DE202011108189U1

DE202011108189U1 - Vorrichtung und Fluidikmodul zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe

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Publication number: DE202011108189U1
Application number: DE202011108189U
Authority: DE
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2011-12-13
Anticipated expiration: 2021-06-09

Abstract

Vorrichtung zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe aus einer zu verdünnenden Lösung (A), die eine zu verdünnende Substanz enthält, und einer Verdünnungslösung (B), mit folgenden Merkmalen: einem Rotationskörper (10), der fluidische Strukturen (46) aufweist, einem Antrieb (20), der ausgelegt ist, um den Rotationskörper (10) mit Rotationen unterschiedlicher Rotationsprotokolle zu beaufschlagen, und einer Steuerung (24), die ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um die Rotationsprotokolle zu durchlaufen, wobei die fluidischen Strukturen (46) folgende Merkmale aufweisen: eine erste Mischkammer (m1) mit zumindest einem Fluidauslass, eine zweite Mischkammer (m2) mit zumindest einem Fluideinlass, eine fluidische Verbindung (s1) zwischen dem Fluidauslass der ersten Mischkammer (m1) und dem Fluideinlass der zweiten Mischkammer (m2), wobei die fluidische Verbindung (s1) zwischen der ersten Mischkammer (m1) und der zweiten Mischkammer (m2) derart ausgelegt ist, dass bei Durchlaufen eines ersten Rotationsprotokolls ein definiertes Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) und ein...

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit Vorrichtungen und Fluidikmodulen zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe und insbesondere Vorrichtungen und Fluidikmodule zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe auf einer zentrifugal-mikrofluidischen Plattform.
Die Herstellung von Verdünnungsreihen ist eine Routineaufgabe in jedem biologischen, chemischen oder medizinischen Labor weltweit. Das manuelle Verdünnen von Reagenzien bzw. Proben mittels Pipette wird für eine Vielzahl von Anwendungen benötigt und ist folglich fester Bestandteil der täglichen Laborarbeit. Entsprechend der Aufgabenstellung werden typischerweise 3 bis 10 Verdünnungen mit Verdünnungsfaktoren zwischen 2 und 20 hergestellt. Sollte eine bestimmte Verdünnungsreihe sehr oft benötigt werden, so kann eine Automatisierung mittels Pipettierroboter erfolgen. Mögliche Beispiele für die Verwendung von Verdünnungsreihen sind unter anderem:

– Verdünnung von Nukleinsäuren in Verbindung mit einer (quantitativen) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Erzeugung eines Kalibrier-Standards mit einer bekannten Menge an Nukleinsäuren oder zur Konzentrationsbestimmung einer unbekannten Nukleinsäureprobe.
– Verdünnung von Antikörpern für immundiagnostische Anwendungen zur Einstellung eines Arbeits- oder Detektionspunktes eines ELISA-(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) oder kompetitiven Immunoassays sowie die Herstellung einer Verdünnungsreihe einer bekannten Probe zur Kalibrierung des Assays selbst.
– Verdünnung von Inhibitoren und Bestimmung der konzentrationsbedingten Auswirkung auf die Enzymaktivität etwa zur Ermittlung des IC50 Wertes.
– Bestimmung von Dosis-Wirkungsbeziehungen zur Ermittlung von Minimaldosen und Untersuchung der allgemeinen Abhängigkeit zwischen Dosis und der zu untersuchenden Wirkung.
– Erstellung von Kalibrierverdünnungen jeglicher Art, wie beispielsweise der optischen Dichte von Bakteriensuspensionen, von Fluoreszenzfarbstoffen, von Enzymen, von Proben in einem Puffer, sowie von Inhibitoren und Aktivatoren.

Ein spezifisches Anwendung ist beispielhaft eine typische Enzymkinetikmessung. Hierzu wird meist eine Verdünnungsreihe eines Substrates eines Enzyms verwendet und die Menge eines erzeugten Produkts innerhalb einer vorgegebenen Zeit bzw. die Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms im Produkt pro Zeiteinheit wird vermessen. Die Verdünnungsreihe umfasst meist 2 bis 4 Größenordnungen an Konzentrationen des Substrats. Die Menge des Enzyms bleibt hierbei konstant. Ähnlich geartete Verdünnungsreihen werden bei Inhibitionsuntersuchungen gemacht, wobei die Enzymmenge und die Substratmenge konstant gehalten werden. Einzig der Inhibitor wird verdünnt.
Eine weitere spezifische Anwendung ist die Verwendung einer Verdünnungsreihe für die Bestimmung einer Bakterienanzahl. Man verdünnt hierzu die Bakterien meist in einer dekadischen logarithmischen Verdünnungsreihe und plattiert ein kleines Volumen jeder Verdünnung aus. Die Verdünnung, die als ”zählbar” (einige bis unter Tausend Bakterienkolonien) befunden wird, wird erfasst und aus den erhaltenen Werten und unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors wird dann die Gesamtanzahl der Bakterien aus der Probe berechnet.
Eine weitere spezifische Verwendung einer Verdünnungsreihe ist die Bestimmung einer DNA-Konzentration bzw. die Verwendung zur Kalibrierung eines PCR-Thermocyclers. Aus einer DNA-haltigen Lösung wird eine Verdünnungsreihe angesetzt. Diese wird dann mit einem PCR-Mix versetzt und die entsprechende enzymatische Reaktion wird durchgeführt. Die Verdünnungsreihen der DNA werden gemessen und aus dem charakteristischen Anstieg der erhaltenen Kurven läßt sich dann die Anfangskonzentration der DNA ermitteln. Da die Anfangskonzentration meist unbekannt ist, wird eine Verdünnungsreihe erzeugt, um zu ermitteln, wann kein Signal mehr erzeugt werden kann. Diese Verdünnung entspricht dann der Konzentration an DNA, die rein statistisch keinen DNA-Strang mehr enthält. Somit kann man aus diesem ”Nicht-Erscheinen” des Signals die Konzentration der DNA bestimmen. Eine Probe mit bekannter DNA kann im Gegenzug dazu verwendet werden, das PCR-System zu validieren. Auch hierzu wird eine Verdünnungsreihe erzeugt, um zu zeigen, dass die Zeitpunkte des charakteristischen Signalanstieges der PCR linear mit der Konzentration der DNA korrelieren.
Die automatisierte Herstellung von Verdünnungsreihen kann mittels eines Pipettierroboters erfolgen, was jedoch aufgrund der Kosten speziell für Anwendungen mit geringem und mittlerem Durchsatz nicht wirtschaftlich ist. Weiterhin muss bei der Erzeugung von Verdünnungsreihen sehr stark auf die Vermeidung von Kontaminationen und Kreuzkontaminationen geachtet werden. Bei automatisierten Lösungen ist dies teils sehr schwierig, wenn die entsprechend kontaminierten Teile des Pipettierroboters gereinigt werden müssen, oder bedeuten einen hohen Umsatz an Verbrauchsmaterialien, wie z. B. wegwerfbare Pipettierspitzen, bei gleichzeitigem hohen technischen Aufwand für die Mechanik, um diese Spitzen aufzunehmen, deren korrekten Sitz zu prüfen und sie nach dem Dispensieren wieder abzuwerfen.
Verdünnungsreihen, insbesondere indirekte Verdünnungsreihen, werden folglich in der Regel durch manuelles Pipettieren hergestellt. Dies umfasst eine mehrfache Wiederholung der folgenden Schritte:

1. Zugabe eines definierten Volumens der Lösung A (zu verdünnende Lösung) zu einem vorgelegten definierten Volumen der Lösung B (Verdünnungslösung)
2. Gutes und vollständiges Mischen und Homogenisieren der Verdünnung und gegebenenfalls Abzentrifugieren bei Schaumbildung;
3. Entnahme eines definierten Volumens der Verdünnung AB und Transfer in ein definiertes Volumen der Lösung B; und
4. Zyklisches Wiederholung der Schritte 2 und 3 bis eine entsprechende Verdünnungsreihe erzeugt wurde.

