DE202007009679U1 - Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen - Google Patents

Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen Download PDF

Info

Publication number
DE202007009679U1
DE202007009679U1 DE202007009679U DE202007009679U DE202007009679U1 DE 202007009679 U1 DE202007009679 U1 DE 202007009679U1 DE 202007009679 U DE202007009679 U DE 202007009679U DE 202007009679 U DE202007009679 U DE 202007009679U DE 202007009679 U1 DE202007009679 U1 DE 202007009679U1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
myostatin
oligonucleotide
gene
muscle
composition according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE202007009679U
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE202006010725U external-priority patent/DE202006010725U1/de
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE202007009679U priority Critical patent/DE202007009679U1/de
Publication of DE202007009679U1 publication Critical patent/DE202007009679U1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Zusammensetzung, welche zur Verabreichung an ein Tier geeignet ist, umfassend ein modifiziertes Oligonucleotid, das 7 bis 75 aufeinanderfolgende Ribosegruppen enthält, welche durch achirale 5' zu 3'-Internucleosidphosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid komplementär ist zu einer Region eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt, der 3'-UTR-Region und der Translationsterminationsstelle, und wobei das Gen für ein Genprodukt codiert, welches an einem Muskelschwundzustand beteiligt ist.

Description

  • Hintergrund
  • Die Erhöhung des Muskelwachstums hat sich im Hinblick auf sowohl die Behandlung von Muskelschwundzuständen als auch auf Nutztiere und Tiere zur Nahrungsmittelerzeugung zu einem wichtigen Gebiet entwickelt. Muskelschwundzustände schließen die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), mehrere Formen der Gliedergürtel-MD (LGMD) und andere kongenitale MDs (CMD), Sarkopenie, Kachexie bei einer Krebserkrankung und Diabetes mellitus ein. Fortschreitende Muskelschädigungen und ein zunehmender Muskelverlust, Gewebsentzündungen und der Ersatz des gesunden Muskels durch Faser- und Fettgewebe resultieren in Behinderungen und Todesfällen.
  • In der Tierhaltung, wie bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung, sind alle Verfahren, welche den Muskelanteil und das Muskelgewicht erhöhen, für die Industrie von großem Nutzen. Jedoch ist noch kein wirksames Mittel gefunden worden, um Muskelschwundzustände zu behandeln und um das Muskelwachstum bei Tieren zu fördern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verwendungen davon für die Behandlung von Muskelschwundzuständen und/oder für die Förderung des Muskelwachstums unter Verwendung von Zusammensetzungen, die ein oder mehrere Oligonucleotide enthalten, bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche zur Verabreichung an ein Tier geeignet sind und ein modifiziertes Oligonucleotid enthalten, das 7 bis 75 aufeinanderfolgende Ribosegruppen enthält, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid komplementär ist zu einer Region eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt, der 3'-UTR-Region und der Translationsterminationsstelle, und wobei das Gen an einem Muskel schwundzustand beteiligt ist. In einigen Ausführungsformen weist das modifizierte Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 75–115°C bei einer Konzentration von 1 mM und einer Länge von 10 bis 26 Basen oder einen Tm-Wert von etwa 40°C bis 85°C bei einer Konzentration von 1 pM und einer Länge von 10 bis 26 Basen auf. In einigen Ausführungsformen umfasst das Oligonucleotid ein Nucleotid, das aus der Gruppe bestehend aus Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen enthält das Oligonucleotid ein oder mehrere Nucleotide, worin die 2'-Position einen Substituenten, zum Beispiel Wasserstoff, Methoxy, Propoxy, Methoxyethoxy, Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid am 3'- und/oder 5'-Ende modifiziert. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid am 3'- und/oder 5'-Ende blockiert. In einigen Ausführungsformen ist das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid, z.B. ein Antisense-Oligonucleotid; welches zu einem Myostatin-Gen, zum Beispiel einem Myostatin-Gen eines Tieres, Säugers oder Menschen komplementär ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das Oligonucleotid eine Sequenz, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das Oligonucleotid eine RNAi, ein Ribozym oder ein Desoxyribozym. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung eine Vielzahl von modifizierten Oligonucleotiden, z.B. zwei modifizierte Oligonucleotide.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung für ein Arzneimittel zur Behandlung eines Muskelschwundzustandes bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Verwendungen zur Förderung des Muskelwachstums in einem Individuum bereit, wobei eine wirksame Menge einer Zusammensetzung der Erfindung an ein Individuum zu verabreichen ist. In einigen Ausführungsformen ist das Individuum ein Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Individuum ein Mensch.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Oligonucleotid 7 bis 75 modifizierte Nucleotide, enthaltend aufeinanderfolgende Ribosegruppen, die durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid zu einer Region der Gene, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, komplementär ist. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung zwei, drei, vier, fünf oder mehr als fünf verschiedene modifizierte Oligonucleotide. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid zu einer Region des Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt, der 3'-UTR-Region und der Translationsterminationsstelle, komplementär. In einigen Ausführungsformen weist das modifizierte Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 75–115°C bei einer Konzentration von 1 mM und einer Länge von 10 bis 26 Basen oder einen Tm-Wert von etwa 40°C bis 85°C bei einer Konzentration von 1 pM und einer Länge von 10 bis 26 Basen auf. Die bevorzugten Zusammensetzungen enthalten entweder Antisense-Oligonucleotide oder siRNA. Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verwendungen davon für die Behandlung von Muskelschwundzuständen für Menschen und Tiere bereit. Die Erfindung stellt auch Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung bei der Nahrungsmittelergänzung bereit. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verwendungen davon für die Modulation der Expression von Genen, codierend Genprodukte, die an Muskelschwund- und/oder Muskelwachstumszuständen beteiligt sind, bereit.
  • Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche die hierin beschriebenen Oligonucleotide umfassen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche zur Verabreichung an ein Tier geeignet ist, umfassend ein modifiziertes Oligonucleotid, das aufeinanderfolgende Ribosegruppen enthält, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid zu einer Region eines Gens, welches Myostatin oder einen Myostatin-Rezeptor codiert, komplementär ist. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung zwei, drei, vier, fünf oder mehr als fünf verschiedene modifizierte Oligonucleotide. In einigen Ausführungsformen umfasst das Oligonucleotid etwa 7 bis 75 Nucleotide, enthaltend sieben oder mehr aufeinanderfolgende Ribosegruppen, die durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid zu einer Region des Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt, der 3'-UTR-Region und der Translationsterminationsstelle komplementär. In einigen Ausführungsformen weist das modifizierte Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 75–115°C bei einer Konzentration von 1 mM und einer Länge von 10 bis 26 Basen oder einen Tm-Wert von etwa 40°C bis 85°C bei einer Konzentration von 1 pM und einer Länge von 10 bis 26 Basen auf. In einigen Ausführungsformen weist die Ribosegruppe des Oligonucleotids einen modifizierten 2'-Substituenten auf. In einigen Ausführungsformen ist der modifizierte Substituent aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methoxy, Propoxy, Methoxyethoxy, Fluor, Chlor, Brom und Jod ausgewählt. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid am 3'-Ende blockiert. In einigen Ausführungsformen ist das modifizierte Oligonucleotid am 5'-Ende blockiert.
  • Die Erfindung stellt auch ein Arzneimittel bereit, umfassend eine Zusammensetzung, welche zur Verabreichung an ein Tier geeignet ist, umfassend ein modifiziertes Oligonucleotid, enthaltend aufeinanderfolgende Ribosegruppen, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid zu einer Region eines Gens, welches Myostatin oder einen Myostatin-Rezeptor codiert, komplementär ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Antisense-Oligonucleotid, das die Expression von Myostatin- oder Myostatin-Rezeptor-Genen hemmt, wobei das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist.
  • In anderen Ausführungsformen stellt Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine Interferenz-RNA (RNAi), welche die Expression von Myostatin oder einem Myostatin-Rezeptor moduliert, bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst die RNAi-Zusammensetzung eine doppelsträngige RNA aus 21–25 Nucleotiden mit überhängenden Enden von 2 Nucleotiden an beiden 3'-Enden, wobei die doppelsträngige Region einen G+C-Gehalt von 30–52%, eine A/U-Basenpaarung in den Positionen 15–19 des Sense-Stranges und keine interne Wiederholungen aufweist.
  • In noch weiteren Ausführungsformen stellt Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche ein DNAzym umfasst, wobei das DNAzym die Expression von Myostatin oder eines Myostatin-Rezeptors moduliert. In einigen Ausführungsformen umfasst das DNAzym eine katalytische Domäne, welche die Nucleotidsequenz GGCTAGCTACAACGA umfasst und eine mRNA, die Myostatin oder einen Myostatin-Rezeptor codiert, an jeder Purin:Pyrimidin-Stelle, gegen welche die katalytische Domäne gerichtet ist, spezifisch spaltet; eine erste Bindungsdomäne, die mit dem 5'-Ende der katalytische Domäne verbunden ist; und eine zweite Bindungs domäne, die mit dem 3'-Ende der katalytische Domäne verbunden ist; wobei jede Bindungsdomäne mit einer Region hybridisiert, welche die Spaltstelle unmittelbar flankiert.
  • In noch weiteren Ausführungsformen stellt Erfindung eine Zusammensetzung für die Modulation der Expression von Myostatin oder Myostatin-Rezeptoren bereit, umfassend zwei oder mehrere Gen-modulierende Oligonucleotide, wobei mindestens ein Oligonucleotid gegen Myostatin gerichtet ist und mindestens ein Oligonucleotid gegen ein anderes Gen als Myostatin gerichtet ist. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung Gen-modulierende Oligonucleotide, umfassend ein oder mehrere Oligonucleotide, welche aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonucleotiden, RNAi und DNAzymen ausgewählt sind. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung Antisense-Oligonucleotide. In einigen Ausführungsformen ist das Nicht-Myostatin-Gen ein Gen, das ein Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Activin A-Rezeptor IIB, der Tolloid-Metalloproteinase, NF-kappaB, TNF-alpha, MuRF1, Caspase-3, Atrogin-1, RAS, P38-MAPK, MKK-3, MKK-6, JNK, c-myc, c-jun, ASK-1, TAK-1, smad, dem Cyclinabhängigen Kinaseinhibitor p21, Gadd45, IL-6 und PIF (Tabelle 1 und Tabelle 2). In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung ein oder mehrere Antisense-Oligonucleotide, die gegen Myostatin gerichtet sind, ausgewählt aus den Oligonucleotiden, die in den Tabellen 3, 4 und 5 angegeben sind, und ein oder mehrere Antisense-Oligonucleotide, welche gegen ein Nicht-Myostatin-Gen gerichtet sind, ausgewählt aus den Oligonucleotiden, die in Tabelle 3 und Tabelle 4 angegeben sind.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verwendungen der hierin beschriebenen Zusammensetzung(en) bereit. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einer Zelle, enthaltend ein Myostatin codierendes Polynucleotid, bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Oligonucleotid, das die Expression des Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, umfassend aufeinanderfolgende Ribosegruppen, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einer Zelle, enthaltend ein Myostatin codierendes Polynucleotid, bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Oligonucleotid, das die Expression des Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, wobei das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus RNAi, Ribozymen und DNAzymen ausgewählt ist.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einer Zelle, enthaltend ein Myostatin codierendes Polynucleotid und ein nicht Myostatin codierendes Polynucleotid, bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem ersten Gen-modulierenden Oligonucleotid und einem zweiten Gen-modulierenden Oligonucleotid, wobei das erste Oligonucleotid die Expression des Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert und das zweite Oligonucleotid die Expression eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Myostatin codierenden Polynucleotid und dem nicht Myostatin codierenden Polynucleotid, moduliert. In einigen dieser Ausführungsformen sind die Oligonucleotide aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonucleotiden, RNAi, Ribozymen und DNAzymen ausgewählt. In einigen Ausführungsformen umfassen die Oligonucleotide ein erstes Antisense-Oligonucleotid und ein zweites Antisense-Oligonucleotid.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einem Tier bereit, wobei eine Zusammensetzung, umfassend ein Oligonucleotid, das die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, zu verabreichen ist, und wobei das Oligonucleotid in einer Dosis von 0,01 bis 100 mg/kg verabreicht wird. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Tier ein Tier zur Nahrungsmittelerzeugung und die Verabreichung hat eine Erhöhung der Muskelmasse zur Folge.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einem Tier bereit, wobei eine Zusammensetzung, umfassend ein Oligonucleotid, das die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, verabreicht wird, und wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, umfassend aufeinanderfolgende Ribosegruppen, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Tier ein Tier zur Nahrungsmittelerzeugung und die Verabreichung hat eine Erhöhung der Muskelmasse zur Folge.
  • In einer noch anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einem Tier bereit, wobei eine Zusammensetzung, umfassend ein Oligonucleotid, das die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, zu verabreichen ist, und wobei das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus RNAi, Ribozymen und DNAzymen ausgewählt ist. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Tier ein Tier zur Nahrungsmittelerzeugung und die Verabreichung hat eine Erhöhung der Muskelmasse zur Folge.
  • In einer noch anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zum Modulieren der Expression von Myostatin in einem Tier bereit, wobei ein erstes Gen-modulierendes Oligonucleotid und ein zweites Gen-modulierendes Oligonucleotid zu verabreichen ist, und wobei das erste Oligonucleotid die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert und das zweite Oligonucleotid die Expression eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Myostatin codierenden Polynucleotid und einem nicht Myostatin codierenden Polynucleotid, moduliert. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Tier ein Tier zur Nahrungsmittelerzeugung und die Verabreichung hat eine Erhöhung der Muskelmasse zur Folge.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung eines Oligonucleotids, das die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, wobei das Oligonucleotid in einer Dosis von 0,001 bis 100 mg/kg zu verabreichen ist, für ein Arzneimittel zur Behandlung eines Tieres, welches an einem Muskelschwundzustand leidet, bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung eines Oligonucleotids, das die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert, wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist, umfassend aufeinanderfolgende Ribosegruppen, welche durch achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen miteinander verknüpft sind, für ein Arzneimittel zur Behandlung eines Tieres, welches an einem Muskelschwundzustand leidet, bereit.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung eines Oligonucleotids, das die Expression eines Myostatin codierenden Poly nucleotids moduliert, wobei das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus RNAi, Ribozymen und DNAzymen ausgewählt ist, für ein Arzneimittel zur Behandlung eines Tieres, welches an einem Muskelschwundzustand leidet, bereit.
  • Die Erfindung stellt auch eine Verwendung eines ersten Gen-modulierenden Oligonucleotids und eines zweiten Gen-modulierenden Oligonucleotids, wobei das erste Oligonucleotid die Expression eines Myostatin codierenden Polynucleotids moduliert und das zweite Oligonucleotid die Expression eines Polynucleotids moduliert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Myostatin codierenden Polynucleotid und einem nicht Myostatin codierenden Polynucleotid, für ein Arzneimittel zur Behandlung eines Tieres, welches an einem Muskelschwundzustand leidet, bereit. In einigen Ausführungsformen sind die Oligonucleotide aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonucleotiden, RNAi, Ribozymen und DNAzymen ausgewählt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Kits bereit, welche eine oder mehrere der Zusammensetzungen der Erfindung und wahlweise Anweisungen für die Verwendung der Zusammensetzungen enthalten.
  • Bezugnahme auf Referenzen
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung erwähnt werden, sind hierin unter Bezugnahme in dem gleichen Maße eingeschlossen, als wenn für jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben worden wäre, dass sie unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die neuen Merkmale der Erfindung sind im Einzelnen in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt. Die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung, die veranschaulichende Ausführungsformen darlegt, worin die Grundsätze der Erfindung angewendet werden, und die beigefügten Zeichnungen besser verständlich.
  • 1 ist ein Balkendiagramm, welches das Muskelgewicht in drei Gruppen von Mäusen, die mit Kochsalzlösung, einer Scheinbehandlung oder mit RNA-Antisense-Oligonucleotiden behandelt wurden, wiedergibt.
  • 2 veranschaulicht die Wirkung von RNA-Oligos, die gegen Foxo1 gerichtet sind, auf die Expression von MyoD und GDF-8 in normalen Mäusen. A: Western-Blots, welche durchgeführt wurden, um die Wirkung von RNA-Oligos auf die Proteinexpressionsrate von MyoD (C) und GDF-8 (B) in normalen Mäusen zu untersuchen. Eine quantitative RT-PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die Wirkung von RNA-Oligos auf die mRNA-Expressionsrate von Foxo1 (D), GDF-8 (E) und MyoD (F) und in normalen Mäusen zu untersuchen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 6), P < 0,01*, angegeben.
  • 3 veranschaulicht die Wirkung von RNA-Oligos, die gegen Foxo1 (GRR-7) gerichtet sind, und einer Kontrollbehandlung auf die Muskelmasse in S-180-Tumormäusen, wobei die präparierte Muskelmasse am Ende der Studie (n = 6), P < 0,01*, angegeben ist.
  • 4 veranschaulicht die Wirkung von RNA-Oligos, die gegen Foxo1 gerichtet sind, auf die Expression von MyoD und GDF-8 in S-180-Mäusen. A: Western-Blots, welche durchgeführt wurden, um die Wirkung der RNA-Oligos auf die Proteinexpressionsrate von GDF-8 (B) und MyoD (C) in S-180-Mäusen zu untersuchen. Eine quantitative RT-PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die Wirkung der RNA-Oligos auf die mRNA-Expressionsrate von Foxo1 (D), GDF-8 (E) und MyoD (F) in normalen Mäusen zu untersuchen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 6), P < 0,01**.
  • 5 veranschaulicht die Wirkung von RNA-Oligos, die gegen Myostatin gerichtet sind, auf die Muskelmasse in S-180-Implantat-Mäusen. (A) Präparierte Muskelmasse am Ende der Studie. Die Ergebnisse zeigten, dass die Muskelmasse bei gemischten RNA-Oligos im Vergleich zu der Kontrollgruppe um 26% erhöht war (n = 6, Mittelwert ± SD, p < 0,05). (B) Verhältnis von Beinmuskelmasse zu Körpermasse. Die Ergebnisse zeigen, dass gemischte RNA-Oligos, die gegen Myostatin gerichtet sind, die Muskelmasse in S-180-Tumormäusen erhöhen konnten (Mittelwert ± SD, p < 0,05). (C und D) Quantitative RT-PCR-Analyse der Myostatin- und MyoD-Expression auf der mRNA-Ebene in einem Mausmodell nach der Injektion von RNA-Oligos während 2 Wochen (P < 0,01).
  • 6(A) Charakteristische Mikroskopaufnahme von Muskel behandelt mit: Kochsalzlösung (links) und gemischten gegen Myostatin gerichteten RNA-Oligos (rechts). Balken: 100 μm. (B) Muskelfaserbereich bestimmt mittels quantitativer Bildanalyse von 6 Feldern für jeden Gewebeschnitt, *P < 0,05.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verwendungen davon für die Modulation der Expression von Genen, codierend Genprodukte, die an Muskelschwund- und/oder Muskelwachstumszuständen beteiligt sind, bereit. Demgemäß stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verwendungen davon für die Erhöhung des Muskelwachstums und für die Behandlung von Erkrankungen, welche mit einem unzureichenden Muskelwachstum, einer abnormalen Fettanreichung oder einem Muskelschwund assoziiert sind, bereit. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verwendungen der Zusammensetzungen zur Erhöhung des normalen Muskelwachstums, falls eine solche Erhöhung erwünscht ist (z.B. bei Nutztieren), bereit.
  • Im Allgemeinen verwenden die Zusammensetzungen und die Verwendungen der Erfindung Oligonucleotide, welche die Genexpression modulieren und hierin als "Genmodulatoren" und "Gen-modulierende Oligonucleotide" bezeichnet werden. Beispielhafte Genmodulatoren der Erfindung schließen Antisense-Oligonucleotide, Interferenz-RNA (RNAi), Ribozyme und DNAzyme ein. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung einen einzelnen Genmodulator bereit, der gegen ein einziges Gen gerichtet ist, welches am Muskelwachstum und der Aufrechterhaltung davon beteiligt ist, z.B. Myostatin, bereit. In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Kombinationen von Genmodulatoren bereit. Diese Kombinationen schließen Kombinationen von verschiedenen Arten von Genmodulatoren, Kombinationen von Genmodulatoren, die gegen verschiedene Teile des gleichen Gens gerichtet sind, und Kombinationen von Genmodulatoren, die gegen verschiedene Gene gerichtet sind, sowie Kombinationen irgendwelcher der vorstehend erwähnten Kombinationen ein.
  • Die Erfindung stellt ferner modifizierte Oligonucleotide zur Verwendung in irgendeiner der vorstehenden Zusammensetzungen bereit. In einigen bevorzugten Ausführungsformen können die in der Erfindung verwendeten Oligonucleotide z.B. endblockiert oder protoniert sein, eine erhebliche Säureresistenz und eine erhebliche Nucleaseresistenz zeigen und/oder achirale Internucleosid-Phosphatbindungen und modifizierte Ribose- und Desoxyribose-Substituenten enthalten.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung bereit. Die Verwendungen schließen Verwendungen der Zusammensetzungen für Arzneimittel zur Behandlung von Tieren (z.B. Säugetieren oder Menschen) durch Modulierung der Genexpression in Zellen durch das Inkontaktbringen der Zellen mit den Zusammensetzungen der Erfindung ein. Die Verwendungen schließen auch Verwendungen der Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen unter Verwendung der Gen-modulierenden Zusammensetzungen der Erfindung ein. Erkrankungen für eine Behandlung schließen Muskelschwunderkrankungen oder Erkrankungen, die mit einer verminderten Muskelmasse und/oder einer erhöhten Fettleibigkeit assoziiert sind, ein. So wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Muskelschwunderkrankung", der gleichbedeutend mit dem Begriff "Muskelschwundzustand" verwendet wird, Erkrankungen oder Zustände, bei denen Muskelschwund eines der primären Symptome ist, wie Muskeldystrophie, Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Anorexie, Sarkopenie, Kachexie, Muskelatrophie infolge Immobilisierung, längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit und dergleichen, sowie Erkrankungen, bei denen ein abnormal hohes Fett-zu-Muskel-Verhältnis an einer Krankheit oder einer Krankheitsvorstufe beteiligt ist, z.B. Typ II Diabetes oder Syndrom X. Zusätzlich stellt die Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Muskelmasse bei Tieren, falls eine solche Erhöhung wünschenswert ist, z.B. bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung wie Säugetieren und Fischen, bereit.
  • Außerdem stellt die Erfindung Kits bereit, welche Zusammensetzungen der Erfindung, wahlweise einschließlich Anweisungen für die Verwendung der Zusammensetzungen in den Verfahren der Erfindung, bereitstellen.
  • Die Genmodulatoren der Erfindung schließen Antisense-Oligonucleotide, Interferenz-RNA (RNAi), Ribozyme und DNAzyme ein. Die Zusammensetzungen der Erfindung enthalten einen oder mehrere Genmodulatoren, welche gegen einen oder mehrere Bereiche eines oder mehrerer Gene gerichtet sind. Eine Zusammensetzung, welche eine Nucleinsäure enthält, "moduliert" die Genexpression oder ist "in der Lage" die Genexpression "zu modulieren" oder ist ein "Modulator" der Genexpression, wenn die Nucleinsäure die Genexpression moduliert oder wenn die Nucleinsäure ein Genprodukt codiert, das die Genexpression moduliert. So wie hierin verwendet, schließt der Begriff "modulieren" sowohl eine Hemmung als auch eine Stimulierung, sowie andere Veränderungen (z.B. die Herstellung eines modifizierten Genprodukts) der Genexpression ein. Der Begriff "Hemmung" soll sowohl die vollständige als auch die partielle Hemmung der Genexpression einschließen. In verschiedenen Ausführungsformen wird die Genexpression in einer Rate gehemmt, welche um etwa 1–99% oder mindestens etwa 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% niedriger als die Wildtyp-Genexpressionsrate ist. In einigen Ausführungsformen wird die Expression in einer Rate gehemmt, welche um mindestens etwa 1–99% oder mindestens etwa 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% niedriger als die Wildtyp-Genexpressionsrate ist.
  • Die Gene für die Modulation können basierend auf ihrer Beteiligung an einem oder mehreren Signalwegen, welche bei der zu behandelnden Erkrankung verändert werden, ausgewählt werden. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die einen Genmodulator enthalten, der gegen einen Bereich eines Gens, z.B. Myostatin, gerichtet ist. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Genmodulatoren bereit, die gegen mehr als einen Bereich eines Gens, z.B. Myostatin, gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Genmodulatoren bereit, die gegen mehrere Gene, z.B. Myostatin und Myostatin-Rezeptor-Gene, sowie andere hierin beschriebenen Gene (Tabelle 1 und Tabelle 2) gerichtet sind. In diesen Ausführungsformen kann mehr als ein Bereich eines Gens der Zielort sein.
  • I. Zusammensetzungen der Erfindung
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung schließen ein oder mehrere Mittel ein, welche in der Lage sind, die Expression eines oder mehrerer Gene, die mit einem Muskelschwund und/oder dem Muskelwachstum assoziiert sind, und die damit verbundenen Zustände zu modulieren. Typischerweise haben die Genmodulatoren der Erfindung eine hemmende Wirkung auf die Genexpression und schließen ohne Einschränkung Antisense-Oligonucleotide, Interferenz-RNA (RNAi), Ribozyme und DNAzyme ein. Die Zusammensetzungen der Erfindung enthalten einen oder mehrere Genmodulatoren, welche gegen einen oder mehrere Bereiche eines oder mehrerer Gene gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche einen Genmodulator enthalten, der gegen einen Bereich eines Gens, z.B. Myostatin, gerichtet ist. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Genmodulatoren bereit, welche gegen mehr als einen Bereich eines Gens, z.B. Myostatin, gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Genmodulatoren bereit, welche gegen mehrere Gene, z.B. Myostatin, Myostatin-Rezeptor-Gene und/oder Myostatin-Transkriptionsfaktoren, gerichtet sind. In diesen Ausführungsformen kann mehr als ein Bereich eines Gens der Zielort sein.
