DE19928313A1 - Verfahren zur Veränderung von Peptidsynthefasen in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methylieren können - Google Patents

Verfahren zur Veränderung von Peptidsynthefasen in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methylieren können

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Veränderung von Peptidsynthetasen (PPS) in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methylieren können. DOLLAR A PPS sind Enzyme, die Peptide auf nicht-ribosomale Weise synthetisieren. Die von den PPS synthetisierten Peptide (oder die daraus hervorgehenden Derivate) sind oft von pharmazeutischem Interesse. Die PPS sind modular aufgebaut. Jedes Modul besitzt eine Aktivierungsdomäne, welche die jeweiligen Substrataminosäure erkennt und kovalent bindet. Die von der PPS katalysierte Peptidsynthese erfolgt dann durch die Kondensation der kovalent gebundenen Substrataminosäuren. Eine geringe Anzahl der bekannten Aktivierungsdomänen ist in der Lage, die gebundenen Substrataminosäuren auch zu N-methylieren. Die hier beschriebene Erfindung ermöglicht die Umwandlung von Aktivierungsdomänen ohne N-Methyltransferase-Aktivität in Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Aktivität, wobei die ursprüngliche Substratspezifität erhalten bleibt. Für jede Spezifität eines vorhandenen PPS-Moduls kann somit ein entsprechendes Modul-Derivat mit zusätzlicher N-Methyltransferase-Aktivität bereitgestellt werden. Diese Derivate können dann dazu genutzt werden, neue oder modifizierte PPS zu konstruieren, wodurch das synthetisierte Peptid dann an den gewünschten Peptidbindungen N-methyliert ist. Dies ermöglicht die Synthese neuer Peptide mit möglichen neuen pharmakologischen Eigenschaften.

Description

Die Erfindung betrifft die Veränderung von Peptidsynthetasen (PPS) in der Weise, daß sie ihre Substrataminosäuren N-methylieren können. Dies wird durch eine gezielte Modifikation oder Austausch der funktionellen Untereinheiten (Aktivierungsdomänen) dieser Enzyme erreicht.
Peptidsynthetasen (PPS) sind Enzyme, die Peptide auf nicht-ribosomale Weise synthetisieren. Die von den PPS synthetisierten Peptide (oder die daraus hervorgehenden Derivate) sind oft von pharmazeutischem Interesse, wie beispielsweise die Penicilline, Vancomycin, Cephalosporin, Pristinamycin oder das Actinomycin D. Die PPS sind modular aufgebaut. Jedes Modul einer PPS erkennt, aktiviert und bindet jeweils eine Aminosäure. Einige PPS-Module akzeptieren auch ungewöhnliche (nicht proteinogene) Aminosäuren als Substrate, wie beispielsweise die alpha- Aminoadipinsäure (in Penicillin) oder das Phenylglycin (in Pristinamycin). Die von der PPS katalysierte Synthese eines Peptides erfolgt durch die enzymkatalysierte Kondensation der an den Modulen gebundenen Aminosäuren. Diese Kondensation ist gerichtet, und zwar in der Weise, daß die am ersten Modul der PPS (bezogen auf den N-Terminus der PPS) gebundene Substrataminosäure den Anfang (N-Terminus) des synthetisierten Peptids bildet. Somit bestimmt die Anzahl und die Reihenfolge der Module innerhalb einer PPS die Länge und die Sequenz des synthetisierten Peptides (Kleinkauf H., von Döhren H. (1990) Eur. J. Biochem. 192: 1-15). Dies ist von entscheidender Bedeutung, da bei einem Austausch bzw. dem Einfügen oder Deletieren von PPS-Modulen auf genetischem Wege die Struktur des danach gebildete Produkt vorhersagbar ist.
