Dies erlaubt zum einen eine einfachere Handhabbarkeit und zum anderen eine bessere Anpassung an die üblichen Kristallisationsgefäße.
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Die Verbindung zwischen äußerem und innerem Randelement durch die Strebe ist vorzugsweise form- oder stoffschlüssig ausgebildet. Dabei bietet die stoffschlüssige Verbindung Stabilisierungsvorteile, während eine formschlüssige Verbindung, beispielsweise durch einen Klick- oder Rast-Mechanismus, Vorteile bei der Montage auf dem Goniometerkopf bietet. Mit anderen Worten eine formschlüssige Verbindung kann direkt vor oder direkt nach der Montage auf dem Goniometerkopf gelöst werden, sodass ein schneller Probenhalterwechsel ermöglicht wird.
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In weiter bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen dass die Form des äußeren Randelements der Art einer äußeren Form eines Deckels einer Kavität einer Mikrotitrierplatte nach ANSI-Standard entspricht, so dass der Probenhalter als ein Deckel auf einer solchen Kavität anbringbar ist. Insbesondere verschließt der Deckel in dieser Ausgestaltung die Kavität luftdicht. Dabei schließt das Randelement den Innenraum der Kavität, beispielsweise in Form eines Pfropfens mit Lamellen, und/oder zumindest einen Teil des äußeren Rands der Öffnung der Kavität formschlüssig ab. Letztere Ausgestaltung kann beispielsweise über eine Ausnehmung im äußeren Rand realisiert werden, die einem Negativ des korrespondierenden Teils der Öffnung bildet. Der Vorteil dieser Ausgestaltung liegt in der universellen Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Probenhalters. So ist der erfindungsgemäße Probenhalter in dieser Ausgestaltung auf allen üblichen Kristallzüchtungsgefäßen zur Proteinkristallzüchtung verwendbar. Besonders bevorzugt ist die Form des Probenhalters an die Form der Kavitäten eines sogenannten 24-Well Formats angepasst, insbesondere an ein solches in dem die Kavitäten einen Durchmesser von 22 mm aufweisen und insbesondere auch an eine solche in dem die Kavitäten einen Durchmesser von 18 mm aufweisen.“
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Mit Vorteil weist jedes der Randelemente eine Höhe auf die den Abstand zweier Grundflächen definiert, wobei die Deckfolie und die Probenfolie einander gegenüberliegender Grundflächen des jeweiligen Randelements entsprechen. Mit anderen Worten, liegen die beiden Randelemente in einer Ebene zueinander, so entspricht der Abstand der einander zugewandten Oberflächen der beiden Folien bevorzugt der Höhe der Randelemente bzw. der Höhe des höheren Randelements. In dieser Ausgestaltung ist zum einen sichergestellt dass die Probenfolie auf einer Seite des inneren Randelementes angeordnet ist die während der Kristallzüchtung der Mutterlösung zugewandt ist. Zum anderen ist bei der Verwendung eines Plateauförmigen Goniometerkopfes, bei dem der Probenhalter horizontal, also derart montiert wird, dass eine Grundfläche des äußeren Randelements auf dem Goniometerkopf aufliegt, sichergestellt das die Probenfolie respektive der auf der Probenfolie angeordnete Kristall bei der Montage auf dem Goniometerkopf den höchsten Punkt bildet. Abschattungen werden so auf ein Mindestmaß reduziert sind.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Deckfolie eine Transparenz für sichtbares Licht von mindestens 85 %, insbesondere von mindestens 90 % bei der bevorzugt von mindestens 95 %, aufweist und Luft und dampfundurchlässig ist. Mit anderen Worten entspricht die Güteklasse der Deckfolie der sogenannten „high clarity“-Güteklasse. Dies verbessert die Eignung des Probenhalters bei der Verwendung als Deckel während der Kristallzüchtung, da der Fortschritt des Kristallwachstums durch die Deckfolie hindurch beobachtet werden kann. Ferner stellt die Undurchlässigkeit für Luft und Dampf sicher, dass die Konzentration der Mutterlösung lediglich in Abhängigkeit vom Fortschritt des Kristallwachstums beeinflusst wird, hingegen nicht durch entweichendes Lösungsmittel. Eine Streuung für sichtbares Licht ist insbesondere <5 % und vorzugsweise weist die Folie eine Dicke von nicht mehr als 70 µm insbesondere nicht mehr als 40 µm auf.