  • In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche Kombinationen von Genmodulatoren zur Erhöhung des Muskelwachstums und zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einem unzureichenden Muskelwachstum oder einem Muskelschwund assoziiert sind, oder zur Erhöhung des normalen Muskelwachstums (z.B. bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung) bereit. Diese Kombinationen schließen Kombinationen von verschiedenen Arten von Genmodulatoren, Kombinationen von Genmodulatoren, die gegen verschiedene Teile des gleichen Gens gerichtet sind, und Kombinationen von Genmodulatoren, die gegen verschiedene Gene gerichtet sind, sowie Kombinationen irgendwelcher der vorstehend erwähnten Kombinationen ein.
  • Die Erfindung stellt ferner modifizierte Oligonucleotide zur Verwendung in irgendeiner der vorstehenden Kombinationen bereit. In einigen Ausführungsformen können die in der Erfindung verwendeten Oligonucleotide z.B. endblockiert oder protoniert sein, eine erhebliche Säureresistenz und eine erhebliche Nucleaseresistenz zeigen und/oder achirale Internucleosid-Phosphatbindungen und modifizierte Ribose- und Desoxyribose-Substituenten enthalten.
  • Die Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung können auf ein beliebiges Gen angewendet werden, für das eine Veränderung der Expression gewünscht wird, um eine therapeutische Wirkung bei Muskelschwunderkrankungen bereitzustellen oder um eine erwünschte Erhöhung der Muskelmasse hervorzurufen. Im Allgemeinen sind die Hauptziele Gene, welche am Muskelwachstum und der Aufrechterhaltung davon beteiligt sind. In den meisten Fällen sind jedoch mehrere Signalwege unter Beteiligung einer Vielzahl von Genen bei einer bestimmten Erkrankung betroffen, und die Erfindung stellt nicht nur Zusammensetzungen und Verfahren bereit, welche gegen einzelne Gene (z.B. Myostatin) gerichtet sind, sondern auch Zusammensetzungen und Verwendungen davon, die gegen mehrere Gene oder gegen mehrere Bereiche auf einem einzigen Gen oder beides gerichtet sind.
  • A. Expression-modulierende Zusammensetzungen
  • In den Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung können beliebige Arten von Therapeutika auf Nucleinsäure-Basis, welche die Expression eines Gens modulieren, verwendet werden. Diese schließen Antisense-Oligonucleotide, Ribozyme, Interferenz-RNA (RNAi) und DNAzyme ein. Das gemeinsame Ziel dieser Ansätze ist die Erkennung der DNA- oder mRNA-Zielsequenzen davon über eine Watson-Crick-Basenpaarung. Die vorliegende Erfindung betrifft daher Polynucleotide, welche mit irgendeiner der hierin beschriebenen Gensequenzen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren. Stringente Bedingungen bezeichnen Bedingungen, welche eine Unterscheidung von Nucleinsäureduplexen aufgrund ihres Fehlpaarungsgrades ermöglichen. Solche Polynucleotide (z.B. Antisense und RNAi) können verwendet werden, um die Expression eines Genprodukts, das mit einem Muskelschwund assoziiert ist, zu hemmen. Solche Polynucleotide können auch als Sonden und Primer für Forschungs- und Diagnosezwecke wirksam sein.
  • Der Begriff "Oligonucleotide", wie hierin verwendet, verweist auf ein Molekül, das Nucleotide (d.h. Ribonucleotide, Desoxynucleotide oder beides) umfasst. Der Begriff schließt Monomere und Polymere von Ribonucleotiden oder Desoxynucleotiden oder Gemische davon ein, wobei die Nucleotide zum Beispiel über 5'-zu-3'-Bindungen, 5'-zu-2'-Bindungen, etc. miteinander verknüpft sind. Die Nucleotide, welche in den Oligonucleotiden verwendet werden, können in der Natur vorkommen oder können synthetisch hergestellte Analoga sein, die in der Lage sind, Wechselwirkungen mit natürlich vorkommenden Basenpaaren zur Bildung einer Basenpaarung einzugehen. Beispiele für nicht in der Natur vorkommende Basen, welche in der Lage sind, Wechselwirkungen zur Bildung einer Basenpaarung einzugehen, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Aza- und Deaza-Pyrimidin-Analoga, Aza- und Deaza-Purin-Analoga und andere heterocyclische Basenanaloga, worin eines oder mehrere der Kohlenstoff- oder Stickstoffatome der Purin- und Pyrimidinringe durch Heteroatome, z.B. Sauerstoff, Schwefel, Selenium, Phosphor, etc., substituiert ist, ein.
  • 1. Antisense-Oliaonucleotide
  • Antisense-Oligonucleotide enthalten kurze, chemisch synthetisierte DNA- oder RNA-Oligonucleotide mit einer Basenpaarhomologie für das mRNA-Zielmolekül von Interesse. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird allgemein angenommen, dass Antisense-Oligonucleotide wirksam sind, indem sie die Genexpression durch Blockierung der mRNA-Translation oder durch Markierung der RNA für den Abbau durch RNAse H hemmen. Antisense-Oligonucleotide können das Spleißen, die Translation oder den Kern-Cytoplasma-Transport blockieren. Die Wirkungsmechanismen von Antisense-Oligonucleotiden variieren abhängig von dem Grundgerüst des Oligonucleotids. Antisense-Oligonucleotide können zu einer gesamten codierenden Region oder nur einem Teil davon komplementär sein.
  • Ein Antisense-Oligonucleotid kann hierin zum Beispiel eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr als 100 Nucleotiden aufweisen. Vorzugsweise hat das Oligonucleotid eine Länge von etwa 5 bis etwa 75 Nucleotiden. Das Oligonucleotid kann auch aus etwa 8 bis etwa 40 oder etwa 10 bis etwa 30 oder etwa 15 bis etwa 30 aufeinanderfolgenden Nucleotiden bestehen. In einer Ausführungsform hat das Oligonucleotid eine Länge von etwa 12 bis etwa 26 Nucleotiden.
  • Typischerweise umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Antisense-Oligonucleotid-Zusammensetzung: (i) Auswählen eines Oligonucleotids, das einer Zielregion eines Gens benachbart ist oder diese überlappt, (ii) Bestimmen des Wertes der freien Gibb'schen Energie, die mit dem Oligonucleotid assoziiert ist, unter Bezug auf das Zielgen, (iii) Abschätzen von Tm unter Bezug auf das Zielgen, und (iv) Durchführen einer Sequenzdatenbanksuche, um das Oligonucleotid zu bestimmen, das mit der 5'-UTR-Region, der Translationsstartsequenz, der 3'-UTR-Region oder der Translationsterminationsstelle einer mRNA eines Gens, welches von dem Zielgen verschieden ist, überlappt. Demgemäß können in einigen Ausführungsformen die Antisense-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung gegen einen Translationsstartpunkt, eine 5'-UTR-Region, eine 3'-UTR-Region oder eine Terminationsstelle gerichtet sein. Vorzugsweise ist das Oligonucleotid dem Translationsstartpunkt des Gens benachbart oder überlappt diesen um mindestens etwa eine Base. Mehr bevorzugt überlappt das Oligonucleotid den Translationsstartpunkt des Gens um mindestens etwa zwei Basen. Noch mehr bevorzugt überlappt das Oligonucleotid den Translationsstartpunkt des Gens um mindestens etwa drei Basen.
  • Es wird allgemein bevorzugt, eine RNA oder DNA zu konstruieren, welche die gleiche oder eine ähnliche Basensequenz wie der Teil des Komplementärstrangs eines Gens, welcher das 5'-Ende einer RNA codiert, aufweist. Jedoch kann eine Nucleinsäure auch zum Beispiel die gleiche oder eine ähnliche Basensequenz wie andere Regionen des Gens, wie die Region, welche einen Translationsstartpunkt oder die 3'-nichttranslatierte Region codiert, aufweisen. In einem anderen Beispiel kann eine Nucleinsäure dergestalt konstruiert werden, dass sie die Region um eine Spleißdonor- oder Spleißakzeptorstelle herum, entweder mit oder ohne das dazwischenliegende Intron, wiedergibt. Von besonderem Interesse sind Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenzen die gesamte Sequenz oder ein Fragment der Sequenz des Komplementärstrangs eines Gens, das in Individuen, welche die Erkrankung oder den Zustand zeigen, überexprimiert wird, umfassen. Der Nachweis der Überexpression eines Gens kann durch molekulare Mittel, z.B. durch Nachweis der Expression in dem betroffenen Gewebe durch herkömmliche Molekulartechniken (z.B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press), erfolgen. Die Überexpression eines Gens kann auch durch Verfahren der Arraytechnik oder aus den Ergebnissen von Proteintests, wie ein ELISA, abgeleitet werden.
  • Geeignete Antisense-Oligonucleotide für die vorliegende Erfindung können durch Abschätzen der Delta G- oder freien Gibb'schen Energie für die Oligonucleotidbindung an den komplementären RNA-Strang bei 37°C und Berechnen des Tm-Wertes ermittelt werden. Die freie Gibb'sche Energie und der Tm-Wert werden für den Teil des Zielgens, welcher dem RNA-Oligonucleotid entspricht, das zugegeben wird, gemessen. Diese Werte können z.B. unter Verwendung des Programms, das unter ftp://rna.chem.rochester.edu zu finden ist, berechnet werden und sind bei Matthews et al., J. Mol. Biol. 288 (1999), 911–940, und Matthews et al., RNA 5 (1999), 1458–1468, beschrieben.
  • Demgemäß wird in einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein Oligonucleotid umfasst, wobei (i) das Oligonucleotid eine Länge von etwa 10 bis etwa 30 Nucleotiden aufweist, (ii) die freie Gibb'sche Energie der Bindung für den Oligonucleotid/RNA-Zielduplex bei 37°C einen Wert von –15 kcal hat, und (iii) das Oligonucleotid zu einer Region innerhalb des Zielgens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt und der Translationsterminationsstelle, komplementär ist.
  • Die freie Gibb'sche Energie wird zwischen dem Teil des Zielgens, welcher dem Oligonucleotid entspricht, und dem Teil, der typischerweise der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt oder der Translationsterminationsstelle entspricht, gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die freie Gibb'sche Energie der Bindung für den Oligonucleotid/RNA-Zielduplex bei 37°C einen Wert von ≤ –20 kcal.
  • Auch bevorzugt hat die freie Gibb'sche Energie einen Wert von ≤ –25 kcal. Für 12–14-Mer-Oligonucleotide hat die freie Gibb'sche Energie vorzugsweise einen Wert von ≤ –15 kcal; für 15–17-Mer-Oligonucleotide hat die freie Gibb'sche Energie vorzugsweise einen Wert von ≤ –20 kcal; für 18–20-Mer-Oligonucleotide hat die freie Gibb'sche Energie vorzugsweise einen Wert von ≤ –25 kcal; für 21–23-Mer-Oligonucleotide hat die freie Gibb'sche Energie einen Wert von ≤ –30 kcal; und für 24–26-Mer-Oligonucleotide hat die freie Gibb'sche Energie einen Wert von ≤ –35 kcal.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, welche ein Oligonucleotid umfasst, wobei (i) das Oligonucleotid eine Länge von etwa 10 bis etwa 30 Nucleotiden aufweist, (ii) der Tm-Wert des Oligonucleotids für ein Zielgen etwa 65–90°C beträgt, und (iii) das Oligonucleotid zu einer Region innerhalb des Zielgens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt und der Translationsterminationsstelle, komplementär ist. Vorzugsweise weist das Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 75–90°C auf. Mehr bevorzugt weist das Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 85–90°C auf. Noch mehr bevorzugt beträgt der Tm-Wert des Oligonucleotids für ein Zielgen bei einer monovalenten Kationenkonzentration von 1 M etwa 65–90°C. Die freie Gibb'sche Energie wird zwischen dem Teil des Zielgens, das dem Oligonucleotid entspricht, und dem Teil, der typischerweise der 5'-UTR-Region, der 3'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt oder der Translationsterminationsstelle entspricht, gemessen.
  • Die Oligonucleotidsequenz kann von irgendeinem der Gene, welche in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, oder irgendeinem anderen Gen, wobei die Modulation der Expression davon wahrscheinlich ein wünschenswertes therapeutisches Ergebnis für einen mit Muskelschwund assoziierten Zustand hervorruft, abgeleitet werden. Die Tabellen 3, 4 und 5 zeigen repräsentative Antisense-Oligonucleoti de, welche in Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden können. Diese Sequenzen sind lediglich repräsentativ, wobei irgendeine Sequenz, welche als ein Antisense-Oligonucleotid wirksam ist und welche die Expression eines Gens moduliert, das an einem Muskelschwundzustand beteiligt ist, in den Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung verwendet werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen sind ein oder mehrere der Antisense-Oligonucleotide der Erfindung modifizierte Oligonucleotide. Bindungs- und Grundgerüstmodifikationen, wie 2'-O-Methylgruppen, 2'-O-Allylgruppen, blockierte Nucleinsäuren und Peptidnucleinsäuren, haben sich für Oligonucleotide, welche in vivo verwendet werden, als sehr vielversprechend erwiesen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung derart modifiziert, dass sie eine erhöhte Säureresistenz im Vergleich zu einem unmodifizierten Oligonucleotid oder eine erhöhte Resistenz gegen Endonucleasen oder beides liefern. Weitere Modifikationen werden nachstehend beschrieben.
  • Ein Antisense-Oligonucleotid kann durch eine chemische Synthese und durch enzymatische Ligierungsreaktionen mit Hilfe von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, konstruiert werden. Alternativ kann die Antisense-Nucleinsäure unter Verwendung eines Expressionsvektors, in welchen eine Nucleinsäure in einer Antisense-Orientierung subcloniert worden ist (d.h. die RNA, welche von der inserierten Nucleinsäure transkribiert wird, liegt in einer Antisense-Orientierung zu einer Zielnucleinsäure von Interesse vor), biologisch hergestellt werden.
  • Obwohl die hierin beschriebenen spezifischen Antisense-Sequenzen (z.B. in den Tabellen 3, 4 und 5) die Sequenzen von Oligonucleotiden veranschaulichen, die nur Desoxyribonucleotidreste enthalten, sollte selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung auch Ausführungsformen einschließt, worin die Oligonucleotide aus Ribonucleotidresten bestehen (z.B. durch Substituieren von Uridin für Thymidin und von Ribosyl-Substituenten für Desoxyribosyl-Substituenten). Außerdem sollte selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung auch die Ausführungsformen einschließt, worin die Oligonucleotide nur aus Desoxyribonucleotidresten, nur aus Ribonucleotidresten oder aus Gemischen von Desoxyribonucleotid- und Ribonucleotidresten bestehen.
  • In einigen Ausführungsformen zeigen die Antisense-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung eine Sequenzübereinstimmung von größer als oder gleich 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% mit einer Nucleotidsequenz, welche aus der Gruppe von SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist.
  • Der Grad der Übereinstimmung zwischen zwei Sequenzen kann mit Hilfe von Methoden, die auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind (z.B. Computerprogrammen einschließlich Fasta (Oxford Molecular Group Inc.) und BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 3389–3402)), bestimmt werden. Diese Methoden können angewendet werden, um Lücken in den Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen zu berücksichtigen. Bei der Bestimmung der Homologie oder Sequenzübereinstimmung auf der Nucleotid- oder Aminosäureebene durch eine BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Analyse wird der Algorithmus, welcher durch die Programme blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 3389–3402, und Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2264–2268, beide unter Bezugnahme vollständig eingeschlossen), welche für die Suche nach einer Sequenzübereinstimmung angepasst sind, verwendet wird, benutzt. Der Ansatz, welcher durch das BLAST-Programm verwendet wird, umfasst erstens das Berücksichtigen von ähnlichen Segmenten mit Lücken (nicht zusammenhängend) und ohne Lücken (zusammenhängend) zwischen einer Abfragesequenz und einer Datenbanksequenz, dann das Beurteilen der statistischen Signifikanz aller Paarungen, die identifiziert werden, und schließlich das Zusammenfassen von ausschließlich solchen Paarungen, die einen vorher festgelegten Signifikanzgrenzwert erfüllen.
  • In einigen Ausführungsformen weisen die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung einen Guanin:Cytosin-Gehalt (GC-Gehalt) von mehr als 35% auf. Der GC-Gehalt ist vorzugsweise größer als 40% und am meisten bevorzugt größer als 45%.
  • 2. Ribozyme
  • "Ribozym" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine spezifische Nucleinsäuresequenz zu spalten. Ribozyme können aus RNA, DNA, Nucleinsäureanaloga (z.B. Phosphorothioaten) oder irgendeiner Kombination davon (z.B. DNA/RNA-Chimären) bestehen. In einigen Ausführungsformen bezieht sich ein Ribozym auf RNA-Moleküle, welche Antisense-Sequenzen für die spezifische Erkennung enthalten und eine enzymatische RNA-Spaltaktivität besitzen.
  • Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Ribozyme bereit, welche die Fähigkeit besitzen, Nucleinsäuremoleküle, die entweder direkt oder indirekt an Muskelschwunderkrankungen beteiligt sind (wobei sie z.B. Proteine codieren), zu spalten oder diese auf andere Weise zu hemmen. Mehrere verschiedene Arten von Ribozymen können für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung konstruiert werden, einschließlich zum Beispiel Hammerkopf-Ribozyme (Rossi J.J. et al., Pharmac. Ther. 50 (1991), 245–254) (Forster und Symons, Cell 48 (1987), 211–220; Haseloff und Gerlach, Nature 328 (1988), 596–600; Walbot und Bruening, Nature 334 (1988), 196; Haseloff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585; Haseloff et al., US-Patent Nr. 5,254,678), Haarnadel-Ribozyme (Hampe) et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 299–304, und US-Patent Nr. 5,254,678), Hepatitis-delta-Virus-Ribozyme (Perrotta und Been, Biochem. 31 (1992), 16), Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071) und RNase P-Ribozyme (Takada et al., Cell 35 (1983), 849); vgl. auch WO 95/29241, betitelt "Ribozymes with Product Ejection by Strand Displacement"; und WO 95/31551, betitelt "Novel Enzymatic RNA Molecules".
  • Die Sequenzanforderung an die Spaltstelle für das Hammerkopf-Ribozym ist, dass eine RNA-Sequenz, bestehend aus NUH (worin N irgendeiner der Reste G, U, C oder A ist, und H C, U oder A bedeutet), an dem Zielort zugänglich ist. Entsprechend ist die gleiche Zielsequenz innerhalb der Haarnadel-Leadersequenz GUC für das Hammerkopf-Ribozym nützlich. Die zusätzlichen Nucleotide des Hammerkopf-Ribozyms oder des Haarnadel-Ribozyms werden durch die Nucleotide, welche die Zielsequenz umgeben, und die Hammerkopf-Konsensussequenz bestimmt (vgl. Ruffner et al., Biochemistry 29 (1990), 10695–10702).
  • Ribozyme sowie DNAs, welche solche Ribozyme codieren, und andere geeignete Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet für die Synthese von Nucleinsäuremolekülen bekannt sind, chemisch synthetisiert werden (vgl. z.B. Heidenreich et al., J. FASEB 70 (1) (1993), 90–96; Sproat, Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1) (1993), 20–28). Alternativ stellen kommerzielle Lieferanten wie Promega, Madison, Wis., USA, eine Reihe von Protokollen bereit, welche für die Herstellung von Nucleinsäuremolekülen wie Ribozymen geeignet sind.
  • Während der Synthese kann das Ribozym durch Ligierung mit einem DNA-Molekül, das die Fähigkeit besitzt, das Ribozym zu stabilisieren und eine Resistenz gegen eine RNAse darauf zu übertragen, modifiziert werden (Rossi et al., Pharmac. Ther. 50 (1991), 245–254). In einer anderen Ausführungsform kann das Ribozym mit einem Phosphothioanalogon zur Verwendung in einem Liposomen-Freisetzungssystem modifiziert werden. Diese Modifikation macht das Ribozym auch resistent gegen eine Endonucleaseaktivität. In einer noch anderen Ausführungsform kann das Ribozym derart modifiziert werden, dass es Propandiolbindungen enthält oder 2'-O-methylierte Nucleotide einschließt.
  • Jedes Ribozym, das die Expression eines Gens moduliert, das an Muskelschwundzuständen beteiligt ist oder welches das Muskelwachstum fördert, falls ein Muskelwachstum wünschenswert ist, z.B. der Gene aus Tabelle 1 und 2, kann in den Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung verwendet werden.
  • 3. Interferenz-RNA (RNAi)
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können doppelsträngige Nucleinsäuren verwendet werden, um die Expression von Genen, die mit einem Muskelschwund assoziiert sind (z.B. Myostatin und Myostatin-Rezeptor-Gene), durch RNA-Interferenz zu hemmen. Die RNA-Interferenz ("RNAi) ist ein posttranslationaler Genabschaltungsmechanismus, bei dem eine doppelsträngige RNA (dsRNA), welche einem Gen (oder einer codierenden Region) von Interesse entspricht, in eine Zelle oder einen Organismus eingeschleust wird, was den Abbau der entsprechenden mRNA zur Folge hat. Die RNAi-Wirkung hält mehrere Zellteilungen an, bevor die Genexpression wieder in Gang kommt. Die RNAi ist daher ein äußerst wirksames Verfahren für das gezielte Erzeugen von knock-out- oder "knock-down"-Ereignissen auf der RNA-Ebene. Die RNAi hat sich bei menschlichen Zellen, einschließlich menschlicher embryonaler Nierenzellen und HeLa-Zellen, als erfolgreich erwiesen. Vgl. z.B. Elbashir et al., Nature, 24. Mai 2001, 411 (6836), 494–498; Tuschel et al., Genes and Development 13 (1999), 3191–3197; Zamore, Cell 101 (2000), 25–33; und US-Patent Nr. 6,506,559, welche alle hierin unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
  • Somit stellt die Erfindung ferner RNAi's bereit, welche die Expression von Genen, die an einer Muskelschwunderkrankung beteiligt sind, hemmen. In diesem Zusammenhang stellt die Erfindung eine RNAi bereit, welche die Expression von Myostatin und eines Myostatin-Rezeptors moduliert. Beispielsweise wird gemäß diesem Aspekt der Erfindung eine kleine (weniger als etwa 50 oder weniger als etwa 40 oder weniger als etwa 30 oder weniger als etwa 20 nt) dsRNA bereitgestellt, welche die Genexpression von Genen, die an einem Muskelschwund oder einem eingeschränkten Muskelwachstum beteiligt sind, spezifisch hemmt (besprochen bei Caplen, Trends in Biotechnology 20 (2002), 49–51). In einigen Ausführungsformen umfasst die RNAi: (a) eine doppelsträngige RNA aus 21–25 Nucleotiden mit überhängenden Enden von 2 Nucleotiden an beiden 3'-Enden; (b) einen G+C-Gehalt von 30–52% für die doppelsträngige Region; und (c) eine A/U-Basenpaarung in den Positionen 15–19 des Sinnstrangs; und (d) keine internen Wiederholungen.
  • 4. DNAzyme
  • Die DNAzym-Technologie kann ähnlich wie die RNAi ebenfalls eine geeignete Wahl für die Gensuppression darstellen. Solche katalytischen DNA-Moleküle haben mehrere Vorteile gegenüber Ribozymen und können in einfacher Weise zu relativ niedrigen Kosten synthetisiert werden. DNAzyme haben darüberhinaus eine mäßiggroße Durchsatzkapazität und sind in einer sequenzspezifischen Weise wirksam. Die Fähigkeit von DNAzymen, aufgrund von Watson-Crick-Wechselwirkungen eine hochflexible Bindung mit Nucleinsäuresubstraten einzugehen und diesbezüglich ein großes Unterscheidungsvermögen zu zeigen, ermöglicht Gentyp-spezifische Reaktionen für eine außerordentlich hochpräzise Überprüfung der Genfunktion. Vgl. z.B. Sun L.Q., Cairns M.J., Saravolac E.G., Baker A. und Gerlach W.L., Pharmacol. Rev. 52 (3) (2000), 325–347; und US-Patent Nr. 6,617,438 und 6,326,174, welche hierin unter Bezugnahme in der Gesamtheit eingeschlossen sind.
  • Somit werden unter diesem Gesichtspunkt der Erfindung DNAzyme bereitgestellt, welche die Expression von Genen, die an einer Muskelschwunderkrankung beteiligt sind, hemmen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein DNAzym bereit, das die Expression von Myostatin oder eines Myostatin-Rezeptors moduliert. In einigen Ausführungsformen schließt die Erfindung ein DNAzym ein, welches enthält: (a) eine katalytische Domäne, welche die Nucleotidsequenz GGC-TAGCTACAACGA (SEQ ID NO: 1) umfasst und welche eine mRNA, die Myostatin oder einen Myostatin-Rezeptor codiert, an jeder Purin:Pyrimidin-Stelle, gegen welche die katalytische Domäne gerichtet ist, spezifisch spaltet, (b) eine erste Bindungsdomäne, welche mit dem 5'-Ende der katalytischen Domäne verbunden ist, und (c) eine zweite Bindungsdomäne, welche mit dem 3'-Ende der katalytischen Domäne verbunden ist, wobei jede Bindungsdomäne mit einer Region, welche die Spaltstelle unmittelbar flankiert, hybridisiert.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen einen Myostatin-Rezeptor, z.B. ARIIb, gerichtet ist, einschließt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen menschliches Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen einen menschlichen Myostatin-Rezeptor, z.B. ARIIb, gerichtet ist, einschließt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen menschliches Myostatin gerichtet ist, wobei die Sequenz des Oligonucleotids aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist, und mindestens-ein-Antisense-Oligonucleotid, das gegen einen Myostatin-Rezeptor, z.B. ARIIb, gerichtet ist, einschließt.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen ein Genprodukt, das inaktives Myostatin in eine aktive Form umwandelt, z.B. TLL2, gerichtet ist, einschließt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen menschliches Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen ein menschliches Genprodukt, das inaktives Myostatin in eine aktive Form umwandelt, z.B. TLL2, gerichtet ist, einschließt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen menschliches Myostatin gerichtet ist, wobei die Sequenz des Oligonucleotids aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen ein Genprodukt, das inaktives Myostatin in eine aktive Form umwandelt, z.B. TLL2, gerichtet ist, einschließt.
  • Jede dieser Kombinationen kann eine Vielzahl von Antisense-Oligonucleotiden einschließen, die gegen eines oder mehrere der Zielgene gerichtet sind, z.B. Kombinationen von Oligonucleotiden, welche gegen die 5'-UTR-Region, die 3'-UTR-Region, das Startsignal, die codierenden Sequenzen und/oder das Terminationssignal eines oder mehrerer der Zielgene gerichtet sind.
  • B. Modifikationen von Nucleinsäuren, welche in den Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sind
  • Die Oligonucleotide, welche im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können modifiziert sein. Ein Oligonucleotid, das mindestens eine Modifikation umfasst, weist eine oder mehrere chemische Modifikationen auf der Molekülebene der natürlichen Molekülstrukturen von sämtlichen oder irgendwelchen der Nucleinsäurebasen, der Zuckereinheiten, der Internucleosid-Phosphatbindungen sowie der Moleküle, welche eine Addition von Substituenten wie Diamingruppen, Cholesteryl- oder anderen lipophilen Gruppen aufweisen, oder eine Kombination von Modifikationen an diesen Stellen auf. Zum Beispiel können die Oligonucleotide endblockiert oder protoniert sein, eine erhebliche Säureresistenz und eine erhebliche Nucleaseresistenz zeigen und achirale Internucleosid-Phosphatbindungen sowie modifizierte Ribose- oder Desoxyribose-Substituenten enthalten.
  • Der Begriff "endblockiert", wie hierin verwendet, verweist auf eine Nucleinsäure mit einer chemischen Modifikation auf der Molekülebene, welche den Abbau ausgewählter Nucleotide, z.B. durch eine Exonucleaseaktivität, verhindert. Diese chemische Modifikation wird derart positioniert, dass sie den integralen Teil der Nucleinsäure, zum Beispiel den Teil einer RNA oder DNA, der eine chemische Ähnlichkeit mit dem Gen aufweist, das an dem physiologischen Zustand beteiligt ist, schützt. Eine Endblockierung kann eine 3'-Endblockierung, eine 5'-Endblockierung oder beides sein. Zum Beispiel kann eine 3'-Endblockierung in der äußersten 3'-Position des Moleküls erfolgen, oder sie kann innerhalb des 3'-Endes erfolgen, vorausgesetzt, dass sie 3' zu den integralen Sequenzen der Nucleinsäure vorliegt.
  • Der Begriff "protonierte Verbindung, betrifft ein Molekül der Erfindung, welches, wenn es in Wasser mit einem pH von 7 gelöst wird, bewirkt, dass der pH-Wert der Lösung abnimmt. Im Allgemeinen werden Verbindungen durch die Addition von Protonen an die reaktiven Stellen des Moleküls protoniert, obwohl andere Modifi kationen des Moleküls möglich sind und durch diesen Begriff eingeschlossen sein sollen. Eine solche Protonierung kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass die Verbindung in Gegenwart einer starken Säure, am meisten bevorzugt einer Säure mit einer flüchtigen konjugierten Base, inkubiert wird. Die Begriffe "Protonierung" und "Acidifizierung", welche hierin gleichbedeutend verwendet werden, beziehen sich auf den Prozess, durch den Protonen (oder positiv geladene Wasserstoffionen) an Protonen-Akzeptorstellen in einer Verbindung der Erfindung addiert werden. Die Protonen-Akzeptorstellen schließen die substituierten oder unsubstituierten Phosphate der Hauptgruppe sowie irgendwelche zusätzlichen Protonen-Akzeptorstellen in entweder der Hauptgruppe oder den Endblockierungsgruppen ein. Da der pH-Wert der Lösung abnimmt, erhöht sich die Anzahl der Akzeptorstellen, welche protoniert werden, wodurch eine stärker protonierte Verbindung erhalten wird.
