DE202018002198U1 - Identification of drugs that induce (re) differentiation in un-or dedifferentiated cells, especially in solid tumors - Google Patents
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Abstract
Vorrichtung umfassend eine erste Teilvorrichtung (1) und eine davon verschiedene zweite Teilvorrichtung (2), wobei die Vorrichtung die (a) schonende, (b) zeitgleiche, (c) gleichmäßige, (d) blasenfreie, (e) vollständige, (f) sterile und (g) effiziente, Entnahme bzw. Zugabe von Flüssigkeit(en) (z.B. Zellsuspensionen, Medien, Puffer oder Reagenzien) aus bzw. in Mikrotiterplatten von beliebiger Well-Zahl ohne die Verwendung von Multikanalpipetten oder Roboter-Systemen sondern mit Verwendung einfacher Handpipetten ermöglicht, so dass alle Arbeitsschritte mit Ausnahme der Zentrifugation steril unter einer handelsüblichen Zellkultur-Sterilwerkbank durchgeführt werden können. Device comprising a first sub-device (1) and a second sub-device (2) different therefrom, the device comprising (a) gentle, (b) simultaneous, (c) uniform, (d) bubble-free, (e) complete, (f) sterile and (g) efficient, removal or addition of liquid (s) (eg cell suspensions, media, buffers or reagents) from or in microtiter plates of any well number without the use of multichannel pipettes or robotic systems but using simple hand pipettes so that all operations except centrifugation can be carried out under sterile conditions using a commercial cell culture sterile workbench.
Description
Das vorliegende Gebrauchsmuster beschreibt eine aus zwei Teilvorrichtungen bestehende Vorrichtung, welche die (a) schonende, (b) zeitgleiche, (c) gleichmäßige, (d) blasenfreie, (e) vollständige, (f) sterile und (g) effiziente, Entnahme bzw. Zugabe von Flüssigkeit(en) (z.B. Medien ,Puffer oder Zellsuspensionen) aus bzw. in Mikrotiterplatten von beliebiger Well-Zahl ohne die Verwendung von Multikanalpipetten oder Roboter-Systemen sondern mit Verwendung einfacher Handpipetten ermöglicht. Alle Arbeitsschritte mit Ausnahme der Zentrifugation können steril unter einer handelsüblichen Zellkultur-Sterilwerkbank durchgeführt werden.The present utility model describes a device consisting of two partial devices, which is the (a) gentle, (b) simultaneous, (c) uniform, (d) bubble-free, (e) complete, (f) sterile and (g) efficient, removal or Addition of liquid (s) (eg media, buffer or cell suspensions) from or in microtiter plates of any well number without the use of multichannel pipettes or robotic systems but using simple hand pipettes. All operations, with the exception of centrifugation, can be carried out under sterile conditions using a commercial cell culture sterile workbench.
Teilvorrichtung zur Flüssigkeitsentfernung aus MikrotiterplattenPartial device for liquid removal from microtiter plates
Das Entfernen der Well-Flüssigkeit aus den einzelnen Wells einer Mikrotiterplatte wird hierbei nicht wie üblich durch Absaugen über (Multikanal)-Pipettensysteme sondern mittels kurzzeitiger Zentrifugation durchgeführt. Hierfür wurde ein für Zentrifugeneinsätze passendes Gefäß entwickelt, in das die Mikrotiterplatte mit der Öffnung der Mikrotiterplatten-Wells nach unten steril über die Gefäßwände und/oder -ränder durch einfachen Aufsatz passend fixiert werden kann und die Flüssigkeit bei der Zentrifugation aus den einzelnen Wells so gleichzeitig in das freie Lumen des Gefäßes abzentrifugiert werden kann. Die Entfernung der Flüssigkeit aus den einzelnen Wells in das entwickelte Gefäß ist dabei sehr effizient und vollständig, was bei Entnahme der Well-Flüssigkeit mittels Pipettensystemen oder Absaugvorrichtungen (z.B. Gefahr des Verlustes adhärent wachsender Zellen in den Wells) so nicht erreicht werden kann. Für Zellkultivierungsversuche mit adhärent wachsenden Zellen kann so nach nur wenigen Sekunden Zentrifugation mit z.B. 100-300xg steril das Medium vollständig abgenommen und aufgefangen werden, wobei keine Mediumreste in den Wells zurückbleiben. Hierdurch können effizient Waschschritte vermieden,somit die Versuchsdauer signifikant verkürzt und der Einsatz von Waschlösungen deutlich reduziert werden. Bei nachfolgender Kultivierung konnten keine Vitalitätsverluste der Zellen/Zelllinien beobachtet werden. Die effiziente Mediumabnahme und Vermeidung von Waschschritten erhöhen wesentlich die Robustheit von zellbasierten Testverfahren. Die effiziente Abnahme von Überständen in Testverfahren über Zentrifugation anstatt Absaugevorrichtungen führt auch in Verfahren wie