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Weiter bevorzugt ist die Deckfolie mit dem äußeren Randelement lösbar verbunden und weist insbesondere eine Lasche auf, die sich über den Rand des äußeren Randelements hinaus erstreckt. Die lösbare Verbindung ermöglicht, dass die Deckfolie vor der Montage des Probenhalters auf einem Goniometerkopf leicht entfernt werden kann, sodass möglichst keine Erschütterungen zu einer Schädigung des zu messenden Kristalls führen kann. Die Lasche verstärkt diesen Vorteil, da die Folie über die Lasche leicht greifbar ist und leicht entfernt werden kann. Das Prinzip kann mit dem Entfernen eines handelsüblichen Joghurtdeckels verglichen werden. Somit es besonders bevorzugt, wenn die Deckfolie auf dem Randelement geklebt oder geschweißt, insbesondere wenn die Deckfolie eine sogenannte Heißsiegelfolie ist.
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Mit besonderem Vorteil weist die Probenfolie eine Perforation auf. Diese besteht vorzugsweise aus in Form, Größe und/oder Lage regelmäßigen oder unregelmäßigen Löchern. Die Perforation ermöglicht ein Passieren von Lösungen oder Lösungsmittel insbesondere von Mutterlösung durch die Probenfolie. Dies hat insbesondere den Vorteil, dass Mutterlösung oder überschüssiges Lösungsmittel hinter den Kristallen, also auf der von den Kristallen abgewandten Oberfläche der Probenfolie abgesaugt werden kann und somit Flüssigkeit vom Kristall berührungslos entfernt werden kann. Alternativ bietet sich die Möglichkeit auf der kristallzugewandten Seite eine Flüssigkeit aufzubringen, die dann durch die Probenfolie hindurch entfernbar ist. Dies kann beispielsweise beim sogenannten Liganden-Soaking vorteilhaft sein. Zusätzlich dient die Perforation als Unregelmäßigkeit auf der Oberfläche an der sich leicht Kristallisationskeime anordnen die wiederum ein Kristallwachstum auslösen. Die Perforation ist beispielsweise durch Laser, Stempel oder aber durch Nadeln eingebracht. Vorliegend ist unter in Form, Größe und Lage unregelmäßig zu verstehen, dass die Löcher auf der Oberfläche der Probenfolie nur bereichsweise einen Flüssigkeitstransport zulassen, sich also beispielsweise Perforationsinseln ausbilden.
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Für die Verwendung des Probenhalters bei einer röntgendiffraktometrischen Datensammlung ist es von Vorteil wenn die Probenfolie für Röntgenstrahlung möglichst transparent ist, also insbesondere eine Lichtstreuung von höchstens 5 %, eine Abbe Zahl von mindestens 50 und oder eine optische Anisotropie von nicht mehr als 0,02 % aufweist. Geeignete Materialien sind daher insbesondere Polyimide, wie das mit Markennamen bezeichnete Kapton® (Du Pont), oder aber Cycloolefin-Copolymere (COC).
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Alternativ oder zusätzlich weist der Probenhalter Zentrierstifte auf welche auf zumindest einem der Randelemente angeordnet sind und zur einfacheren Vororientierung und Fixierung der Folien beidseitig des Halters im Herstellungsprozess dienen. Dadurch ist die Ausschussware so gering wie möglich gehalten. Die Zentrierstifte haben funktional für die Messung und die Handhabung des Probenhalters keine Relevanz, sondern stellen eine reine Herstellungsoptimierung dar, indem sie als Montagehilfen eine exakte Positionierung der Deckfolie und Probenfolie beim Aufkleben auf den Probenhalter gewährleisten, so dass die Folien die Innen- und Außenbereiche des Probenhalters sauber abschließen. Durch entsprechend eingebrachte Löcher in den jeweiligen Folien, ist ein Verrutschen der Folien beim Kleben oder beim Umgang mit dem Halter ausgeschlossen.
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Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprüchen genannten Merkmalen.
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Die Erfindung wird nachfolgend in einem Ausführungsbeispiel und anhand der zugehörigen Zeichnung erläutert. Es zeigt:
- 1: eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Kit aus Probenhalter und Basis.
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes Kit aus Probenhalter 1 und Basis B.
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Der erfindungsgemäße Probenhalter 1 ist in schräger Aufsicht auf die Probenfolie 7 dargestellt. Die Deckfolie 6 befindet sich auf der, in der Ansicht rückseitigen Seite des Probenhalters. In der gezeigten Ausführungsform weist der Probenhalter 1 eine Halterung 5 auf die an einem äußeren Randelement 2 angeordnet ist. Das äußere Randelement 2 ist als Zylinderwand mit einer gegebenen Höhe ausgeführt, wobei die Deckfolie 6 auf einer Grundfläche des äußeren Randelements 2 angeordnet ist. Die Deckfolie 6 weist in der gezeigten Ausführungsform eine Lasche 6a auf die sich über den Rand des äußeren Randelements 2 erstreckt.