  • Viele Nucleinsäuregerüste sind bei einem niedrigen pH-Wert (z.B. pH 1–3) nicht stabil und einer Depurinierung unterworfen, wenngleich eine Reihe von Grundgerüsten bei pH 4–5 relativ stabil sind. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung reflektiert die Erkenntnis, dass bestimmte Modifikationen einschließlich 2'-Halogenid-, 2'-O-Alkyl-, 3'-O-Alkyl- und 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl)-Nucleinsäuremoleküle bei dem gewünschten pH-Wert von 1–2 stabil sind. Diese Modifikationen verbessern die Fähigkeit der Oligonucleotide der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, einen Zustand in vivo zu beeinflussen. So können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Nucleinsäuremoleküle einschließen, welche im Wesentlichen säureresistent sind. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch Nucleinsäuremoleküle einschließen, die nucleaseresistent sind. Diese schließen Nucleinsäuremoleküle ein, welche durch 2'-O-Methylphosphodiester-, 2'-O-Alkyl-, 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl)-, 2'-Fluoro- oder 2'-Desoxyerythropentofuranosylgruppen, chimäre Bindungen und irgendwelche anderen Grundgerüstmodifikationen, sowie andere Modifikationen, welche die Nucleinsäuremoleküle gegen eine endogene Nucleaseaktivität im Wesentlichen resistent machen, vollständig derivatisiert sind. Weitere geeignete Verfahren um Nucleinsäuremoleküle nucleaseresistent zu machen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, u.a. die kovalente Modifizierung der Purin- oder Pyrimidinbasen, aus denen die Nucleinsäure besteht, ein. Zum Beispiel können Basen methyliert, hydroxymethyliert oder auf andere Weise substituiert (z.B. glycosyliert) werden, sodass die Nucleinsäuremoleküle, umfassend die modifizierten Basen, im Wesentlichen nucleaseresistent werden. Eine Nucleaseresistenz trägt auch dazu bei, dass die Oligonucleotide der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ihre Wirksamkeit in vivo beibehalten.
  • Vorzugsweise bleiben die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung chemisch relativ unverändert, wenn sie an ein Individuum verabreicht werden, und behalten ihre Aktivität unter sauren Bedingungen (bei einem pH-Wert unter 6,0) oder in Gegenwart einer Endonuclease oder Exonuclease (z.B. in einer in-vivo-Umgebung) bei.
  • Der Begriff "im Wesentlichen säureresistent", wie hierin verwendet, verweist auf Nucleinsäuremoleküle, welche gegen einen Säureabbau im Vergleich zu unmodifizierten Nucleinsäuremolekülen resistent sind. Typischerweise wird die relative Säureresistenz einer Nucleinsäure durch Vergleichen des prozentualen Abbaus einer resistenten Nucleinsäure mit dem prozentualen Abbau des unmodifizierten Gegenstücks davon (d.h. einer entsprechenden Nucleinsäure von gleicher Länge und Sequenz mit einem "normalen" Grundgerüst und normalen Basen) gemessen. Eine Nucleinsäure, welche säureresistent ist, ist vorzugsweise mindestens 1,5-fach resistenter, mehr bevorzugt mindestens 2-fach resistenter, noch mehr bevorzugt mindestens 5-fach resistenter und am meisten bevorzugt mindestens 10-fach resistenter gegen einen Säureabbau als das unmodifizierte Gegenstück davon.
  • Obwohl bestimmte säureresistente Nucleinsäuremoleküle eine ausgesprochene Säurestabilität und Endonuclease-Resistenz zeigen, sind sie gegen 3'-Exonucleasen empfindlich. Um die Exonuclease-Resistenz von 2'-O-Alkyl-substituierten Nucleinsäuremolekülen zu erhöhen, werden die 3'- oder 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure vorzugsweise an eine chemische Einheit gebunden, die eine Exonuclease-Blockierungsfunktion vorsieht. Zum Beispiel können ein oder mehrere Phosphorothioat-Nucleotide an jedem Ende der RNA oder DNA eingebracht werden. Zusätzlich können eine oder mehrere invertierte Basen an jedem Ende der RNA oder DNA eingebracht werden, oder können ein oder mehrere Alkyl- oder Alkohol- (z.B. Butanol-substituierte) Nucleotide oder chemische Gruppen an einem oder beiden Enden eingebracht werden. Demgemäß ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäure, welche eine Nucleinsäure mit der folgenden Struktur umfasst: A-B-C, worin "B" eine 2'-O-Alkyl- oder 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl)- substituierte RNA mit einer Länge von etwa 1 bis etwa 98 Basen ist, und "A" und "C" 5'- bzw. 3'-Endblockierungsgruppen sind (z.B. ein oder mehrere Phosphorothioat-Nucleotide (aber typischerweise weniger als sechs), invertierte Basenbindungen oder Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, O-Alkyl- und O-Alkyl-n(O-alkyl)-Gruppen oder substituierte Nucleotide). Eine unvollständige Liste von Blockierungsgruppen schließt invertierte Basen, Didesoxynucleotide, Methylphosphate, Alkylgruppen, Arylgruppen, Cordycepin, Cytosinarabinosid, 2'-Methoxyethoxy-Nucleotide, Phosphoramidate, eine Peptidbindung, eine Dinitrophenylgruppe, 2'- oder 3'-O-Methyl-Basen mit Phosphorothioatbindungen, 3'-O-Methyl-Basen, Fluorescein, Cholesterin, Biotin, Acridin, Rhodamin, Psoralen, eine Glycerylgruppe, Methylphosphonate, Butanol, eine Butylgruppe, Hexanol und 3'-O-Alkylgruppen ein. Eine enzymresistente Butanolgruppe besitzt vorzugsweise die Struktur OH-CH2CH2CH2CH2 (4-Hydroxybutylgruppe), welche auch als C4-Spacergruppe bezeichnet wird.
  • Der Begriff "im Wesentlichen nucleaseresistent" verweist auf Nucleinsäuremoleküle, welche gegen einen Nucleaseabbau im Vergleich zu natürlich vorkommenden oder unmodifizierten Nucleinsäuremoleküle resistent sind. Modifizierte Oligonucleotide der Erfindung sind mindestens 1,25-fach resistenter gegen einen Nucleaseabbau als eine unmodifizierte Nucleinsäure mit der gleichen Sequenz und der gleichen Anzahl an Nucleotiden, und mehr bevorzugt mindestens 2-fach resistenter, noch mehr bevorzugt mindestens 5-fach resistenter und am meisten bevorzugt mindestens 10-fach resistenter als das unmodifizierte Gegenstück davon. Solche im Wesentlichen nucleaseresistenten Nucleinsäuremoleküle schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Nucleinsäuremoleküle mit modifizierten Grundgerüsten wie Ethylphosphotriester, 2'-O-Methylphosphorothioate, 2'-O-Methyl-p-ethoxy-Ribonucleotide, 2'-O-Alkyl, 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl), 2'-Fluor, 2'-Desoxyerythropentofuranosyl, 2'-O-Methyl-Ribonucleoside, 3'-O-Methyl-Ribonucleotide, invertierte Basen (z.B. invertierte T-Reste) oder chimäre Ausführungsformen dieser Grundgerüste ein.
  • Das modifizierte Oligonucleotid schließt eine RNA oder DNA, umfassend Modifikationen der Zuckereinheiten, wie 2'-substituierte oder 3'-substituierte Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotidmonomere, welche jeweils über Internucleosidbindungen miteinander verknüpft sind, ein. Die modifizierte RNA oder DNA kann auch aus PNA- oder Morpholino-modifizierten Grundgerüsten bestehen, wobei die Spezifität der Sequenz beibehalten wird.
  • Die Ribosegruppen und die Internucleosidbindungen, welche die Basen in einer Nucleinsäure miteinander verknüpfen, werden als das Nucleinsäuregerüst bezeichnet. Ein modifiziertes Grundgerüst schließt Modifikationen der chemischen Bindung zwischen den Nucleotiden, sowie andere Modifikationen, welche dazu verwendet werden können, die Stabilität und Affinität zu erhöhen, wie Modifikationen der Zuckerstruktur, ein. Zum Beispiel kann ein L-Anomer von Desoxyribose verwendet werden, wobei die Base im Hinblick auf das natürliche D-Anomer invertiert ist. In einer Ausführungsform kann die 2'-OH-Gruppe der Zuckergruppe in eine 2'-Halogen-, 2'-O-Alkyl- oder 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl)-Gruppe umgewandelt werden, welche eine Resistenz gegen einen Abbau liefert, ohne dass die Affinität beeinflusst wird. Andere geeignete modifizierte Grundgerüste schließen die folgenden Arten von Internucleotidbindungen ein: 2'-O-Methyl-Phosphodiester, 2'-O-Alkyl-, 2'-O-Ethyl-, 2'-O-Propyl-, 2'-O-Butyl-, 2'-O-Alkyl-n(O-alkyl)-, 2'-Methoxyethoxy-, 2'-Fluor, 2'-Desoxyerythropentofuranosyl-, 3'-O-Methyl- und p-Isoproyl-Oligonucleotide, 2'-O(CH2CH2)xCH3- und/oder Butin-Bindungen. Ein Oligonucleotid kann Kombinationen aus solchen modifizierten Grundgerüsten aufweisen, kann vollständig modifiziert sein oder kann Phosphodieser-Bindungen umfassen, welche alle oder einen Teil der Bindungen ausmachen.
  • Die bevorzugten Internucleosidbindungen in dem modifizierten Oligonucleotid sind achiral. Der Begriff "achiral", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das mit seinem Spiegelbild zur Deckung gebracht werden kann, während sich der Begriff "chiral" auf ein Molekül bezieht, das nicht mit seinem Spiegelbild zur Deckung gebracht werden kann. Oligonucleotide, welche achirale 5'-zu-3'-Internucleosid-Phosphatbindungen enthalten, besitzen Internucleotidbindungen, die achiral sind (d.h. keine Stereochemie zeigen). Die achiralen Oligonucleotide enthalten vorzugsweise mindestens etwa 3 bis 8 aufeinanderfolgende achirale Internucleosidbindungen, mehr bevorzugt 9 bis 10 aufeinanderfolgende achirale Internucleosidbindungen und noch mehr bevorzugt 11 bis 12 aufeinanderfolgende achirale Internucleosidbindungen, und bestehen am meisten bevorzugt vollständig aus achiralen Internucleosidbindungen über die gesamte zusammenhängende Sequenz. In einer anderen Ausführungsform werden die achiralen Internucleosidbindungen von einzelnen chiralen Internucleosidbindungen unterbrochen (z.B. zwei aufeinanderfolgende achirale Bindungen, gefolgt von einer chiralen Bindung, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden achiralen Bindungen; drei aufeinanderfolgende achirale Bindungen, gefolgt von einer chiralen Bindung; vier aufeinanderfolgende achirale Bindungen, gefolgt von zwei chiralen Bindungen, etc.). Beispiele für achirale Internucleosidbindungen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Phosphodiester- und Diphosphorothioatbindungen ein. Achirale RNA- und DNA-Bindungen in dem Grundgerüst werden herkömmlicherweise während der automatisierten Synthese der Oligonucleotide erzeugt, falls die Endstruktur ein symmetrisches Molekül ist (d.h. ein Phosphat, das auf beiden Seiten mit dem gleichen Atom verbunden ist).
  • Die Internucleosid-Phosphatbindungen können Phosphodiester- oder 3'-zu-3'-, 5'-zu-2'- oder 5'-zu-5'-Bindungen und Kombinationen aus solchen ähnlichen Bindungen (um eine modifizierte RNA oder DNA mit einem gemischten Grundgerüst herzustellen) sein. Die Modifikationen können innerhalb (einmalig oder wiederholt) oder an einem Ende oder an beiden Enden des RNA- oder DNA-Moleküls vorkommen. Diese Modifikationen können Additionen an das Nucleinsäuremolekül wie eine Cholesterylgruppe, Diaminverbindungen mit einer unterschiedlichen Anzahl an Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und der terminalen Ribosegruppe und Desoxyribose- oder Phosphatmodifikationen, welche die gegenüberliegenden Ketten oder assoziierte Enzyme oder andere Proteine abspalten oder damit vernetzt sind, einschließen. Elektrophile Gruppen wie Ribose-Dialdehyd können kovalent an eine epsilon-Aminogruppe des Lysylrestes eines solchen Proteins gebunden werden. Eine nucleophile Gruppe wie n-Ethylmaleimid, welche mit einer RNA oder DNA verknüpft ist, kann kovalent an das 5'-Ende einer mRNA oder an eine andere elektrophile Stelle gebunden werden.
  • Die Wirksamkeit einer bestimmten Zusammensetzung kann mit Hilfe der auf dem Fachgebiet bekannten Mittel bestimmt werden. Diese schließen in-vitro- und in-vivo-Methoden wie z.B. die Analyse der Expression in einer Zellkultur, die mit den Zusammensetzungen in Kontakt gebracht wird, die Analyse der Expression und/oder der phänotypischen Eigenschaften und/oder der physiologischen Eigenschaften in einem in-vivo-Modell und klinische Tests ein. In-vivo-Modelle schließen etablierte Tiermodelle für verschiedene Erkrankungen, sowie normale Tiere, welche getestet werden, um die Wirkung einer Zusammensetzung zu bestimmen, ein. Für Myostatin und das Muskelwachstum regulierende Zusammensetzungen können zum Beispiel die in den Beispielen vorgestellten Modellsysteme verwendet werden.
  • C. Zusammensetzungen
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, welche ein einziges die Genexpression modulierendes Oligonucleotid oder Kombinationen von die Genexpression modulierenden Oligonucleotiden enthalten. Die Oligonucleotide sind gegen Gene, die an Muskelschwunderkrankungen beteiligt sind, und/oder Gene, welche das Muskelwachstum fördern, falls ein Muskelwachstum erwünscht ist, gerichtet. Die Zusammensetzungen können nur einen Oligonucleotid-Typ, z.B. nur Antisense-Oligonucleotide, einschließen. Die Zusammensetzungen können mehr als einen Typ (z.B. eine Kombination von Antisense-Oligonucleotiden, RNAi, Ribozymen und/oder DNAzymen) einschließen. Die Zusammensetzungen können mehrere Oligonucleotide einschließen, welche gegen mehrere Bereiche eines einzigen Gens gerichtet sind. Zum Beispiel stellt die Erfindung in einigen Ausführungsformen Kombinationen von Oligonucleotiden bereit, z.B. Antisense-Oligonucleotide, welche gegen die 5'-untranslatierte Region (UTR), die 3'-UTR-Region, den Startpunkt und/oder das Terminationssignal einer mRNA, die von einem Gen abgeleitet ist, gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen ist das Gen ein Myostatin-Gen. Die Zusammensetzungen können mehrere Oligonucleotide einschließen, welche gegen mehr als ein Gen gerichtet sind. Die Zusammensetzungen können mehrere Oligonucleotide einschließen, welche gegen mehrere Bereiche von mehrere Genen gerichtet sind.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung schließen typischerweise mehr als etwa ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75 oder 100 verschiedene Oligonucleotide ein. Vorzugsweise schließen die Zusammensetzungen der Erfindung etwa zwei bis etwa 20 verschiedene Oligonucleotide ein. Mehr bevorzugt schließen die Zusammensetzungen der Erfindung etwa zwei bis etwa 15 verschiedene Oligonucleotide ein, und am meisten bevorzugt schließen die Zusammensetzungen der Erfindung etwa zwei bis etwa 10 verschiedene Oligonucleotide ein; oder schließen die Zusammensetzungen der Erfindung alternativ etwa zwei bis etwa acht verschiedene Oligonucleotide oder etwa zwei bis etwa sechs verschiedene Oligonucleotide ein. In einigen Ausführungsformen schließen die Zusammensetzungen der Erfindung etwa zwei bis etwa vier verschiedene Oligonucleotide ein. So stellt die Erfindung in einigen Ausführungsformen Kombinationen von zwei oder mehreren Oligonucleotide bereit, welche den Zweck haben, die Expression von zwei oder mehreren verschiedenen Genen, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, zu modulieren. Beispielhafte Gene, gegen welche die Antisense-Oligonucleotide gerichtet sein können, sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Kombinationen von zwei oder mehreren Oligonucleotide bereit, wobei die Oligonucleotide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonucleotiden, RNAi, Ribozymen und DNAzymen, welche den Zweck haben, die Expression von zwei oder mehreren verschiedenen Genen, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, zu modulieren, wobei die Gene aus denjenigen ausgewählt sind, welche in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine RNAi gegen Myostatin, Myostatin-Rezeptoren und/oder andere Gene, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von RNAi's bereit, wobei die RNAi's eine Hemmwirkung gegenüber mindestens zwei der Gene, welche in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind, besitzen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Ribozyme gegen Myostatin, Myostatin-Rezeptoren und/oder andere Gene, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von Ribozymen bereit, wobei die Ribozyme eine Hemmwirkung gegenüber mindestens zwei der Gene, welche in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind, besitzen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung DNAzyme gegen Myostatin, Myostatin-Rezeptoren und/oder andere Gene, die an Muskelschwundzuständen beteiligt sind, bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von DNAzymen bereit, wobei die DNAzyme eine Hemmwirkung gegenüber mindestens zwei der Gene, welche in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind, besitzen.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein oder mehrere Antisense-Oligonucleotide gegen Myostatin bereit. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von Antisense-Oligonucleotiden gegen Myostatin bereit, welche mindestens zwei verschiedene Antisense-Oligonucleotide gegen Myostatin einschließt. In einigen Ausführungsformen ist das Myostatin aus der Gruppe bestehend aus menschlichem, Rinder-, Schweine-, Hühner-, Maus-, Pferde-, Hunde- und Fisch-Myostatin ausgewählt. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von Antisense-Oligonucleotiden gegen verschiedene Teile des menschlichen Myostatin-Gentranskripts bereit, umfassend mindestens zwei Antisense-Oligonucleotide, die gegen Teile des Transkripts, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, der 3'-UTR-Region, dem Startpunkt und dem Terminationssignal, gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Kombination von Antisense-Oligonucleotiden gegen menschliches Myostatin bereit, umfassend mindestens zwei Antisense-Oligonucleotide, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt sind.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen mindestens ein Nicht-Myostatin-Gen, ausgewählt aus den in Tabelle 1 und 2 angegebenen, gerichtet ist, einschließt. Einige Ausführungsformen stellen Kombinationen von Antisense-Oligonucleotiden bereit, welche gegen Myostatin und gegen zwei oder mehrere andere Gene, welche in Tabelle 1 und 2 aufgeführt sind, gerichtet sind. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen mindestens eines von NFκB, Cox 2 oder MyoD, einen Myostatin-Rezeptor (z.B. ARIIb) und/oder ein Genprodukt, das inaktives Myostatin in eine aktive Form umwandelt (z.B. TLL2), gerichtet ist, einschließt.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen Myostatin gerichtet ist, und mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen MyoD gerichtet ist, einschließt. In bevorzugten Ausführungsformen sind das Myostatin und das MyoD menschlichen Ursprungs. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, welche mindestens ein Antisense-Oligonucleotid, das gegen menschliches Myostatin gerichtet ist, wobei die Sequenz des Oligonucleotids aus SEQ ID NO: 1–191 ausgewählt ist, einschließt.
  • Jede dieser Kombinationen kann eine Vielzahl von Antisense-Oligonucleotiden, welche gegen eines oder mehrere der Zielgene gerichtet sind, z.B. Kombi nationen von Oligonucleotiden, welche gegen die 5'-UTR-Region, die 3'-UTR-Region, das Startsignal und/oder das Terminationssignal eines oder mehrere der Zielgene gerichtet sind, einschließen.
  • D. Arzneimittel-, Nahrungsergänzungs- und homöopathische Zusammensetzungen
  • Die Erfindung stellt ferner Arzneimittel-, Nahrungsergänzungs- und homöopathische Zusammensetzungen bereit.
  • Arzneimittel
  • Die vorliegende Erfindung schließt Arzneimittel ein, die mindestens etwa ein Oligonucleotid, wie hierin beschrieben, umfassen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Arzneimittel bereit, welche mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75 oder 100 verschiedene Oligonucleotide, wie hierin beschrieben, einschließen. In einigen Ausführungsformen sind die Oligonucleotide Antisense-Oligonucleotide, Ribozyme, RNAi's, DNAzyme oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen umfassen ein oder mehrere der Oligonucleotide ein modifiziertes Oligonucleotid. In einigen Ausführungsformen enthält das Arzneimittel ein oder mehrere Antisense-Oligonucleotide, wobei alle oder irgendwelche davon modifiziert sein können, wie hierin beschrieben ist. Die Arzneimittelumfassen wahlweise ferner einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten.
  • So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Arzneimittel" auf eine therapeutische Zusammensetzung, welche zur Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines pathologischen Zustandes verwendet wird und welche für die parenterale, orale oder topische Verabreichung an Säugetiere, vorzugsweise Menschen, geeignet ist.
  • Die Zusammensetzungen, welche die Oligonucleotide der Erfindung in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, können in Übereinstimmung mit bekannten Techniken hergestellt werden. Der Träger kann abhängig von der Form der Zubereitung, welche für die Verabreichung gewünscht wird, z.B. intravenös, oral, topisch, als Aerosol (für eine topische oder Inhalationstherapie), als Zäpfchen, parenteral oder als Rückenmarksinjektion, in einer großen Vielzahl von Formen vorliegen. Der Exzipient kann eine beliebige Zahl von Trägern enthalten. Im Falle von homöopathischen Arzneimitteln wären die Träger vorzugsweise homöo pathische Träger, z.B. homöopathische Mittel, welche die Wirksamkeit der homöopathischen Zusammensetzung erhöhen können oder welche dazu beitragen, die mit einem physiologischen Zustand assoziierten Symptome zu lindern. Zusätzlich kann die Zusammensetzung Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und andere Bestandteile, vorzugsweise in Mengen von etwa 0,5 bis 2,0 Gew.-%, enthalten, vorausgesetzt, dass sie die Fähigkeit des Arzneimittels, den physiologischen Zustand zu behandeln, nicht ungünstig beeinflussen. Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, einen geeigneten Verabreichungsweg festzulegen und ein geeignetes Freisetzungssystem auszuwählen.
  • Durch die Verabreichung der Zusammensetzung werden die modifizierten Oligonucleotide in einer verdünnten Menge in das Individuum eingebracht. Beispielhafte Dosiseinheiten für die orale oder topische Verabreichung können mehr als etwa 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1 oder 5 mg/kg und/oder weniger als etwa 10, 5, 1, 0,5, 0,1 oder 0,05 mg/kg umfassen. Beispielhafte Dosiseinheitsbereiche für eine Zusammensetzung, welche ein einziges Oligonucleotid enthält, können zwischen etwa 0,01 mg/kg und 10 mg/kg oder zwischen etwa 0,010 mg/kg und 1,0 mg/kg oder zwischen etwa 0,10 mg/kg und 1,0 mg/kg liegen. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Dosiseinheiten von etwa 0,01 bis etwa 100 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 0,1 bis etwa 100 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 0,1 bis etwa 10 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 1 bis etwa 10 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 1 bis etwa 5 μg pro kg Körpergewicht verabreicht. Wenn mehr als ein Oligonucleotid in der Zusammensetzung vorhanden ist, dann können die Dosierungen jedes Oligonucleotids innerhalb der zuletzt genannten Bereiche liegen, oder kann die Dosierung eines oder mehrerer der Oligonucleotide basierend auf der erwarteten Gesamtwirkung der Kombination verringert werden. In einigen Ausführungsformen liegen die Dosiseinheiten je einzelnem Oligonucleotid bei oder unterhalb 100 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 10 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 1 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 0,1 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 0,01 μg pro kg Körpergewicht.
  • Falls oral verabreicht, kann eine Dosiseinheit einmal alle 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Tage oder einmal pro Tag oder 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- oder mehr als 10-mal pro Tage verabreicht werden, bis eine Linderung erreicht wird oder bis die Symptome verschwinden oder ausreichend abgeschwächt sind. In einigen Ausführungsformen wird eine Dosiseinheit etwa einmal bis etwa viermal pro Tag verabreicht. In einigen Ausführungsformen erhält ein Patient die Instruktion, zwei bis drei Dosiseinheiten pro Tag oral einzunehmen. Für eine solche orale Verabreichung kann die Dosiseinheit unter der Zunge des Patienten plaziert oder einfach geschluckt werden.
  • Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung können für die Verabreichung an Menschen und Tiere in einer flüssigen Form oder als Tabletten, Dragees, Granulate, Pulver oder Salben, Cremes, Injektionspräparate oder Zäpfchen zubereitet werden. Salben und Cremes sind mit einer geringen Flüssigkeitsmenge oder zuweilen mit Muttertinkturen versetzt und werden im Allgemeinen als spezifische Arzneien verordnet. Flüssige Zusammensetzungen können in bernsteinfarbenen Glastropfflaschen bereitgestellt werden, um sie vor Licht zu schützen.
  • Bei der Zubereitung der Zusammensetzungen in einer oralen Dosierungsform können beliebige der herkömmlichen pharmazeutischen Medien wie zum Beispiel Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Färbemittel und dergleichen im Falle von oralen, flüssigen Zubereitungen (wie zum Beispiel Suspensionen, Elixire und Lösungen); oder Träger wie Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Zerfallsmittel und dergleichen im Falle von oralen, festen Zubereitungen (wie zum Beispiel Pulver, Kapseln und Tabletten) verwendet werden.
  • Für die Verabreichung durch Injektion können die Zubereitungen eine wässrige Lösung einer wasserlöslichen oder solubilisierten und pharmakologisch verträglichen Form der Nucleinsäure in einer geeigneten Flüssigkeit, z.B. Wasser oder Kochsalzlösung, umfassen. Injizierbare Suspensionen können unter Verwendung von geeigneten flüssigen Trägern, Suspendiermitteln, Mitteln zur Einstellung der Isotonizität, Konservierungsmitteln und dergleichen ebenfalls hergestellt werden. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von verabreichbaren Arzneimitteln sowie Anpassungen davon, welche für die Verabreichung an Individuen erforderlich sind, sind den Fachleuten bekannt oder für diese ersichtlich.
  • Für die topische Verabreichung kann der Träger abhängig von der Zubereitung, welche eine Creme, ein Verbandsmaterial, ein Gel, eine Lotion, eine Salbe oder eine Flüssigkeit sein kann, in einer großen Vielzahl von Formen vorliegen. Die Zusammensetzung kann ein Tensid einschließen, um ein tieferes Eindringen der Bestandteile vorzusehen. Obwohl natürliche Tenside bevorzugt werden, können auch andere Tenside, wie zum Beispiel Isopropylmyristat, verwendet werden. In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine kosmetische Zusammensetzung für die topische Verabreichung an die Haut. So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "kosmetische Zusammensetzung" auf eine Zusammensetzung, welche topisch auf die Haut aufgebracht wird, um das Erscheinungsbild der Haut zu verbessern.
  • Aerosole werden durch Lösen oder Suspendieren der Nucleinsäure in einem Treibmittel wie Ethylalkohol oder in Treibmittel- und Lösungsmittelphasen hergestellt. Die Arzneimittel für eine topische Form oder eine Aerosolform enthalten im Allgemeinen etwa 0,001 Gew.-% (der Nucleinsäure) bis etwa 40 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,02 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% und mehr bevorzugt etwa 0,05 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, abhängig von der besonderen Form, welche verwendet wird. Zäpfchen werden durch Mischen der Nucleinsäure mit einem Lipidvehikel wie Theobroma-Öl, Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyoxyethylenglykolen hergestellt.
  • Das eine oder die mehreren Nucleinsäuremoleküle können mit einem Lipid, einem kationischen Lipid oder einem anionischen Lipid kombiniert werden, wobei der Wirkstoff durch eine Nucleinsäure/Lipid-Emulsion oder eine Liposomensuspension freigesetzt wird. Durch Einbau der Nucleinsäuremoleküle in Lipid-assoziierte Strukturen, können die Nucleinsäuremoleküle eine erhöhte Halbwertszeit in vivo zeigen. Beispiele geeigneter anionischer Lipide zur Verwendung in Verbindung mit einer RNA oder DNA schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Cardiolipin, Dimyristoyl-, Dipalmitoyl- oder Dioleoylphosphatidylcholin oder -phosphatidylglycerin, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin oder -phosphatidylglycerin, Phosphatidinsäure, Lysophosphatidinsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit und anionische Formen von Cholesterin ein.