Besonders problematisch ist hierbei die exponentielle Fortpflanzung von Pipettierfehlern. Beispielsweise wird eine einmalig falsch eingestellte Pipette oder mangelnde Durchmischung zu Beginn der Verdünnungsreihe sich auf sämtliche, davon abgeleitete Konzentrationen auswirken. Dieser Fehler geschieht einmalig und setzt sich linear durch die Verdünnungsreihe fort. Sollte der Pipettierschritt für die Vorlage der Lösung B oder für die Entnahme und Überführung der Verdünnung AB fehlerbehaftet sein, so pflanzt sich dieser Fehler exponentiell fort.
Darüber hinaus stellt das manuelle Handling kleinster Flüssigkeitsvolumina mit entsprechender Präzision eine entsprechende Herausforderung dar. Beispielsweise ist es für die Erstellung einer Verdünnung mit Verdünnungsfaktor 10 und einem Gesamtvolumen von 10 μL notwendig, 1 μL einer Lösung A mit 9 μL einer Lösung B zu mischen. Für die Automatisierung im beschriebenen Volumenregime sind spezielle Dispensiersysteme erforderlich, um die benötigte Präzision zu gewährleisten.
Im Stand der Technik sind diverse mikrofluidische Systeme zur automatischen Erzeugung von diskreten Verdünnungen oder Konzentrationsgradienten beschrieben. Grundlegend wird hierbei anhand der Art der Flüssigkeitsaktuierung zwischen zentrifugalen und druckgetriebenen mikrofluidischen Systemen unterschieden. Während zentrifugale Systeme Flüssigkeiten passiv durch gezielte Rotation und die hierdurch entstehenden zentrifugalen Kräfte schalten und bewegen können, werden Flüssigkeiten in druckgetriebenen Systemen durch eine äußere Druckquelle, beispielsweise eine Spritzenpumpe oder eine Luftdruckquelle bewegt, wie bei D. Mark et al., Chem. Soc. Rev., 2010, 39: 1153–1182, beschrieben ist. Der Vorteil von zentrifugal aktuierten Systemen ist grundsätzlich die Möglichkeit, mit kleinsten Volumina und nahezu Totvolumen-frei arbeiten zu können. Andererseits sind maximale Volumina auf einige ml begrenzt. Druckgetriebene Systeme können prinzipiell größere Volumina verarbeiten (bis zu Volumina von m³ bei der Herstellung von Lebensmitteln wie z. B. Multivitaminsäften). Für großvolumige Verdünnungen (> 50 μl) sind manuelle Pipettierfehler tendenziell vernachlässigbar.
C.-Y. Chen et al., Proc. MicroTas, 2010, S. 752–754, beschreiben einen PDMS-Chip (PDMS = Polydimethylsiloxan) mit fünf Flüssigkeitseinlässen, einem Auslass und magnetisch gesteuerten Ventilen. Abhängig von der Ventilstellung können so Verdünnungsstufen mit einem Verhältnis von 1:10 über 5 Größenordnungen hergestellt werden. Als Anwendungsbeispiel wird Tetraethylammonium (TEA) in einem Puffer verdünnt und die Auswirkung auf die Ionen-Kanäle von Zellen beobachtet. Das System ist sehr komplex im Aufbau und besitzt sehr hohe Totvolumen (zum Befüllen der Schläuche).
J. Koehler et al., Assay Drug Develop., 2002, S. 91–96, beschreiben eine druckgetriebene Fluidik zur automatischen Erzeugung von Verdünnungen. Als Anwendungsbeispiel werden verschiedene Substratflüssigkeiten (chemische Verbindungen, die in einer von einem Enzym katalysierten Reaktion umgesetzt werden) für Enzymkinetik- und Dosis-Wirkungs-Messungen verdünnt. Das System ist hierbei so konstruiert, das die entstehenden Fluoreszenzsignale in einem Standard-Mikrotiterplatten-Leser ausgelesen werden können Die Totvolumen sind sehr hoch, die Verdünnungsstufen müssen programmiert werden und die Verdünnungen können nicht einfach entnommen werden. Der Eintrag von Luftblasen oder die Veränderungen von fluidischen Widerständen führt zu einem unkontrollierbaren verstellen der Flussraten und erzeugt hierdurch Fehler in den Verdünnungen.
Darüber hinaus sind verschiedene druckgetriebene fluidische Systeme zur Erzeugung von Konzentrationsgradienten bei Noo Li Jeon et al., Langmuir, 2000, 16: 8311–8316, und Kyle Champbell et al., Lab Chip, 2007, 7: 264–272, beschrieben.
Ein trägheitsbedingtes Mischen von Flüssigkeiten in einer Mischkammer durch Variieren der Rotationsfrequenz ist bei M. Grumann et al., Lab Chip, 2005, 5: 560–565, beschrieben.
In der US 2008/0193336 A1 ist ein zentrifugal-mikrofluidisches System zur Erzeugung von Verdünnungen offenbart. Flüssigkeiten können in einer zentralen Mischkammer gemischt werden. Der Verdünnungsfaktor Z und die erzeugten Volumina werden hierbei durch mehrere Kanäle bestimmt, die in definierter radialer Höhe Flüssigkeit aus den Einfüllkammern in die Mischkammer überführen. Alternativ können mehrere Einfüllkammern verwendet werden, deren Inhalt seriell jeweils nach dem Öffnen eines Ventils in die Mischkammer überführt wird. Die erzeugte Mischung kann anschließend in Endkammern weiter geleitet werden. Um die entsprechenden fluidischen Wege zu öffnen oder zu schließen, sind in die Kartusche Wachsventile integriert, die aktiv über einen externen Laser aufgeschmolzen werden müssen. Die Volumina und die Verdünnungen sind durch das mikrofluidische Design der Kartusche vorgegeben und können nicht nachträglich verändert werden.
Die US 2011/0085950 A1 offenbart ein mikrofluidisches System, das einen Spindelmotor aufweist, über den ein Träger antreibbar ist. Kartuschen, in denen fluidische Strukturen (46) gebildet sind, sind in den Träger einsetzbar.
Die US 6004515 und die US 5869004 sind auf Verfahren und Vorrichtungen zur Erzeugung von Verdünnungen gerichtet, bei denen Verdünnungen mittels eines Hauptkanals insbesondere unter Verwendung eines elektroosmotischen Flusses erzeugt werden.
Aus der US 6632655 B1 sind Techniken beschrieben, bei denen Arrays von fließfähigen oder festen Partikelsätzen in mikrofluidischen Systemen verwendet werden, um Assays durchzuführen und einen hydrodynamischen Fluss zu modifizieren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Fluidikmodul zu schaffen, die eine automatisierte Erzeugung von Verdünnungsreihen mit hoher Genauigkeit ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung nach Anspruch 1 und ein Fluidikmodul nach Anspruch 20 gelöst.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe aus einer zu verdünnenden Lösung, die eine zu verdünnende Substanz enthält, und einer Verdünnungslösung, mit folgenden Merkmalen:
einem Rotationskörger, der fluidische Strukturen aufweist,
einem Antrieb, der ausgelegt ist, um den Rotationskörper mit Rotationen unterschiedlicher Rotationsprotokolle zu beaufschlagen, und
einer Steuerung, die ausgelegt ist, um den Antrieb zu steuern, um die Rotationsprotokolle zu durchlaufen,
wobei die fluidischen Strukturen folgende Merkmale aufweisen:
eine erste Mischkammer mit zumindest einem Fluidauslass,
eine zweite Mischkammer mit zumindest einem Fluideinlass,
eine fluidische Verbindung zwischen dem Fluidauslass der ersten Mischkammer und dem Fluideinlass der zweiten Mischkammer,
wobei die fluidische Verbindung zwischen der ersten Mischkammer und der zweiten Mischkammer derart ausgelegt ist, dass bei Durchlaufen eines ersten Rotationsprotokolls ein definiertes Volumen der zu verdünnenden Lösung und ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung in der ersten Mischkammer gemischt werden, um eine erste Mischung mit einem ersten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen, wobei kein Teil der ersten Mischung in die zweite Mischkammer gelangt, und
wobei die fluidische Verbindung zwischen der ersten Mischkammer und der zweiten Mischkammer derart ausgelegt ist, dass bei Durchlaufen eines zweiten Rotationsprotokolls ein definiertes Teilvolumen der ersten Mischung aus der ersten Mischkammer durch die fluidische Verbindung in die zweite Fluidkammer, in der sich ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung befindet, transportiert wird und ein definiertes Volumen der ersten Mischung in der ersten Mischkammer verbleibt,
wobei die Steuerung ausgelegt ist, um den Antrieb zu steuern, um das erste und das zweite Rotationsprotokoll zu durchlaufen und nach dem Durchlaufen des ersten Rotationsprotokolls und des zweiten Rotationsprotokolls ein drittes Rotationsprotokoll zu durchlaufen, um in der zweiten Mischkammer das definierte Teilvolumen der ersten Mischung mit dem definierten Volumen der Verdünnungslösung zu mischen, um eine zweite Mischung mit einem zweiten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen.
Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung können somit ein definiertes Volumen einer ersten Mischung mit einem ersten Verdünnungsverhältnis in der ersten Mischkammer und ein definiertes Volumen einer zweiten Mischung mit einem zweiten Verdünnungsverhältnis in der zweiten Mischkammer erzeugt werden. Ausführungsbeispiele ermöglichen somit die Erzeugung einer Verdünnungsreihe, die zwei Mischungen mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen aufweist. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können n Mischkammern vorgesehen sein, wobei n eine natürliche Zahl ≥ 3 ist, so dass eine Verdünnungsreihe mit drei oder mehr Mischungen unterschiedlicher Verdünnungsverhältnisse erzeugt werden kann. Dabei sind die Mischkammern über entsprechende fluidische Verbindungen verbunden, wobei die Mischungen seriell nacheinander erzeugt werden, indem jeweils ein definiertes Teilvolumen einer Mischung aus einer vorhergehenden Mischkammer mittels des Durchführens eines entsprechenden Rotationsprotokolls über die fluidische Verbindung in eine nachfolgende Mischkammer verbracht wird und dort mit einem definierten Volumen der Verdünnungslösung gemischt wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung basieren dabei auf der Erkenntnis, dass Verdünnungsreihen automatisiert vorteilhaft dadurch erzeugt werden können, dass auf einer zentrifugalen Plattform eine Mehrzahl von Mischkammern verwendet wird. Dadurch ist es möglich, durch Durchlaufen entsprechender Rotationsprotokolle einen zentrifugalen Antrieb für die zu verdünnende Substanz, die Verdünnungslösung und die Mischungen bereitzustellen. Somit können durch Vorsehen entsprechender fluidischer Strukturen und durch ein Variieren der Rotationsfrequenz, mit der der Rotationskörper beaufschlagt wird, jegliche gewünschte Verdünnungsreihen, wie z. B. logarithmische Verdünnungsreihen, implementiert werden.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist die fluidische Verbindung einen Siphon auf, wobei der Siphon einen Fluideinlass, der an einer ersten radialen Position in die erste Mischkammer mündet, und einen Fluidauslass, der an einer zweiten radialen Position in die zweite Mischkammer mündet, aufweist, wobei die zweite radiale Position radial außerhalb der ersten radialen Position ist. Die Teile der ersten Mischkammer, die radial außerhalb der ersten radialen Position liegen, können dabei ein definiertes Fluidvolumen festlegen, so dass durch Entleeren der ersten Mischkammer über den Siphon ein definiertes Flüssigkeitsvolumen in der ersten Mischkammer verbleiben kann. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung mit n Mischkammern kann ein entsprechender Siphon jeweils zwischen einer vorhergehenden Mischkammer und einer nachfolgenden Mischkammer vorgesehen sein, wobei die die Position, an der der Siphon in die vorhergehende Mischkammer mündet, radial innerhalb der Position ist, an der der Siphon in die nachfolgende Mischkammer mündet.
Bei Ausführungsbeispielen erstrecken sich die Mischkammern von einer Position, an der die fluidische Verbindung von der vorhergehenden Mischkammer in die Mischkammer mündet, radial nach außen, so dass eine vorhergehende Mischkammer jeweils radial weiter innen angeordnet ist als eine nachfolgende Mischkammer. Dies ermöglicht auf einfache Weise einen zentrifugalen Flüssigkeitstransport zwischen den Mischkammern.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann jeder Mischkammer eine Dosierkammer zugeordnet sind, die über ein fluidisches Ventil mit der Mischkammer verbunden ist. Die Dosierkammern können Finger einer Aliquotierstruktur bilden, über die ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung in jede der Mischkammern eingebracht werden kann. Die Dosierkammern können dabei ausgelegt sein, um das gleiche oder unterschiedliche Volumina der Verdünnungslösung in die unterschiedlichen Mischkammern einzubringen. Bei Ausführungsbeispielen werden die Dosierkammern der Aliquotierstruktur jeweils mit einem definierten Volumen der Verdünnungslösung befüllt, indem ein viertes Rotationsprotokoll durchlaufen wird, wobei die definierten Volumen dann über die Ventile in die Mischkammern eingebracht werden, indem ein fünftes Rotationsprotokoll durchlaufen wird. Die Ventile können bei Ausführungsbeispielen durch radial nach außen verlaufende hydrophobe Engstellen gebildet sein, die die Verdünnungslösung erst ab einer vorbestimmten Rotationsgeschwindigkeit passieren kann.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können die fluidischen Strukturen zum Bereitstellen eines definierten Volumens der zu verdünnenden Lösung eine Vorportionierungskammer aufweisen, die mit der ersten Mischkammer fluidisch verbunden ist. Die Vorportionierungskammer kann bei Ausführungsbeispielen der Erfindung eine geeignete Überlaufstruktur aufweisen, so dass das an die erste Mischkammer weitergeleitete Volumen der zu verdünnenden Lösung unabhängig von einem eingefüllten Volumen der zu verdünnenden Lösung ist, sofern eine das definierte Volumen übersteigende Menge der zu verdünnenden Lösung eingefüllt wird. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann der Rotationskörper bzw. das Fluidikmodul mit mehreren Vorportionierungskammern versehen sein, die jeweils einen Einlas aufweisen und unterschiedliche Volumina definieren, so dass eine von mehreren möglichen Verdünnungsreihen mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen durch Auswahl eines entsprechenden Einlasses ausgewählt werden kann. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Vorportionierungskammer in einem Einsatz vorgesehen sein, der wechselbar ist, so dass durch Wechseln zwischen Vorportionierungskammern mit unterschiedlichen definierten Volumina unterschiedliche Verdünnungsreihen erzeugt werden können.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein Fluidikmodul, das den Rotationskörper bildet, oder eingesetzt in einen Träger den Rotationskörper bildet. Das Fluidikmodul weist die fluidischen Strukturen auf, die das Erzeugen der Verdünnungsreihe ermöglichen, wie sie hierin beschrieben sind.
Ein Verfahren zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe aus einer zu verdünnenden Lösung, die eine zu verdünnende Substanz enthält, und einer Verdünnungslösung, kann folgende Merkmale aufweisen:
Einbringen eines definierten Volumens der Verdünnungslösung in eine erste Mischkammer und Einbringen eines definierten Volumens der Verdünnungslösung in eine zweite Mischkammer, wobei die erste und die zweite Mischkammer in einem Rotationskörper gebildet sind und wobei ein Fluidauslass der ersten Mischkammer über eine fluidische Verbindung mit einem Fluideinlass der zweiten Mischkammer verbunden ist;
Einbringen eines definierten Volumens der zu verdünnenden Lösung in die erste Mischkammer;
Beaufschlagen des Rotationskörpers mit einem ersten Rotationsprotokoll, so dass eine erste Mischung mit einem ersten Verdünnungsverhältnis in der ersten Mischkammer erzeugt wird, ohne dass ein Teil der ersten Mischung in die zweite Mischkammer gelangt;
Beaufschlagen des Rotationskörpers mit einem zweiten Rotationsprotokoll, so dass ein definiertes Teilvolumen der ersten Mischung aus der ersten Mischkammer in die zweite Fluidkammer, in der sich das definierte Volumen der Verdünnungslösung befindet, transportiert wird und ein definiertes Volumen der ersten Mischung in der ersten Mischkammer verbleibt; und
Beaufschlagen des Rotationskörpers mit einem dritten Rotationsprotokoll, um in der zweiten Mischkammer das definierte Teilvolumen der ersten Mischung mit dem definierten Volumen der Verdünnungslösung zu mischen, um eine zweite Mischung mit einem zweiten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen.
Bei einem solchen Verfahren kann das aus der ersten Mischkammer in die zweite Mischkammer übertragene Volumen abhängig von einem zugegebenen Volumen der zu verdünnenden Lösung und/oder dem definierten Volumen der Verdünnungslösung sein.
Bei Beispielen eines solchen Verfahrens wird ein Rotationskörper mit n Mischkammern, wobei jeweils ein Fluidauslass einer vorhergehenden Mischkammer mit einem Fluideinlass einer nachfolgenden Mischkammer über eine entsprechende fluidische Verbindung verbunden ist, verwendet. Das Verfahren kann ferner ein Beaufschlagen des Rotationskörpers mit entsprechenden Rotationsprotokollen aufweisen, um jeweilige Teilvolumina einer n-1-ten Mischung in eine n-te Mischkammer zu transportieren, wobei ein definiertes Volumen der n-1-ten Mischung in der n-1-ten Mischkammer verbleibt, um eine Verdünnungsreihe mit n Mischungen mit n unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen zu erzeugen, wobei n eine natürliche Zahl größer oder gleich drei ist. Bei Ausführungsbeispielen können die definierten Volumina und Teilvolumina derart sein, dass die n Mischungen eine logarithmische Verdünnungsreihe darstellen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind auf die automatisierte Erzeugung von Verdünnungsreihen gerichtet und zielen auf kleine Volumina ab (im μL bis mL Bereich), so dass die entsprechenden fluidischen Strukturen als mikrofluidische Strukturen bezeichnet werden können. Ausführungsbeispiele der Erfindung zielen insbesondere auf Anwendungen im meist analytischen Bereich ab. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sind zur Erzeugung von Verdünnungsreihen für beliebige Anwendungen einsetzbar, beispielsweise die eingangs beschriebenen Anwendungsgebiete.
Ausführungsbeispiele der Erfindung nutzten zentrifugale Kräfte aus, um automatisch Flüssigkeiten zu transportieren, zu portionieren und zu mischen. Als Plattform dient ein Rotationskörper bzw. ein Fluidikmodul mit eingearbeiteten Kavitäten bzw. (mikro)fluidischen Strukturen. Der Rotationskörper bzw. das Fluidikmodul können als Kartusche, die aus Kunststoff bestehen kann, bezeichnet werden. Während für nicht zentrifugale Mikrofluidiksysteme in der Regel präzise und teure Spritzenpumpen zum Flüssigkeitstransport benötigt werden, kann bei Ausführungsbeispielen der Erfindung als Antrieb und Steuerung zur Erzeugung der Verdünnungsreihe eine Standard-Laborzentrifuge genutzt werden. Der Rotationskörper kann dann anstelle des Standardrotors eingelegt werden und die benötigten Rotationsprotokolle können manuell oder mit entsprechender Software eingestellt werden.
Unter Rotationsprotokoll wird dabei im Rahme dieser Offenbarung eine Rotation des Rotationskörpers mit einer Rotationsfrequenz oder einer Abfolge von Rotationsfrequenzen bezeichnet. So kann ein Rotationsprotokoll eine Rotation bei einer bestimmten Rotationsfrequenz bezeichnen. Ein anderes Rotationsprotokoll kann Rotationen bei mehreren verschiedenen Frequenzen umfassen. Wiederum eine anderes Rotationsprotokoll kann ein Anhalten der Rotation umfassen.
Weiter vorteilhaft bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die Möglichkeit, auf aktiv gesteuerte Ventile verzichten zu können. Es wird keine Schnittstelle zu externer Peripherie benötigt. Durch die eingebrachten Volumina und die (durch die fluidischen Strukturen) in dem Rotationskörper (der Kartusche) vordefinierten Volumina können die erzeugten Verdünnungen eindeutig festgelegt werden und die ”menschlichen” Fehler während der Handhabung ebenso wie die Möglichkeit einer Kontamination auf ein Minimum reduziert werden.
Im Vergleich zu spritzenpumpengetriebenen Systemen bieten Ausführungsbeispiele der Erfindung den Vorteil deutlich reduzierter Totvolumen der Flüssigkeiten, da Schlauchverbindungen und entsprechende fluidische Anschlüsse, um die Flüssigkeit auf den Chip zu pumpen, nicht benötigt werden. Somit ermöglichen Ausführungsbeispiele der Erfindung einen reduzierten Bedarf an Reagenzien, ohne, wie dies bei spritzenpumpengetriebenen Systemen der Fall wäre, eine unmischbare Systemflüssigkeit einzusetzen, was jedoch die Gefahr einer Kontamination der Probe und der Verdünnungen mit sich bringen würde. Bei zentrifugalen Systemen werden die Flüssigkeiten mittels inhärenter Trägheitskräfte (Zentrifugalkraft) gesteuert. So können auch kleinste Flüssigkeitsmengen transportiert werden. Folglich lassen sich Lösungen mit nur geringen bis gar keinen Totvolumina realisieren.
Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen eine erhöhte Flexibilität, da sie ermöglichen, den Verdünnungsfaktor einzustellen, beispielsweise durch einen Wechsel zwischen Einsätzen mit unterschiedlichen Vorportionierungskammern, wie er oben beschrieben wurde.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend teilweise Bezug nehmend auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen sind gleiche oder gleichwirkende Elemente mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet. Es zeigen:
1 schematisch eine Draufsicht auf die fluidischen Strukturen eines Rotationskörpers gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
2 eine schematische Draufsicht eines Ausführungsbeispiels eines Rotationskörpers; und
3a bis 3h schematische Darstellungen zur Erläuterung der Erzeugung einer Verdünnungsreihe bei Ausführungsbeispielen der Erfindung;
4 und 5 schematische Seitenansichten von Ausführungsbeispielen erfindungsgemäßer Vorrichtungen.
Bevor Ausführungsbeispiele der Erfindung teilweise Bezug nehmend auf die Zeichnungen weiter erläutert werden, sei zunächst auf das folgende Glossar verwiesen.
Glossar

