DE202004012901U1

DE202004012901U1 - Lactobacillus Salivarius

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Publication number: DE202004012901U1
Application number: DE202004012901U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2014-08-19

Abstract

Lactobacillus salivarius, gekennzeichnet durch eine Siedlungsaktivität für Tauben und Ziervögel.

Description

Die Erfindung betrifft einen Lactobacillus salivarius, ein Tierarzneimittel, das einen solchen enthält, sowie ein einen Lactobacillus salivarius enthaltendes Nahrungsergänzungsmittel für Tiere.
Domestizierte Vögel zeigen eine hohe Infektionsbereitschaft für pathogene Keime, die sich insbesondere im Darm der Tiere ansiedeln. Nicht nur Darmkrankheiten sind damit verbunden, vielmehr kann sich eine krankmachende Wirkung auch in anderen Teilen des Organismus, insbesondere im Atmungsapparat, entfalten. Meist sind diese Krankheiten durch einen starken Befall mit E. coli verursacht. Bei Pflaumenkopfsittichen äußert sich ein durch E. coli-Befall verursachtes Krankheitsbild durch schmierigen Kot und abgestorbene Embryonen in den Bruteiern.
Die häufige Applikation von Antibiotika führt zur Resistenz vieler in Vögeln Krankheiten verursachender Keime. Durch die Antibiotikabehandlung wird ferner die Darmflora von Vögeln geschädigt, weil auch nützliche Darmbakterien getötet werden. Die Besiedlung des Dünndarms der Vögel mit nützlichen Keimen wird also nachhaltend beeinträchtigt. Dies gilt insbesondere auch für Tauben.
Die WO 89/05849 betrifft aus dem Gastrointestinaltrakt von Schweinen gewonnene Milchsäurebakterien, L. salivarius subsp. SS129 (DSM 4325) und L. salivarus SS258 (DSM 4328), diese enthaltende fermentierte Milchprodukte und deren Verwendung in veterenärmedizischen Zusammensetzungen zur Prophylaxe oder Behandlung von Infektionen des Gastrointestinaltrakts in Schweinen. Wie alle im Gastrointestinaltrakt von Lebewesen siedelnden Bakterien sind auch diese offenbarten Stämme spezifisch. Es kann nicht davon ausgegangen werden, dass diese Stämme auch zur Behandlung von Vögeln geeignet sind.
Die JP 05-246864 A beschreibt den Einsatz von L. salivarius, insbesondere FERM B-12763, zur Wachstumsstimulierung bei Geflügel. Angaben zur Siedlungsaktivität in anderen Vogelarten, beispielsweise Tauben, sind nicht enthalten.
Die DE 199 43 488 A1 betrifft den L. salivarius mit der Hinterlegungsnummer DSM 12892 und dessen Einsatz als Arzneimittel zur Behandlung und Vorbeugung von Taubenkrankheiten, die durch eine unphysiologische Darmflora verursacht sind sowie dessen Einsatz als Nahrungsergänzungsmittel für Tauben. Dieser Stamm wird von seinem Hinterleger intern als „TS-6" bezeichnet. Der Stamm TS-6 verhält sich Tauben gegenüber siedlungsaktiv, hingegen Papageien gegenüber siedlungspassiv.
Die DE 199 45 746 A1 betrifft den L. salivarius mit der Hinterlegungsnummer DSM 12000, dessen Verwendung als Tierarzneimittel zur Behandlung und Vorbeugung von Ziervogelkrankheiten sowie dessen Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel für Ziervögel. Dieser intern vom Hinterle ger als WS-ll bezeichnete L. salivarius zeigte zunächst eine hohe Siedlungsaktivität für Papageienvögel, insbesondere Papageien, Wellensittiche und Kanarienvögel. Er ist siedlungspassiv in Finken, Prachtfinken und Timalien.