Allen bekannten PPS-Modulen ist gemeinsam, daß sie sich aus mindestens drei funktionellen Domänen zusammensetzen (Abb. 1A). Diese drei Domänen sind (1) die Adenylierungs- Domäne, notwendig für die Erkennung und Adenylierung der Substrataminosäure, und (2) die ACP-Domäne, notwendig für die kovalente Bindung der adenylierten Aminosäure in Form eines Thioesters und (3) die Kondensationsdomäne, notwendig zur Kondensation aller an der PPS gebundenen Aminosäuren zum synthetisierten Peptid (Stachelhaus et al. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 125: 3-14). Die Adenylierungs-Domäne und ACP-Domäne werden zusammen auch als Aktivierungsdomäne bezeichnet (Abb. 1A), da sie zusammen die Erkennung und kovalente Bindung der Substrataminosäure in Form eines reaktiven Thioesters ermöglichen. Eine besondere Gruppe bilden jene Aktivierungsdomänen, die ihre Substrataminosäuren nach der kovalenten Bindung auch N-methylieren können. Bei PPS mit solchen Aktivierungsdomänen enthält folglich das bei der nachfolgenden Kondensation entstehende Peptid auch N-methylierte Aminosäuren. Die Zahl der zur Zeit bekannten bzw. klonierten Gene kodierend für Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Aktivität (11 Domänen) ist jedoch deutlich geringer als die Zahl der Aktivierungsdomänen ohne N-Methyltransferase-Aktivität (über 80 Domänen). Zudem zeigen viele der Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Aktivität eine vergleichbare Substrataktivität, wie z. B. für die Aminosäure Valin in den Modulen der Actinomycin Synthetase II aus Streptomyces chrysomallus (Schauwecker et al. (1998) J. Bacteriol.
180: 2468-2474), der Cyclosporin Synthetase aus Tolypocladium niveum (Weber et al. (1994) Cur. Genet. 26: 120-125) und der Enniatin Synthetase aus Fusarium scirpi (Haese et al. (1993) Mol. Microbiol. 7: 905-914).
Die hier beschriebene Erfindung ist deshalb von Bedeutung, da sie auch die Umwandlung von Aktivierungsdomänen ohne N-Methyltransferase-Aktivität in Aktivierungsdomänen mit N- Methyltransferase-Aktivität beschreibt, wobei die ursprüngliche Aminosäure-Substratspezifität erhalten bleibt. Für jede Spezifität eines vorhandenen PPS-Moduls kann somit ein entsprechendes Modul-Derivat mit zusätzlicher N-Methyltransferase-Aktivität bereitgestellt werden. Diese Derivate können dann dazu genutzt werden, neue oder modifizierte PPS zu konstruieren, wodurch das von der PPS synthetisierte Peptid an den gewünschten Peptidbindungen N-methyliert ist. Dies ermöglicht die Synthese neuer Peptide mit möglichen, neuen pharmakologischen Eigenschaften. Viele der bereits bekannten pharmakologisch aktiven Peptide und Peptid-Derivate, wie beispielsweise das Cyclosporin, enthalten N-methylierte Aminosäuren. Die durch die Erfindung erreichbare, selektive N-Methylierung einzelner Stickstoffatome in den Peptidbindungen von Polypeptiden, ist durch chemische Methoden kaum oder nicht möglich.
Die Erfindung basiert darauf, daß alle Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Aktivität eine zusätzliche Domäne besitzen, welche zwischen der Adenylierungs-Domäne und ACP- Domäne lokalisiert ist (Abb. 1B). Diese zusätzliche Domäne wird im Weiteren als N- Methyltransferase-Domäne bezeichnet und vermittelt die N-Methylierung der gebundenen Substrataminosäure. Die Erfindung beinhaltet Verfahren zur Umwandlung von Aktivierungsdomänen ohne N-Methyltransferase-Aktivität in Aktivierungsdomänen mit N- Methyltransferase-Aktivität und deren Nutzung zur Neukonstruktion von PPS für die Synthese von N-methylierten Aminosäuren und Peptiden. Aktivierungsdomänen ohne N- Methyltransferase-Aktivität einer PPS können prinzipiell durch zwei Wege in Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Aktivität überführt werden:
  • 1. Ein ganzes Modul oder die ganze Aktivierungsdomäne einer PPS wird ausgetauscht. Dieses Verfahren ist in Beispiel 2 beschrieben.