zum Beispiel ELISA-basierten Systemen zu einer Vermeidung von Waschschritten und hiermit verbundenen Artefakten.The removal of the well fluid from the individual wells of a microtiter plate is not carried out as usual by aspiration via (multi-channel) pipette systems but by means of short-term centrifugation. For this purpose, a suitable for centrifuge inserts vessel was developed, in which the microtiter plate with the opening of the microtiter plate wells down sterile over the vessel walls and / or edges can be fixed by a simple essay and the liquid during centrifugation from the individual wells at the same time can be centrifuged into the free lumen of the vessel. The removal of the liquid from the individual wells into the developed vessel is thereby very efficient and complete, which can not be achieved in the case of removal of the well fluid by means of pipette systems or suction devices (for example the risk of the loss of adherently growing cells in the wells). For cell cultivation experiments with adherently growing cells, centrifugation with e.g. 100-300xg sterile the medium is completely removed and collected, leaving no residual media in the wells. As a result, washing steps can be efficiently avoided, thus significantly shortening the duration of the test and significantly reducing the use of washing solutions. In subsequent cultivation no loss of vitality of the cells / cell lines could be observed. Efficient media removal and avoidance of washing steps significantly increase the robustness of cell-based testing procedures. The efficient removal of supernatants in assays via centrifugation rather than aspirators also results in avoidance of washes and associated artifacts in procedures such as ELISA-based systems.
Es hat sich zudem gezeigt, dass aufgrund der mangelnden Adhärenz toter adhärenter Zellen (z.B. Epithelzellen) im Bereich der Zellkultur bei Verwendung der erwähnten Teilvorrichtung ein neuartiger kostenneutraler Toxizitätstest für adhärente Zellen integriert wird, da die toten Zellen bei der Zentrifugation mitentfernt werden und die Verringerung der Adhärenz somit als neuartiges Vitalitätskriterium in einem Testverfahren für adhärente Zellen verwendet werden kann. So kann z.B. über die Reduktion eines vorher von Zellen aufgenommenen bzw. gebundenen Fluorophors oder Chromophors oder auch ohne deren Verwendung allein aufgrund der Absorption durch zelluläre Nukleotide und aromatische Aminosäuren mit Absorptionsmaximum bei 280 nm nach Zentrifugation in Relation zum Hintergrundsignal die Anzahl vitaler Zellen quantifiziert werden. Dies wird möglich, da nach Kultivierung unter toxischen Bedingungen und anschließender mittels der beschriebenen Teilvorrichtung Zentrifugation-basierter Mediumabnahme tote Zellen entfernt werden und nur die verbliebenen vitalen adhärente Zellen als Quelle eines Fluoreszenz- oder Absorptionssignals dienen. Zudem liegen die Messung störende Mediumreste aufgrund der mittels der Vorrichtung vorgenommenen Mediumabnahme nicht mehr vor. Nach der Vitalitätsmessung stehen die vitalen Zellen im Gegensatz zu herkömmlichen Vitalitätstests unbehandelt für weitere Untersuchungen zur Verfügung.It has also been shown that due to the lack of adherence of dead adherent cells (eg epithelial cells) in the area of cell culture when using the mentioned subunit a novel cost neutral toxicity test is integrated for adherent cells, since the dead cells are removed in the centrifugation and reducing the Adherence can thus be used as a novel vitality criterion in a test procedure for adherent cells. Thus, e.g. the number of vital cells can be quantified by the reduction of a fluorophore or chromophore previously taken up by cells or bound or even without their use solely on the basis of absorption by cellular nucleotides and aromatic amino acids with absorption maximum at 280 nm after centrifugation in relation to the background signal. This becomes possible because cells are removed after cultivation under toxic conditions and subsequent dead cells by means of the described centrifugation-based medium removal device, and only the remaining vital adherent cells serve as the source of a fluorescence or absorption signal. In addition, the measurement interfering medium residues are no longer due to the medium removal made by means of the device. After the vitality measurement, the vital cells, in contrast to conventional vitality tests untreated, are available for further examinations.