Die beiden zuletzt genannten Druckschriften zeigen die positiven Wirkungen der Besiedlung des Dünndarms der jeweiligen Vogelarten. Schädliche Keime wie E. coli und Hefen werden zurückgedrängt; die Anzahl von Enterokokken, die als nützliche Darmbewohner gelten, steigt deutlich an. Nachteilig an L. salivarius Stämmen ist die beschränkte Siedlungsaktivität.
Der Erfindung liegt mithin die Aufgabe zu Grunde, einen L. salivarius Stamm bereitzustellen, der dieselben positiven Eigenschaften wie die bekannten Stämme aufweist und darüber hinaus ein größeres Spektrum im Hinblick auf die Siedlungsaktivität bei Vögeln zeigt.
Gelöst wird diese Aufgabe durch einen L. salivarius mit einer Siedlungsaktivität für Tauben und Ziervögel. Dieser L. salivarius ist in der Lage Rhamnose, Salicin und Trehalose zu vergären.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Tierarzneimittel, enthaltend einen L. salivarius mit Siedlungsaktivität bei Tauben und Ziervögeln. Dieser L. salivarius ist in der Lage Rhamnose, Salicin und Trehalose zu vergären.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Nahrungsergänzungsmittel für Tiere, enthaltend den zuvor beschriebenen L. salivarius. Dieses dient der Vorbeugung von Darmerkrankungen in Tieren, beispielsweise Tauben und Ziervögeln.
Unter siedlungsaktiven Lactobacillusspezies werden solche Lactobazillen verstanden, die sich einerseits unter Konkurrenzdruck durchsetzen und bei möglichst vielen Taubenvögeln und Ziervögeln, gleich welchen Schlags und welcher Rasse, im Dünndarm dauerhaft ansiedeln. Sie besitzen eine Besiedlungsaktivität von 80 % und mehr, beispielsweise auch 90 % und darüber. Siedlungsaktivität von 80 % bedeutet, dass bei 80 % der Tiere einer Gruppe, die mit Lactobazillen behandelt wurden, diese auch im Dünndarm siedeln, d.h. Dünndarmrezeptoren besetzen. Der Nachweis einer Siedlungsaktivität erfolgt über mehrere Wochen, in der Regel vier bis sechs Wochen, nach Beendigung der Applikation des Lactobazillus über die Rückisolierung des Lactobazillus aus dem Kot der Probanden. Eine Siedlungsaktivität von 80 % ist als relativ hoch anzusehen, da nicht nur die Strukturrezeptoren im Dünndarm sondern auch unterschiedliche Bedingungen wie Bakterienmilieu, pH-Wert-Verhältnisse, Nahrungsangebot für die Lactobazillen im Verdauungstrakt und die Ansiedlung von Lactobazillen im Dünndarm beeinflussen können.
Beispielhaft für einen erfindungsgemäßen L. salivarius wird auf den bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH am 28. Juni 2004 international unter der Eingangsnummer DSM 16530 hinterlegten L. salivarius (interne Bezeichnung PT-12) verwiesen.
Überraschend wurde festgestellt, dass dieser Stamm siedlungsaktiv bei Taubenvögeln und Ziervögeln ist. Die erfindungsgemäßen Stämme sind grampositive Stäbchen, fakultativ anaerob, obligat saccharoklastisch und sogenannte Homofermenter, d. h. sie liefern als Endprodukt der Glucosegärung einer rechtsdrehende Milchsäure. Anders als die zuvor genannten bekannten Stämme WS-11 und TS-6 ver gären die erfindungsgemäßen Stämme sowohl Rhamnose als auch Salicin und Trehalose.
Nur der erfindungsgemäße L. salivarus siedelt bei Ziervögeln und Tauben. Auch bei Kanarien, Waldvögeln, Cardeuliden und Weichfressern kann dieser Lactobazillus vier Wochen nach Beendigung der Applikation aus dem Kot rückisoliert werden. Mithin erfolgte auch hier eine aktive Besiedlung.
Die Zuckervergärung des erfindungsgemäßen Stamms PT-12 sowie der beiden bekannten Stämme WS-11 und TS-6 wurde untersucht. Das Ergebnis der Untersuchung ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1

+w = schwache/verzögerte Reaktion nb = nicht bestimmt

Die Tabelle zeigt, dass der erfindungsgemäße L. salivarius PT-12 im Hinblick auf die Kohlenhydratvergärung das kompletteste Muster aufweist.