  • Nahrungsergänzungen
  • So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Nahrungsergänzung" auf eine Zusammensetzung, welche die Ernährung ergänzen soll. Eine Nahrungsergänzung schließt irgendeine diätische Substanz, welche in Säugetieren verwertet wird, um die Ernährung durch Erhöhung der Gesamtnährstoffaufnahme zu ergänzen, oder ein Konzentrat, einen Metaboliten, einen Bestandteil, einen Extrakt, etc. hiervon ein. Eine Nahrungsergänzung schließt irgendein Produkt ein, welches für die Einnahme in Tabletten-, Kapsel-, Pulver-, Weichgel-, Gelkapsel- oder flüssiger Form bestimmt ist. So wie hierin verwendet, wird der Begriff "Nahrungsergänzung" gleichbedeutend mit dem Begriff "Diätergänzung" und "medizinisches Lebensmittel" in dieser Beschreibung verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, welche als eine Nahrungsergänzung im Allgemeinen und speziell für solche Individuen, welche an einem Muskelschwundzustand leiden, nützlich ist.
  • Die Nahrungsergänzungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, welche ein einziges Oligonucleotid und/oder eine Kombination aus etwa zwei oder mehreren Oligonucleotiden enthalten. Die Oligonucleotide oder Kombinationen von Oligonucleotiden können irgendwelche der hierin beschriebenen sein. Die Nahrungsergänzungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um irgendeines der vorstehend erwähnten Indikationen zu behandeln. Diese Mittel können in einer oralen Dosisform mit anderen gut bekannten Nahrungsergänzungen und/oder Nicht-Flavonoid-Antioxidantien (z.B. Selen, Vitamin E (Tocopherol, insbesondere alpha-Tocopherol), Vitamin C (Ascorbinsäure) und Coenzym Q10) kombiniert werden. Ballaststoffergänzungen können ebenfalls in der Zusammensetzung verwendet werden.
  • Die Nahrungsergänzung der vorliegende Erfindung kann weitere Zusätze einschließen. Solche Zusätze schließen Mineralien (z.B. Bor; etc.) und Spurenmetalle wie Zink, Magnesium, Mangan, Chrom, Molybdän, Kupfer, Eisen, Calcium und Kalium, sowie andere Spurenelemente wie Thiamin, Riboflavin, Niacin, Pantothensäure, Pyridoxin, Cholin, Biotin, Inosit, para-Aminobenzoesäure, Vitamin D, Vitamin K und Vitamin A ein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann zu der Zusammensetzung auch eine Ballaststoffergänzung wie Haferkleie oder eine andere natürliche Ballaststoffquelle zugegeben werden.
  • Typischerweise schließt die Nahrungsergänzung ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger wie Lactose, Sucrose, Maisstärke, Kartoffelstärke, Celluloseacetat, Ethylcellulose, etc. ein. Verdünnungsmittel und andere Zusätze, wie ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Bindemittel, Füllstoffe, Träger, Verdickungsmittel, Geschmacksverbesserer, Färbemittel, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Regulatoren, Emulgiermittel oder Gemische davon, können abhängig von der Form der Zusammensetzung, welche verwendet wird, verwendet werden.
  • Zusätzlich zur Bereitstellung der vorstehend erwähnten Zusammensetzungen umfasst die Erfindung auch die Verwendung der Nahrungsergänzungszusammensetzungen in Dosierungen, welche wirksam sind, um den Gesundheitszustand eines Individuums aufrechtzuerhalten und zu verbessern, wobei die Zusammensetzungen oral verabreicht werden. Geeignete Formen für die Nahrungsergänzungszusammensetzung zur oralen Verabreichung schließen Tabletten, Kapseln, Pastillen, Sirupe, Granulate, Lösungen und Suspensionen ein, welche Dosiseinheiten der Ergänzung für die einmalige oder mehrmalige Verabreichung pro Tag enthalten. Die Nahrungsergänzungszusammensetzung der Erfindung wird typischerweise als eine Flüssigkeit, eine Tablette oder eine Kapsel oral verabreicht. Tabletten, Geltabletten, Kapseln, flüssige Zubereitungen und Formulierungen mit einer verzögerten Freisetzung können im Einklang mit den in der Pharmaindustrie gut bekannt Herstellungstechniken hergestellt und in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden.
  • Die Menge der Oligonucleotide der Erfindung, welche in einer Nahrungsergänzung enthalten ist, hängt von der erwünschten Ernährungswirkung ab. Da die hierin beschriebenen modifizierten Oligonucleotide im Allgemeinen sehr gut toleriert werden, können große Mengen davon in der Form von Nahrungsergänzungen verabreicht werden. Beispielhafte Dosierungen schließen etwa 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg pro Tag oder etwa 1,0 mg/kg bis 50 mg/kg pro Tag oder etwa 1,0 mg/kg bis 20 mg/kg pro Tag ein. Wenn Kombinationen von Oligonucleotiden, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, können die Dosierungen von einzelnen Oligonucleotiden in der Nahrungsergänzung verringert werden, falls dies notwendig oder wünschenswert ist. Die Nahrungsergänzungen der Erfindung können modifizierte Oligonucleotide, wie hierin beschrieben, einschließen.
  • Homöopathische Zusammensetzungen
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung homöopathische Zusammensetzungen bereit. Homöopathische Zusammensetzungen können durch Verfah ren hergestellt werden, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Ein beispielhaftes Verfahren für die Herstellung einer homöopathischen Zusammensetzung umfasst: (i) das Zerreiben eines festen Oligonucleotids der Erfindung in einem 1:9-Verhältnis mit Lactose, um einen 1× Feststoff herzustellen, und (ii) das Wiederholen des Vorgangs, bis die gewünschte Verdünnung erhalten wird. In gleicher Weise ist ein Verfahren für die Herstellung einer homöopathischen Zusammensetzung eingeschlossen, welches umfasst: (i) das Lösen von einem Gewichtsteil des Oligonucleotids der Erfindung in einer Flüssigkeit, um 10 Volumenteile einer flüssigen Verdünnung, bezeichnet mit 1×, herzustellen, und wahlweise (ii) das Mischen von 1 ml der 1× Verdünnung mit 9 ml eines Verdünnungsmittels, um eine niedrigere Konzentration zu erhalten.
  • In einigen Ausführungsformen schließt die Erfindung homöopathische Zusammensetzungen ein, welche modifizierte Oligonucleotide enthalten. Jedes Oligonucleotid oder jede Kombination von Oligonucleotiden, welche hierin beschrieben werden, können in den homöopathischen Zusammensetzungen verwendet werden. In einer Ausführungsform werden Tabletten für den homöopathischen Gebrauch vorzugsweise als Placebotabletten hergestellt, welche dann durch das Auftropfen oder das Aufsprühen von ausreichend Flüssigkeit auf die Tabletten in einer solchen Weise, dass ein Koeffizient der Imprägnierung von nahezu 100% sichergestellt wird, mit Arzneistoffen imprägniert werden. Die Placebotabletten werden vorzugsweise durch Komprimierung hergestellt. Dragees oder Granulate sind vorzugsweise kugelförmig und weisen einen Durchmesser von etwa 4 mm und ein Gewicht von 3 bis 5 Zentigramm auf. Sie werden vorzugsweise in der gleichen Weise wie Tabletten hergestellt (aus reiner Lactose) und mit Arzneistoffen imprägniert. Zum Beispiel können feste Oligonucleotide oder Kombinationen von Oligonucleotiden in einem 1:9-Verhältnis mit Lactose (1 g Oligonucleotid + 9 g Lactose) zur Herstellung eines 1× Feststoffes zerrieben werden. Der Vorgang wird wiederholt (1 g dieses Materials plus 9 g Lactose), bis die gewünschte Verdünnung erhalten wird.
  • Für homöopathische Zusammensetzungen kann der Exzipient eine beliebige Zahl von Trägern enthalten, und vorzugsweise homöopathische Träger, z.B. homöopathische Mittel, welche die Wirksamkeit der homöopathischen Zusammensetzung erhöhen oder welche dazu beitragen, die mit einem physiologischen Zustand verbundenen Symptome zu lindern. Zum Beispiel können Oligonucleotide oder Kombinationen von Oligonucleotiden in einem Gewichtsteil einer Flüssigkeit gelöst werden, um 10 Volumenteile einer flüssigen Verdünnung, bezeichnet als 1×, herzustellen. Zur Herstellung von niedrigeren Verdünnungen werden 1 ml der 1× Verdünnung und 9 ml eines Verdünnungsmittels verwendet (welche gründlich miteinander vermischt werden), um eine 2× Verdünnung herzustellen. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die gewünschte Verdünnung erhalten wird. Eine homöopathische Trägerlösung, wie die in US-Patent Nr. 5,603,915 beschriebene, kann verwendet werden, um die Wirksamkeit des homöopathischen Mittels zu erhöhen. Diese Trägerlösung wird nacheinander einer Wechselstrom-Elektrobehandlung und einer Gleichstrom-Elektrobehandlung unterzogen, und im Anschluss daran werden zusätzliche Bestandteile wie Meerwasser, Hirnhormone und biologisch aktive Enzyme zugegeben. Die Elektrobehandlung des Trägers zusammen mit der Zugabe von homöopathisch wirksamen Substanzen kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der homöopathischen Zusammensetzung zu erhöhen. Alternativ kann ein elektromagnetischer Träger, wie in US-Patent Nr. 5,830,140 beschrieben, verwendet werden. Für homöopathische Präparate können die Oligonucleotide oder die Kombinationen von Oligonucleotiden zum Beispiel in einem Gewichtsteil einer Flüssigkeit gelöst werden, um 10 Volumenteile einer flüssigen Verdünnung, bezeichnet als 1×, herzustellen. Zur Herstellung von niedrigeren Verdünnungen werden 1 ml der 1× Verdünnung und 9 ml eines Verdünnungsmittel verwendet (welche gründlich miteinander vermischt werden), um eine 2× Verdünnung herzustellen. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die gewünschte Verdünnung erhalten wird. Typische homöopathische Dosiseinheiten sind in Tabelle 7 angegeben.
  • II. Verwendungen der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ferner Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung bereit. Die Verwendungen schließen die Modulierung der Genexpression in Zellen durch das Inkontaktbringen der Zellen mit den Zusammensetzungen der Erfindung ein. Die Verwendungen schließen auch die Verwendung der Zusammensetzungen zur Behandlung von Muskelschwunderkrankungen oder -zuständen ein. So wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Muskelschwunderkrankung", der hierin gleichbedeutend mit dem Begriff "Muskelschwundzustand" verwendet wird, Erkrankungen oder Zustände, bei denen ein Muskelschwund eines der Hauptsymptome ist, wie Muskeldystrophie, Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Anorexie, Sarkopenie, Kachexie, Muskelatrophie infolge Immobilisierung, längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit und dergleichen, sowie Erkrankungen, bei denen ein abnormal hohes Fett-zu-Muskel-Verhältnis an einer Krankheit oder einer Krankheitsvorstufe beteiligt ist, z.B. Typ II Diabetes oder Syndrom X, ein. Die Verwendungen schließen allopathische, nutritionelle und homöopathische therapeutische Verwendungen ein. Herkömmliche Diagnosemittel können angewendet werden, um die Anwesenheit und die Schwere dieser Zustände festzustellen. Zusätzlich stellt die Erfindung Verwendungen der Zusammensetzungen zur Erhöhung der Muskelmasse bei Tieren, falls eine solche Erhöhung wünschenswert ist, z.B. bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung wie Säugetieren und Fischen, bereit. Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können auch als ein Hilfsmittel zu anderen Therapien, z.B. solche, welche andere therapeutische Mittel, Diätmodifikationen, eine physikalische Therapie und dergleichen anwenden, verwendet werden.
  • Eine Skelettmuskelatrophie tritt bei Muskeln von erwachsenen Tieren als ein Ergebnis des fehlenden Gebrauchs, der Alterung, des Hungerns und als eine Folge einer Vielzahl von Krankheiten, Störungen und Zuständen wie Sepsis, Muskeldystrophie, AIDS, Alterung und Krebs auf. Der Muskelverlust ist im Allgemeinen durch eine Abnahme des Proteingehalts, der Kraftausübung, der Ermüdungsresistenz und des Muskelfaserdurchmessers gekennzeichnet. Diese Abnahme kann sowohl zu einer Verringerung der Proteinsynthese als auch zu einer Erhöhung des Proteinabbaus beitragen. Muskelschwund und verwandte Zustände, gegen welche die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung gerichtet sind, schließen irgendeinen Zustand ein, bei dem ein erhöhtes Muskelwachstum oder eine Verminderung des Muskelschwunds ein therapeutisches oder in anderer Weise wünschenswertes Ergebnis hervorruft. Die Zustände schließen Muskeldystrophie, Sarkopenie, Kachexie, Diabetes mellitus und die Verbesserung der Muskelmasse, falls eine solche Verbesserung ethisch und wünschenswert ist, z.B. bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung, ein.
  • Erkrankungen, die mit einem Muskelschwund in Zusammenhang stehen, sind im Allgemeinen mit einer veränderten oder abnormalen Expression einer Reihe von Genen im Vergleich zu dem Normalzustand assoziiert. So wie hierin verwendet, wird der Begriff "abnormal", falls unter Bezugnahme auf die Menge, die Entwicklung oder die Stoffwechselaktivität von Muskel- oder Fettgewebe verwendet, in einem relativen Sinne im Vergleich zu einer Menge, einer Entwicklung oder einer Stoffwechselaktivität verwendet, die ein erfahrener Krankenhausarzt oder ein anderer zuständiger Fachmann als normal oder ideal ansehen würde. Solche Normal- oder Idealwerte sind dem Krankenhausarzt bekannt und basieren auf Durchschnittswerten, die im Allgemeinen bei einem gesunden Individuum in einer entsprechenden Population beobacht werden oder erwünscht sind. Zum Beispiel wäre dem Krankenhausarzt bekannt, dass bei Patienten, die an Krankheiten leiden, welche mit einer Fettleibigkeit in Beziehung stehen, wie Diabetes, die Fettleibigkeit mit einem Körpergewicht assoziiert ist, das etwa 20% über einem "idealen" Gewichtsbereich für eine Person mit einer bestimmten Größe und einem bestimmten Körpertyp liegt. Dem Krankenhausarzt wäre auch bekannt, dass ein Bodybuilder nicht notwendigerweise nur auf Grund eines Körpergewichts, das 20% oder mehr über dem Gewicht liegt, welches für eine Person mit derselben Größe und demselben Körpertyp in einer sonst entsprechenden Population erwartet wird, fettleibig ist. In gleicher Weise wäre dem Fachmann bekannt, dass bei einen Patienten, der eine abnormal vermindert erscheinende Muskelaktivität zeigt, eine abnormale Muskelentwicklung dadurch nachgewiesen werden kann, dass der Patient zum Beispiel verschiedenen Kräftetests unterzogen wird und die Ergebnisse mit denjenigen, welche für ein durchschnittliches gesundes Individuum in einer entsprechenden Population erwartet werden, verglichen werden.
  • Die Zusammensetzungen und die Verwendungen der Erfindung sind gegen einzelne Gene sowie vorzugsweise Kombinationen von Genen, welche an diesen Zuständen beteiligt sind, gerichtet. Durch die Verwendung von Kombinationszusammensetzungen und -therapien können reversible Reaktionen vermieden und mehrere Signalwege gleichzeitig zielgerecht angegangen werden, wodurch ein größerer therapeutischer Effekt erzielt wird, als wenn einzelne Gene zielgerecht angegangen werden. Eine vorhandene Toxizität, wenn überhaupt, kann durch die Verwendung von Kombinationstherapien aufgrund der möglicherweise geringeren Mengen jedes einzelnen Genmodulators, welcher verwendet wird, verringert werden. Zusätzlich sind Kombinationen von Hemmstoffen und Kombinationen von Zielregionen in einzelnen Genen durch die Verwendungen der Erfindung eingeschlossen. Im Allgemeinen sind die Genmodulatoren, welche in den Zusammensetzungen und den Verwendungen der Erfindung verwendet werden, gegen Gene gerichtet, deren Expression wünschenswerterweise gehemmt werden soll. Jedoch können in einigen Fällen einige der Genmodulatoren, welche in den Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, eine Erhöhung der Expression zur Folge haben.
  • Die Erfindung umfasst auch modifizierte Oligonucleotide zur Verwendung bei der Genmodulation, wobei die modifizierten Oligonucleotide typischerweise stabiler und resistenter gegenüber einem Abbau als natürliche Oligonucleotide sind. Die modifizierten Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung sind weniger toxisch als viele der gegenwärtig verwendeten Modifikationen (z.B. S-Oligonucleotide), wodurch höhere Dosierungen verwendet werden können, ohne dass ungünstige Nebenwirkungen hervorgerufen werden.
  • A. Muskelschwundzustände
  • Die Zusammensetzungen und die Verwendungen der Erfindung werden für Zustände verwendet, bei denen ein Muskelschwund auftritt und/oder einer erhöhte Muskelmasse und/oder eine verringerte Fettmasse wünschenswert ist. Beispielhafte Zustände von Säugern, welche durch die Zusammensetzungen und die Verwendungen der Erfindung behandelt werden können, umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt:
  • Muskeldystrophie
  • Die Muskeldystrophien stellen eine heterogene Gruppe von neuromuskulären Störungen dar. Die Erkrankungen schließen den häufigsten Typ, die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), mehrere Formen der Gliedergürtel-MD (LGMD) und andere kongenitale MDs (CMD) ein. Fortschreitende Muskelschädigungen und ein zunehmender Muskelverlust, Gewebsentzündungen und der Ersatz des gesunden Muskels durch Faser- und Fettgewebe sind bei einer Muskeldystrophie für einen Muskelschwund verantwortlich. Der extreme Muskelverlust ist eines der deutlichsten Anzeichen der Erkrankung und hat Komplikationen und Symptome einschließlich den Tod zur Folge.
  • Sarkopenie
  • Sarkopenie steht für den Verlust von Muskelmasse, Kraft und Funktion im Alter. Dieser beginnt ab dem 40. Lebensjahr und beschleunigt sich in einem Alter von über etwa 75 Jahren. Viele Faktoren, einschließlich körperliche Inaktivität, Remodel lierung der motorischen Einheiten, verminderte Hormonspiegel und eine verringerte Proteinsynthese, können alle zu einer Sarkopenie beitragen. Mit Ausnahme der körperliche Inaktivität können alle diese Faktoren einer genetischen Kontrolle unterworfen sein, wobei eine Genmodulation nützlich sein kann. Zum Beispiel wird die Sarkopenie durch die Rate der Muskelproteinsynthese und des Proteinabbaus beeinflusst. Das Gleichgewicht von Proteinsynthese und -abbau bestimmt den Proteingehalt im Körper. Forscher haben übereinstimmend berichtet, dass die Muskelproteinsyntheseraten in älteren Erwachsenen im Vergleich zu jüngeren Erwachsenen geringer sind. Eine Verringerung des Muskelproteinkatabolismus, welche z.B. durch eine Genmodulation hervorgerufen wird, könnte eine Verlangsamung oder eine Umkehrung des Verlustes an Muskelmasse zur Folge haben.
  • Kachexie
  • Kachexie ist ein Zustand, welcher mit einer Vielzahl von schwerwiegenden Erkrankungen einschließlich Krebs, AIDS, Sepsis und kongestivem Herzversagen assoziiert ist. Die wichtigste Auswirkung davon ist ein massiver Verlust von sowohl Fettgewebe als auch Skelettmuskulatur, der nicht durch eine Mangelernährung verursacht wird. Die Kachexie trägt zu nahezu einem Drittel aller Todesfälle infolge von Krebs bei. In einem noch nicht hinreichend verstandenen Prozess vermitteln Cytokine und Tumorfaktoren einen Muskelschwund durch die Suppression von Muskelgenprodukten. Es ist gezeigt worden, dass Kachexiefaktoren spezifisch gegen die schwere Kette von Myosin gerichtet sind. In Myotuben und Maus-Muskeln wurde die Myosin-Expression durch TNF-alpha und IFN-gamma durch einen RNA-abhängigen Mechanismus stark verringert. Eine Kachexie beinhaltet eine vielschichtige Störung mehrerer Systeme, welche auch eine Anämie, Insulinresistenz, Immunsuppression und die Aktivierung einer Akutphasen-Antwort zur Folge hat. Vgl. z.B. Acharyya et al., J. Clin. Invest. 114 (2004), 370–378. Die daraus resultierende fortschreitende Schwäche kann Patienten mit einer Krebserkrankung für die toxischen Wirkungen einer Bestrahlung und Chemotherapie empfindlicher machen. Viele dieser Patienten sterben an Syndromen, die mit einer Kachexie in Beziehung stehen, anstatt an ihren Tumoren. Folglich werden die Therapien der vorliegenden Erfindung, welche das Ziel haben, den Muskelschwund bei einer Kachexie umzukehren, als ein vielversprechender Ansatz für diesen Zustand angesehen.
  • Diabetes
  • Diabetes mellitus stellt die häufigste Erkrankung dieser schwerwiegenden Stoffwechselkrankheiten dar. Fettleibigkeit und ein hoher Körpermasseindex (BMI) sind Risikofaktoren für Diabetes. Typ I Diabetes, auch bekannt als im Jugendalter auftretender Diabetes, resultiert aus der Zerstörung der beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse und macht im Allgemeinen eine exogene Verabreichung von Insulin für eine Behandlung erforderlich. Typ II Diabetes, auch bekannt als im Erwachsenenalter auftretender Diabetes, ist für mehr als 80% der Fälle von Diabetes verantwortlich, wobei die Häufigkeitsrate davon schnell zunimmt. Bei Typ II Diabetes erfolgt der Ausbruch im Allgemeinen allmählich und steht mit einer Reihe von Faktoren einschließlich Fettleibigkeit in Beziehung. Typ II Diabetes kann durch Veränderungen des Lebensstils, die einen Gewichtsverlust und eine Erhöhung der Skelettmuskelmasse einschließen können, häufig gebessert und in einigen Fällen kontrolliert werden. Studien mit transgenen Mäusen haben gezeigt, dass Veränderungen der Muskelmasse und der Körperzusammensetzung, welche durch eine Modulation der Genaktivität hervorgerufen werden, die mit Diabetes assoziierten Parameter verändern kann. Zum Beispiel zeigt die drastische Verringerung der Gesamtfettanreicherung in Myostatin-mutierten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen, dass die Myostatin-Aktivität manipuliert werden kann, um Fettleibigkeit oder Typ II Diabetes zu behandeln oder zu verhindern. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 6,656,475, hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen.
  • Für die Fachleute ist ersichtlich, dass die vorstehenden Zustände lediglich beispielhaft für Zustände sind, bei denen eine Modulation der Gene, welche an einem Muskelschwund beteiligt sind, durch die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung wirksam sein kann. Andere Erkrankungen, welche durch eine Modulation der Genexpression, welche an einem Muskelschwund beteiligt ist, behandelt werden können, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, traumatische Verletzungen, kongestive obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Anorexie, AIDS, Atrophie infolge Immobilisierung, Bettruhe oder Schwerelosigkeit oder irgendeine andere Erkrankung, welche mit einer Veränderung der normalen Skelettmuskelmasse oder -kraft verbunden ist, ein. Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können Gene, deren Expression bei diesen Erkrankungen verändert ist oder deren Modulation einen therapeutischen Effekt hervorrufen würde, selbst wenn die Expression davon nicht direkt verändert wird, z.B. Myostatin, Myostatin-Regulatorelemente und dergleichen, moduliert werden, um die muskelspezifische Expression eines Zielgens zur Förderung des Muskelwachstums und zur Erhöhung der Muskelmasse für die Behandlung einer muskelbedingten Erkrankung zu erreichen. Andere Gene, die abnormal exprimiert werden oder deren modulierte Expression einen therapeutischen Effekt für den Zustand begünstigt, können durch die Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung einzeln oder gleichzeitig moduliert werden.
  • B. Zielgene für eine Therapie
  • Die Zielgene für eine Therapie schließen, aber sind nicht begrenzt auf, diejenigen Gene ein, welche in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst sind und nachstehend ausführlicher beschrieben werden.
  • Myostatin
  • Myostatin ist ein wichtiges an der Regulierung des Muskelwachstums beteiligtes Gen, welches direkt oder indirekt an praktisch jedem Muskelschwundzustand beteiligt ist. Als ein sezernierter Wachstumsfaktor ist Myostatin als ein negativer Regulator der Skelettmuskelmasse in Säugetieren und anderen Tieren wirksam. Myostatin wird praktisch ausschließlich in der Skelettmuskel-Abstammungslinie exprimiert, worin es die Differenzierung und das Wachstum von Myocyten negativ reguliert und die Muskelgröße bestimmt. Es ist ein Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β-Familie und wird sowohl in sich entwickelnden als auch in ausgewachsenen Muskeln exprimiert. Während der Entwicklung wird Myostatin zunächst in der Myotomschicht von Somiten, welche den Skelettmuskel bilden, exprimiert. In Erwachsenen wird Myostatin in allen Skelettmuskeln exprimiert. Mäuse, denen das Myostatin-Gen fehlt, weisen eine um 25–30% verminderte Muskelmasse auf. Vgl. z.B. McPherron et al., Nature 387 (1997) (6628), 83–90. Einzelne Muskeln, wie der Pektoralismuskel und der Quadrizepsmuskel, von Myostatin-mutierten Mäusen sind um das 2-3-fache schwerer als solche von Wildtyp-Mäusen. Vgl. z.B. Whittemore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 (4) (2003), 965–971; und Grobet et al., Genesis 35 (4) (2003), 227–238.
  • Diese Modulation erfolgt sowohl in der frühen Entwicklung als auch in Erwachsenen. Die Blockierung der Myostatin-Funktion in erwachsenen Mäusen unter Verwendung eines Myostatin-Antikörpers oder der konditionalen Knockout-Technik resultiert im Zuwachs der Muskelmasse. Ähnlich wie endokrine Hormone zirkuliert Myostatin in hohen Mengen im Serum, wobei für Krankheitszustände in Verbindung mit einem Muskelschwund ein erhöhter Myostatin-Spiegel beschrieben worden ist. Folglich wird Myostatin als ein spezifischer Zielort für Arzneistoffe angesehen, und Therapien, welche das Skelettmuskelwachstum modulieren, wären für Krankheitszustände wie Muskeldystrophie, Sarkopenie, Kachexie, Diabetes und ähnliche Muskelschwunderkrankungen nützlich.
  • Vor kurzem wurde die Antikörper-vermittelte Myostatin-Blockierung in mdx-Mäusen dazu verwendet, eine Dystrophie zu bessern. Die Blockierung von Myostatin in mdx-Mäusen erhöhte nicht nur die Anzahl der normalen Muskelzellen, sondern vergrößerte auch die Muskelkraft. Der Mechanismus, durch den die Myostatin-Blockierung eine Wiederherstellung der Muskelfunktion zur Folge hatte, ist unklar, wobei aber, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, angenommen wird, dass der Ausgleich des Muskelverlusts durch den Muskelschwund durch eine erhöhte Muskelmasse infolge der Myostatin-Blockierung für dystrophische Muskeln vorteilhaft sein könnte. Da die Myostatin-Blockierung selbst bei Erwachsenen in der Erhöhung der Muskelmasse wirksam ist, sind Myostatin-Blocker als eine Therapie für Dystrophie und andere Muskelschwunderkrankungen ebenfalls vielversprechend.
  • Bei einer Sarkopenie erhöht sich der Myostatin-Spiegel im Serum bei der menschlichen Alterung in Verbindung mit einem Muskelschwund und ist als ein Biomarker für eine altersbedingte Sarkopenie in Betracht gezogen worden. Es wird angenommen, dass das menschliche Myostatin-Genprodukt ein Suppressor des Skelettmuskelwachstums mit fortschreitendem Alter ist. Daher wäre eine Myostatin-Blockierung zur Verhinderung einer Sarkopenie vorteilhaft.
  • Außerdem, selbst wenn Myostatin nicht direkt an einer Erkrankung beteiligt ist, ist die Modulation davon insofern nützlich, als sie als ein alternativer Weg für die Stimulierung des Muskelwachstums durch das Umgehen eines Weges, der bei einer bestimmten Erkrankung blockiert oder modifiziert sein kann, dienen kann.
  • Myostatin-Rezeptoren
  • Die Signalübertragung durch Myostatin ist mit derjenigen von Activinen und TGF-β vergleichbar. Es bindet wirksam an den Typ II-Rezeptor ActRIIB und bildet einen heteromeren Komplex mit dem Typ I-Rezeptor ALK4 oder ALK5, wodurch die Vertreter der Smad-Familie für eine Kontrollgen-Transkription phosphoryliert und die Wirkungen von Myostatin übertragen werden: Smads sind eine Familie von signalübertragenden Molekülen, welche die Signale von Zelloberflächenrezeptoren direkt auf den Kern übertragen. Im Kern regulieren sie die Transkription durch die Wechselwirkung mit sowohl DNA-Elementen als auch transkriptionellen Coaktivatoren und Corepressoren. Smads binden an zahlreiche Transkriptionsregulatoren wie p53, CBP und die fos/jun-Familie und sind an der Zelltyp-spezifischen Genexpression beteiligt.
  • Foxo1
  • Foxo1 ist einer der Foxo-Transkriptionsfaktoren vom Typ Forkhead. Er weist bei Zuständen verminderter Energiezufuhr wie Fasten, Krebs und schwerem Diabetes eine deutliche Hinaufregulation im Skelettmuskel auf. Überexpression von Foxo-1 im Skelettmuskel zeigte eine reduzierte Skelettmuskelmasse. Siehe Kamei et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 41114–41123. In den Foxo-1-Überexpressionsstudien wurde vorgeschlagen, dass die Abnahme der Muskelmasse durch die Veränderung der Abbaurate von Skelettmuskelproteinen wie Atrogin-1 und MuRF1 verursacht sein könnte. Siehe Sandri et al. (2004) Cell 117, 399–412. Foxo-1 kann eine große Bandbreite von Genen, die am Muskelaufbau und -wachstum beteiligt sind, aktivieren. Die Knock-down-Suppression von Foxo-1 durch Antisense-RNA-Oligonucleotid wird begleitet von einer Abnahme der Myostatinspiegel (GDF-8) und erhöhten MyoD-Spiegeln. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Foxo-1 die myotubuläre Fusion primärer Mausmyoblasten stimuliert und verschiedene Zellfunktionen, einschließlich Zellzyklus und Apoptose, reguliert. Siehe Bois und Grosveld (2003) EMBO J. 22, 1147–1157; Dijkers et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 9138–9148; Medema et al. (2000) Nature 404, 782–787; Brunet et al. (1999) Cell 96, 857–868; und Kops et al. (2002) Nature 419, 316–321.