– Die Zahlenindices n, k, i seien natürliche Zahlen inklusive 0. Es gelte generell i ≤ n.
– V_X sei das aus einer Lösung X entnommene Volumen.
– Lösung A sei die zu verdünnende Lösung. Sie enthält die zu verdünnende Substanz.
– Lösung B sei die Verdünnungslösung. Sie wird verwendet um Lösung A zu verdünnen.
– Verdünnen bezeichne das Herabsetzen einer Konzentration der zu verdünnenden Substanz in Lösung A, indem ein Volumen V_A der Lösung A und ein Volumen V_B der Lösung B miteinander gemischt werden.
– Verdünnung AB bezeichne eine Verdünnung von Lösung A mit Lösung B.
– Verdünnung AB₁ bezeichne die 1. Verdünnung von Lösung A mit Lösung B.
– Verdünnung AB₀ bezeichne die 0. Verdünnung von Lösung A mit Lösung B und ist damit gleichzusetzen mit der unverdünnten Lösung A.
– Verdünnung AB_i sei die i-te Verdünnung einer Verdünnungsreihe der Lösung A mit der Lösung B und dem Verdünnungsfaktor Z_i zugeordnet.
– Volumendefinitionen:
– V_A sei ein Volumen, das aus der Lösung A entnommen wurde.
– V_Ai sei ein Volumen, das aus der Lösung A entnommen wurde, um die i-te Lösung einer Verdünnungsreihe zu erzeugen.
– V_B sei ein Volumen, das aus der Lösung B entnommen wurde.
– V_Bi sei ein Volumen, das aus der Lösung B entnommen, wurde um die i-te Lösung einer Verdünnungsreihe zu erzeugen.
– V_AB sei ein Volumen, auch als Überführungsvolumen V_AB bezeichnet, das aus einer bestehenden Verdünnung AB aus Lösung A mit Lösung B entnommen und überführt wird.
– V_ABi, auch als Überführungsvolumen V_ABi bezeichnet, sei ein Volumen, das aus einer i-ten Verdünnung einer Verdünnungsreihe entnommen wird um die (i + 1)-te Verdünnung zu erzeugen. Es gilt stets V_ABi ≤ V_AB(i-1) + V_Bi.
– V_AB0 sei ein Volumen, das einer 0-ten Verdünnung einer Verdünnungsreihe aus Lösung A entspricht und ist daher dem Volumen V_A gleichzusetzen.
– Verdünnungsfaktor Z: Für eine Verdünnung AB ist der Verdünnungsfaktor definiert als Z = (V_A + V_B)/V_A mit Z ≥ 1. Die Konzentration c der zu verdünnenden Substanz in Verdünnung AB ist verglichen mit der Konzentration in Lösung A auf 1/Z erniedrigt. Dabei ist das erzeugte Endvolumen für die Verdünnung selbst irrelevant. Zahlenbeispiel: Verdünnung AB erstellt aus V_A = 10 mL Lösung A und V_B = 90 mL Lösung B mit Verdünnungsfaktor Z = 10. Konzentration der zu verdünnenden Substanz in Verdünnung AB: c = 1/10. Eine identische Verdünnung, aber ein anderes Endvolumen lässt sich beispielsweise mit V_A = 20 mL Lösung A und V_B = 180 mL Lösung B oder V_A = 1,1 mL Lösung A und V_B = 9,9 mL Lösung B erzeugen.
– Verdünnungsfaktor Z₀ = 1 sei der unverdünnten Lösung A zugeordnet.
– Verdünnungsfaktor Z_i: Für eine Verdünnung AB_i, die aus einer dem Volumen V_ABk der Verdünnung AB_k mit dem Verdünnungsfaktor Z_k durch Verdünnen mit einem Volumen V_Bi > 0 der Lösung B hergestellt wurde, gilt Z_i = (V_ABk + V_Bi)/V_ABk·Z_k mit Z_k < Z_i und k < i.
– Verdünnungsreihe: Eine Verdünnungsreihe ist eine Anzahl von n Verdünnungen mit n > 1 und bestehend aus den einzelnen Verdünnung ABi, mit i ≤ n aus einer Lösung A und einer Lösung B mit unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren Z_i. Es gilt Z_i ≤ Z_k für i < k innerhalb einer Verdünnungsreihe. Zahlenbeispiel: Verdünnung AB₁: Z₁ = 1; 10 mL Lösung A verdünnt mit 0 mL Lösung B; Verdünnung AB₂: Z₂ = 2; 10 mL Lösung A verdünnt mit 10 mL Lösung B; Verdünnung AB₃: Z₃ = 2,4; 5 mL Lösung A verdünnt mit 7 mL Lösung B; Verdünnung AB₄: Z₄ = 2,5; 10 mL Lösung A verdünnt mit 15 mL Lösung B; Verdünnung AB₅: Z₅ = 8; 20 mL Lösung A verdünnt mit 140 mL Lösung B; etc.
– Direkte Verdünnungsreihe: Direktes Verdünnen aus Lösung A. Hierbei werden alle Verdünnungen AB_i aus je einem Volumen V_Ai der Lösung A mit einem entsprechenden Volumen V_Bi. Der Verdünnungsfaktor wird mittels Z = (V_Ai + V_Bi)/V_Ai berechnet. Zahlenbeispiel: Verdünnung AB₁: Z₁ = 10; 10 mL Lösung A verdünnt mit 90 mL Lösung B; Verdünnung AB₂: Z₂ = 100; 10 mL Lösung A verdünnt mit 990 mL Lösung B; Verdünnung AB₃: Z₃ = 1000; 10 mL Lösung A verdünnt mit 9990 mL Lösung B; Verdünnung AB₄: Z₄ = 2000; 10 mL Lösung A verdünnt mit 19990 mL Lösung B; etc.
– Indirekte Verdünnungsreihe: Serielle Verdünnung eines Volumens V_ABk einer zuvor erzeugten Verdünnung AB_k mit einem weiteren Volumen V_Bi der Lösung B zu einer Verdünnung AB_i. Der entsprechende Verdünnungsfaktor Z_i wird nach Z_i = (V_ABk + V_Bi)/V_ABk·Z_k mit Z_i > Z_k und i > k berechnet. Zahlenbeispiel: Verdünnung AB₁: Z₁ = 10; 10 mL Lösung A verdünnt mit 90 mL Lösung B; Verdünnung AB₂: Z₂ = 100; 10 mL Lösung AB₁ verdünnt mit 90 mL Lösung B (somit Z₂ = 10·(10 + 90)/10); Verdünnung AB₃: Z₃ = 1000; 10 mL Lösung AB₂ verdünnt mit 90 mL Lösung B (somit Z₃ = 100·(10 + 90)/10); Verdünnung AB₄: Z₄ = 2000; 10 mL Lösung AB₃ verdünnt mit 190 mL Lösung B (somit Z₄ = 100·(10 + 190)/10), es besteht jedoch auch z. B. die Alternative aus der Lösung AB₂ die Verdünnung AB₄ herzustellen. 1 mL Lösung AB₂ verdünnt mit 199 mL Lösung B (somit Z₄ = 10·(1 + 199)/1); etc.
– Logarithmische Verdünnungsreihe: Meist eine indirekte Verdünnungsreihe, bei der jede Verdünnung aus der vorangegangenen erzeugt wurde. Meist wird ein aus konstanten Volumina V_Bi = V_B1 der Lösung B und konstanten Überführungsvolumen V_AB(i-1) die jeweils folgende Verdünnung AB_i erzeugt. Hierdurch ergibt sich ein Verdünnungsfaktor von Z_i = ((V_AB(i-1) + V_Bi)/V_AB(i-1))^i. Zahlenbeispiel: Verdünnung AB₁: Z₁ = 10; 10 mL Lösung A verdünnt mit 90 mL Lösung B; Verdünnung AB₂: Z₂ = 100; 10 mL Lösung AB₁ verdünnt mit 90 mL Lösung B; Verdünnung AB₃: Z₃ = 1.000; 10 mL Lösung AB₂ verdünnt mit 90 mL Lösung B; Verdünnung AB₄: Z₄ = 10.000; 10 mL Lösung AB₃ verdünnt mit 90 mL Lösung B; etc.
– IC50 Wert: Konzentration eines Inhibitors, bei der eine Inhibition beobachtet wird, welche die Enzymaktivität auf 50% der maximalen Enzymaktivität herabsetzt.
– LD50 Wert: Letale Dosis eines Giftes, bei der 50% der untersuchten Lebewesen versterben.
– DNA: Desoxyribonukleinsäure.
– RNA: Ribonukleinsäure.
– Enzym: Biokatalysator meist basierend auf Protein.
– PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion, ein enzymatisches System zur exponentiellen Amplifikation und zum Nachweis von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA.
– Michaelis-Menten-Konstante: Eine charakteristische Konstante aus dem Bereich der Enzymkinetik. Sie wird in mol pro L gemessen und entspricht genau der Konzentration des Substrates, bei welcher das Enzym 50% seiner maximalen Umsatzgeschwindigkeit erreicht. 100% der maximalen Umsatzgeschwindigkeit werden erst bei theoretisch ”unendlicher” Substratmenge erreicht. Je kleiner die Michelis-Menten-Konstante, umso kleinere Substratmengen werden schnell und effizient umgesetzt.
– Wechselzahl: Eine weitere charakteristische Konstante aus dem Bereich der Enzymkinetik. Sie ist ein Maß für die Leistungsfähigkeit eines Enzyms und wird in s^–1 vermessen. Sie gibt an, wie viel Substrat eine definierte Menge Enzym pro Zeiteinheit umsetzen kann. Je höher die Wechselzahl, desto ”schneller” arbeitet das Enzym.
– Most Probable Number (Höchstwahrscheinliche Zahl): Statistische Methode zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroorganismen bzw. an funktionellen Biomolekülen z. B. bei einer DNA-Bestimmung.
– Kartusche: Der Ausdruck Kartusche wird als Sammelbegriff für das mikrofluidische Bauelement verwendet, in welchem die Verdünnungsreihe automatisiert erzeugt und bei Bedarf weitergeleitet werden kann, und umfasst sowohl einen Rotationskörper als auch ein Fluidikmodul, das eingesetzt in einen Rotor einen Rotationskörper bildet.