Der erfindungsgemäße L. salivarius kann über das Trinkwasser mittels Kropfsonde oder als Beimischung zum Futter verabreicht werden. Als besonders vorteilhafte Verabreichungsform hat sich ein L. salivarius enthaltender Sirup erwiesen. Ein Sirup enthält über seinen Zuckerantei wertvolle Nahrung für Lactobazillen, die sich dadurch im Dünndarm besser vermehren können. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass ein L. salivarius, der über einen Sirup an Körnerfutter gebunden wurde, drei Tage lang seine Lebensfähigkeit erhält. Auch hat man durch Sirup als Bindemittel im Vergleich zum Öl wesentlich geringer Abriebverlusste an Lactobazillen. Öl zieht schon nach kurzer Zeit in die Futterkörner ein. Die gebundenen Lactobazillen fallen ab und sind dann nicht mehr für Tiere greifbar. Der Sirup hingegen wirkt wie ein Klebstoff und verbindet auch nach Aushärten die Lactobazillen mit dem Körnerfutter zu einer untrennbaren Masse.
Vorzugsweise wird der L. salivarius gefriergetrocknet gelagert und in dieser Form dem Applikationsmedium beigemischt. Der erfindungsgemäße Lactobazillus kann in einer Dosis von 1 bis 5 × 10⁸ KBE/Vogel/Tag verabreicht werden. Auch andere Verabreichungsmengen sind möglich. Sie können auch deutlich höher liegen.
Um die erfindungsgemäßen gewünschten Wirkungen zu erzielen, sollte die Erstapplikation mindestens über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen erfolge, damit neben dem Enterobakteriaceae weitere unphysiologische Begleitflora im Dünndarm verdrängt werden. Ist der Titer der pathogenen Keime sehr hoch, ist vor Beginn der ersten Applikation ein Antibiotikum zu verabreichen, um Platz für die Laktobazillen zu schaffen. Die Erstapplikation des erfindungegemäßen L. salivarius sollte bei frisch geschlüpften Jungvögeln sobald als möglich, d.h. sofort nach der Geburt oder ab dem vierten oder fünften Lebenstag, je nach Größe der zu behandelnden Vogelart, erfolgen. Als besonders vorteilhaft hatte sich erwiesen, die Applikation des L. salivarius fünf Wochen lang fortzuführen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Gewinnung eines L. salivarius mit hoher Siedlungsaktivität
Zur Isolierung von Lactobazillen wurde eine Gruppe von Tieren zunächst eingegrenzt. Voraussetzung für die Auswahl der Tiere ist, dass diese über Jahre Jungtiere ohne Probleme aufgezogen haben und ihre Dünndarmflora physiologisch intakt ist, d.h. der Anteil an Enterobakteriaceae muss möglichst gering sein. Der Lactobazillen-Titter im Kot sollte möglichst hoch sein und einen Wert von 1 × 10⁷ KBE/Kot überschreiten.
Es wurde jeweils 1 g Kot der Tiere gesammelt, in 1%iger Kochsalzlösung homogenisiert und eine Verdünnungsreihe erstellt. Pro Verdünnungsreihe wurde ein Tropfen entnommen und auf eine MRS-Nährbodenplatte gleichmäßig ausgestrichen. Die MRS-Nährbodenplatten wurden im Brutschrank bei 38 °C 72 Stunden gebrütet und anschließend visuell auf mögliche Lactobazillen untersucht. Keime, die morphologisch Lactobazillen zuzuordnen sind, wurde auf eine neue MRS-Nährbodenplatter überimpft und wiederum 72 Stunden bebrütet. Von diesen Platten werden Einzelkolonien abgeimpft und auf Columbia-Blutagar-Platten zur Reinigung ausgestrichen. Auf Blut-Agar wachsen Enterobakteriaceae sehr gut, Lactobazillen jedoch nur als vergrünende stecknadelspitz große Kolonien. Diese stecknadelspitz großen Kolonien werden dann den Blut-Agar-Platten entnommen, wiederum auf MRS-Platten ausgestrichen und bebrütet. Die auf diesen Platten gewachsenen Keime werden im Hinblick auf für Lactobazillen typische Eigenschaften untersucht.