  • 2. Eine N-Methyltransferase-Domäne wird als funktionelle Einheit in eine Aktivierungsdomäne inseriert. Die N-Methyltransferase-Domäne kann beispielsweise direkt zwischen die Adenylierungs-Domäne und ACP-Domäne der umzuwandelnden Aktivierungsdomäne inseriert werden (Abb. 2 A). Zur Insertion können auch zwei dicht benachbarte Fusionsstellen genutzt werden. Hierbei wird der zwischen den Fusionsstellen liegende Bereich in der umzuwandelnden Aktivierungsdomäne deletiert und durch entsprechende Bereiche ersetzt, die zusammen mit der N-Methyltransferase-Domäne inseriert werden (Abb. 2 B). Dieses Verfahren ist in Beispiel 3 beschrieben. Bei der Verwendung von zwei Fusionsstellen kann die N-Methyltransferase-Domäne auch als Block mit einer nachfolgenden ACP-Domäne (oder Teilen davon) hinter die Aktivierungsdomäne inseriert werden, wodurch es zu einem Austausch der ursprünglichen ACP-Domäne durch die inserierte ACP-Domäne (bzw. Teilen davon) kommt (Abb. 2C und 2D). Bei allen Insertionen bleibt die Substratspezifität der umgewandelten Aktivierungsdomäne aber erhalten, da die Adenylierungs- Domäne (Erkennung und Adenylierung der Substrataminosäure) nicht verändert wird.
Geeignete Insertionsstellen für die Insertion der N-Methyltransferase-Domäne in eine Aktivierungsdomäne werden durch den Übergang zwischen Adenylierungs-Domäne und ACP- Domäne festgelegt. Diese ergeben sich aus dem Sequenzvergleich zwischen Aktivierungsdomänen mit N-Methyltransferase-Domäne und Aktivierungsdomänen ohne N- Methyltransferase-Domäne (Abb. 3). Die N-Methyltransferase-Domänen liegen als Einschub etwa 45 Aminosäuren hinter (C-terminal) der als "core motif 5" bekannten Konsensussequenz QVKIRG (F/H/Y) RIE (L/I) GEIE (Turgay et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 529-546) der Adenylierungs-Domäne und unmittelbar N-terminal zur Konsensussequenz (Q/E/D)(I/V)REx(V/L)xxxLPXYM(V/I)P.
Alle beschriebenen Methoden zur Umwandlungen einer Aktivierungsdomäne ohne N- Methyltransferase-Aktivität in eine Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität oder deren Verwendung zur Konstruktion neuer PPS beinhalten eine gezielte Veränderung und Kombination der entsprechenden DNA-Abschnitte von Peptidsynthetase Genen. Hierzu wird der DNA-Abschnitt, welcher für die N-Methyltransferase-Domäne einer beliebigen Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität kodiert, in das DNA-Segment, welches für die umzuwandelnde Aktivierungsdomäne kodiert, eingefügt. Dies muß in einer Weise geschehen, daß sich nach der Insertion ein gemeinsamer Leserahmen bildet und die kodierte N- Methyltransferase-Domäne integraler Bestandteil der kodierten Aktivierungsdomäne wird. Hierfür kann beispielsweise das DNA-Fragment aus einem Gen einer PPS, welches komplett oder teilweise für die umzuwandelnde Aktivierungsdomäne kodiert, in Plasmiden kloniert werden. Zur Klonierung und Modifikation von DNA können alle gängigen Methoden der Molekularbiologie verwendet werden, wie beispielsweise die Polymerase Kettenreaktion (PCR). Die Klonierungen und DNA-Manipulationen können in allen für diese Zwecke geeigneten Plasmiden und Organismen, wie beispielsweise pUC-Plasmiden und E. coli, erfolgen. Bei der Klonierung und Modifikation der DNA können bereits vorhandene oder beispielsweise durch PCR erzeugte Restriktionsschnittstellen genutzt werden. Solche Verfahren sind in Beispiel 1 beschrieben und beinhalten die Einführung einer Restriktionsschnittstelle in die DNA des Gens der Actinomycin Synthetase II, welche dann zum nachfolgenden Modulaustausch genutzt wird.
Durch die Insertion eines für die N-Methyltransferase-Domäne kodierenden DNA-Segments in das Gensegment einer PPS können neue PPS konstruiert werden. Die Expression eines neuen PPS-Gens kann in Plasmiden erfolgen und zur Synthese neuer Produkte führen. Dies ist in Beispiel 4 beschrieben und beinhaltet die Expression eines rekombinanten PPS-Gens nach der Transformation eines entsprechenden Plasmids in Streptomyces lividans und den Nachweis der katalytischen Aktivität der von dem PPS-Gen kodierten PPS. Auch können DNA-Segmente dazu genutzt werden, PPS-Gene in das Genom von Organismen einzuführen oder bereits im Genom vorhandene PPS-Gene zu verändern, wie beispielsweise gezeigt beim Gen der Surfactin Synthetase in Bacillus subtilis (Stachelhaus et al. (1995) Science 269 (5220): 69-72). Entsprechend können daher auch Module mit N-Methyltransferase-Aktivität in genomische PPS- Gene eingebracht werden und zur Bildung neuer, N-methylierter Peptide führen.