  • Transkriptionsfaktoren
  • Der myogene Transkriptionsfaktor MyoD ist ein mutmaßlicher Regulator der Wirkungen von Myostatin. Eine Familie von Transkriptionsfaktoren, welche insbesondere in den Muskeln exprimiert werden, einschließlich myoD, Myogenin, myf-5 und MRF-4/Herculin/myf-6, ist cloniert worden. Diese Faktoren sind phosphorylierte Kernproteine, enthaltend ein Helix-Schleife-Helix (bHLH)-Motiv, welches für sowohl die Dimerisierung als auch die DNA-Bindung erforderlich ist, und es wird angenommen, dass sie Determinanten des zellspezifischen Differenzierungsprogramms sind. Wenn einer dieser Faktoren in nicht-myogene Zellen eingeschleust wird, wird die Differenzierung zu reifen Muskelzellen initiiert. Es ist festgestellt worden, dass die myoD-Familie, die eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren ist, die Muskelbildung steuert, die Proliferation hemmt, die Differenzierung aktiviert und einen kontraktilen Phänotyp hervorruft. Während myoD und myf-5 innerhalb der proliferierenden Myoblasten exprimiert werden, werden Myogenin und MRF-4 nicht exprimiert, bis die Myoblasten als Antwort auf einen Mitogenentzug aus dem Zellzyklus ausscheiden. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde gezeigt, dass Myogenin und MRF-4 die Expression von muskelspezifischen Genen aktivieren und aufrechterhalten, während angenommen wird, dass myoD und myf-5 eine Rolle bei der Proliferation von Myoblasten spielen.
  • Dystrophin-Gen
  • Die Zusammensetzungen und die Verwendungen der Erfindung können einen Genmodulator, z.B. ein Antisene-Oligonucleotid, einschließen, welcher eine Veränderung der Mutation, die bei der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) beobachtet wird, zu einer Mutation im Leseraster hervorruft. Die DMD, die schwerste Form dieser Erkrankung, resultiert aus einer Abnormalität in Exon 19 des Dystrophin-Gens, welche eine Verschiebung des Leserasters aus dem Leseraster der Aminosäuren der Dystrophin-mRNA heraus verursacht. Im Gegensatz dazu bleibt bei der Becker-Muskeldystrophie (BMD), einer viel milder verlaufenden Form dieser Erkrankung, das Leseraster trotz einer partiellen Deletion in dem Gen intakt (d.h. im Leseraster), und daher wird ein Dystrophin-Protein synthetisiert, welches sich jedoch hinsichtlich der Größe von dem Wildtyp-Dystrophin unterscheidet. Wenn die abnormale Leserasterverschiebung von DMD zu einer Anordnung im Leseraster umgewandelt wird, dann wird die DMD in eine BMD umgewandelt, wobei eine Besserung der Symptome zu erwarten wäre. Das Überspringen von Exon 19 kann künstlich induziert werden, indem ein Antisene-Oligonucleotid gegen Exon 19 an den Patienten verabreicht wird, wodurch das Leseraster infolge des Gesamtverlustes von 330 Nucleotiden aus der prä-RNA aufgrund des Verlustes von 242 Nucleotiden von Exon 20 und 88 Nucleotiden von Exon 19 wieder in das richtige Leseraster gebracht werden könnte.
  • Es ist gezeigt worden, dass das Ausspleißen von Exon 19 durch ein Antisene-Oligonucleotid gegen Exon 19 in den Zellen eines DMD-Patienten mit einem vollständigen Verlust von Exon 20 in der reifen Dystrophin-mRNA induziert werden kann und dass auf diese Weise die vorhandene Verschiebung des Leserasters entlang der reifen Dystrophin-mRNA korrigiert werden kann, wodurch die Dystrophinnegativen Zellen in positive Zellen umgewandelt werden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse sind Antisene-Oligonucleotide, die gegen Teile des Dystrophin-Gens gerichtet sind, als eine Behandlung für DMD vorgeschlagen worden. Vgl. z.B. die Japanische Patentoffenlegungsschrift mit der Anmeldenummer 11-140930 und US-Patent Nr. 6,727,355 und 6,653,467, welche alle hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind. Demgemäß können die Zusammensetzungen und die Verfahren der Erfindung einen Genmodulator, z.B. ein Antisene-Oligonucleotid, einschließen, der eine Veränderung der Mutation, welche bei DMD beobachtet wird, zu einer Mutation im Leseraster hervorruft.
  • An einer Kachexie beteiligte Gene
  • An einer Kachexie können verschiedene Signalwege und Modulatoren beteiligt sein. Es wird angenommen, dass die Fieber hervorrufenden Cytokine, welche durch Entzündungszellen und Tumorzellen freigesetzt werden, zu einer Kachexie beitragen. In der Tat wird durch die Verabreichung des Tumornekrosefaktors (TNF) oder Cachectin an Labortiere ein Labormodell für Kachexie erhalten. Activine und Myostatin sind bei mehreren Krebsarten und Infektionen hochreguliert und könnten therapeutische Ziele für eine Kachexie sein. Es ist gezeigt worden, dass Myostatin an verschiedenen Formen der Kachexie beteiligt ist. Die Verabreichung von Myostatin in vivo ruft einen schweren Gewichtsverlust und eine Verminderung der Muskelmasse hervor. Außerdem kann eine beschleunigte Proteolyse in Muskeln beim Fasten oder bei einer Denervierungsatrophie auf die Aktivierung des nicht-lysosomalen (cytosolischen) ATP-Ubiquitin-abhängigen proteolytischen Prozesses zurückgeführt werden. Die an diesem Prozess beteiligten Proteine sind mögliche Ziele für Genmodulatoren. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,972,636, welches hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist. Beim Fasten sind für den vermehrten Muskelproteinabbau auch Glucokortikoide und ein niedriger Insulinspiegel erforderlich, und bei fiebrigen Infektionen sind Interleukin-1 und TNF erforderlich. Ein neues Protein, der Krebs-Kachexiefaktor, kann ebenfalls an der Kachexie bei z.B. Krebs beteiligt sein und stellt ein anderes Ziel für Genmodulatoren als eine Therapie dar. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,834,192, welches hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist.
  • Diabetes
  • Da eine richtige Skelettmuskelfunktion für eine normale Glucosehomöostase wichtig ist, wird durch einen Verlust der Aktivität von Myostatin nicht nur die Muskelmasse erhöht, sondern auch eine altersbedingte Zunahme der Gesamtmasse der Fettgewebe verhindert. Myostatin-defiziente Mäuse zeigten eine Verringerung der Fettanreicherung mit zunehmenden Alter. Es wurde auch gezeigt, dass das Activin-Follistatin-System an der Entwicklung des Pankreas beteiligt ist. Es wurde vorgeschlagen, dass die durch Follistatin induzierte Modulation der Bildung des exokrinen Pankreas durch die Hemmung von Activin-ähnlichen signalübertragenden Molekülen erfolgte. Vor kurzem wurden mit Hilfe von funktionellen genomischen Hilfsmitteln mehrere sezernierte Polypeptide mit therapeutischen Anwendungen bei der Behandlung von Diabetes sowie BMP-9 als mögliche Hemmstoffe der Glucoseproduktion und der Glykämie identifiziert. So sind zusätzlich zu Adipocytokinen wie Leptin und Adiponectin mehrere TGF-β-Familienmitglieder einschließlich Myostatin, Activin und BMP-9 an der Glucosehomöostase und an Diabetes beteiligt. Fettleibige und insulinresistente Mäuse mit einem Myostatin-KO zeigen eine geringere Fettanreicherung, einen niedrigeren Blutglucosespiegel und einen niedrigeren Insulinspiegel als ihre Gegenstücke mit einem Wildtyp-Myostatin, was zu der Annahme führte, dass die Hemmung von Myostatin eine Behandlungsmöglichkeit für Typ 2 Diabetes mellitus sein kann.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung zur Modulation der Expression eines oder mehrerer Gene in Zellen durch das Inkontaktbringen der Zellen mit den Zusammensetzungen der Erfindung bereit. Bei diesen Verwendungen enthalten die zu behandelnden Zellen ein Polynucleotid, welches ein Genprodukt codiert, das an einem Muskelschwundzustand oder am Muskelwachstum oder an der Hemmung des Muskelwachstums beteiligt ist. Repräsentative Polynucleotide sind in den Tabellen 3, 4 und 5 angegeben. Die Zelle wird mit irgendeiner der hierin beschriebenen Zusammensetzungen von Oligonucleotiden in Kontakt gebracht, um die Expression eines oder mehrerer Polynucleotide zu modulieren. In einigen Ausführungsformen enthält die Zelle ein Polynucleotid, das Myostatin, einen Myostatin-Transkriptionsfaktor, ein Myostatin aktivierendes Protein und/oder einen Myostatin-Rezeptor codiert, und enthält die Zusammensetzung, welche mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, ein oder mehrere Oligonucleotide, welche in der Lage sind, die Expression von Myostatin, eines Myostatin-Transkriptionsfaktors, eines Myostatin aktivierenden Proteins und/oder eines Myostatin-Rezeptors zu modulieren.
  • Eine Verwendung der Erfindung kann zum Beispiel durch das Inkontaktbringen einer Zielzelle und einer Oligonucleotidzusammensetzung der Erfindung unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden. Geeignete Bedingungen können dadurch bereitgestellt werden, dass die Zelle, welche eine isolierte Zelle oder eine Komponente eines Gewebes oder eines Organs sein kann, in ein geeignetes Kulturmedium eingebracht wird, oder die Zelle in situ in einem Organismus damit in Kontakt gebracht wird. Zum Beispiel kann ein Medium, das die Zelle enthält, mit einer Oligonucleotidzusammensetzung, welche z.B. die Expression von Myostatin, Myostatin-Signaltransduktionsfaktoren, Myostatin-Rezeptoren, Myostatin-Transkriptionsfaktoren, Myostatin aktivierenden Genprodukten und dergleichen moduliert, in Kontakt gebracht werden. Im Allgemeinen ist die Zelle eine Komponente eines Gewebes oder eines Organs in einem Individuum, wobei in diesem Falle das Inkontaktbringen der Zelle die Verabreichung des Mittels an das Individuum umfassen kann. Jedoch kann die Zelle auch in der Kultur manipuliert werden, dann in der Kultur aufrechterhalten werden, an ein Individuum verabreicht werden oder zur Erzeugung eines transgenen Tieres, welches kein Mensch ist, verwendet werden. Die mRNA-Expressionsrate des Zielgens in der Zelle, dem Gewebe, dem Organ oder dem Tier kann mit Hilfe von Techniken, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, einer Northern- oder Western-Blot-Analyse von Gewebeproben, die aus der Zelle, dem Gewebe, dem Organ oder dem Tier erhalten werden, einer in-situ-Hybridisierungsanalyse und einer RT-PCR, abgeschätzt werden. Die Proben der Zelle, des Gewebes, des Organs oder des Tieres können auch unter Verwendung von Antikörpern, die für das Zielgenprodukt spezifisch sind, immuncytochemisch beurteilt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verwendungen davon sowie Kits für die Behandlung von Tieren bereit. Der Begriff "Tier" oder "tierisches Individuum", wie hierin verwendet, schließt Menschen sowie andere Säugetiere und Nichtsäuger ein. Der Begriff "Behandeln" und die grammatischen Entsprechungen davon, wie hierin verwendet, schließen das Erzielen eines therapeutischen Vorteils und/oder eines prophylaktischen Vorteils ein. Mit einem therapeutischen Vorteil ist die Beseitigung, Besserung oder Verhinderung der zugrundeliegenden Erkrankung, welche behandelt wird, gemeint. Zum Beispiel beinhaltet ein therapeutischer Vorteil bei einem Diabetespatienten die Beseitigung oder die Besserung des zugrundeliegenden Diabetes, d.h. einen Rückgang der Blutzucker- und Blutinsulinspiegel auf Normalwerte oder eine Tendenz zu Normalwerten. Ein therapeutischer Vorteil wird auch durch die Beseitigung, Besserung oder Verhinderung eines oder mehrerer der physiologischen Symptome, welche mit der zugrundeliegenden Erkrankung assoziiert sind, sodass eine Verbesserung in dem Patienten beobachtet wird, ungeachtet der Tatsache, dass der Patient noch immer an der zugrundeliegenden Erkrankung leiden kann, erzielt. Zum Beispiel sieht die Verabreichung der hierin beschriebenen Oligonucleotidzusammensetzungen an einen Patienten, welcher an einer Muskeldystrophie, Sarkopenie, Rückenmarksverletzung, neurodegenerativen Erkrankung, Anorexie oder Kachexie leidet, einen therapeutischen Vorteil vor, wenn eine Verbesserung in dem Patienten im Hinblick auf die Muskelmasse, Muskelkraft und dergleichen beobachtet wird. Für einen prophylaktischen Vorteil können die Zusammensetzungen der Erfindung zum Beispiel für einen Patienten, für den ein Risiko für einen Muskelschwundzustand besteht, zum Beispiel einen Patienten, der einer längeren Bettruhe ausgesetzt ist, oder für einen Patienten, der über eines oder mehrere der physiologischen Symptome einer Muskelschwunderkrankung berichtet oder an einem Zustand leidet, der den Patienten für eine Muskelschwunderkrankung prädisponiert, auch wenn keine Diagnose einer Muskelschwunderkrankung gestellt werden kann, verwendet werden. Zum Beispiel können die Oligonucleotidzusammensetzungen der Erfindung für einen Patienten mit einer Krebserkrankung, für die keine Kachexie diagnostiziert worden ist, verwendet werden. In einem anderen Beispiel können die Zusammensetzungen der Erfindung für einen Patienten, der an dem Syndrom X leidet, welcher aber noch keine klinischen Symptome eines Diabetes zeigt, wie einen anhaltend erhöhten Blutglucosespiegel, der oberhalb des klinisch akzeptierten Grenzwertes für Diabetes liegt, verwendet werden. Folglich umfasst die Verwendung der Zusammensetzungen für die Behandlungen der vorliegenden Erfindung irgendeine Behandlung der Symptome einer Erkrankung in einem Tier, vorzugsweise einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, und schließt ein:
    • (a) das Verhindern des Auftretens von Symptomen einer Erkrankung in einem Individuum, das für einen Zustand prädisponiert sein kann, bei dem aber dieser Zustand noch nicht diagnostiziert worden ist;
    • (b) das Hemmen der Symptome einer Erkrankung (d.h. das Aufhalten der Entwicklung davon); oder
    • (c) das Lindern von Symptomen einer Erkrankung (d.h. das Bessern und/oder das Hervorrufen einer Regression der Symptome); und/oder
    • (d) das Aufrechterhalten der Homöostase (d.h. des normalen Gleichgewichts von RNA oder DNA in einem Individuum).
  • Für den Fachmann ist ersichtlich, dass aus der Perspektive eines praktischen Arztes oder eines Patienten praktisch jede Linderung oder Verhinderung eines unerwünschten Symptoms wünschenswert sein könnte.
  • Die Dosierungen der Oligonucleotidzusammensetzung bei Tieren hängen von der Erkrankung oder dem Zustand, welche behandelt werden, dem Verabreichungsweg und den physischen Eigenschaften des zu behandelnden Tieres ab, und auch davon, ob die Behandlung nutritionell, allopathisch oder homöopathisch ist.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden derart formuliert, dass sie eine "nutritionell wirksame" oder "allopathisch wirksame" oder "homöopathisch wirksame" Menge eines oder mehrerer Nucleinsäuremoleküle enthalten. So wie hierin verwendet, soll der Begriff "nutritionell wirksame" Menge eine Menge einer Oligonucleotidzusammensetzung bezeichnen, die nicht toxisch ist und die größer ist als die minimale Menge, welche erforderlich ist, um eine erwünschte physiologische Wirkung aufrechtzuerhalten. So wie hierin verwendet, soll der Begriff "allopathisch wirksame" Menge eine Menge einer Oligonucleotidzusammensetzung bezeichnen, die nicht toxisch ist und die größer ist als die minimale Menge, welche erforderlich ist, um eine erwünschte physiologische Wirkung hervorzurufen. So wie hierin verwendet, soll der Begriff "homöopathisch wirksame" Menge auf eine Menge einer Oligonucleotidzusammensetzung bezeichnen, die nicht toxisch ist und welche die geringste erforderliche Menge ist, um eine erwünschte physiologische Wirkung vorzusehen. Eine homöopathische Wirkung im Einklang mit der vorliegenden Erfindung wird durch eine Dosis einer modifizierten Nucleinsäure, welche bei der Behandlung (d.h. Linderung, Besserung oder Verhinderung) der Symptome eines bestimmten Zustandes oder einer besonderen Erkrankung wirksam ist, erzielt. Eine solche Behandlung kann prophylaktischer Natur sein (d.h. das zukünftige Auftreten eines Symptoms vollständig oder teilweise verhindern) und/oder kann therapeutischer Natur sein (d.h. eine(n) teilweise(n) oder vollständige(n) Stillstand oder Besserung eines Symptoms vorsehen).
  • Demgemäß können in Ausführungsformen, bei denen die Behandlung allopathisch wirksame Mengen der Zusammensetzungen verwendet, die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einer Dosiseinheit von mehr als etwa 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1 oder 5 mg/kg und/oder weniger als etwa 10, 5, 1, 0,5, 0,1 oder 0,05 mg/kg verabreicht werden. Beispielhafte Dosiseinheitsbereiche für eine Zusammensetzung, welche ein einziges Oligonucleotid enthält, können zwischen etwa 0,01 mg/kg und 10 mg/kg oder zwischen etwa 0,010 mg/kg und 1,0 mg/kg oder zwischen etwa 0,10 mg/kg und 1,0 mg/kg liegen. In einigen Ausführungsformen sind die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Dosiseinheiten von etwa 0,01 bis etwa 100 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 0,1 bis etwa 100 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 0,1 bis etwa 10 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 1 bis etwa 10 μg pro kg Körpergewicht oder etwa 1 bis etwa 5 μg pro kg Körpergewicht zu verabreichen ist. Wenn mehr als ein Oligonucleotid in der Zusammensetzung vorhanden ist, können die Dosierungen jedes Oligonucleotids innerhalb der zuletzt genannten Bereiche liegen, oder kann die Dosierung eines oder mehrerer der Oligonucleotide basierend auf der erwarteten Gesamtwirkung der Kombination verringert werden. In einigen Ausführungsformen liegen die Dosiseinheiten pro einzelnem Oligonucleotid bei oder unterhalb 100 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 10 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 1 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 0,1 μg pro kg Körpergewicht oder bei oder unterhalb 0,01 μg pro kg Körpergewicht.
  • Falls oral verabreicht, kann eine Dosiseinheit einmal alle 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Tage oder einmal pro Tag oder 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- oder 10-mal oder mehr als 10-mal pro Tag verabreicht werden, bis eine Linderung erzielt wird oder bis die Symptome verschwinden oder ausreichend abgeschwächt sind. In einigen Ausführungsformen wird eine Dosiseinheit etwa einmal bis etwa viermal pro Tag verabreicht. In einigen Ausführungsformen erhält ein Patient die Instruktion, zwei bis drei Dosiseinheiten pro Tag oral einzunehmen. Für eine solche orale Verabreichung kann die Dosiseinheit unter der Zunge des Patienten plaziert oder einfach geschluckt werden.
  • Modifizierte Oligonucleotide, wie hierin beschrieben, z.B. achirale Oligonucleotide von natürlich vorkommenden Phosphodiester-DNA- oder -RNA-Bindungen mit einem 3'-Nucleaseschutz und zuweilen auch einem 5'-Nucleaseschutz, sind nicht toxisch, wodurch ein großer Bereich von Dosierungen in Verbindung mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung möglich ist. Zum Beispiel beträgt die empfohlene Nahrungsergänzung für Nucleinsäuren 0,5 bis 2,0 g/Tag. Metabolite sind natürlich vorkommenden Verbindungen, die in Nahrungsmitteln und als Nebenprodukte des Zellkatabolismus vorkommen. Außerdem rufen solche Verbindungen keine Immunantwort hervor. Demgemäß liegen die Dosierungen in einigen Ausführungsformen im Bereich von etwa 10 μg bis 100 mg/kg/Tag oder 0,01 g bis 10 g/kg/Tag oder 0,01 g bis 1 g/kg/Tag oder 0,01 g bis 0,1 g/kg/Tag.
  • In homöopathischen Zusammensetzungen wird typischerweise eine geringere Menge der Nucleinsäure als in allopathischen oder nutritionellen Zusammensetzungen verwendet. Beispielhafte Dosierungen zur Verwendung im Einklang mit der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 7 angegeben. Außerdem können die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für den homöopathischen Gebrauch mit einem beliebigen homöopathischen Arzneistoff kombiniert werden und dennoch eine therapeutische Wirkung hervorrufen.
  • Die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können abhängig von dem zu behandelnden Zustand zusammen mit anderen aktiven Arzneimitteln verabreicht werden. Arzneimittel, welche bei der Behandlung von Muskelschwunderkrankungen nützlich sind, ihre optimalen Dosierungen und die Verab reichungswege davon sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die gemeinsame Verabreichung kann die gleichzeitige Verabreichung der zwei Mittel in der gleichen Dosierungsform, die gleichzeitige Verabreichung in verschiedenen Dosierungsformen und die getrennte Verabreichung einschließen. Außerdem können die Oligonucleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen Therapien wie einer Diättherapie, einer Nahrungsergänzung, einer physikalischen Therapie, einer körperlichen Betätigung und dergleichen, welche bei der Behandlung der hierin beschriebenen Erkrankungen eingesetzt werden, verwendet werden.
  • Die Oligonucleotidzusammensetzung kann durch Injektion, topisch, oral, transdermal oder rektal verabreicht werden. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung oral verabreicht. Die orale Form, in der das Oligonucleotid verabreicht wird, kann ein Pulver, eine Tablette, eine Kapsel, eine Lösung oder eine Emulsion einschließen. Die wirksame Menge kann in einer Einzeldosis oder in einer Reihe von Dosen, getrennt durch geeignete Zeitintervalle wie Stunden, verabreicht werden.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen ein oder mehrere der Oligonucleotide mindestens eine Modifikation im Einklang mit der vorliegenden Erfindung. Eine bevorzugte Modifikation ist der Einbau von mindestens etwa 3 bis 8 aufeinanderfolgenden achiralen Internucleosid-Phosphatbindungen oder mindestens etwa 9 bis 10 aufeinanderfolgenden achiralen Internucleosid-Phosphatbindungen oder mindestens etwa 11 bis 15 achiralen Internucleosid-Phosphatbindungen in das Oligonucleotidgerüst, oder das gesamte Oligonucleotid enthält achirale Internucleosid-Phosphatbindungen. In einigen Ausführungsformen ist das Oligonucleotid am 3'-Ende blockiert.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von Erkrankungen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Muskeldystrophie, Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Atrophie infolge von Immobilisierung, Bettruhe oder Schwerelosigkeit, Sarkopenie, Kachexie und Diabetes, verwendet werden. Tabelle 6 gibt die Zielgene oder Kombinationen von Zielgenen an, welche vorzugsweise bei der Herstellung von Gen-modulierenden Zusammensetzungen zur Verwendung in Arzneimitteln für die Behandlung verschiedener Symptome und Zustände verwendet werden. In Tabelle 6 ist die Verwendung einer Kombination von Zielgenen durch ein "/" gekennzeichnet (zum Beispiel kennzeichnet "A/B/C" die Kombination der Zielgene A, B und C); falls zwei oder mehrere ver schiedene Kombinationen bevorzugt werden, ist jede solche Kombination in einer gesonderten Zeile angegeben. Die Gen-modulierenden Zusammensetzungen, die gegen Gene gerichtet sind, werden üblicherweise in einem 1:1:1-Verhältnis verwendet, aber dies kann variieren. Zum Beispiel kann bei homöopathischen Behandlungen eine Kombination von 4×, 5× und 6× Lösungen, welche von 1:1:1 abweicht, verwendet werden. Irgendein anderes Verhältnis der Zusammensetzungen kann abhängig von dem zu behandelnden Zustand, dem Zustand des Individuums und von anderen Faktoren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, ebenfalls in den Kombinationen verwendet werden.
  • Vorzugsweise sind Tiere, z.B. Säugetiere, unter Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu behandeln, wobei die Zusammensetzungen Nucleinsäuremoleküle enthalten, welche eine Sequenz aufweisen, die für ein bestimmtes Tier geeignet ist. Zielspezies schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Vögel, Fische und Säugetiere (besonders Hühner, Schweine, Ziegen, Schafe, Rinder, Hunde, Pferde, Katzen und insbesondere Menschen) ein. Ein Fachmann kann anhand mehrerer Methoden, welche den Fachleuten bekannt sind, einschließlich einer Muskelfaseranalyse oder Biopsie, feststellen, ob ein bestimmter therapeutischer Verlauf der Behandlung erfolgreich ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung zur Erhöhung der Muskelmasse eines Tieres, falls eine solche Erhöhung wünschenswert ist, z.B. bei Tieren zur Nahrungsmittelerzeugung und bei nicht-menschlichen Sporttieren, bereit, wobei eine Oligonucleotidzusammensetzung der Erfindung an das Tier verabreicht wird, um z.B. die Expression des Myostatin-Gens zu modulieren. Diese Verwendungen ergeben Tiere mit einem erhöhten Muskel- und Proteingehalt, und, falls die Tiere zur Nahrungsmittelerzeugung verwendet werden, weisen die Muskeln auch vorteilhafterweise einen verminderten Fettgehalt auf. Auf Oligonucleotiden basierende Zusammensetzungen, wie hierin beschrieben, welche direkt oder indirekt die Expression der Myostatin-Region regulieren, können verwendet werden, um die Expression des Myostatin-Genprodukts zu verringern. Solche Oligonucleotidzusammensetzungen können an ein Nutztier, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, ein Rind, ein Schaf, ein Schwein, einen Truthahn, ein Huhn oder einen Fisch, oder an Haustiere, insbesondere Katzen und Hunde, verabreicht werden, um auf diese Weise eine Verringerung der Expression von Myostatin in dem Tier und folglich mehr Muskelgewebe als normal, vorzugsweise ohne eine Erhöhung der Fett- und/oder Cholesterinspiegel, zu erreichen. Ein Polynucleotid, das ein Pro-Myostatin oder Myostatin oder einen Myostatin-Transkriptionsfaktor, -Rezeptor oder -Signaltransduktionsfaktor oder ein Myostatin aktivierendes Genprodukt codiert, kann von irgendeinem Organismus, für den eine erhöhte Muskelmasse wünschenswert sein kann, vorzugsweise einem Tier zur Nahrungsmittelerzeugung, einem Sporttier oder einem Forschungstier, einschließlich zum Beispiel einer Maus, einer Ratte, einem Rind, einem Schwein, einem Huhn, einem Truthahn, einem Zebrafisch, einem Lachs, einem Schwertfisch, anderen aquatischen Organismen und anderen Spezies, abgeleitet sein. Beispiele für aquatische Organismen umfassen solche der Klasse Piscina, wie Forelle, Saibling, Ayu-Fisch, Karpfen, Karausche, Goldfisch, Plötze, Breitling, Aal. Sardine, fliegender Fisch, Seebarsch, Seebrasse, Papageienbarsch, Schnapper, Makrele, Stöcker, Thunfisch, Bonito, Gelbschwanzmakrele, Steinfisch, Anglerfisch, Seezunge, Flunder, Kugelfisch und Feilenfisch; solche der Klasse Cephalopoda, wie Tintenfisch, Sepie und Oktopus, solche der Klasse Pelecypoda, wie KlafFmuscheln (z.B. hartschalige Muschel, Manilamuschel, Venusmuschel, Brandungsmuschel, weichschalige Muschel); Herzmuscheln, Miesmuscheln, Strandschnecken; Jacobsmuscheln (z.B. See-, Bucht- und Calloo-Region); Meeresschnecken, Schnecken, Seegurken; Archenmuschel; Austern (z.B. C. virginica, Golfregion, Neuseeland, Pazifik); solche der Klasse Gastropoda, wie Turbanschnecke, Seeohr (z.B. grünes, rosafarbenes oder rotes); und solche der Klasse Crustacea, wie Hummer, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Gemeine Languste, Gebirgshummer und Amerikanischer Hummer; Hummerkrabben; Garnelen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, M. rosenbergii, P. styllrolls, P. indicus, P. jeponious, P. monodon, P. vannemel, M. ensis, S. melantho, N. norvegious; Kaltwassergarnelen; Krabben, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Blaue Krabbe, Turmkrabbe, Steinkrabbe, Königskrabbe, Königinnenkrabbe, Schneekrabbe, Braune Krabbe, Dungeness-Krabbe, Jonah-Krabbe, Mangrovenkrabbe, Weichkrabbe; Squilla, Krill, Langostinos; Flusskrebs/Bachkrebs, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, blauer Krebs, Macron-Krebs, Red Claw-Krebs, Red Swamp-Krebs, Weichkrebs, Weißer Krebs; Annelida; Chordata, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Reptilien wie Alligatoren und Schildkröten; Amphibien, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Frösche: und Echinodermata, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Seeigel.