Die Lactobazillen wurden katalogisiert und über das sogenannte Microbank-Verfahren bei –22 °C 6 Monate gelagert. Anschließend erfolgte erneut ein Ausstreichen der Keime auf MRS-Platten und die Kontrolle des Wachstumverhaltens. Eine Reihe von Keimen wuchsen nicht mehr an, d.h. sie hatten sich selbst ausselektiert. Die verbleibenden Keime wurden dann auf ihre Besiedlungseigenschaften im Dünndarm getestet.
Beispiel 2
Primärinfektiöse Darmerkrankungen bei Pflaumenkopfsittichen (Psittacula cyanocephala) wurden mit dem bekannten TS-6 und dem erfindungsgemäßen PT-12 behandelt. Das Krankheitsbild äußerte sich in einem schmierigen Kot und abgestorbenen Embryonen in den Bruteiern. Die Pflaumenkopfsittichen wiesen einen starken Befall mit E. coli im Dünndarm auf. Die erkrankten Vögel wurden in zwei Gruppen mit jeweils 20 Probanden unterteilt. Vor der Behandlung wurden die Probanden untersucht und die Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) für E. coli und den jeweiligen Lactobazillus ermittelt. Die Behandlung erfolgte mit jeweils 1 × 10⁹ Keime je Vogel und Tag über einen Zeitraum von 14 Tagen. Nach der Voruntersuchung erfolgten weitere Untersuchungen 7 und 14 Tage nach Beginn der Applikation sowie 7 und 14 Tage nach Beendigung der Applikation. Im Falle der Applikation des PT-12 erfolgten weitere Untersuchungen 21 Tage, 28 Tage und 42 Tage nach Beendigung der Applikation sowie eine letzte Untersuchung 12 Wochen nach der Applikation. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
Tabelle 2 – Keime im Kot von Pflaumenkopfsittichen bei Behandlung mit TS-6
Die Tabelle zeigt, dass während der TS-6-Applikation der E. coli Titer ein wenig verringert wird. Eine nennenswerte Reduktion von E. coli erfolgt nicht. Auch konnte der TS-6-Lactobazillus im Kot nur in der Applikationsphase nachgewiesen werden. Nach der fünften Untersuchung wurde der Versuch abgebrochen, da die Testergebnisse keine Veränderungen mehr zeigten. Es kann festgehalten werden, dass der TS-6 bei den Pflaumenkopfsittichen nur als ein „passiver" Lactobazillus auftritt, d.h. er zeigt eine Wirkung nur so lange er verabreicht wird. Der TS-6 siedelt nicht. Die negativen Symptome bei den Sittichen bleiben erhalten. Die Embryonen starben weiterhin im Ei ab.
Tabelle 3 zeigt die Verhaltensweise eines aktiv siedelnden Lactobazilius. PT-12 ist schon bei der ersten Untersuchung nach Applikation in einer nicht unerheblichen Menge im Kot der Pflaumenkopfsittiche nachzuweisen. Der Titer des PT-12 steigt dann nach Beendigung der Applikation noch deutlich an und verbleibt sogar 12 Wochen nach Beendigung der Applikation auf einem hohen Niveau. Hier liegt eine Besiedlung des Dünndarms mit Laktobazillen vor. Durch das Ausbreiten des PT-12 im Dünndarm werden die E. coli verdrängt und verschwinden schließlich. Interessant ist in diesem Versuch zu beobachten, dass bei der zweiten Untersuchung Enterokokken, die zu den nützlichen Bakterien im Dünndarm zählen, auftreten. Diese waren vermutlich bei der ersten Untersuchung durch die Dominanz der E. coli im Dünndarm so stark zurückgedrängt, dass sie auf Grund ihrer geringen Anzahl unter der Nachweisgrenze von > 1 × 102 lagen. Die Behandlung mit PT-12 hat somit zusätzlich Raum für nützliche Bakterien geschaffen. Der Kot der Sittiche hat sich nachhaltig gebessert. Aus allen befruchteten Eiern sind lebensfähige Küken geschlüpft.