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Die Deckfolie ist bevorzugt für sichtbares Licht, also für ein Wellenlängenbereich von 350 - 780 nm möglichst transparent ausgeführt. D.h. sie zeigt eine Lichttransmission von mindestens 90 % in diesem Bereich, sowie eine Lichtstreuung von weniger als 5 %. Dabei sollte die Deckfolie 6 eine Dicke von 50 µm nicht überschreiten die Deckfolie 6 ist vorzugsweise auf dem Rand des äußeren Randelements 2 geschweißt oder geklebt. Besonders geeignet ist eine Heißsiegelfolie zur Verwendung als Deckfolie 6, also eine Deckfolie 6 aus einem Material welches durch Einwirkung von Hitze an den Kontaktflächen mit dem äußeren Randelement 2 lokal auf geschmolzen und infolgedessen mit dem Rand des äußeren Randelements 2 verklebt wird.
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Die Deckfolie 6 ist mittels der Fixierstifte 14 in ihrer Lage fixiert.
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In der gezeigten Ausführungsform weist das äußere Randelement 2 zwei Anschläge 13 in Form von seitlichen Erhöhungen auf. Diese Erhöhungen sind in einem inneren und einem äußeren Umfang des äußeren Randelements 2 angeordnet und erstrecken sich auf der der Probenfolie 7 zugewandten Seite über die Höhe des äußeren Randelements 2. Die Anschläge 13 dienen der formschlüssigen Fixierung des Probenhalters bei der Verwendung als Deckel eines Kristallisationsgefäßes (nicht gezeigt).
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Das Gerüst aus innerem Randelement 3, äußerem Randelement 2, Streben 4 und Halterung 5 ist vorzugsweise aus einem thermoplastische Kunststoff gefertigt, welcher zumindest in einem Temperaturbereich von -180 °C bis 160 °C temperaturstabil ist. Das Gerüst ist beispielsweise mittels eines 3-D Druckers (Temperatur bis 60 Grad) oder aber mittels Spritzguss herstellbar (deutlich höhere Temperatur möglich).
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Auf dem inneren Randelement 3 ist eine Probenfolie 7 derart angeordnet, dass sie eine in der gezeigten Ausführungsform kreisförmige Grundfläche des inneren Randelements 3 überspannt. Die Probenfolie weist Perforationen 8 auf, die in der gezeigten Ausführungsform inselartig angeordnet sind. Alternativ zu der gezeigten Ausführungsform können die Löcher der Perforation 8 auch in Form Größe und Anordnung regelmäßig angeordnet sein, also ein gleichmäßiges Muster ergeben. 1 zeigt jedoch den Vorteil einer unregelmäßigen, insbesondere inselartigen Ausgestaltung der Perforation 8, wobei jede Insel gleichsam als Kristallisationsinitiator dient. In der Figur schematisch dargestellt ist sowohl je ein auf der Probenfolie gewachsene Kristall 9 im Bereich der Perforation 8 sowie beispielhaft ein Tropfen Mutterlösung 10, die den wachsenden Kristall 9 einer dritten Perforationsinsel überdacht.
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Die Probenfolie 7 ist aus einem für Röntgenstrahlung möglichst transparenten Material gefertigt. Das Material der Probenfolie 7 sollte biologisch inert, röntgentransparent und möglichst dünn sein, also insbesondere eine Dicke von 40 µm nicht überschreiten, dickere Ausführungen sind jedoch nicht ausgeschlossen. Besonders geeignet sind Materialien die eine Lichtstreuung von weniger als 5 % sowie eine Transmission für sichtbares Licht von mindestens 90 % aufweisen.
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Besonders gute Ergebnisse konnten mit Polyimiden, wie Kapton®, sowie mit Cycloolefin Copolymeren erzielt werden.
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Der Probenhalter 1 im Ausführungsbeispiel ist an eine kommerzielle Well plate mit 22 mm Ø Standard Well Grösse angepasst. Auf einer solchen Platte wird er zur Kristallisation als Deckel verwendet, d.h. mit der Probenfolie zum Innenraum der Kavität angeordnet.
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Der erfindungsgemäße Probenhalter 1 ist mittels dem Halter 5 auf der Basis B anzuordnen, in dem der Halter 5 in die hierzu in der Basis B vorgesehene, formschlüssig angepasste Aufnahme A eingesteckt wird. Die Basis B ist im Ausführungsbeispiel aus einem magnetisierten Metall gebildet und weist eine zylindrische Form auf.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Probenhalter
- 2
- äußeres Randelement
- 3
- inneres Randelement
- 4
- Strebe
- 5
- Halterung
- 6
- Deckfolie
- 6a
- Lasche
- 7
- Probenfolie
- 8
- Perforation
- 9
- Kristall
- 10
- Mutterlösung
- 13
- Anschläge
- 14
- Fixierstifte
- B
- Basis
- A
- Aufnahme
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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