Ausführungsbeispiele der Erfindung erlauben die Herstellung von Verdünnungsreihen, deren Verdünnungsfaktor Z durch den Benutzer definiert werden kann. Die hierfür benötigte Kartusche kann ausschließlich passive geometrische Elemente enthalten. Aktiv gesteuerte Ventile sind nicht erforderlich. Es werden eine Lösung A (mit Volumen V_A) und eine Lösung B (mit Volumen V_B) zugegeben. Lösung B kann zunächst in mehrere, durch die fluidischen Strukturen festgelegte ”Portionen” (V_B1, V_B2, V_B3 ... mit Summe ΣV_Bi ≤ V_B), aufgeteilt. Die zu verdünnende Lösung A wird nun zu Portion V_B1 hinzugegeben und gemischt. Es wird eine Mischung mit dem Verdünnungsfaktor Z₁ = (V_A + V_B1)/(V_A) erzeugt. Danach wird ein Volumen V_AB1 der Verdünnung AB₁ in die Portion V_B2 überführt und erzeugt ein Z₂ = (V_AB1 + V_B2)/(V_AB1) usw. Durch weiteres sukzessives überführen eines Volumens V_AB(i-1) einer Verdünnung AB_(i-1) in eine Portion V_Bi zur Erzeugung der Verdünnung AB_i kann so eine indirekte Verdünnungsreihe erzeugt werden. Der jeweilige Verdünnungsfaktor Z_i leitet sich sukzessive aus dem vorangegangenen Verdünnungsfaktor Z_(i-1) ab und ist durch Z_i = (V_AB(i-1) + V_Bi)/(V_AB(i-1))·Z_(i-1) definiert.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung entspricht das jeweils überführte Volumen V_ABi dem initial zugegebenen Volumen V_A der Lösung A. Ebenso sind bei Ausführungsbeispielen der Erfindung alle Volumen V_Bi identisch zueinander und damit gleich dem ersten Volumen V_B1 der Lösung B in der ersten Mischkammer. Bei dieser Auslegung ergibt sich der jeweilige Verdünnungsfaktor der jeweiligen Stufe mit Z_i = (V_A + V_B1)/(V_A)·Z_(i-1) = [(V_A + V_B1)/V_A]ⁱ. Der Benutzer hat bei Ausführungsbeispielen der Erfindung die Möglichkeit, durch Zugabe einer definierten Menge der Lösung A den Verdünnungsfaktor einzustellen.
Im folgenden wird dies anhand von drei Zahlenbeispielen erläutert.
1. Zahlenbeispiel:
Unterschiedliche Volumina von V_Bi und unterschiedliche Überführungsvolumen V_ABi:
Beispielkartusche:
Drei Mischkammern mit Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL;
Überführungsvolumen V_AB1 = 20 μL, V_AB2 = 45 μL
Anwendung 1:

Zugabe von V_A = 15 μl ergibt Z₁ = 3; Z₁ = 12 und Z₁ = 48

Es wird ein V_B ≤ ΣV_Bi ≤ 210 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer (Waste) überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 15 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (15 + 30)/15 = 3. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 20 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (20 + 60)/20·3 = 12. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 40 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (40 + 120)/40·12 = 48.
Anwendung 2:

Zugabe von V_A = 30 μl ergibt Z₁ = 2; Z₁ = 8 und Z₁ = 32

Es wird ein V_B ≥ ΣVBi ≥ 210 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 30 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (30 + 30)/30 = 2. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 20 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (20 + 60)/20·2 = 8. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 40 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (40 + 120)/40·8 = 32.
2. Zahlenbeispiel:
Unterschiedliche Volumina von V_Bi und Überführungsvolumen V_ABi identisch zu V_A:
Beispielkartusche:
Drei Mischkammern mit Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL
Überführungsvolumen V_AB1 = V_AB2 = V_A
Anwendung 1:

Zugabe von V_A = 15 μl ergibt Z₁ = 3; Z₁ = 15 und Z₁ = 135

Es wird ein V_B ≥ ΣV_Bi ≥ 210 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 15 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (15 + 30)/15 = 3. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 15 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (15 + 60)/15·3 = 15. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 15 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (15 + 120)/15·15 = 135.
Anwendung 2:

Zugabe von V_A = 30 μl ergibt Z₁ = 2; Z₁ = 6 und Z₁ = 30

Es wird ein V_B ≥ ΣVBi ≥ 210 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 60 μL und V_B3 = 120 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 30 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (30 + 30)/30 = 2. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 30 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (30 + 60)/30·2 = 6. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 30 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (30 + 120)/30·6 = 30.
3. Zahlenbeispiel:
Identische Volumina V_Bi = V_B1 und Überführungsvolumen V_ABi identisch zu V_A:
Dies ist die Auslegung zur Erzeugung von logarithmischen Verdünnungsreihen.
Beispielkartusche:
3 Mischkammern mit Volumina V_B1 = V_B2 = V_B3 = 30 μL
Überführungsvolumen V_AB1 = V_AB2 = V_A
Anwendung 1:

Zugabe von V_A = 15 μl ergibt Z₁ = 3; Z₁ = 9 und Z₁ = 27 (3^1; 3^2; 3^3)

Es wird ein V_B ≥ ΣVBi ≥ 90 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 30 μL und V_B3 = 30 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 15 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (15 + 30)/15 = 3. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 15 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (15 + 30)/15·3 = 9. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 15 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (15 + 30)/15·9 = 27.
Anwendung 2:

Zugabe von V_A = 30 μl ergibt Z₁ = 2; Z₁ = 4 und Z₁ = 8 (2^1; 2^2; 2^3)