Beispiel 3
Rosakakadus (Eolophus roseicapilla) wurden mit TS-6 und PT-12 zur Verdrängung von sogenannten Sprosspilzen (Candida crusei) behandelt (1 × 10⁹ Keime je Vogel und Tag über 14 Tage). Die Kontamination mit Sprosspilzen kann über das Körnerfutter erfolgen und ist bei Papageien ein großes gesundheitliches Problem. Sprosspilze verhindern häufig den Aufbau einer physiologischen Darmflora.
Die Voruntersuchung und die Behandlung erfolgte im Wesentlichen wie in Beispiel 2, wobei im Falle der Behandlung mit PT-12 die letzte Untersuchung 28 Tage nach Beendigung der Applikation von PT-12 erfolgte.
Tabelle 4 – Keime im Kot von Rosakakadus bei Behandlung mit TS-6
Auch in diesem Fall konnte der Versuch mit dem TS-6 nach der fünften Untersuchung abgebrochen werden. Während der 14 tägigien TS-6 Applikation konnte der Hefepilz um fast zwei Zehnerpotenzen zurückgedrängt werden. Nach Beendigung der Laktobazillenapplikation steigt der Titer des Pilzes jedoch wieder kontinuierlich an. Eine Besiedlung mit TS-6 bei den Rosakakadus war nicht zu erkennen.
Es wurden weitere Versuche mit TS-6 bei anderen Vogelarten, nämlich Aras, Nymphensittichen, Wellensittichen, Kanarien und Finken durchgeführt, um festzustellen ob pathogene Keime im Dünndarm dieser Vogelarten verdrängt werden können. Diese Versuche scheiterten genau so wie in den beiden zuvor dargestellten Versuchen.
Tabelle 5 – Keime im Kot von Rosakakadus bei Behandlung mit PT-12
Der Sprosspilz konnte in diesem Versuch durch den PT-12 innerhalb von sechs Wochen im Dünndarm der Rosakakadus verdrängt werden. Auch zeigte der PT-12 in diesem Versuch siedlungsaktive Eigenschaften. So blieb vier Wochen nach Beendigung der Laktobazillenapplikation der Titer des PT-12 im Kot der Kakadus auf einem relativ hohen Niveau.
Beispiel 4 – von verschiedenen psittaciformen Spezies mit PT-12 im Babyalter
In den ersten Lebenstagen ist der Dünndarm von Vögeln noch relativ sauber. Appliziert man im Babyalter Laktobazillen, kann man sehr schnell darüber urteilen, ob eine Laktobazillenspezies einen siedlungsaktiven oder – passiven Charakter bei einer bestimmten Vogelart hat. So wurde der PT-12 bei unterschiedlichen Papageienarten zum Einsatz gebracht. Der Einsatz des PT-12 beschränkte sich auf die ersten vier Lebenstage und zwar auf eine einmalige Applikation in einer Dosis von 1 × 10⁸ Keimen. Dabei konnte der PT-12 zu 100 % vier Wochen nach Applikation bei Ara rubrogenys, Ara macao, Amazona pretrei, Ara maracana, Ara severa, Amazona o. ochrocelphala, Amazona leucophala, Amazona tresamariae, Amazona viridigenalis, Amazona aestiva, Amazona o. xantholaema, Amazona a. nana, Amazona f. bodini, Amazona barbadensis, Psittacus enthacus, Psittacus e. timneh, Cacatua molluccensis, Cacatua pastinator, Cacatua leadbeateri, Pionus chalcopterus, Pionus senilis.