  • Die Verwendungen der Zusammensetzungen zur Erhöhung der Muskelmasse in einem Tier, falls eine solche Erhöhung wünschenswert ist, entsprechen im Wesentlichen denjenigen, welche bei der Behandlung von Erkrankungen angewendet werden. Die Dosierungen, die Verabreichungswege und die Behandlungsdauer können gegebenenfalls angepasst werden, um eine optimale Entwicklung und eine optimale Terminierung der Entwicklung, wie sie für die Verwendung des Tieres geeignet ist, vorzusehen. Tabelle 1: Beispielhafte menschliche Zielgene, welche an Muskelschwundzuständen beteiligt sind
    Figure 00610001
    Tabelle 2: Beispielhafte tierische Zielgene, welche an Muskelwachstum und -entwicklung beteiligt sind
    Figure 00620001
    Figure 00630001
    Tabelle 3: Antisense-Oligonucleotide, gerichtet gegen menschliche Gene, welche an einem Muskelschwund beteiligt sind
    Figure 00640001
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    Figure 00670001
    Tabelle 4: Antisense-Oligonucleotidseguenzen, gerichtet gegen tierische Gene, die an Muskelwachstum und -entwicklung beteiligt sind
    Figure 00670002
    Figure 00680001
    Figure 00690001
    Tabelle 5: Antisense-Oligonucleotidseguenzen, welche gegen das menschliche Myostatin-Gen gerichtet sind
    Figure 00700001
    • * Basierend auf AF104922.
    Tabelle 6: Beispielhafte Kombinationen von Oligonucleotiden zur Behandlung von Muskelschwund
    Figure 00710001
    Tabelle 7: Homöopathische RNA/DNA-Dosierungen
    Figure 00710002
  • III. Kits
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kits, umfassend eine oder mehrere Zusammensetzungen der Erfindung, zur Behandlung von Muskelschwundzuständen und/oder zur Förderung des Muskelwachstums und der Aufrechterhaltung davon bereit. Diese Kits umfassen eine Zusammensetzung, enthaltend ein Gen-modulierendes Oligonucleotid, wie hierin beschrieben, sowie Anweisungen, welche die Verwendung des Kits gemäß den verschiedenen Verfahren und Ansätzen, welche hierin beschrieben wurden, erläutern. Solche Kits können auch Informationsmaterial wie wissenschaftliche Literaturangaben, Beipackzettel, Ergebnisse klinischer Prüfungen und/oder Zusammenfassungen davon und dergleichen einschließen, welche die Wirksamkeit und/oder Vorteile der Zusammensetzung veranschaulichen oder belegen. Dieses Informationsmaterial kann auf den Ergebnissen verschiedener Studien basieren, wie zum Beispiel Studien, welche Versuchstiere als in-vivo-Modelle verwenden, und Studien, die auf klinischen Prüfungen am Menschen basieren. Die hierin beschriebenen Kits können Trägern des Gesundheitswesens einschließlich Medizinern, Schwestern, Apothekern, Naturheilkundlern, Homöopathen, Chiropraktikern, „formulary officials" und dergleichen angeboten, verkauft und/oder vorgestellt werden. Kits für den nutritionellen oder homöopatischen Gebrauch können direkt dem Verbraucher angeboten, verkauft und/oder vorgestellt werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Nachweis der Kombinationswirkung von Myostatin-RNA-Oligonucleotiden in einem Zellkultursystem
  • Zeltwachstum und Kultur
  • C2C12 ist eine Maus-Myoblastenzelllinie (ATCC CRL-1772), welche sich schnell differenziert, kontraktile Myotuben bildet und charakteristische Muskelproteine herstellt. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco-BRL), ergänzt mit 10% FCS, 1 % L-Glutamin, 0,5% Penicillin und 0,5% Streptomycin, aufrechterhalten. Sie wurden bei 37°C unter 5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Zellen, welche eine Konfluenz von annähernd 50–70% aufwiesen, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 0,25% (Gew.Nol.) Trypsin – 0,53 mM EDTA-Lösung abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden in mit Serum ergänztem Medium resuspendiert und bei 1000 UpM bei Raumtemperatur für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in einer verdünnten Zellkonzentration subkultiviert.
  • Transfektion
  • Die RNA-Oligonucleotide wurden einzeln und in Kombinationen in Zellen getestet. Die Aufnahme der RNA-Oligonucleotide in die Zellen wurde durch Komplexierung mit Lipofectamin 2000 verbessert. Ungefähr 1 × 105 C2C12-Zellen wurden in 0,5 ml Wachstumsmedium ohne Antibiotika einen Tag vor der Transfektion in Platten mit 24 Vertiefungen überimpft. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C erreichten die Zellen eine Konfluenz von etwa 50%.
  • Für jede Transfektionsprobe wurde die geeignete Menge der RNA-Oligonucleotide in 50 μl Opti-MEM® I-Reduced-Serum-Medium ohne Serum verdünnt. Anschließend wurde 1 μl Lipofectamin 2000 zu 50 μl Opti-MEM® I-Medium zugegeben. Die Lösungen wurden vorsichtig gemischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der 5-minütigen Inkubation wurden die verdünnten RNA-Oligonucleotide mit dem verdünnten Lipofectamin 2000 vereinigt (Gesamtvolumen 100 μl). Die Probe wurde dann vorsichtig gemischt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von RNA-Oligonucleotid:Lipofectamin 2000-Komplexen zu ermöglichen.
  • 100 μl siRNA:Lipofectamin 2000-Komplexe wurden zu jeder Vertiefung zugegeben (2 μM Endkonzentration der RNA-Oligonucleotide). Die Zellen wurden bei 37°C in einem CO2-Brutschrank für 24–72 Stunden inkubiert, bis sie auf ein Gen-Knockdown untersucht werden konnten.
  • Proteinanalyse
  • Das Zellprotein von behandelten und unbehandelten C2C12-Zellen wurde für eine Immunblot-Analyse extrahiert. Die Zellen wurden geerntet und auf Eis gestellt, bevor sie in RIPA-Puffer (100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0,1% SDS, 2% NP-40, 1 % Natriumdesoxycholat), enthaltend 100 μg/ml PMSF und 1 μg/ml Aprotinin, jeweils kurz vorher zugesetzt, resuspendiert wurden. Die Zellextrakte wurden dann Scherkräften ausgesetzt, indem sie 13-mal durch eine 22-Gauge-Nadel gezogen wurden, und im Anschluss daran wurde zusätzlich 1 μl/ml PMSF zugegeben. Nach dem Stehenlassen auf Eis für 30–60 Minuten wurde das Zelllysat bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Protein enthaltende Überstand wurde gesammelt und die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Bio-Rad-Proteintestsystems (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) abgeschätzt.
  • Die Proteinanalyse erfolgte mit Hilfe von Immunblots, welche auch als Western-Blots bekannt sind. Ungefähr 40 μg jeder Probe wurden auf einem 10%igen SDS-PAGE-Gel (Invitrogen) aufgetrennt. Das Gel wurde dann mittels Elektrotransfer in kaltem Transferpuffer bei 30V für eine Stunde auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die freien Bindungsstellen der Membran wurden mit 3% BSA in TBS-T (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) für 30 Minuten blockiert. Die Membran wurde dann mit Blotto A (5% Magermilchpulver in TBS-T) und dem geeigneten Primärantikörper (anti-Myostatin und anti-MyoD) für eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt und anschließend mit TBS-T gewaschen. Die Membran wurde dann mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper als Sonde für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend gewaschen, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Immunkomplexe wurden durch eine Chemilumineszenzreaktion unter Verwendung der in dem Amersham RCL-Kit (Amersham) bereitgestellten Reagenzien nachgewiesen und dann auf einem Hyperfilm (Amersham) exponiert. Der Film wurde anschließend entwickelt, um Proteinbanden sichtbar zu machen.
  • Um eine gleichmäßige Beladung sicherzustellen, wurde ein β-Actin-Primärantikörper als eine Kontrolle für die Untersuchung der Membran durch einen Immunblot verwendet. Es wurde eine densitometrische Messung durchgeführt, um die Intensitäten aller Banden, welche durch die Western-Analyse erhalten wurden, quantitativ zu messen.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse zeigten, dass C2C12-Zellen mit einer Effizienz von mehr als 50% wirksam mit RNA-Oligos transfiziert werden konnten. Die Untersuchung von sieben RNA-Oligos in den Zellen zeigte, dass alle eine Hemmwirkung auf die Myostatin-Expression hatten, wobei drei davon besonders aktiv waren: A (ATg Tag CgT CCg AgA gAC, gerichtet gegen die 5'-UTR-Region), B (TgC ATC ATT TTA AAA ATC AgC, gerichtet gegen den Translationsstartpunkt) und C (ACC TAA TgC AAA gCT CAT, gerichtet gegen die Translationsstopp-Region), wie durch Western-Blots gezeigt wurde. Alle drei RNA-Oligos sind mit einer 2'-O-Methylgruppe modifiziert und mit einer 3'-Butanolgruppe blockiert.
  • Beispiel 2: Wirkung von einzelnen und kombinierten RNA-Oligos auf das Muskelgewicht bei Mäusen
  • Dieses Beispiel wurde entworfen, um die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, welche gegen Myostatin-Gene gerichtet sind, zu untersuchen.
  • Materialien
  • Oligonucleotide: Drei Oligonucleotide (A, B und C, wie in Beispiel 1) waren mit einer geradkettigen 2'-Methoxygruppe modifiziert.
  • Probenherstellung
  • Jedes Oligo wurde in Kochsalzlösung gelöst. Für die A+B+C-Gruppe wurden 3 RNA-Oligos in gleichen Volumenteilen gemischt. 100 μl jedes Gemisches verwendet, um Mäusen eine Dosis von 5 mg/kg zu injizieren.
  • Experimentelles Verfahren
  • Weibliche Mäuse (6–8 Wochen alt) wurden für 7 Tage in Käfigen gehalten, bevor mit den Injektionen begonnen wurde (Tag 1). Die Mäuse wurde zufällig auf fünf Gruppen verteilt: Gruppe A (RNA-Oligo A), Gruppe B (RNA-Oligo B) und Gruppe C (RNA-Oligo C), Gruppe D (RNA-Oligo-Gemisch A+B+C) und Gruppe E (Kochsalzlösung). In jedem Behandlungszyklus erfolgte am Tag 1 die Verabreichung einer IV-Injektion in die Schwanzvene. gefolgt von einer IP-Injektion am Tag 2 und 3. Zehn Behandlungszyklen waren in dem Protokoll vorgesehen. Während des Experiments wurde das Protokoll nach dem Zyklus 5 dergestalt angepasst, dass nur IV-Injektionen verabreicht wurden. An jedem Tag wurde vor den Injektionen das Körpergewicht gemessen. Am Ende des Experiments wurde ein Teil des Quadrizeps (Rectus femoris) präpariert und gewogen. Die Proben wurden für die Pathologie (fixiert) und die Molekularanalyse (Flüssigstickstoff) aufgeteilt.
  • Ergebnisse
  • Körpergewicht: Das Körpergewicht der Mäuse wurde jeden Tag gemessen, wobei alle Mäuse ein normales Wachstum mit einer stetigen Erhöhung des Körpergewichts zeigten.
  • Wirkung der Oligos auf das Muskelgewicht: Das Muskelgewicht wurde für jede Gruppe gemessen. Wie in der folgenden Tabelle 8 gezeigt, zeigten allen Gruppen, welche mit RNA-Oligos behandelt wurden, im Vergleich zu der Kochsalzlösung-Kontrollgruppe eine Erhöhung des Muskelgewichts (P < 0,05), wobei die kombinierten Oligos am wirksamsten waren. Tabelle 8: Vergleich der Einzel- und Kombinationswirkung auf das Muskelgewicht
    Figure 00760001
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Behandlung mit den modifizierten RNA-Antisense-Oligonucleotiden der Erfindung das Muskelwachstum fördert.
  • Beispiel 3: Spezifität der Wirkung von RNA-Oligos auf das Muskelgewicht bei Mäusen
  • Dieses Beispiel wurde entworfen, um die Wirkung der kombinierten Antisense-Oligonucleotide, welche gegen das Myostatin-Gen gerichtet sind, auf das Muskelgewicht und die Zielgen-Expression zu untersuchen.
  • Materialien
  • Oligonucleotide: Drei Oligonucleotide (A, B und C, wie in Beispiel 1) waren mit einer geradkettigen 2'-Methoxygruppe modifiziert.
  • Probenherstellung
  • Die drei RNA-Oligos wurden in gleichen Volumenteilen gemischt. 100 μl jedes Gemisches wurden verwendet, um Mäusen eine Dosis von 5 mg/kg zu injizieren.
  • Experimentelles Verfahren
  • Weibliche Mäuse (6–8 Wochen alt) wurden für 7 Tage in Käfigen gehalten, bevor mit den Injektionen begonnen wurde (Tag 1). Die Mäuse wurde zufällig auf drei Gruppen verteilt: Gruppe A (RNA-Oligos A+B+C), Gruppe B (drei Kontroll-DNA-Oligos) und Gruppe C (Kochsalzlösung). In jedem Zyklus der Behandlung erfolgte am Tag 1 die Verabreichung einer IV-Injektion in die Schwanzvene gefolgt von einer IP-Injektion am Tag 2 und 3. Zehn Behandlungszyklen waren in dem Protokoll vorgesehen. Während des Experiments wurde das Protokoll nach dem Zyklus 5 dergestalt angepasst, dass nur IV-Injektionen verabreicht wurden. An jedem Tag wurde vor den Injektionen das Körpergewicht gemessen. Am Ende des Experiments wurde ein Teil des Quadrizeps (Rectus femoris) präpariert und gewogen. Die Proben wurden für die Pathologie (fixiert) und die Molekularanalyse (Flüssigstickstoff) aufgeteilt.
  • Ergebnisse
  • Körpergewicht: Das Körpergewicht der Mäuse wurde jeden Tag gemessen, wobei alle Mäuse ein normales Wachstum mit einer stetigen Erhöhung des Körpergewichts zeigten.
  • Wirkung der Oligos auf das Muskelgewicht: Das Muskelgewicht wurde für jede Gruppe gemessen. Wie in der folgenden Tabelle 9 gezeigt, zeigte die mit den kombinierten RNA-Oligos behandelte Gruppe im Vergleich zu den Kochsalzlösung-DNA-Oligo-Kontrollgruppen eine Erhöhung des Muskelgewichts (P < 0,05). Tabelle 9: Spezifische Wirkung der kombinierten RNA-Oligos auf das Muskelgewicht
    Figure 00770001
  • Wenn Muskelgewebe entnommen und durch Western-Blots auf die Expression des Myostatin-Gens untersucht wurde, wurde gezeigt, dass die kombinierten RNA-Oligos die Myostatin-Expression signifikant hemmen konnten, während für das Haushaltsgen β-Actin kein Auswirkung beobachtet wurde.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Behandlung mit den modifizierten RNA-Antisense-Oligonucleotiden der Erfindung die Zielgen-Expression spezifisch hemmen konnte, was eine Erhöhung des Muskelgewichts zur Folge hat.
  • Beispiel 4: Verabreichung von RNA-Oligos über verschiedene Wege
  • Dieses Beispiel wurde entworfen, um die Wirkung der kombinierten Antisense-Oligonucleotide, welche gegen das Myostatin-Gen gerichtet sind, auf das Muskelgewicht durch drei verschiedene Verabreichungswege zu untersuchen.
  • Materialien
  • Oligonucleotide: Drei Oligonucleotide (A, B und C, wie in Beispiel 1) waren mit einer geradkettigen 2'-Methoxygruppe modifiziert.
  • Probenherstellung
  • Die drei RNA-Oligos wurden in gleichen Volumenteilen gemischt. 100 μl jedes Gemisches wurden verwendet, um Mäusen eine Dosis von 5 mg/kg zu injizieren.
  • Experimentelles Verfahren
  • Weibliche Mäuse (6–8 Wochen alt) wurden für 7 Tage in Käfigen gehalten, bevor mit den Injektionen begonnen wurde (Tag 1). Die Mäuse wurde zufällig auf vier Gruppen verteilt: Gruppe A (IV-Injektion, alle drei Tage), Gruppe B (IV- und IP-Injektion alle zwei Tage), Gruppe C (Kochsalzlösung, verabreicht wie in Gruppe B) und Gruppe D (oral). Am Ende des Experiments wurde ein Teil des Quadrizeps (Rectus femoris) präpariert und gewogen. Die Proben wurden für die Pathologie (fixiert) und die Molekularanalyse (Flüssigstickstoff) aufgeteilt.
  • Ergebnisse
  • Körpergewicht: Das Körpergewicht der Mäuse wurde jeden Tag gemessen, wobei alle Mäuse ein normales Wachstum mit einer stetigen Erhöhung des Körpergewichts zeigten.
  • Wirkung der Oligos auf das Muskelgewicht: Das Muskelgewicht wurde für jede Gruppe gemessen. Wie in der folgenden Tabelle 10 gezeigt, wurde bei allen drei Verabreichungswegen im Vergleich zu der Kochsalzlösung-Kontrollgruppe eine Erhöhung des Muskelgewichts beobachtet (P < 0,05). Tabelle 10: Wirkung der kombinierten RNA-Oligos auf das Muskelgewicht bei drei verschiedenen Verabreichungswegen
    Figure 00790001
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Behandlung mit den modifizierten RNA-Antisense-Oligonucleotiden der Erfindung das Muskelwachstums über verschiedene Verabreichungswege fördern konnte.
  • Beispiel 5: Die Hemmung von Foxo1 hat eine Erhöhung des Muskelgewichts bei sowohl normalen als auch Tumor-tragenden Mäusen zur Folge
  • Experimentelle Verfahren
  • Tiere, Oligonucleotide und Verabreichungsverfahren – Weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen alt) mit einem Gewicht von 15–18 g wurde für das Normal- und das Krebsmodell verwendet. S-180-Sarkomzellen in 0,2 ml PBS (5 × 106 Zellen) wurden IP injiziert und für 7–10 Tage wachsen gelassen. Sechs Mäuse pro Gruppe wurden mit den RNA-Oligos durch eine Injektion in die Schwanzvene (100 μg/0,1 ml) alle zwei Tage behandelt. Die Mäuse wurden während des Behandlungszeitraums jeden Tag gewogen. In dem Experiment wurden gegen Foxo1 gerichtete Oligonucleotide und ein Kontroll-Oligo verwendet. Die Mäuse wurden zu bestimmten Zeitpunkten getötet, und die Muskeln wurden gewogen, in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
  • RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR-Analyse – Die Gesamt-RNA wurde in TRIzol (Invitrogen) extrahiert. Die RNA wurde durch eine Elektrophorese auf Agarosegelen unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt, um die Integrität der ribosomalen RNA-Banden zu bestätigen. Unter Verwendung von 2 μg der Gesamt-RNA wurde mit Hilfe der reversen Transkriptions-(RT)-Reaktion (Promega) eine Einzelstrang-cDNA-Synthese durchgeführt. Die quantitative Fluoreszenz-Echtzeit- PCR wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Prism 7000-Geräts, des Applied Biosystems SYBR®-Green-Mastermix-Reagens und Oligonucleotidpaaren gegen die cDNA des endogenen Kontrollgens beta-Actin sowie von MyoD, GDF-8 und Foxo1 durchgeführt. Die Reagenzien wurden bei 95°C für 10 min denaturiert, gefolgt von 40 Zyklen von 15 s bei 95°C und 60 s bei 60°C. Die 5'-zu-3'-Primersequenzen waren wie folgt:
    beta-Actin-Vorwärts: GAA CCC TAA GGC CAA CCG TGA A
    beta-Actin-Rückwärts: CTC AGT AAC AGT CCG CCT AGA A
    MyoD-Vorwärts: 5'-GCA AGA CCA CCA ACG CTG AT-3'
    MyoD-Rückwärts: 5'-GGT TCG GGT TGC TGG ACG TG-3'
    GDF-8-Vorwärts: 5'-CAG ACC CGT CAA GAC TCC TAC A-3'
    GDF-8-Rückwärts: 5'-CAG TGC CTG GGC TCA TGT CAA G-3'
    Foxo1-Vorwärts: 5'-GTA CGC CGA CCT CAT CAC CA-3'
    Foxo1-Rückwärts: 5'-TGC TGT CGC CCT TAT CCT TG-3'
  • Die durchschnittlichen CT-Werte für MyoD, GDF-8 und Foxo1 wurden berechnet und auf die CT-Werte für beta-Actin normalisiert. Die normalisierten Werte wurden in die Formel 2–ΔΔCt eingesetzt, um den Faktor der Veränderung zwischen den Kontroll- und den Versuchsgruppen zu berechnen. Die Formel und die Ableitungen davon wurden dem ABI Prism 7000-Sequenzdetektionssystem-Benutzerhandbuch entnommen. Alle Reaktionen wurden in doppelter oder dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
  • Wesfern-Blot – Das Protein wurde mit Lysepuffer, enthaltend 100 mM Tris-HCI, 0,05% CA-630, 100 μg/ml PMSF, 100 μg/ml DTT, 1 μg/ml Aprotinin und 1 μg/ml Lenpeptin, aus dem Muskelgewebe der verschiedenen Gruppen extrahiert. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde nach der Bradford-Methode (Bio-Rad Laboratories) bestimmt. Die Proben wurden bei 95°C für 5 min hitzedenaturiert, durch eine 12,5%ige SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die freien Bindungsstellen der Membran wurden mit 5% fettfreiem Trockenmilchpulver in TBST-PufFer (50 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl und 0,1% Tween-20, pH 7,4) blockiert. Die Membran wurde mit einem monoclonalen anti-MyoD-Antikörper, 1:200 verdünnt (BD, Pharmingen), einem monoclonalen anti-Myostatin-Antikörper, 1:100 verdünnt (Santa Cruz Biotechnology) und einem anti-beta- Actin-Antikörper, 1:250 verdünnt (Santa Cruz Biotechnology), inkubiert und dann weitere 90 min bei 37°C inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden durch eine nachfolgende Chemilumineszenzreaktion mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten IgG (1:3000) in dem ECL-System (Amersham) sichtbar gemacht. Die Abbildung und die Daten wurden mit der Bandscan 5.0-Software analysiert.
  • Statistische Analyse – Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und einer Ein-Weg-ANOVA mit den Faktoren Behandlung, Genotyp oder Wildtyp unterzogen. Vergleiche zwischen zwei Gruppen erfolgten durch einen ungepaarten Student-t-Test. Ein Wert von p < 0,05 wurde als signifikant verschieden angesehen.
  • Ergebnisse
  • 1. Das Foxo1-RNA-Oligonucleotid förderte das Muskelwachstum bei normalen Mäusen.
  • Um die Auswirkungen des Foxo1-RNA-Oligo's auf das Muskelwachstum zu untersuchen, wurden die Beinmuskeln am Ende der Behandlung entnommen und gewogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Muskelmasse der normalen Mäusen um 10% erhöht war, während in den Kontrollgruppen keine signifikante Veränderung beobachtet wurde (1). Bei der Untersuchung der Muskelgewebe auf die Expression des Zielgens wurde beobachtet, dass der Proteinspiegel von GDF-8 um 48,5% verringert war und der Proteinspiegel von MyoD um 42% erhöht war, verglichen mit der Kontrollgruppe (2). Auf der RNA-Ebene, wie durch eine Echtzeit-PCR gemessen wurde, war der mRNA-Spiegel von Foxo1 um 75% verringert, war der mRNA-Spiegel von GDF-8 um 49% verringert und war der mRNA-Spiegel von MyoD um 58% erhöht, verglichen mit der Kontrollgruppe (2). Dieses Ergebnis zeigte deutlich, dass das Foxo1-RNA-Oligo das Muskelwachstum durch direkte Hemmung der Foxo1-Expression und indirekten Einfluss auf die Myostatin- und die MyoD-Expression erhöhen konnte.
  • 2. Erhöhung des Muskelgewichts in einem Krebskachexie-Modell durch das Foxo1-RNA-Oligonucleotid
  • Um die Auswirkung des RNA-Oligo's in einem relevanten Krankheitsmodell auf die Muskelmasse zu untersuchen, wurde der S-180-Ascitestumor als ein Krebskachexie-Modell verwendet, für das ein Muskelverlust charakteristisch ist. Wie bei den normalen Mäusen zeigte die Gruppe, welcher das Foxo1-RNA-Oligo injiziert wurde, eine Erhöhung der Muskelmasse um 32,8% im Vergleich zu der Kontrollgruppe (3). Auf der Proteinebene wurde eine Verringerung von Myostatin um 40,4% und eine Erhöhung von MyoD um 41,8% beobachtet (4). Auf der mRNA-Ebene wurde eine Verringerung der Foxo1-Expression um 81%, eine Verringerung von Myostatin von 58% und eine Erhöhung von MyoD um 66% im Vergleich zu der Kontrollgruppe beobachtet (4). Dieses Ergebnis zeigte, dass die Verwendung des Foxo1-Oligo's das Muskelwachstum in dem Krebskachexie-Modell beeinflussen konnte.
  • Beispiel 6: Die Hemmung der Myostatin-Genexpression durch RNA-Oligos erhöhte das Muskelwachstum in Tumor-tragenden Mäusen
  • Experimentelle Verfahren
  • Tiere, Oligonucleotide und Verabreiehungsverfahren – Weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen alt) mit einem Gewicht von 15–18 g wurde für das Krebsmodell verwendet. S-180-Sarkomzellen in 0,2 ml PBS (5 × 106 Zellen) wurden IP injiziert und für 7–10 Tage wachsen gelassen. Sechs Mäuse pro Gruppe wurden mit den RNA-Oligos durch eine Injektion in die Schwanzvene (100 μg/0,1 ml) alle zwei Tage behandelt. Die Mäuse wurden während des Behandlungszeitraums jeden Tag gewogen. In dem Experiment wurden gegen Myostatin gerichtete Oligonucleotide und ein Kontroll-Oligo verwendet. Die Mäuse wurden zu bestimmten Zeitpunkten getötet, und die Beinmuskeln, einschließlich des Quadrizeps (Rectus femoris), des Gastrocnemicus, des Trizeps und des EDL's, wurden gewogen, in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
  • Statistische Analyse – Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und einer Ein-Weg-ANOVA mit den Faktoren Behandlung, Genotyp oder Wildtyp unterzogen. Vergleiche zwischen zwei Gruppen erfolgten durch einen ungepaarten Student-t-Test. Ein Wert von p < 0,05 wurde als signifikant verschieden angesehen.
  • Quantitative RT-PCR-Analyse der mRNA – Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung der RNA-Präparationskits mit dem TRIZOL®-Reagens (Invitrogen) aus den Zellen isoliert. Durch Verwendung der reversen Transkriptase Impromll® (Promega) und von Oligo(d)T-Primern wurde gemäß den Anweisungen der Herstel ler, typischerweise unter Verwendung von 1 μg der Gesamt-RNA pro Reaktion, eine cDNA hergestellt. Die quantitative PCR wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Prism 7000-Geräts mit Hilfe des Applied Biosystems SYBR®-Green-Mastermix-Reagens und Oligonucleotdpaaren gegen die cDNA des menschlichen Zellhaushaltsgens beta-Actin durchgeführt. Die 5'-zu-3'-Primersequenzen waren wie folgt:
    Beta-Actin-Vorwärts: GAA CCC TAA GGC CAA CCG TGA A
    Beta-Actin-Rückwärts: CTC AGT AAC AGT CCG CCT AGA A
    GDF-8-Vorwärts: CAg ACC CgT CAA gAC TCC TAC A
    GDF-8-Rückwärts: CAg TgC CTg ggC TCA TgT CAA g
    MyoD-Vorwärts: gCA AgA CCA CCA ACg CTg AT, und
    MyoD-Rückwärts: ggT TCg ggT TgC Tgg ACg Tg.
  • Die durchschnittlichen CT-Werte für MyoD und GDF-8 wurden berechnet und auf die CT-Werte für beta-Actin normalisiert. Die normalisierten Ct-Werte für die drei Experimente wurden berechnet, und die Ergebnisse wurden zusammen mit der entsprechenden Standardabweichung, angegeben durch Fehlerbalken in den Figuren, graphisch dargestellt. Die Formel und die Ableitungen davon wurden dem ABI Prism 7000-Sequenzdetektionssystem-Benutzerhandbuch entnommen.
  • Statistische Analyse – Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und einer Ein-Weg-ANOVA mit den Faktoren Behandlung, Genotyp oder Wildtyp unterzogen. Vergleiche zwischen zwei Gruppen erfolgten durch einen ungepaarten Student-t-Test. Ein Wert von p < 0,05 wurde als signifikant verschieden angesehen.
  • Ergebnisse
  • Gegen das Myostatin-Gen gerichtete RNA-Oligos verringerten die Myostatin-Expression und erhöhten die Muskelmasse in S-180-Implantat-Mäusen
  • Die drei gegen das Myostatin-Gen gerichteten RNA-Oligos wurden in gleichen Molteilen gemischt, und das Gemisch wurde in dem Experiment verwendet. Die Wirkung auf die Muskelmasse in Mäusen mit implantierten S-180-Zellen wurden in S-180-Implantat-Mäusen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Muskelmasse in der Gruppe, welche mit dem RNA-Oligo-Gemisch behandelt wurde, um 26% erhöht war, verglichen mit der Kontrollgruppe (5A, p < 0,05). Wie in 5B erkennbar ist, erhöhte sich in der Gruppe, welche Injektionen der RNA-Oligos erhielt, das Verhältnis von Skelettmuskelmasse zu der Körpermasse um 10,4% (p < 0,05). Auf der mRNA-Ebene wurde eine Verringerung von Myostatin um 21,3% (5C, p < 0,01) und eine Erhöhung von MyoD um das 1,23-fache (5D, p < 0,01) im Vergleich zu der Kontrollgruppe beobachtet.
  • Beispiel 7: Histologische Muskelfaseranalyse
  • Experimentelle Verfahren
  • Histologische Schnitte – Den mit Kochsalzlösung oder gemischten gegen Myostatin gerichteten RNA-Oligos behandelten Mäusen wurden Muskeln entnommen und entweder in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet oder eingefroren. Paraffinschnitte (2–4 μm) wurden mit Hematoxylin und Eosin gefärbt.
  • Faserzählung und Querschnittmessungen – Für die quantitative Auswertung der eingefärbten Schnitte im Hinblick auf die Größe der Myofibrillen wurde das ImagePro 5.0.1-Software-Programm (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) zusammen mit einem Nikon-80I-Mikroskop verwendet, das mit einer Nikon-DS-L1-Digitalkamera ausgestattet war, kalibriert für räumliche Messungen und Intensität. Die Fasergröße wurde durch Messung der Fläche jeder transversalen Myofibrille pro definierter Fläche bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Gemischte gegen Myostatin gerichtete RNA-Oligos bewirkten eine Zunahme der Myofibrillengröße.
  • Der Skelettmuskel besteht aus post-mitotischen, multinuklearen Fasern. Die Zunahme der Muskelmasse, die bei einer Anti-Myostatin-Behandlung beobachtet wurde, könnte auf eine erhöhte Zahl der Muskelfasern oder eine Zunahme ihrer Größe zurückzuführen sein. Um die Wirkung von Antisense-RNA auf Muskelfasern zu bestimmen, wurden Faserquerschnitte von mit gemischten RNA-Oligos behandelten Mäusen und von mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen gemessen. Signifikante Zunahmen wurden im Einzelfaserquerschnitt von Skelettmuskeln der mit gemischten RNA-Oligos behandelten Mäuse festgestellt, die auf eine tatsächliche Hypertrophie auf Einzelmyofibrillenebene hindeuteten. Insgesamt war bei den mit gemischten RNA-Oligos behandelten Mäusen die Muskelfaserfläche im Verhältnis zur Muskelfaserfläche der Kochsalzkontrollgruppe um 12,3% vergrößert (6A und 6B). Zusammen zeigten diese Ergebnisse, dass die Antisense-RNA-Oligonucleotide die Myostatin-Expression hemmen konnten, was die Zunahme des Muskelgewichts zur Folge hatte.
  • Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin veranschaulicht und beschrieben worden sind, ist für Fachleute ersichtlich, dass solche Ausführungsformen nur als Beispiele angegeben werden. Zahlreiche Variationen, Veränderungen und Substitutionen sind für die Fachleute nun erkennbar, ohne von der Erfindung abzuweichen. Es sollte selbstverständlich sein, dass verschiedene Alternativen zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Patentansprüche den Schutzumfang der Erfindung definieren und dass die Verfahren und die Strukturen innerhalb des Schutzumfangs dieser Patentansprüche und deren Entsprechungen dadurch eingeschlossen sind.