Es wird ein V_B ≥ ΣVBi ≥ 90 μL der Lösung B in die Kartusche gegeben und die Kammern 1 bis 3 mit dem Volumina V_B1 = 30 μL, V_B2 = 30 μL und V_B3 = 30 μL befüllt. Nicht benötigtes Volumen der Lösung B wird in eine Abfallkammer überführt. Es wird die Lösung A mit einem V_A = 30 μl in Mischkammer 1 hinzugegeben. Es ergibt sich ein Z₁ = (30 + 30)/30 = 2. Aus Mischkammer 1 werden nun V_AB1 = 30 μL in Mischkammer 2 überführt. Es ergibt sich ein Z₂ = (30 + 30)/30·2 = 4. Aus Mischkammer 2 werden nun V_AB2 = 30 μL in Mischkammer 3 überführt. Es ergibt sich ein Z₃ = (30 + 30)/30·4 = 8.
4 und 5 zeigen schematisch Ausführungsbeispiele von Vorrichtungen zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe.
4 zeigt einen Rotationskörper 10, der ein Substrat 12 und einen Deckel 14 aufweist. Das Substrat 12 und der Deckel 14 können in Draufsicht kreisförmig sein, mit einer mittigen Öffnung, über die der Rotationskörper über eine übliche Befestigungseinrichtung 16 an einem rotierenden Teil 18 einer Antriebsvorrichtung 20 angebracht sein kann. Das rotierende Teil 18 ist drehbar an einem stationären Teil 22 der Antriebsvorrichtung 20 gelagert ist. Bei der Antriebsvorrichtung kann es sich beispielsweise um eine herkömmliche Zentrifuge mit einstellbarer Drehgeschwindigkeit oder auch ein CD- oder DVD-Laufwerk handeln. Eine Steuereinrichtung 24 ist vorgesehen, die ausgelegt ist, um die Antriebsvorrichtung 20 zu steuern, um den Rotationskörper 10 mit Rotationen mit unterschiedlichen Rotationsgeschwindigkeiten zu beaufschlagen. Die Steuereinrichtung 24 kann, wie für Fachleute offensichtlich ist, beispielsweise durch eine entsprechend programmierte Recheneinrichtung oder eine anwenderspezifische integrierte Schaltung implementiert sein. Die Steuerung 24 kann ferner ausgelegt sein, um auf manuelle Eingaben durch einen Benutzer bin die Antriebsvorrichtung 20 zu steuern, um die erforderlichen Rotationen des Rotationskörpers zu bewirken. In jedem Fall ist die Steuereinrichtung konfiguriert, um die Antriebsvorrichtung zu steuern, um den Rotationskörper mit den erforderlichen Rotationsprotokollen zu beaufschlagen, um die Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, zu implementieren. Als Antriebsvorrichtung 20 kann eine herkömmliche Zentrifuge mit nur einer Drehrichtung verwendet werden.
Der Rotationskörper 10 weist die zum Erzeugen der Verdünnungsreihe erforderlichen fluidischen Strukturen auf. Beispielsweise können die fluidischen Strukturen durch Kavitäten und Kanäle in dem Substrat 12 gebildet sein. Alternativ können die fluidischen Strukturen durch Kavitäten und Kanäle in dem Substrat 12 und dem Deckel 14 gebildet sein. Bei Ausführungsbeispielen sind die fluidischen Strukturen in dem Substrat 12 gebildet und Einfüllöffnungen und Entlüftungsöffnungen sind in dem Deckel 14 gebildet.
Bei einem alternativen, in 5 gezeigten Ausführungsbeispiel weist der der Rotationskörper 10 einen Rotor 30 und in den Rotor 30 eingesetzte Fluidikmodule 32 auf. Die Fluidikmodule 32 können jeweils durch ein Substrat und einen Deckel aufweisen, in denen wiederum die zur Erzeugung der Verdünnungsreihe erforderlichen fluidischen Strukturen gebildet sein können. Der Rotor 30 und die Fluidikmodule 32 bilden den Rotationskörper, der wiederum durch die Antriebsvorrichtung 20, die durch die Steuereinrichtung 24 gesteuert wird, mit einer Rotation beaufschlagbar ist.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können der Rotationskörper bzw. das Fluidikmodul, der bzw. das die fluidischen Strukturen aufweist, aus einem beliebigen geeigneten Material gebildet sein, beispielsweise einem Kunststoff, wie PMMA (Polymethylmethacrylat), Polycarbonat, PVC (Polyvinylchlorid) oder PDMS (Polydimethylsiloxan), Glas oder dergleichen.
Der Rotationskörper kann als eine zentrifugal mikro-fluidische Plattform betrachtet werden.
1 zeigt eine schematische Draufsicht auf einen Ausschnitt eines Ausführungsbeispiels des Rotationskörpers 10 in der Form einer Scheibe mit einer mittigen Öffnung 40. In 1 ist lediglich ein Segment der Scheibe dargestellt. Der Mittelpunkt der Scheibe stellt das Rotationszentrum 42 des Rotationskörpers 10 dar. Eine radial abfallende Richtung ist in 1 durch einen Pfeil 44 gezeigt und ist die Richtung von dem Rotationszentrum 42 zum Rand des Rotationskörpers 10. Die Rotationskörper weist fluidische Strukturen 46 auf, wie nachfolgend erläutert wird. Bei einer Rotation des Rotationskörpers wirkt auf Flüssigkeiten, die sich in den fluidischen Strukturen 46 befinden, eine radial nach außen gerichtete Zentrifugalkraft, so dass Flüssigkeiten in den fluidischen Strukturen 46 zentrifugal angetrieben werden können.
Die fluidischen Strukturen 46 weisen fünf Mischkammern m₁ bis m₅ auf. Die erste Mischkammer m₁ ist über einen Einlasskanal 50 mit einer ersten Einlasskammer 52 fluidisch verbunden. Eine Einlassöffnung 52a und eine Entlüftungsöffnung 52b für die erste Einlasskammer 52 sind vorgesehen, beispielsweise in einem Deckel des Rotationskörpers. Die erste Mischkammer m₁ ist über eine erste fluidische Verbindung s₁ mit der zweiten Mischkammer m₂ verbunden. Die zweite Mischkammer m₂ ist über eine zweite fluidische Verbindung s₂ mit der dritten Mischkammer m₃ verbunden, die dritte Mischkammer m₃ ist über eine dritte fluidische Verbindung s₃ mit der vierten Mischkammer m₄ verbunden und die vierte Mischkammer m₄ ist über eine vierte fluidische Verbindung s₄ mit der fünften Mischkammer m₅ verbunden. Die fünfte Mischkammer m₅ ist über einen Auslasskanal 54 mit einer Abfallkammer 56 fluidisch verbunden, die über einen Entlüftungskanal 56a mit einer Entlüftungsöffnung 56b fluidisch verbunden ist. Jede der Mischkammern m₁ bis m₅ ist ebenfalls über einen entsprechenden Entlüftungskanal 58 mit einer Entlüftungsöffnung 60 verbunden, wobei in 1 der Übersichtlichkeit halber lediglich der Entlüftungskanal 58 und die Entlüftungsöffnung, die der fünften Mischkammer zugeordnet sind, mit einem Bezugszeichen versehen sind.
Die fluidischen Strukturen 46 weisen ferner eine zweite Einlasskammer 62 auf, für die wiederum eine Einlassöffnung 62a und eine Entlüftungsöffnung 62b vorgesehen sein können. Die zweite Einlasskammer 62 ist fluidisch mit einer Aliquotierstruktur verbunden, die einen Kanal 64 und Dosierkammern e₁ bis e₅ aufweist. Ein radial äußeres Ende 66 des Kanals 64 ist mit einer weiteren Abfallkammer (waste) 68 verbunden, die über einen Entlüftungskanal 68a mit einer Entlüftungsöffnung 68b fluidisch verbunden ist.
Ein radial äußerer Bereich jeder der Dosierkammern e₁ bis e₅ ist über ein jeweiliges Ventil 70 mit einem radial inneren Bereich einer zugeordneten der Mischkammern m₁ bis m₅ fluidisch verbunden. Die Dosierkammern e₁ bis e₅ stellen Aliquotierfinger in Form von radial nach außen angeordneten Ausbuchtungen des Kanals 64 dar, wobei der Kanal 64 von der Einlasskammer 62 zu einem Bereich 64a strömungsmäßig hinter der fünften Dosierkammer e₅ einen radial abfallenden Verlauf aufweist. Somit ermöglicht die Aliquotierstruktur bei einer Rotation des Rotationskörpers, dass ein definiertes Flüssigkeitsvolumen in jeder der Dosierkammern e₁ bis e₅ zurückgehalten wird, während überschüssige Flüssigkeit abgeschert wird und in die Abfallkammer 68 gelangt.
Die Ventile 70 können beispielsweise durch eine hydrophobe Engstelle gebildet sein, die ein Passieren von Flüssigkeit, beispielsweise einer Verdünnungslösung, erst ab einer bestimmten Rotationsgeschwindigkeit ermöglicht. Bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel sind die den Mischkammern m₂ bis m₅ zugeordneten Ventile über jeweilige Fluidkanäle mit den Mischkammern fluidisch verbunden, wobei ein der Mischkammer m4 zugeordneter Fluidkanal beispielhaft mit dem Bezugszeichen 72 bezeichnet ist.
Bei dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die fluidischen Verbindungen s₁ bis s₅ als Siphonstrukturen ausgebildet. Die Siphonstrukturen weisen jeweils einen kapillaren Fluidkanal mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass auf, wobei der Fluideinlass in eine vorhergehende Mischkammer mündet und der Fluidauslass in eine nachfolgende Mischkammer. Der kapillare Fluidkanal der Siphonstruktur weist in üblicher Weise einen radial nach innen verlaufenden Abschnitt und einen radial nach außen verlaufenden Abschnitt auf.
Der Fluideinlass jeder Siphonstruktur mündet radial weiter innen in die vorhergehende Mischkammer als der Fluidauslass in die nachfolgende Mischkammer mündet. Somit ermöglichen die Siphonstrukturen bei Durchlaufen eines geeigneten Rotationsprotokolls jeweils eine Entleerung des Flüssigkeitsvolumens der vorhergehenden Mischkammer, das radial innerhalb der Position, an der der Fluideinlass der Siphonstruktur in die Mischkammer mündet, in die nachfolgende Mischkammer. Dadurch verbleibt nach einer solchen Teilentleerung ein definiertes Flüssigkeitsvolumen in der vorhergehenden Mischkammer. Die Mischkammern m₁ bis m₅ sind somit jeweils ausgebildet, um nach einer Teilentleerung in die jeweils nachfolgende Mischkammer ein definiertes Flüssigkeitsvolumen zu rückzuhalten.
Eine Teilentleerung der Mischkammern kann durch Durchlaufen eines entsprechenden Rotationsprotokolls bewirkt werden. Ist die durch eine Rotation bedingte Zentrifugalkraft größer als die in dem kapillaren Fluidkanal der Siphonstruktur wirkende Kapillarkraft, so wird eine kapillare Befüllung des Siphons verhindert und eine Teilentleerung findet nicht statt. Wird die Rotationsfrequenz derart reduziert, dass die Kapillarkraft größer als die Zentrifugalkraft ist, findet eine kapillare Befüllung der Siphonstruktur statt. Reicht nach der kapillaren Befüllung der Siphonstruktur die Zentrifugalkraft überdies aus, um einen Meniskus an dem Fluidauslass der Siphonstruktur zu überwinden, so findet eine Teilentleerung der vorhergehenden Mischkammer, wie sie oben beschrieben wurde, statt. Dies kann durch eine Erhöhung der Rotationsfrequenz nach der kapillaren Befüllung der Siphonstruktur bewirkt werden.
Wie in 1 zu sehen ist, sind die Mischkammern ausgehend von der ersten Mischkammer m₁ radial abfallend angeordnet. Anders ausgedrückt sind die Bereiche der Mischkammern, die das definierte Flüssigkeitsvolumen zurückhalten, von der ersten zur fünften Mischkammer zunehmend weiter radial außen angeordnet. Von zwei Mischkammern ist unter vorhergehender Mischkammer die Mischkammer zu verstehen, die radial weiter innen angeordnet ist, während unter nachfolgender Mischkammer die zu verstehen ist, die radial weiter außen angeordnet ist.
In 2 ist ein Ausführungsbeispiel eines Rotationskörpers gezeigt, bei dem die fluidischen Strukturen 46 doppelt in vorgesehen sind, so dass gleichzeitig zwei Verdünnungsreihen erzeugt werden können. Es ist für Fachleute offensichtlich, dass auch eine größere Anzahl von fluidischen Strukturen bei ausreichendem Platzangebot azimutal auf dem Rotationskörper verteilt sein können. Bei Ausführungsbeispielen können mehrere Fluidikmodule, die jeweils entsprechende fluidische Strukturen aufweisen, azimutal verteilt in einen Rotor eingesetzt sein.
Die Funktionsweise des in 1 gezeigten Ausführungsbeispiels sowie ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe wird mm anhand der Erzeugung von mehreren diskreten Verdünnungen einer Lösung A, die eine zu verdünnende Lösung, die eine zu verdünnende Substanz enthält, darstellt, und einer Lösung B, die eine Verdünnungslösung darstellt, Bezug nehmend auf die 3a bis 3h erläutert. Die 3a bis 3h zeigen dabei jeweils im rechten Teil den Rotationskörper 10 mit den fluidischen Strukturen 46 und im linken Teil ein Frequenzprotokoll, das die Rotationsprotokolle, die durchlaufen werden, zeigt.
Bei dem beschriebenen Beispiel sind die Volumina V_i der einzelnen Verdünnungen nominell identisch, da die jeweiligen Dosierkammern und Mischkammern ausgebildet sind, um gleiche Flüssigkeitsvolumina bereitzustellen. Bei alternativen Ausführungsbeispielen sind jedoch durch entsprechende Ausgestaltung der Kammern beliebige Volumina V_i möglich.
Die Steuerung der Flüssigkeiten, d. h. der Transport, die Volumenbestimmung, das Mischen, etc. erfolgt durch entsprechende Frequenzprotokolle der Rotation des Rotationskörpers (der Kartusche) und basiert auf dem Wechselspiel der daraus resultierenden Kräfte, d. h. Zentrifugalkräfte, Trägheitskräfte und Kapillarkräfte. Ein wichtiger Vorteil von Ausführungsbeispielen der Erfindung besteht dabei darin, dass in dem Rotationskörper keine aktiven Komponenten wie z. B. aktiv zu schaltende Ventile erforderlich sind. Wie bereits ausgeführt wurde, können als Antrieb und Steuerung eine Standardlaborzentrifuge verwendet werden.
Zunächst wird, wie in 3a durch einen Pfeil 100 gezeigt ist, die Lösung B in die zweite Einlasskammer 62 eingefüllt. Das Einfüllen der Lösung B kann per Hand oder automatisch beispielsweise durch einen Pipettierautomaten erfolgen.
Wie im linken Teil der 3a und 3b gezeigt ist, steuert die Steuerung den Antrieb, um eine definierte Rotation bei einer Frequenz f₁ (von beispielsweise 15 Hz) durchzuführen. Dies führt dazu, dass das Gesamtvolumen V_B der Lösung B in mehrere Einzelvolumina, sogenannte Aliquots, mit definiertem Volumen V_Bi in den Dosierkammern e₁ bis e₅ aufgeteilt wird, wie durch einen Pfeil 102 in 3b angedeutet ist. Der Überstand wird in die Abfallkammer 68 überführt, Pfeil 104. Die Rotation bei der Frequenz f₁ kann beispielsweise als eine Rotation gemäß einem fünften Rotationsprotokoll betrachtet werden.
Im Anschluss bewirkt die Steuerung eine Erhöhung der Rotationsgeschwindigkeit auf eine Frequenz f₂ (f₂ > f₁), wie im linken Teil von 3c zu sehen ist. f₂ kann beispielsweise 50 Hz betragen. Die durch die Rotation bei der Frequenz f₂ erzeugte Zentrifugalkraft ist ausreichend, um den Widerstand der hydrophoben Engpässe der Ventile 70 zu überwinden, so dass jedes Einzelvolumen V_Bi der Lösung B aus den Dosierkammern e₁ bis e₅ in eine der Mischkammern m₁ bis m₅ überführt wird. Die Rotation bei der Frequenz f₂ kann beispielsweise als eine Rotation bei einem vierten Rotationsprotokoll betrachtet werden.
Im Anschluss steuert die Steuerung den Antrieb, um die Rotation zu stoppen, siehe den Pfeil 110 im linken Teil von 3d. Dabei kann, bei Bedarf, ein Überstand der Lösung B durch die fluidischen Verbindungen s1 bis s5 in die Abfallkammer 56 gelangen.
Nach dem Stoppen der Rotation wird ein vom Anwender definiertes Volumen V_A der Lösung A in die Einlasskammer A gefüllt, was wiederum manuell oder automatisch erfolgen kann. Das definierte Volumen V_A bestimmt den Verdünnungsfaktor. Im Anschluss erfolgt eine erneutes Beschleunigen beispielsweise auf die Rotationsfrequenz f₂, wodurch die Lösung A in die erste Mischkammer m₁ überführt wird, wie durch den Pfeil 112 in 3e gezeigt ist.
Nachdem die Lösung A in die erste Mischkammer m₁ gelangt ist, bewirkt die Steuerung einen alternierenden Wechsel 114 der Rotationsfrequenzen zwischen f₁ und f₂, wodurch es in Mischkammer m₁ trägheitsbedingt zu einer Durchmischung 116 der Lösung A mit der vorgelegten Lösung B kommt, wie in 3f dargestellt ist. Beispielsweise kann ein zehnfacher Wechsel zwischen den Rotationsfrequenzen f₁ und f₂ stattfinden. Die alternierenden Wechsel der Rotationsfrequenzen können als ein erstes Rotationsprotokoll betrachtet werden.
Nachdem die Lösungen bzw. Substanzen homogen gemischt wurden, wird ein definiertes Volumen der hergestellten Mischung in die benachbarte Kammer überführt. Dazu wird die Rotationsfrequenz durch die Steuerung soweit gesenkt, beispielsweise angehalten 118, dass der kapillaren Siphon s₁ kapillar befüllt wird, wie durch einen Pfeil 120 in 3g angedeutet ist. Wie bereits ausgeführt wurde, ermöglichen im Stillstand und bei niedrigen Rotationsfrequenzen kapillare Kräfte eine Befüllung des Siphons mit Flüssigkeit, während bei erhöhten Frequenzen die Zentrifugalkraft über die Kapillarkraft dominiert und eine kapillare Befüllung nicht möglich ist. Kommt es aufgrund niedriger Zentrifugalkräfte zu einer kompletten Befüllung, so führt eine anschließende Erhöhung der Beschleunigung zu einem Flüssigkeitstransport vom radial innen gelegenen Eingang des Siphons zum radial außenliegenden Ende. Der Eingang der Siphons s₁ bis s₅ ist auf dem Rotationskörper so mit einer jeweiligen der Mischkammern m₁ bis m₅ verbunden, dass nur ein definiertes Volumen der darin befindlichen Verdünnung in die jeweils nachfolgende Mischkammer verbracht wird. Dieses Volumen ist durch die konkrete radiale Position bestimmt, an der die betreffende Siphonstruktur in der Mischkammer m_i ansetzt. Das von der Kammer n_(n-1) in die Kammer m_i überführte Volumen ist dadurch definiert. Das entsprechende Rotationsprotokoll, um das Teilvolumen aus der Mischkammer m₁ in die Mischkammer m₂ zu überführen, kann als zweites Rotationsprotokoll betrachtet werden.
Der Zustand nachdem das definierte Teilvolumen 130 in die zweite Mischkammer verbracht wurde, ist in 3h gezeigt. Im Anschluss bewirkt die Steuerung ein drittes Rotationsprotokoll, bei dem ein Mischen der in der zweiten Mischkammer m₂ vorgelegten Lösung B und des Teilvolumens 130 stattfindet. Das dritte Rotationsprotokoll kann dabei dem ersten Rotationsprotokoll entsprechen.
Die entsprechenden Rotationsprotokolle (Rotationsprotokolle 1 bis 3) können dann wiederholt werden, um weitere Verdünnungen in den Mischkammern m₃ bis m₅ zu erzeugen.
Die beschriebene Art des Flüssigkeitstransfers ermöglicht es, mit einem geometrisch festgelegten Rotationskörper bzw. einer geometrisch festgelegten Kartusche durch Zugabe einer variablen Menge an Lösung A Verdünnungen mit unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren zu erzeugen. Der Verdünnungsfaktor wird lediglich durch die zugegebene Menge der Lösung A bestimmt. Es können seriell mehrerer Verdünnungen hergestellt werden, wobei die Anzahl der Verdünnungsstufen im Wesentlichen durch die Baugröße des Rotationskörpers limitiert ist.