Beispiel 5
Brieftauben wurden mit PT-12 und WS-11 zur Verdrängung von E. coli behandelt. Es wurden 40 Brieftauben aus einem Latent mit E. coli infizierten Taubenschlag untersucht. Diese wurden nach dem Zufallsprinzip auf je 20 Tiere pro Gruppe aufgeteilt. Die Kotuntersuchung verlief nach dem Poolverfahren d.h. morgentlicher Kot wurde pro Gruppe eingesammelt, gut gemischt und dann auf sogenannte Mac-Conkey und Nährböden ausgestrichen. Die koloniebildenden Einheiten (KBE) wurde über Verdünnungsreihen ermittelt. Die Behandlung mit PT-12 und WS-11 erfolgte derart, dass 14 Tage lang 1 × 10⁹ Keime pro Taube und Tag verabreicht wurden. Eine erste Untersuchung erfolgte vor der Applikation der Keime. Weitere Untersuchungen erfolgten 7 und 14 Tage nach der Erstapplikation sowie 7, 14, 21 und 35 Tage nach Beendigung der Applikation.
Tabelle 6 – Diagnostizierte Keime im Kot von Brieftauben
Der Tabelle 6 ist zu entnehmen, dass die Tiere beider Versuchsgruppen einen relativ hohen Keimbesatz mit E. coli aufweisen. Während und kurz nach der Beendigung der Applikation werden E. coli zunächst in beiden Gruppen zurückgedrängt. Mit fortschreibender Versuchsdauer ist deutlich erkennbar, dass die E. coli in der Vergleichsgruppe WS-11 wieder deutlich zunehmen, wohingegen sie in der mit PT-12 behandelten Gruppe weiter abnehmen und gegen null laufen. Den gegenteiligen Verlauf zeigen die Laktobazillen. Schon in der Startphase des Versuchs sind im Kot der mit PT-12 behandelten Gruppe deutlich mehr Laktobazillen. Der PT-12 nimmt während der Behandlung ständig zu und bleibt auf einem relativ hohen Niveau. In der WS-11 behandelten Gruppe verringert sich die Anzahl der Lactobazilluskeime bereits kurz nach der Beendigung der Applikation. Nach der fünften Untersuchung ist dieser Bazillus im Kot nicht mehr nachweisbar. PT-12 ist siedlungsaktiv bei Brieftauben. WS-11 ist siedlungspassiv bei Brieftauben
Beispiel 6
Bei Brieftauben im Nestlingsalter wurden PT-12 und WS-11 am vierten und sechsten Lebenstag in einer Keimzahl von 1 × 10⁹ Keimen appliziert. Der Kot dieser Jungtauben wurde dann im Alter von 14 und 21 Tagen auf mögliche Rückisolierung der jeweiligen Laktobazillenspezies untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7 – Rückisolierung von PT-12 und WS-11
Die Ergebnisse der Tabelle 7 zeigen deutlich, dass der PT-12 bei Jungtauben auch bei einer nur zweimaligen Applikation zu 100 % ückisoliert werden kann. Dies weist auf eine hohe Siedlungsaktivität im Dünndarm der Tauben hin. Hingegen konnte der WS-11 in drei Fällen bei einem Lebensalter der Tauben von 14 Tagen rückisoliert werden, im Alter von 21 Lebenstagen war er im Kot hingegen nicht mehr auffindbar. Auch dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass der PT-12 bei Tauben eine siedlungsaktive Stellung einnimmt.

Claims

Lactobacillus salivarius, gekennzeichnet durch eine Siedlungsaktivität für Tauben und Ziervögel.
Lactobacillus salivarius nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Befähigung Rhamnose, Salicin und Trehalose zu vergären.
Lactobacillus salivarius nach Anspruch 1 oder 2 mit der Eingangsnummer DSM 16530.
Lactobacillus salivarius nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er in einem Sirup vorliegt.
Tierarzneimittel, enthaltend einen Lactobacillus salivarius nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Nahrungsergänzungsmittel für Tiere, enthaltend einen Lactobacillus salivarius nach einem der Ansprüche 1 bis 4.