Claims (28)

  1. Zusammensetzung, welche zur Verabreichung an ein Tier geeignet ist, umfassend ein modifiziertes Oligonucleotid, das 7 bis 75 aufeinanderfolgende Ribosegruppen enthält, welche durch achirale 5' zu 3'-Internucleosidphosphatbindungen miteinander verknüpft sind, wobei das modifizierte Oligonucleotid komplementär ist zu einer Region eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der 5'-UTR-Region, dem Translationsstartpunkt, der 3'-UTR-Region und der Translationsterminationsstelle, und wobei das Gen für ein Genprodukt codiert, welches an einem Muskelschwundzustand beteiligt ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Oligonucleotid einen Tm-Wert von etwa 75 bis 115°C bei einer Konzentration von 1 mM und einer Länge von 10 bis 26 Basen, oder einen Tm-Wert von etwa 40°C bis 85°C bei einer Konzentration von 1 pM und einer Länge von 10 bis 26 Basen hat.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oligonucleotid ein Nucleotid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oligonucleotid eines oder mehrere Nucleotide umfasst, in denen die 2'-Position einen Substituenten umfasst.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der 2'-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methoxy, Propoxy, Methoxy-Ethoxy, Fluor, Chlor, Brom und Jod.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das modifizierte Oligonucleotid 3'- und/oder 5'-End-modifiziert ist.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das modifizierte Oligonucleotid 3'- und/oder 5'-end-blockiert ist.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Oligonucleotid ist.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem Myostatingen ist.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Myostatingen ein tierisches Myostatingen ist.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Myostatingen ein Säugermyostatingen ist.
  12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Myostatingen ein menschliches Myostatingen ist.
  13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Oligonucleotid eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1 bis 191 (dargestellt in Tabellen 3, 4 und 5).
  14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Oligonucleotid eine RNAi, Ribozym oder Desoxyriboyzm umfasst.
  15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 weiterhin umfassend eine Vielzahl von modifizierten Oligonucleotiden.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15 umfassend zwei modifizierte Oligonucleotide.
  17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Zusammensetzung ein Nahrungsergänzungsmittel ist.
  19. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Muskelschwundzuständen.
  20. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, als Nahrungsergänzungsmittel zur Förderung des Muskelwachstums in einem Individuum.
  21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Individuum ein Säuger ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Individuum ein Mensch ist.
  23. Kit, umfassend eine oder mehrere der Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 18 und gegebenenfalls Anleitungen für die Verwendung der Zusammensetzung(en).
  24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22 und/oder Kit nach Anspruch 23, wobei das Gen, welches ein Genprodukt codiert, welches an einem Muskelschwundzustand beteiligt ist, ausgewählt ist aus der Gruppe dargestellt in Tabelle 1 und/oder 2.
  25. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem FOXO1-Gen ist.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das FOXO1-Gen ein tierisches FOXO1-Gen ist.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das FOXO1-Gen ein Säuger-FOXO1-Gen ist.
  28. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das FOXO1-Gen ein menschliches FOXO1-Gen ist.
DE202007009679U 2006-07-11 2007-07-11 Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen Expired - Lifetime DE202007009679U1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE202007009679U DE202007009679U1 (de) 2006-07-11 2007-07-11 Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE202006010725.8 2006-07-11
DE202006010725U DE202006010725U1 (de) 2006-07-11 2006-07-11 Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen
DE202007009679U DE202007009679U1 (de) 2006-07-11 2007-07-11 Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE202007009679U1 true DE202007009679U1 (de) 2007-10-11