Anhand eines Zahlenbeispiels wird nun ein spezielles Ausführungsbeispiel der Erzeugung einer Verdünnungsreihe für eine Zugabe von 7,5 μL (I) bzw. 15 μL (II) der Lösung A beschrieben. Die Lösung A enthalte im Folgenden ein beliebiges Bakterium mit einer Konzentration von c = 10.000 Stück/μL. 200 μL einer Lösung B werden in die Einlasskammer 62 gegeben und das Frequenzprotokoll wird gestartet. Aufgrund zentrifugaler Kräfte wird Lösung B in einzelne Aliquots in den Dosierkammern e₁–e₅ mit einem Volumen von je 30 μL aufgeteilt. Der Überstand fließt in die Abfallkammer 68. Die Frequenz wird erhöht und die Aliquots werden aus den Dosierkammern e₁–e₅ in die Mischkammern m₁–m₅ transferiert. Die Volumina der Dosierkammern e₁–e₅ sind so bestimmt, dass nun jede Mischkammer bis zur Unterkante des kapillaren Siphons s₁–s₅ gefüllt ist. Die Rotation wird gestoppt und es werden die initialen Volumina 7,5 bzw. 15 μL Lösung A in die Einlasskammer 52 gegeben. Eine erneute Rotation überführt die Lösung A in die Mischkammer m₁, wo sie mit den bereits vorgelegten 30 μL der Lösung B vermischt wird. Nun ist der Flüssigkeitsstand der Kammer erhöht und der kapillare Siphon s₁ kann sich im Stillstand befüllen. Nach erneuter Rotation werden aus der Mischkammer m₁ die initialen Volumina der Lösung A, also exakt 7,5 bzw. 15 μL der erzeugten Verdünnung AB₁ in die Mischkammer m₂ überführt und dort ebenfalls mit den vorgelegten 30 μL der Lösung B vermischt usw., wie in der folgenden Tabelle 1 dargelegt ist. Tabelle 1

	Volumen Lösung A = 6 μL	Anfangskonzentration 10.000 Stück/μL	Volumen Lösung A = 15 μL	Anfangskonzentration 10.000 Stück/μL
	Verdünnungsfaktor Z_I	Konzentration in Stück/μL	Verdünnungsfaktor Z_I	Konzentration in Stück/μL
Kammer m₁	6	1666,7	3	3333,3
Kammer m₂	36	277,8	9	1111,1
Kammer m₃	216	46,3	27	370,4
Kammer m₄	1296	7,7	81	123,5
Kammer m₅	7776	1,3	243	41,2

Tabelle 1 zeigt die Verdünnungsfaktoren und Bakterienkonzentration der einzelnen Verdünnungen in den Mischkammern m₁–m₅ für Zugaben von 6 μL bzw. 15 μL Lösung A und bei Vorlage von 30 μL Lösung B in jeder Mischkammer.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Einfüllkammern für die Verdünnungslösung und die zu verdünnenden Lösung so ausgestaltet sein bzw. mit der restlichen Fluidik verbunden sein, dass sowohl die zu verdünnende Lösung als auch die Verdünnungslösung gleichzeitig vor Beginn des Frequenzprotokolls vorgelegt werden können. Eine Unterbrechung der Rotation nach der Prozessierung der Verdünnungslösung, d. h. nach dem Einbringen der Verdünnungslösung in die Mischkammern wäre dann nicht mehr erforderlich.
Anstelle der in 1 gezeigten Aliquotierstruktur für die Verdünnungslösung könnte das volle Volumen der Verdünnungslösung initial in die Mischkammer m₁ eingeleitet werden. Durch Reduktion der Rotationsfrequenz unterhalb der kritischen Frequenz, bei der sich die Siphons befüllen, und einer anschließenden Rotation oberhalb der kritischen Frequenz erfolgt ebenfalls eine Volumendefinition in der Kammer m₁. Wird dieser Zyklus mehrfach wiederholt, so sind danach alle Mischkammern m₁ bis m₅ mit einem definierten Volumen, welches durch die Siphonstruktur in der Mischkammer definiert ist, befüllt. Bei solchen Ausführungsbeispielen wird frühestens nach der Portionierung der Verdünnungslösung in Mischkammer m₁ die zu verdünnende Lösung in die Mischkammer m₁ überführt und dort mit dem Verdünnungsmedium gemischt.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann eine integrierte Vorportionierung der zu verdünnenden Lösung vorgesehen sein. Beispielsweise kann der Einlass bzw. die Einlasskammer für die zu verdünnende Lösung (Lösung A) der Kartusche mit einer fluidischen Struktur für die definierte Volumenbestimmung kombiniert werden, so dass die zu verdünnende Lösung nur noch im Überschuss zugegeben werden muss. Das Ausgangsvolumen der zu verdünnenden Lösung lässt sich dadurch ebenfalls automatisch und ohne Einflüsse einer manuellen Pipettierung bestimmen. Bei Ausführungsbeispielen können mehrere Einlässe für die zu verdünnende Lösung auf einer Kartusche realisiert sein, wobei jeder der Einlässe für eine andere Vorportionierung ausgelegt ist, so dass durch Auswahl eines der Einlässe ein gewünschte Verdünnungsreihe erzeugt werden kann. Somit kann die zu verdünnende Lösung jeweils entsprechend der gewünschten Verdünnungsreihe portioniert werden, so dass mit einer einzigen Kartusche nach Anwenderwunsch unterschiedliche Verdünnungsreihen hergestellt werden können.
Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel sind benachbarte Mischkammern durch kapillare Siphons miteinander verbunden, die jeweils ein definiertes Volumen der einen Mischkammer in die benachbarte Mischkammer überführen. Alternativ können benachbarte Mischkammern auch mit anderen geeigneten Ventilen oder Überleitungen verbunden sein, die es erlauben, die Flüssigkeiten zunächst zu mischen und dann einen Anteil der Mischung in die nächste Kammer zu überführen. Dies kann durch ein entsprechendes Frequenzprotokoll erreicht werden. Das Prinzip der Verdünnungsreihenerzeugung beruht auf dem sequentiellen Transport eines definierten Flüssigkeitsvolumens von einer Mischkammer in die benachbarte Mischkammer.
Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist eine fluidisches Ventil in Form einer hydrophoben Entstelle zwischen den Dosierkammern und den Mischkammern vorgesehen. Alternativ können andere geeignete Ventile oder Überleitungen vorgesehen sein, die rotationsfrequenzabhängig die Verdünnungslösung durchlassen oder nicht.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können geeignete fluidische Strukturen in dem Rotationskörper vorgesehen sein, die ein Ausleiten der Mischungen aus den Mischkammern durch weitere fluidische Operationen (Einheitsoperationen) ermöglichen. Zur Weiterverwendung oder Weiterverarbeitung der erzeugten Verdünnungen können die einzelnen Mischkammern über geeignete Ventile an weitere fluidische Elemente auf dem Rotationskörper angeschlossen werden. Es besteht ferner die Möglichkeit, die Flüssigkeiten in der Mischkammer über geeignete Ventile aus dem Rotationskörper in Auffanggefäße zu zentrifugieren. Als Auffanggefäße könnten insbesondere Standard-Labor-Behältnisse fungieren, zum Beispiel Standard-Tubes (sogenannte Eppendorf-Cups mit Volumen von z. B. 0,5 mL, 1 mL, 1.5 mL, 2 mL, Falkon-Tubes mit 15 ml oder 50 ml) oder Mikrotiterplatten oder Mikrotiterplatten-ähnliche Gefäße sowie kleinere Probenbehältnisse wie PCR-Tubes. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können somit die erzeugten Verdünnungen nach dem Herstellen der Mischung auf dem Rotationskörper weiter prozessiert bzw. in weiter außen liegende Kavitäten überführt werden, beispielsweise in der Enzymatik. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können die erzeugten Verdünnungen nach dem Mischen von dem Rotationskörper auf außen liegende Gebinde bzw. Behälter überführt werden, die entnommen werden können. Diese Gebinde können Standard-Labor-Gebinde wie z. B. Eppendorf-Cups, Mikrotiterplatten und dergleichen sein. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann ein Fluidausgang an einem radial äußeren Abschnitt einer oder mehrerer der Mischkammern vorgesehen sein, der mit einem Ventil versehen sein kann, so dass die Mischung in der Mischkammer durch Beaufschlagen des Rotationskörpers mit einer Rotationsfrequenz, bei der das Ventil das Mischung durchlässt, aus der Mischkammer transportiert werden kann.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind geeignet, um je nach Anwendung verschiedene Ausgangslösungen zu verdünnen. Hierfür kommen unter anderem folgende zu verdünnenden Lösungen/Gemische in Frage:

– Nukleinsäurehaltige Lösungen (Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, RNA), beispielsweise zur Bestimmung des Nukleinsäuregehaltes und/oder zur Erstellung von Kalibrierstandards.
– Proteinhaltige und sonstige Lösungen, Zell-Lysate oder daraus abgeleitete Lösungen, beispielsweise zur Bestimmung von Konzentrationen, zur Bestimmung von IC50, LD50 oder ähnlichen Werten, zur Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten, zur Enzymkinetik, und/oder zur Erstellung von Kalibrierstandards.
– Emulsionen, Suspensionen oder Gemische, beispielsweise für Verdünnungen oder zur Erzeugung unterschiedlicher Bedingungen einer phasenbedingte Reaktion wie Polymerisation von Nano- und Mikropartikeln oder Stabilisierung von Emulsionen durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an Emulgatoren oder Stabilisatoren.
– Zellhaltige und zellbestandteilhaltige Suspensionen, zur Bestimmung der Keimzahl, zur Bestimmung von Inhaltsstoffen und/oder zur Erstellung von Kalibrierstandards.