Teilvorrichtung zur Flüssigkeitszugabe in MikrotiterplattenSubassembly for the addition of liquid in microtiter plates
Herkömmlich kann die zeitgleiche Medium- bzw. Flüssigkeitszugabe in alle Wells einer Mikrotiterplatte über einen Multikanal-Roboterkopf realisiert werden. Alternativ wurde nun erstmals festgestellt, dass dies auch unter Verwendung herkömmlicher (Multikanal-/) Handpipetten mit einer speziell hergestellten Mikrotiterplatte erreicht werden kann:
- - Hierbei wird in einem ersten Schritt in eine hergestellte Mikrotiterplatte mit konischen sich nach untenverjüngenden und am unteren Ende (z.B. kreisförmig) offenen Wells, die zuzugebende Flüssigkeit zugegeben. Für jedes einzelne Well kann hierbei gezielt eine gesonderte Flüssigkeitszusammensetzung verwendet werden. Aufgrund der Oberflächenspannung fließt die Flüssigkeit nicht durch die Öffnung im Boden der einzelnen konischen/sich nach unten verjüngenden Wells. Der Durchmesser der Loch-Bohrung ist hierbei an die Oberflächenspannung der Flüssigkeit anzupassen: Geringere Oberflächenspannung z.B. bei Gegenwart von Detergenzien, erfordern einen geringeren Durchmesser, erhöhte Oberflächenspannung einer Flüssigkeit ermöglichen einen größeren Durchmesser. Alternativ kann das Beladen der Mikrotiterplatte mit konischen/sich nach unten verjüngenden Wells mit Flüssigkeit statt mittels Pipettieren auch in einem Schritt einfach über das vollständige Eintauchen der Mikrotiterplatte in die Flüssigkeit erreicht werden.
- - In einem zweiten Schritt wird dann die Mikrotiterplatte mit den konischen/sich nach unten verjüngenden Wells passend auf die Mikrotiterplatte, in die das Medium bzw. die Flüssigkeit überführt werden soll (handelsübliche Mikrotiterplatte mit nicht-konischen Wells, z.B. quadratischen Wells), gesetzt, wobei die konischen/ sich nach unten verjüngenden Wells nicht den Boden der nicht-konischen Wells berühren. Zur Erhaltung der Sterilität wird die Mikrotiterplatte mit einem passenden Deckel verschlossen. Nun kann unter Zentrifugation gleichzeitig die Flüssigkeit aus den konischen/sich nach unten verjüngenden Wells in die Mikrotiterplatte mit nicht-konischen Wells zentrifugiert werden. Hierbei wird unabhängig von der verwendeten Drehzahl durch die Radialkraft automatisch unter dem geringst-möglichen Druck die Flüssigkeit durch die Well-Öffnung der konischen/sich nach unten verjüngenden Wells in die nicht-konischen Wells gedrückt. Dies ist dabei unabhängig von Höhe der bei der Zentrifuge eingestellten Zentrifugationsgeschwindigkeit, da bereits bei der geringst möglichen Umdrehung im Beschleunigungsprozess, bei der die zugehörige Radialkraft die Kraft der Oberflächenspannung, die die Flüssigkeit zurückhält, übersteigt, die Flüssigkeit in das zugehörige nichtkonische Well überführt wird. Eine weitere Steigerung der Zentrifugationsgeschwindigkeit kann ggf. noch erreichen, dass durch Adhäsion verbliebene Rest-Flüssigkeit vollständig überführt wird. Hierdurch wird aufgrund der vollständigen Flüssigkeitsentfernung eine weitere Verwendung der gelochten Mikrotiterplatte für andere Substanzen ohne vorherige Reinigung ermöglicht.
- - In this case, the liquid to be added is added in a first step in a prepared microtiter plate with conical downwardly tapering and at the bottom (eg circular) open wells. For each individual well, a separate liquid composition can be used in a targeted manner. Due to the surface tension, the liquid does not flow through the opening in the bottom of the individual conical / downwardly tapered wells. The diameter of the hole is to be adapted to the surface tension of the liquid: Lower surface tension, for example, in the presence of detergents, require a smaller diameter, increased surface tension of a liquid allow a larger diameter. Alternatively, loading the microtiter plate with conical / downwardly tapered wells with liquid rather than pipetting can also be achieved in one step simply by completely submerging the microtiter plate in the liquid.