Beispiele
Im Folgenden wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben.
Die bei der Durchführung der Beispiele verwendeten Plasmide (pSP72, pBlueScript, pIJ702, pSPIJ004 und pACMS) sind in Abb. 4 schematisch gezeigt und in Tabelle 1 näher erläutert.
Die DNA-Sequenzen der bei der PCR verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die in den Beispielen angegebenen Größen der PCR-Fragmente beziehen sich auf PCR- Fragmente, deren Enden mit den in den Beispielen genannten Restriktionsenzymen geschnitten wurden. Zusätzliche Restriktionsschnittstellen in den Oligonukleotiden wurden genutzt, um die PCR-Fragmente vor den in den Beispielen geschilderten Klonierungen zuerst in E. coli- Standardplasmiden zu klonieren.
Die DNA-Seguenz des Gens der Actinomycin Synthetase II (acmB) ist in der Datenbank "GenBank" unter dem Eintrag AF047717 abgelegt. Die DNA-Sequenz eines 3849 bp BamHI- Fragments aus dem Gen der Actinomycin Synthetase III (acmC) ist den Beispielen nachfolgend beigefügt.
Beispiel 1 Einführen einer Restriktionsschnittstelle in das Gen der Actinomycin Synthetase II, um einen Austausch einer Aktivierungsdomäne zu ermöglichen
Die Actinomycin Synthetase II (ACMS II) aus Streptomyces chrysomallus besitzt zwei Module ohne N-Methyltransferase-Domäne, von denen Modul 1 die Aminosäure Threonin und Modul 2 die Aminosäure Valin aktiviert. Um die Aktivierungsdomäne von Modul 2 austauschen zu können, wurde durch Mutagenese eine EcoRV Schnittstelle in das Gen der ACMS II (acmB) eingeführt. Diese EcoRV Schnittstelle und eine bereits im Gen vorhandene ClaI-Schnittstelle ermöglichen es, den für die Aktivierungsdomäne von Modul 2 kodierenden Bereich durch beliebige ClaI- EcoRV-Fragmente auszutauschen. Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte, welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden.
1. Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie
Zur Erzeugung einer EcoRV-Restriktionschnittstelle in das Gen der ACMS II (acmB) wurde das Plasmid pACMS genutzt (Abb. 4; Schauwecker et al. (1998) J. Bacteriol., 180: 2468-2474). Das Pasmid pACMS (Abb. 4) trägt das acmB-Gen hinter einem konstitutiven Streptomyceten Promotor (mel P) und ist ein Derivat des Streptomyceten-Plasmids pIJ702. Durch PCR-Mutagenese und entsprechende Klonierungen wurde eine EcoRV-Schnittstelle in das acmB-Gen hinter den für die Phosphopantethein-Bindungsstelle kodierenden Bereich (in Modul 2) an Basenpaar (bp) Position (Pos.) 6251 eingeführt:
2. Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte
Zuerst wurde ein 4923 bp PstI-ClaI-Fragment, welches den mel-Promotor und den größten Teil des 5'-gelegenen Bereichs der acmB umfaßt (bis zur ClaI-Schnittstelle an bp Pos. 4519 in acmB) aus pACMS isoliert und in das E. coli Plasmid pSP72 kloniert (A in Abb. 5). Danach wurde ein Teil des direkt anschließenden 3'-Bereiches der acmB (beginnend mit der ClaI-Schnittstelle an bp 4519) mit den Oligonukleotiden prim-A und prim-B durch PCR amplifiziert (PCR-Fragment 1 in Abb. 5) und als 1737 bp ClaI-EcoRV-Fragment eingefügt (B in Abb. 5). Die durch prim-B eingeführte EcoRV-Schnittstelle entspricht bp Pos. 6251 in acmB. Die zusammengesetzten Fragmente wurden dann als komplettes PstI EcoRV Fragment isoliert und in pBlueScript umkloniert (C in Abb. 5). Hieraus kann dann der zusammengesetzte 5'-Bereich der acmB zur späteren Klonierung als BamHI-EcoRV-Fragment isoliert werden. Der noch fehlende 3'- Bereich der acmB wurde mit den Oligonukleotiden prim-C und prim-D amplifiziert (PCR-Fragment 2 in Abb. 5) und als 2583 bp EcoRV-BamHI-Fragment in pSP72 kloniert (D in Abb. 5). Das erhaltene Plasmid wurde mit BglII und EcoRV geschnitten und der 5'-Bereich der acmB (isoliert als BamHI-EcoRV-Fragment wie oben beschrieben) eingesetzt. Dies ergibt Plasmid pACM00-A (Abb. 5), welches das vollständig zusammengesetzte acmB Gen mit der an bp Pos. 6251 eingeführten EcoRV Schnittstelle trägt.