Family

ID=38580496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE202007009679U Expired - Lifetime DE202007009679U1 (de) 2006-07-11 2007-07-11 Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE202007009679U1 (de)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8097596B2 (en) Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
Dupont-Versteegden et al. Early changes in muscle fiber size and gene expression in response to spinal cord transection and exercise
KR102459500B1 (ko) 퀘르세틴 배당체를 함유하는 근위축 억제제
LANE et al. 2-Deoxy-D-glucose feeding in rats mimics physiologic effects of calorie restriction
CA2558160C (en) Antisense oligonucleotide targeting myostatin or fox01 for treatment of muscle wasting
KR101965868B1 (ko) 대상에게서 ｓｍｎ２ 스플라이싱을 조정하기 위한 조성물 및 방법
KR20060063788A (ko) 올리고 핵산 담지 복합체, 이 복합체를 함유하는 의약조성물
WO2003035083A1 (de) Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz
JP2020503327A (ja) Ｓｍａｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの組成物および乾癬を処置するまたは予防する方法
Kim et al. Gene expression during inactivity-induced muscle atrophy: effects of brief bouts of a forceful contraction countermeasure
WO2008005019A1 (en) Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
US20190038769A1 (en) Micro-rna profiling, compositions, and methods of treating diseases
Dong et al. Down-regulation of GFRα-1 expression by antisense oligodeoxynucleotide attenuates electroacupuncture analgesia on heat hyperalgesia in a rat model of neuropathic pain
DE69613984T2 (de) Für die protein-kinase a-spezifische modifizierte oligonukleotide und verfahren zur deren verwendung
Shao et al. MAPK-ERK-CREB signaling pathway upregulates Nav1. 6 in oxaliplatin-induced neuropathic pain in the rat
DE202007009679U1 (de) Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen
DE202006010725U1 (de) Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Behandlung von Muskelschwundzuständen
US11414663B2 (en) Micro-RNA profiling, compositions, and methods of treating diseases
US10744151B1 (en) Micro-RNA profiling, compositions, and methods of treating diseases
Wilsey et al. Oral vanadium enhances the catabolic effects of central leptin in young adult rats
JP6441364B2 (ja) ジベンゾ−アルファ−ピロンを用いた体重増加制御
WO2004106519A2 (de) Mrp8/mrp14 inhibitoren und ihre verwendung zur prävention und/oder behandlung von hypertrophen narben und keloiden
Xu et al. The Effect of Glycine and N-Acetylcysteine on Oxidative Stress in the Spinal Cord and Skeletal Muscle After Spinal Cord Injury
JP7478894B1 (ja) 痒みの予防又は改善剤
US20230040823A1 (en) Micro-rna profiling, compositions, and methods of treating diseases

Legal Events

Date Code Title Description
R207 Utility model specification

Effective date: 20071115

R150 Utility model maintained after payment of first maintenance fee after three years

Effective date: 20100907

R151 Utility model maintained after payment of second maintenance fee after six years

Effective date: 20130813

R152 Utility model maintained after payment of third maintenance fee after eight years
R071 Expiry of right