- In a second step, the microtiter plate with the conical / downwardly tapering wells is then placed on the microtiter plate into which the medium or the liquid is to be transferred (commercial microtiter plate with non-conical wells, eg square wells). the conical / downwardly tapered wells do not touch the bottom of the non-conical wells. To maintain sterility, the microtiter plate is closed with a suitable lid. Now, under centrifugation, the liquid from the conical / downwardly tapered wells can be simultaneously centrifuged into the microtiter plate with non-conical wells. In this case, regardless of the speed used by the radial force automatically under the lowest possible pressure, the liquid through the well opening of the conical / downwardly tapered wells pressed into the non-conical wells. This is independent of the amount of centrifugation speed set in the centrifuge, since even at the lowest possible revolution in the acceleration process in which the associated radial force exceeds the force of the surface tension which holds the liquid, the liquid is transferred to the associated non-conical well. A further increase in the centrifugation speed may possibly still achieve that remaining liquid left over by adhesion is completely transferred. In this way, due to the complete liquid removal, further use of the perforated microtiter plate for other substances is made possible without prior purification.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mittels der beschriebenen Teilvorrichtung mit einer von null aufsteigende Zentrifugationsgeschwindigkeit bis z.B. 300 g in einer herkömmlichen Zellkulturzentrifuge einzelne Flüssigkeiten gezielt, schonend, zeitgleich, gleichmäßig und vollständig in die einzelnen Wells einer Mikrotiterplatte überführt werden können.In summary, it can be stated that by means of the described sub-device with a zero-ascending centrifugation speed up to e.g. 300 g in a conventional cell culture centrifuge individual liquids targeted, gentle, simultaneous, uniform and complete in the individual wells of a microtiter plate can be transferred.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- Fig. 1:Fig. 1:
-
Draufsicht auf Teilvorrichtung 1Top view on
sub-device 1 - Fig. 2:Fig. 2:
-
Seitliche Ansicht Teilvorrichtung
1 (über die Längsseite)Side view Part device1 (over the long side) - Fig. 3:3:
-
Seitliche Ansicht Teilvorrichtung
1 (über die Querseite)Side view Part device1 (across the lateral side) - Fig. 4:4:
-
Bodenansicht von Teilvorrichtung
1 Bottom view ofpart device 1 - Fig. 5:Fig. 5:
-
Perspektivischer Ausschnitt von Teilvorrichtung
1 zur Verdeutlichung der Auflageflächen für die MTP-Platte und der eingefügten Aussparung zur vereinfachten Entnahme der MTP-PlattePerspective section ofpart device 1 to clarify the support surfaces for the MTP plate and the inserted recess for easy removal of the MTP plate - Fig. 6:Fig. 6:
-
Perspektivische Ansicht auf Teilvorrichtung
1 von der Ecke aus betrachtetPerspective view onpart device 1 viewed from the corner - Fig. 6:Fig. 6:
-
Draufsicht auf Teilvorrichtung
2 Top view onpart device 2 - Fig. 7:Fig. 7:
-
Seitliche Ansicht Teilvorrichtung
2 (über die Längsseite)Side view Part device2 (over the long side) - Fig. 9:Fig. 9:
-
Seitliche Ansicht Teilvorrichtung
2 (über die Querseite)Side view Part device2 (across the lateral side) - Fig. 10:Fig. 10:
-
Perspektivische Ansicht auf Teilvorrichtung
2 von der Ecke aus betrachtetPerspective view onpart device 2 viewed from the corner
Die Bezugszeichen bedeuten:
- a1/a2
Seitenwände der Teilvorrichtung 1 - b1/b2
Seitenwände der Teilvorrichtung 1 - c1/c2
Boden der Teilvorrichtung 1 - da/db
- Vorsprünge der Seitenwände Auflagefläche für die MTP-Platte
- e1/e2
- Aussparung zur vereinfachten Entnahme der MTP-Platte
- 1:
- Platte der Teilvorrichtung
B - 2:
- Wells
- 3:
- Boden der Wells
- a 1 / a 2
- Side walls of the
sub-device 1 - b 1 / b 2
- Side walls of the
sub-device 1 - c 1 / c 2
- Floor of the
sub-device 1 - d a / d b
- Projections of the side walls Support surface for the MTP plate
- e 1 / e 2
- Recess for easy removal of the MTP plate
- 1:
- Plate of the part device
B - 2:
- Wells
- 3:
- Bottom of the wells
Claims (3)
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---|---|---|---|
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JP2019572786A JP2020525036A (en) | 2017-06-29 | 2018-06-28 | Method for identifying multiple pharmaceutical agents that induce (re)differentiation in undifferentiated or dedifferentiated cells, especially in solid tumors |
US16/626,896 US20200116701A1 (en) | 2017-06-29 | 2018-06-28 | Methods for identifying agents which induce (re) differentiation in un- or dedifferentiated solid tumor cells |
EP18732821.6A EP3646027A1 (en) | 2017-06-29 | 2018-06-28 | Methods for identifying agents which induce (re) differentiation in un- or dedifferentiated solid tumor cells |
CN201880044487.XA CN110832321A (en) | 2017-06-29 | 2018-06-28 | Method for identifying agents inducing the (re) differentiation of undifferentiated or dedifferentiated solid tumor cells |
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2018
- 2018-05-02 DE DE202018002198.9U patent/DE202018002198U1/en active Active
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