Beispiel 2 Austausch einer vollständigen Aktivierungsdomäne ohne N-Methyltransferase-Aktivität durch eine Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität in einer PPS
Der Austausch einer vollständigen Aktivierungsdomäne wurde in der Actinomycin Synthetase II (ACMS II) aus Streptomyces chrysomallus vorgenommen. Die Aktivierungsdomäne von Modul 2 wurde durch eine Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität ausgetauscht. Die zum Austausch verwendete Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität stammt aus der Actinomycin Synthetase III (ACMS III) und ist ebenfalls spezifisch für Valin. Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte, welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden.
1. Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie
Der Bereich zwischen einer in acmB liegenden ClaI Schnittstelle an bp Pos. 4519 und einer an bp Pos. 6251 eingeführten EcoRV Schnittstelle (in Plasmid pACM00-A aus Beispiel 1), welcher für die zweite Aktivierungsdomäne der ACMS II kodiert, wurde deletiert und durch ein mit PCR generiertes 2961 bp ClaI EcoRV Fragment ersetzt, welches für eine Aktivierungsdomäne mit N- Methyltransferase-Aktivität der ACMS III mit Spezifität für Valin kodiert. Die Bereiche an den Fusionsstellen (ClaI und EcoRV) kodieren für in beiden PPS konservierte Regionen, welche N­ terminal und C-terminal zu den Aktivierungsdomänen lokalisiert sind. Nach der Insertion des PCR-generierten ClaI-EcoRV-Fragments in das modifizierte acmB Gen entsteht wieder ein durchgehender Leserahmen, welcher für eine rekombinante ACMS II kodiert:
Das Gen der rekombinanten ACMS II (in Plasmid pACM00-B, Abb. 7) wurde in Streptomyces lividans transformiert und die enzymatische Aktivität der eingeführten Aktivierungsdomäne nach der Expression des PPS-Gens wie in Beispiel 4 beschrieben nachgewiesen.
2. Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte
Von einem 3849 bp BamHI-Fragment aus dem Gen der ACMS III (acmC, die Sequenz ist beigefügt), welches für eine Valin-Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Domäne kodiert, wurde mit den Oligonukleotiden prim-E und prim-F durch PCR ein 2967 bp ClaI-EcoRV-Fragment amplifiziert (PCR-Fragment 4 in Abb. 6). Dieses ClaI-EcoRV Fragment wurde in das Plasmid pACM00-A (aus Beispiel 1) kloniert und hierdurch das ursprünglich in pACM00-A vorhandene ClaI-EcoRV Fragment ausgetauscht. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI und HindIII geschnitten und der Streptomyceten-Anteil aus Plasmid pSPIJ004 (Abb. 4) als 5130 bp BgIII-HindIII-Fragment eingesetzt. Hierdurch entsteht das Plasmid pACM00-B (Abb. 7), welches sowohl in E. coli als auch in Streptomyceten transformiert und selektioniert werden kann.
Beispiel 3 Umwandlung einer Aktivierungsdomäne ohne N-Methyltransferase-Aktivität in eine Aktivierungsdomäne mit N-Methyltransferase-Aktivität und Einbringen dieser umgewandelten Aktivierungsdomäne in eine PPS
In die Valin-Aktivierungsdomäne aus Modul 2 der ACMS II wurde zwischen die Adenylierungs- Domäne und die ACP-Domäne eine zusätzliche N-Methyltransferase-Domäne inseriert. Hierdurch wird die Aktivierungsdomäne der ACMS II mit einer zusätzlichen N-Methyltransferase- Aktivität versehen. Die eingesetzte N-Methyltransferase-Domäne stammt aus Modul 3 der ACMS III. Der Austausch beinhaltet zahlreiche Klonierungsschritte, welche zunächst formal und nachfolgend detailliert beschrieben werden.