Anwendungen von Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen auf dem Gebiet der Enzymkinetik. Sowohl das Enzym, als auch das Substrat, als auch Inhibitoren oder Aktivatoren können durch die beschriebenen Strukturen verdünnt und in Endkavitäten zusammengemischt werden. Hierdurch wird es möglich, Michaelis-Menten-Konstanten, Wechselzahlen, IC50 Werte oder andere typische Kennzahlen der Enyzmkinetik zu bestimmen.
Damit ist es möglich, das verwendete Enzym, das Substrat und den Inhibitor bzw. den Aktivator genau zu charakterisieren.
Anwendungen von Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen auf dem Gebiet der Immunoassay-Kalibrierung, wobei das Antigen des Immunoassays verdünnt wird. So kann der entsprechende Immunoassay kalibriert und die Nachweisgrenze oder die Quantifizierungsgrenze bestimmt werden.
Anwendungen von Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen auf dem Gebiet der Most-Probable-Number für Keime. Keime, wie beispielsweise Bakterien, Viren oder Pilze, werden verdünnt und die Verdünnungen in Endkavitäten aliquotiert. Befinden sich wachstumsfähige Einheiten in den Endkavitäten wird dies durch eine Veränderung nachgewiesen (z. B. Farbumschlag, Trübung etc.). Aus den erzeugten Verdünnungen und den einzelnen positiven Subvolumina kann anhand der Bestimmung der Most-Probable-Number abgeschätzt werden, wie viele Keime das anfängliche Gemisch beinhaltete.
Anwendungen von Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen auf dem Gebiet der Most-Probable-Number für Nukleinsäuren. Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, werden verdünnt und die Verdünnungen in Endkavitäten aliquotiert. Dort wird eine PCR durchgeführt. Befindet sich die entsprechende Nukleinsäure in der Endkavität, so wird ein positives Signal erzeugt. Aus den erzeugten Verdünnungen und den einzelnen positiven Aliquoten kann anhand der Bestimmung der Most Probable Number abgeschätzt werden, wie viel Nukleinsäure-Moleküle das anfängliche Gemisch beinhaltete.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen eine halb- oder vollautomatische Erzeugung von diskreten Verdünnungen in einer Kartusche durch Zentrifugation wie z. B. in einer konventionellen Laborzentrifuge. Da kein externes Equipment (Laser, Infrarotstrahler) zur Aktuierung von Ventilen benötigt wird, eignen sich bereits Standardlaborgeräte (Zentrifugen) zum Betrieb der Kartusche, was experimentell bestätigt wurde. Es wird kein spezielles Prozessiergerät benötigt.
Die Konzentrationen der erzeugten Verdünnungen bzw. die realisierten Verdünnungsfaktoren Z lassen sich sowohl durch das Layout, der in der Kartusche implementierten Strukturen (produktionsseitig), als auch durch das hinzu pipettierte Probenvolumen der Lösung A (anwenderseitig) verändern. Dies wurde bereits experimentell gezeigt. Somit können auch nach Produktion der Kartuschen durch den Nutzer die Verdünnungsfaktoren Z der Verdünnungsreihe verändert werden. Hierbei gilt weiterhin Z = (V_A + V_B)/V_A. V_B wird durch die Kartusche festgelegt, V_A kann entweder durch den Anwender frei variiert werden, oder ist ebenfalls durch die Kartusche festgelegt. Verschiedene mikrofluidische Layouts sind deshalb nicht notwendig, um unterschiedliche Z zu realisieren, was dem Gesamtsystem ein hohes Maß an Flexibilität verleiht, was ebenfalls bereits experimentell bestätigt wurde.
Insbesondere lassen sich jedoch Verdünnungsreihen herstellen, bei denen die Verdünnungsstufen völlig automatisch und ohne Einfluss von manuellen Pipettierfehlern realisiert werden können. Dazu werden in die Kartusche zusätzlich zu den Einlässen für die die zu verdünnende Lösung A und die Verdünnungslösung B fluidische Strukturen zur Volumendefinition dieser Lösungen A und B integriert. Die Lösungen müssen dann nur noch im Überschuss zugegeben werden. In diesem Falle kann eine hochpräzise, von manuellen Pipettierfehlern nahezu fehlerfreie (bis auf den Fall, dass zu wenig einpipettiert wird) Verdünnungsreihe realisiert werden. Der Verdünnungsfaktor Z kann bei solchen Ausführungsbeispielen fest durch die Fluidik vorgegeben sein, so dass die freie Wahl der Verdünnungsfaktoren Z durch den Anwender entfällt.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen somit eine zentrifugal-mikrofluidische Struktur, die halb- oder vollautomatisch eine Verdünnungsreihe realisiert. Dabei wird die Verdünnungslösung B in einzelne Volumina V_B1 bis V_Bn unterteilt (mit n > 1). Eine zu verdünnende Lösung A mit dem Volumen V_A wird zugegeben und mit V_B1 verdünnt. Aus dieser Verdünnung wird ein Volumen V_AB1 überführt und mit einem Volumen V_B2 verdünnt. Sukzessive wird stets ein Volumen V_AB(i-1) überführt und mit einem Volumen V_Bi verdünnt und so eine Verdünnungsreihe mit Z_i = ((V_AB(i-1) + V_Bi)/V_AB(i-1))·Z_(i-1) mit i ≤ n und Z₀ = 1 erzeugt. Dieses Mischen und Überführen kann sowohl seriell als auch parallel durchgeführt werden, bis alle Verdünnungen der Verdünnungsreihe hergestellt sind.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen eine zentrifugal-mikrofluidische Struktur, die eine Verdünnungsreihe realisiert. Dabei wird die Verdünnungslösung B in einzelne Volumina V_B1 bis V_Bn unterteilt (mit n > 1). Eine zu verdünnende Lösung A mit dem Volumen V_A wird zugegeben und mit V_B1 verdünnt. Hieraus wird wiederum ein Teilvolumen V_AB1 = V_A in das nächste Volumen V_B2 überführt. Sukzessive wird stets ein Volumen V_AB(i-1) = V_A überführt und mit einem Volumen V_Bi vermischt. Dieses Mischen und Überführen wird sukzessive durchgeführt, bis alle Verdünnungen hergestellt sind. So entsteht eine Verdünnungsreihe mit Z_i = ((V_A + V_Bi)/V_A)·Z_(i-1) mit i ≤ n. Auch bei diesem Layout kann der Anwender durch Wahl des Volumens V_A die Verdünnungsfaktoren Z_i der Verdünnungsreihe verändern.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen eine zentrifugal-mikrofluidische Struktur, die eine logarithmische Verdünnungsreihe realisiert. Dabei wird die Verdünnungslösung B in einzelne Volumina V_B1 bis V_Bn unterteilt (mit n > 1) und alle Volumina seien identisch mit V_Bi = V_B1. Eine zu verdünnende Lösung A mit dem Volumen V_A wird zugegeben und mit V_B1 verdünnt. Hieraus wird wiederum ein Teilvolumen V_AB1 = V_A in das nächste Volumen V_B2 = V_B1 überführt. Sukzessive wird stets ein Volumen V_AB(i-1) = V_A überführt und mit einem Volumen V_Bi = V_B1 vermischt. Dieses Mischen und Überführen wird sukzessive durchgeführt, bis alle Verdünnungen hergestellt sind. So entsteht eine Verdünnungsreihe mit Z_i = ((V_A + V_B1)/V_A)·Z_(i-1) mit i ≤ n. Hierdurch ergibt sich ein Z_i = ((V_A + V_B1)/V_A)^i, was einer logarithmischen Verdünnungsreihe, mit einer Verdünnung von ((V_A + V_B1)/V_A) zwischen einzelnen Konzentrationen, entspricht. Auch bei diesem Layout kann der Anwender durch Wahl des Volumens V_A die Verdünnungsfaktoren Z_i der Verdünnungsreihe verändern.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist das Volumen V_Bi ist durch die Mikrofluidik festgelegt, während das Volumen V_A durch den Anwender bestimmt wird.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das Volumen V_A nicht durch den Anwender beeinflusst werden. Die Kartusche verfügt über einen oder mehrere Einlässe, um damit unterschiedliche Verdünnungsfaktoren Z, für bevorzugt logarithmische Verdünnungsreihen, zu realisieren.
Ausführungsbeispiele der Erfindung weisen ein rotierendes Substrat mit einer Mehrzahl an mikrofluidischen Strukturen (Einfüllkammern, Mischkammern, gegebenenfalls Siphons, gegebenenfalls Aliquotierstrukturen, gegebenenfalls passive Ventile) auf. (a1) Ein fluidischer Kanal verbindet eine der Einfüllkammern für die Verdünnungslösung mit einer Mehrzahl an fluidischen ”Fingern” mit definiertem Volumen. (a2) Diese Finger können die anfängliche Menge der Lösungen aus der Einfüllkammer in mehrere Subvolumina aufteilen. Der Überstand der Lösung wird in eine Überstandskammer überführt. Jeder der Finger ist mit je einer Mischkammer verbunden sein. Alternativ zu (a1) und (a2) kann die Einfüllkammer für die Verdünnungslösung ebenfalls direkt mit der ersten Mischkammer m₁ verbanden. Eine Portionierung kann durch seriellen Transfer des Lösungsüberstandes in die jeweils benachbarte Mischkammer über die kapillaren Siphons erfolgen. Eine zweite Einfüllkammer für die zu verdünnende Lösung ist mit einer der Mischkammern verbunden. Zwischen jeweils benachbarten Mischkammern ist eine geeignete, fluidische Verbindung vorgesehen, zum Beispiel ein kapillarer Siphon, um zunächst ein Mischen und dann ein Überführen eines Anteils der Mischung in die nächste Mischkammer zu erlauben
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die Volumina der Verdünnungsreihe von der Kartusche auf externe Behältnisse überführt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die externen Behältnisse von der Kartusche abnehmbar. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich bei den Behältnissen um Standard-Laborbehältnisse wie z. B. Eppendorf-Cups. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich bei den Behältnissen um Mikrotiterplatten oder Teile von Mikrotiterplatten. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich um Behältnisse für Nukleinsäureanalytik oder Immunoassays. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die Volumina der Verdünnungsreihe auf der Kartusche weiter prozessiert. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die Volumina in weiter außen liegende Kavitäten auf der Kartusche überführt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die Volumina aliquotiert und auf je eine oder mehrere weiter außen liegende Kavitäten auf der Kartusche überführt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird in die weiter außen liegenden Kavitäten vor oder nach dem Überführen der Volumina der Verdünnungsreihe eine oder mehrere weitere Lösungen zugeführt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich bei den eingesetzten Lösungen um ein Enzym, ein Substrat, einen Inhibitor oder einen Aktivator. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich bei den eingesetzten Lösungen um eine Nukleinsäure bzw. eine Lösung, die Nukleinsäuren enthält. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung handelt es sich bei den eingesetzten Lösungen um eine Lösung von Molekülen, Emulsionen oder Suspensionen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthalten die eingesetzten Lösungen Keime (Bakterien, Viren, Pilze). Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthalten die eingesetzten Lösungen Partikel. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird die Struktur verwendet, um biochemische Größen und Kennzahlen zu bestimmen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung Nukleinsäuren und es wird die Anfangskonzentration der Nukleinsäure bestimmt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung Proteine und es wird die Anfangskonzentration der Proteine bestimmt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung Keime und es wird die Anfangskonzentration der Keime bestimmt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung ein Antigen oder einen Antikörper und es werden charakteristische Werte/Kennzahlen eines Immunoassays bestimmt. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung ein Enzym und es werden charakteristische Werte der Enzymkinetik bestimmt (wie z. B. die Michael-Menten-Konstante, Wechselzahl, Kinetik-Konstanten und Umsatzraten). Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung einen Inhibitor oder einen Aktivator und es werden charakteristische Werte der Enzymkinetik bestimmt wie z. B. der IC50_Wert. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung enthält die zu verdünnende Lösung Partikel und es wird eine Bestimmung der anfänglichen Partikelkonzentration durchgeführt.
Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen gegenüber bekannten Lösungsansätzen zur Erzeugung von Verdünnungsreihen zahlreiche erhebliche Vorteile.
1. Flexibilität

– Verdünnungsfaktor der Lösungen A und B kann durch die zugegebene Menge der zu verdünnenden Lösung bestimmt werden. Eine Anpassung der Kartusche oder der in der Kartusche integrierten Strukturen sind daher nicht erforderlich.
– Durch die Wahl von gleichen Volumina kann eine logarithmische Verdünnungsreihe realisiert werden.

2. Geringe Systemanforderungen

– Ausführungsbeispiele der Erfindung können auf einer üblichen Zentrifuge mit nur einer einzigen Rotationsrichtung implementiert werden.
– Eine kostengünstige Herstellung der Kartuschen beispielsweise durch Spritzguss ist möglich.
– Es sind keine aktiv angesteuerten Ventile, keine beweglichen Teile, keine externen Aktuierungsmechanismen erforderlich.

3. Geringe Prozessierungskosten

– Zur Prozessierung der Kartuschen eignen sich Standardlaborgeräte wie etwa Zentrifugen.

4. Hoher Automatisierungsgrad

– Durch Verwendung geeigneter Schnittstellen an den Laborgeräten ist eine vollständige Automatisierung des Ablaufs möglich.
– Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung erfordert die Herstellung der Verdünnungsreihe lediglich das manuelle Einpipettieren der Lösungen. Die Mischungen und die Verdünnungen selbst werden vollautomatisch durch das Frequenzprotokoll erzeugt.