1. Formale Zusammenfassung der Klonierungsstrategie
Zur geplanten Insertion der N-Methyltransferase-Domäne wurden zuerst zwei Snaßl- Schnittstellen im Gen der acmB an bp Pos. 5899 und bp Pos. 5932 durch PCR-Mutagenese eingeführt. Anschließend wurde der zwischen den beiden SnaBI-Schnittstellen liegende Bereich von 33 bp deletiert und durch ein 1263 bp EcoRV-EcoRV Fragment, welches für die oben genannte N-Methyltransferasedomäne der ACMS III kodiert, ersetzt. Die Ligation der SnaBI- Enden mit den EcoRV-Enden führt zur Bildung einer mit diesen beiden Restriktionsenzymen nicht mehr spaltbaren DNA-Sequenz an den Fusionsstellen. Nach der Insertion des PCR-generierten EcoRV-EcoRV-Fragments entsteht bei einer der beiden möglichen Orientierungen wieder ein durchgehender Leserahmen, welcher für eine rekombinante ACMS II kodiert:
Das Gen der rekombinanten ACMS II (in Plasmid pACM00-C, Abb. 7) wurde in Streptomyces lividans transformiert und die neu eingeführte N-Methyltransferase-Aktivität der rekombinanten PPS wie in Beispiel 4 beschrieben nachgewiesen.
2. Detaillierte Beschreibung der einzelnen Klonierungsschritte
Zur Einführung der SnaBI-Schnittstellen wurden der Bereich des acmB-Gens von bp Pos. 4591 bis 5899 mit den Oligonukleotiden prim-G und prim-H (PCR-Fragment 1 in Abb. 6) sowie der Bereich von bp Pos. 5932 bis 6251 mit den Oligonukleotiden prim-I und prim-J (PCR- Fragment 2 in Abb. 6) durch PCR amplifiziert. Danach wurde zuerst das PCR-Fragment 2 als 330 bp HindIII-EcoRV Fragment in pBlueScript kloniert und dann das PCR-Fragment 1 als 1386 bp ClaI-SnaBI Fragment eingesetzt. Hierdurch entsteht ein DNA-Fragment, welches für die fast vollständige Aktivierungsdomäne von Modul 2 der ACMS II kodiert und in welches eine SnaBI-Schnittstelle eingeführt wurde (A in Abb. 6). In diese SnaBI-Schnittstelle wurde anschließend ein 1263 bp EcoRV-EcoRV-Fragment eingesetzt, welches von einem 3849 BamHl- Fragment aus dem Gen der ACMS III (acmC, die Sequenz ist beigefügt) durch PCR mit den Oligonukleotiden prim-K und prim-L amplifiziert wurde (PCR-Fragment 3 in Abb. 6). Die Orientierung des inserierten EcoRV-EcoRV-Fragments, welches für die N-Methyltransferase- Domäne der ACMS III kodiert, wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Durch die Fusion der EcoRV-Enden mit den SnaBI-Enden konnte die zusammengesetzte Aktivierungsdomäne dann komplett als 2961 bp ClaI-EcoRV-Fragment isoliert werden und wurde in das Plasmid pACM00-A (aus Beispiel 1) kloniert und hierdurch das ursprünglich in pACM00-A vorhandene ClaI-EcoRV- Fragment ausgetauscht. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI und HindIII geschnitten und der Streptomyceten-Anteil aus Plasmid pSPIJ004 (Abb. 4) als 5130 bp BglII-HindIII- Fragment eingesetzt. Hierdurch entsteht das Plasmid pACM00-C (Abb. 7), welches sowohl in E. coli als auch in Streptomyceten transformiert und selektioniert werden kann.