5. Vollständige Automatisierung definierter Verdünnungen möglich

– Bei Ausführungsbeispielen einer speziell ausgelegten Kartusche kann die zu verdünnende Lösung im Überschuss aufgegeben werden. Die enthaltene Mikrofluidik kann ein definiertes automatisches Portionieren der zu verdünnenden Lösung gewährleisten. Da die vorgelegten Portionen der Verdünnungslösung ebenfalls vorgegeben sind, legen diese Portionierungsvolumina den Verdünnungsfaktor Z eindeutig für diese Kartusche fest. Es kann eine logarithmische Verdünnungsreihe entsprechend dieses Z vollautomatisch ohne Risiko eines manuellen Pipettierfehlers erzeugt werden. So kann für jedes beliebige Z eine Kartusche ausgelegt werden.
– Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann eine allgemeiner ausgelegte Kartusche wahlweise die Herstellung mehrerer unterschiedlicher logarithmischen Verdünnungsreihen ermöglichen. Beispielhaft können hierzu unterschiedliche Einlässe für die Lösung A, die mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor Z gekennzeichnet sind, verwendet werden. Der jeweilige Einlass portioniert die zu verdünnende Lösung so, dass der entsprechende Verdünnungsfaktor Z realisiert wird. Je nach gewünschter Verdünnungsreihe wird die Probe dann im Überschuss in den entsprechenden Einlass eingefüllt, die Probe an dem betreffenden Einlass auf ein adäquates Volumen portioniert und anschließend in die erste Verdünnungsstufe (Mischkammer) weitergeleitet. Mit einer einzigen Kartusche können so die im Laboralltag gebräuchlichsten Verdünnungsreihen erzeugt werden, wie z. B. Z = 2, Z = ∛10, Z = 3, Z = √10, Z = 4, Z = 5, Z = 10 etc.. der Anwender kann dann je nach Bedarf den entsprechenden Einlass befüllen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2008/0193336 A1 [0015]
US 2011/0085950 A1 [0016]
US 6004515 [0017]
US 5869004 [0017]
US 6632655 B1 [0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

D. Mark et al., Chem. Soc. Rev., 2010, 39: 1153–1182 [0010]
C.-Y. Chen et al., Proc. MicroTas, 2010, S. 752–754 [0011]
J. Koehler et al., Assay Drug Develop., 2002, S. 91–96 [0012]
Noo Li Jeon et al., Langmuir, 2000, 16: 8311–8316 [0013]
Kyle Champbell et al., Lab Chip, 2007, 7: 264–272 [0013]
M. Grumann et al., Lab Chip, 2005, 5: 560–565 [0014]

Claims

Vorrichtung zum Erzeugen einer Verdünnungsreihe aus einer zu verdünnenden Lösung (A), die eine zu verdünnende Substanz enthält, und einer Verdünnungslösung (B), mit folgenden Merkmalen: einem Rotationskörper (10), der fluidische Strukturen (46) aufweist, einem Antrieb (20), der ausgelegt ist, um den Rotationskörper (10) mit Rotationen unterschiedlicher Rotationsprotokolle zu beaufschlagen, und einer Steuerung (24), die ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um die Rotationsprotokolle zu durchlaufen, wobei die fluidischen Strukturen (46) folgende Merkmale aufweisen: eine erste Mischkammer (m₁) mit zumindest einem Fluidauslass, eine zweite Mischkammer (m₂) mit zumindest einem Fluideinlass, eine fluidische Verbindung (s₁) zwischen dem Fluidauslass der ersten Mischkammer (m₁) und dem Fluideinlass der zweiten Mischkammer (m₂), wobei die fluidische Verbindung (s₁) zwischen der ersten Mischkammer (m₁) und der zweiten Mischkammer (m₂) derart ausgelegt ist, dass bei Durchlaufen eines ersten Rotationsprotokolls ein definiertes Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) und ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung (B) in der ersten Mischkammer (m₁) gemischt werden, um eine erste Mischung mit einem ersten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen, wobei kein Teil der ersten Mischung in die zweite Mischkammer (m₂) gelangt, und wobei die fluidische Verbindung (s₁) zwischen der ersten Mischkammer (m₁) und der zweiten Mischkammer (m₂) derart ausgelegt ist, dass bei Durchlaufen eines zweiten Rotationsprotokolls ein definiertes Teilvolumen der ersten Mischung aus der ersten Mischkammer (m₁) durch die fluidische Verbindung (s₁) in die zweite Mischkammer (m₂), in der sich ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung (B) befindet, transportiert wird und ein definiertes Volumen der ersten Mischung in der ersten Mischkammer (m₁) verbleibt. wobei die Steuerung (24) ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um das erste und das zweite Rotationsprotokoll zu durchlaufen und nach dem Durchlaufen des ersten Rotationsprotokolls und des zweiten Rotationsprotokolls ein drittes Rotationsprotokoll zu durchlaufen, um in der zweiten Mischkammer (m₂) das definierte Teilvolumen der ersten Mischung mit dem definierten Volumen der Verdünnungslösung (B) zu mischen, um eine zweite Mischung mit einem zweiten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei dem das dritte Rotationsprotokoll gleich dem ersten Rotationsprotokoll ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die fluidische Verbindung (s₁) einen Siphon aufweist, wobei der Siphon einen Fluideinlass, der an einer ersten radialen Position in die erste Mischkammer (m₁) mündet, und einen Fluidauslass, der an einer zweiten radialen Position in die zweite Mischkammer (m₂) mündet, aufweist, wobei die zweite radiale Position radial außerhalb der ersten radialen Position ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die fluidischen Strukturen (46) eine dritte Mischkammer (m₃) aufweisen, wobei die zweite Mischkammer (m₂) einen Fluidauslass aufweist, der über eine entsprechende fluidische Verbindung (s₂) mit einem Fluideinlass der dritten Mischkammer (m₃) verbunden ist, wobei die Steuerung (24) ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um nach dem Erzeugen der zweiten Mischung erneut das zweite Rotationsprotokoll zu durchlaufen, so dass ein definiertes Teilvolumen der zweiten Mischung aus der zweiten Mischkammer (m₂) in die dritte Mischkammer (m₃), in der sich ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung (B) befindet, transportiert wird und ein definiertes Volumen der zweiten Mischung in der zweiten Mischkammer (m₂) verbleibt, und ein weiteres Rotationsprotokoll zu durchlaufen, um das definierte Teilvolumen der zweiten Mischung mit dem definierten Volumen der Verdünnungslösung (B) in der dritten Mischkammer (m₃) zu mischen, um eine dritte Mischung mit einem dritten Verdünnungsverhältnis zu erzeugen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die fluidischen Strukturen (46) eine Anzahl von n Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) aufweisen, wobei jeweils ein Fluidauslass einer vorhergehenden Mischkammer mit einem Fluideinlass einer nachfolgenden Mischkammer über eine entsprechende fluidische Verbindung (s₁, s₂, s₃, s₄) verbunden ist, wobei die Steuerung (24) ausgelegt ist, um entsprechende Rotationsprotokolle zu durchlaufen, um in den n Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) n Mischungen mit n unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen zu erzeugen, wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich drei ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der das definierte Volumen der zu verdünnenden Lösung (A), die definierten Volumina der Verdünnungslösung (B) und die definierten Teilvolumina der jeweiligen Mischungen derart ausgelegt sind, dass die n Mischungen eine logarithmische Verdünnungsreihe darstellen.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der eine vorhergehende Mischkammer jeweils radial weiter innen in dem Rotationskörper (10) angeordnet ist als eine nachfolgende Mischkammer.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die fluidischen Strukturen (46) eine Abfallkammer (56) aufweisen, wobei ein Fluidauslass der n-ten Mischkammer mit einem Fluideinlass der Abfallkammer (56) über eine entsprechende fluidische Verbindung (s₅) fluidisch verbunden ist, wobei die Steuerung (24) ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um nach dem Erzeugen der n-ten Mischung in der n-ten Mischkammer das zweite Rotationsprotokoll zu durchlaufen, so dass ein definiertes Teilvolumen der n-ten Mischung aus der n-ten Mischkammer in die Abfallkammer transportiert wird und ein definiertes Volumen der n-ten Mischung in der n-ten Mischkammer verbleibt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der die fluidischen Strukturen (46) eine Mehrzahl von Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) aufweisen, deren Anzahl der Anzahl von Mischkammern entspricht, wobei jede der Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) ausgelegt ist, um ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung (B) bereitzustellen, wobei jede der Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) über ein fluidisches Ventil (70) mit einer der Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der das fluidische Ventil (70) ausgelegt ist, um die Verdünnungslösung (B) bei einer Rotation des Rotationskörpers (10) gemäß einem vierten Rotationsprotokoll passieren zu lassen und bei einer Rotation des Rotationskörper (10) gemäß einem fünften Rotationsprotokoll nicht passieren zu lassen.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der das fluidische Ventil (70) eine hydrophobe Engstelle aufweist, die die Verdünnungslösung (B) passieren muss.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei der die fluidischen Strukturen (46) einen gemeinsamen Fluidkanal (64) aufweisen, über den die Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) mit den definierten Volumina der Verdünnungslösung (B) befüllbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der die Steuerung (24) ausgelegt ist, um den Antrieb (20) zu steuern, um den Rotationskörper (10) mit einer Rotationsfrequenz zu beaufschlagen, bei der die Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) mit den definierten Volumina der Verdünnungslösung (B) befüllt werden, während die fluidischen Ventile (70) geschlossen sind, und nachfolgend die Rotationsfrequenz derart zu erhöhen, dass die Ventile die definierten Volumina der Verdünnungslösung (B) in die Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) durchlassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei der das erste Rotationsprotokoll und das dritte Rotationsprotokoll ein mehrfaches Variieren der Rotationsfrequenz aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der das zweite Rotationsprotokoll ein Reduzieren der Rotationsfrequenz unter eine Rotationsfrequenzschwelle, bei der eine Kapillarkraft in dem Siphon eine durch die Rotation bewirkte Zentrifugalkraft überwiegt, so dass sich der Siphon kapillar befüllt, und ein nachfolgendes Erhöhen der Rotationsfrequenz über eine Rotationsfrequenz, bei der ein Meniskus an dem Fluidauslass des Siphon überwunden wird, aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei der die fluidischen Strukturen (46) eine Vorportionierungskammer für die zu verdünnende Substanz aufweisen, die mit der ersten Mischkammer (m₁) fluidisch verbunden und ausgelegt ist, um ein definiertes Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) an die erste Mischkammer (m₁) weiterzuleiten, das, sofern ein größeres Volumen als das definierte Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) in die Vorportionierungskammer eingefüllt wird, unabhängig von einem eingefüllten Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, die eine Mehrzahl von entsprechenden Vorportionierungskammern mit separaten Einlässen aufweist, die ausgelegt sind, um unterschiedliche definierte Volumen der zu verdünnenden Lösung (A) an die erste Mischkammer (m₁) weiterzuleiten, so dass Verdünnungsreihen mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen erzeugt werden können, wobei eine der Verdünnungsreihen durch eine Auswahl von einem der Einlässe gewählt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der die Vorportionierungskammer in einem Einsatz des Rotationskörpers (10) ausgebildet ist, so dass durch ein Wechseln zwischen Einsätzen mit Vorportionierungskammern, die ausgebildet sind, um unterschiedliche definierten Volumen weiterzuleiten, unterschiedliche Verdünnungsreihen realisiert werden können.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei der zumindest eine der Mischkammern einen Fluidausgang aufweist, über den die in der Mischkammer erzeugte Mischung zentrifugal in eine radial weiter außen in dem Rotationskörper vorgesehene Kammer oder in ein von der Rotationskörper abnehmbares Aufnahmegefäß transportierbar ist.
Fluidikmodul für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, das den Rotationskörper (10) bildet oder eingesetzt in einen Träger den Rotationskörper (10) bildet, das die fluidischen Strukturen (46) aufweist, die die erste Mischkammer (m₁) mit dem zumindest einen Fluidauslass, die zweiten Mischkammer (m₂) mit dem zumindest einen Fluideinlass und die fluidische Verbindung (s₁) zwischen dem Fluidauslass der ersten Mischkammer (m₁) und dem Fluideinlass der zweiten Mischkammer (m₂) aufweisen.
Fluidikmodul nach Anspruch 20, bei dem die fluidische Verbindung (s₁) den Siphon aufweist, wobei der Siphon den Fluideinlass, der an der ersten radialen Position in die erste Mischkammer (m₁) mündet, und den Fluidauslass, der an der zweiten radialen Position in die zweite Mischkammer (m₂) mündet, aufweist, wobei die zweite radiale Position radial außerhalb der ersten radialen Position ist.
Fluidikmodul nach Anspruch 20 oder 21, bei dem die fluidischen Strukturen (46) die Anzahl von m Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) aufweisen, wobei jeweils ein Fluidauslass einer vorhergehenden Mischkammer mit einem Fluideinlass einer nachfolgenden Mischkammer über eine entsprechende fluidische Verbindung (s₁, s₂, s₃, s₄) verbunden ist.
Fluidikmodul nach Anspruch 22, bei der eine vorhergehende Mischkammer jeweils radial weiter innen in dem Rotationskörper (10) angeordnet ist als eine nachfolgende Mischkammer.
Fluidikmodul nach einem der Ansprüche 20 bis 23, bei dem die fluidischen Strukturen (46) die Mehrzahl von Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) aufweisen, deren Anzahl der Anzahl von Mischkammern (m₁, m₂, m₃, m₄, m₅) entspricht, wobei jede der Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) ausgelegt ist, um ein definiertes Volumen der Verdünnungslösung (B) bereitzustellen, wobei jede der Dosierkammern über ein fluidisches Ventil mit einer der Mischkammern verbunden ist.
Fluidikmodul nach Anspruch 24, bei der die fluidischen Strukturen (46) den gemeinsamen Fluidkanal (64) aufweisen, über den die Dosierkammern (e₁, e₂, e₃, e₄, e₅) mit den definierten Volumina der Verdünnungslösung (B) befüllbar sind.