Beispiel 4 Expression rekombinanter PPS mit eingeführter N-Methyltransferase-Domäne und in vitro Testung ihrer N-Methyltransferase-Aktivität
Zur Expression der in den Beispielen 2 und 3 konstruierten PPS-Gene wurden die dort beschriebenen Plasmide pACM00-B und pACM00-C (Abb. 7) in Streptomyces lividans (Stamm TK64) transformiert. Die Transformation sowie die mikrobielle Kultivierung von Streptomyceten erfolgte nach Standardprotokollen (Hopwood et al. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, England). Die Reinigung der plasmidkodierten PPS aus den Transformanten erfolgte jeweils aus 1 Liter YEME Kulturmedium nach dem Erreichen der stationären Wachstumsphase (3 Tage Wachstum). Die Reinigung der PPS auf einen für die Analyse notwendigen Reinheitsgrad beruht im wesentlichen auf einem bereits detailliert beschrieben Protokoll (Schauwecker et al. (1998) J. Bacteriol. 180: 2468-2474) und wird deshalb im Folgenden nur schematisch erläutert: Zur Freisetzung von Proteinen wurden die Zellen mechanisch aufgebrochen (French-Press). Die ebenfalls freigesetzte genomische DNA wurde durch eine Inkubation mit DNAse I gespalten um eine dünnflüssige Suspension zu erhalten. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und Proteine anschließend durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 55% gefällt. Die gefällten Proteine wurden durch eine Ausschlußchromatographie (Säulenmatrix: Ultrogel-AcA-34 von Biosepra) nach Größe aufgetrennt. Proteinfraktionen mit Proteinen einer Größe von mehr als 200 kDa wurden vereinigt und weiter über einen Anionenaustauscher (Säulenmatrix: Q-Sepharose FF von Pharmacia) aufgereinigt. Die an den Anionenaustauscher gebundenen Proteine wurden durch kontinuierliche Zugabe von NaCl vom Anionenaustauscher freigesetzt. Die in den Beispielen 2 und 3 konstruierten PPS eluierten in einem Bereich zwischen 150 bis 250 mM NaCl. Die nach diesem Protokoll partiell gereinigten PPS können dann beispielsweise nach folgenden Vorschriften weiter analysiert werden:
Beispielvorschrift zum in vitro Nachweis der spezifischen Erkennung und Bindung von Aminosäuren an eine PPS
100 µl angereinigte PPS werden mit mit 3 µl 14C-markierter Substrataminosäure (100 µCi/ml), 2 µl MgCl2 (1 M) und 15 µl ATP (0,1 M) gemischt und für 30 min bei 30°C inkubiert. Die PPS wird durch Zugabe von 2 ml 7% Trichloressigsäure (TCA) gefällt, mit 10 ml 5% TCA gewaschen und die am Enzym gebundene Menge der Substrataminosäure durch Messen der Radioaktivität bestimmt.
Beispielvorschrift zum in vitro Nachweis der durch eine PPS katalysierte N-Methylierung von Aminosäuren
Zum Nachweis der N-Methylierungs-Aktivität wird die PPS wie oben beschrieben mit 14C­ markierter Substrataminosäure inkubiert, dem Ansatz aber noch zusätzlich 3 µl 0,1 M S- Adenosyl-Methionin (SAM) als Donor für die auf die Aminosäure übertragene Methylgruppe zugesetzt. Nach der TCA-Fällung wird die PPS mit 4 ml 5% TCA (zwei Portionen) und danach mit 2 ml Ethanol gewaschen und bei 37°C getrocknet. Durch Zugabe von 300 µl Perameisensäure und einer Inkubation für 6 Stunden bei 20°C wird die als Thioester gebundene Substrataminosäure freigesetzt. Der Ansatz wird anschließend im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Die Aminosäure wird durch Zugabe von 40 µl Ameisensäure gelöst und die Umwandlung in die N-methylierte Form beispielsweise durch chromatographische Methoden nachgewiesen. Für die Umwandlung von Valin in N-Methyl-Valin kann beispielsweise folgendermaßen verfahren werden: 20 µl von der PPS freigesetzten (14C-markierte) Aminosäure wird parallel mit 5 µl der entsprechenden Referenzen (0,1 M Valin und 0,5 M N-Methyl-Valin) auf einer Kieselgel 60 DC-Folie (Merck) mit dem Laufmittel n-Butanol : Essigsäure : H2O (Volumen 80 : 20 : 20) chromatographiert. Die Aminosäuren werden durch eine Ninhydrinreaktion, und einem Autoradiogramm für die "C-markierte Substrataminosäure, sichtbar gemacht.
Beispielvorschrift zum in vitro Nachweis der durch eine PPS katalysierten Bildung von Peptiden
Grundsätzlich kann ein Peptid durch saure Hydrolyse und anschließendem Nachweis der einzelnen Aminosäurekomponenten auf einfachem Wege analysiert werden. Dies trifft besonders auf Peptide zu, welche durch PPS gebildet werden, da die Aminosäuresequenz des synthetisierten Peptids durch die Anordnung der Module bereits bekannt ist. Durch den Einsatz von 14C-markierten Aminosäuren kann die Analyse des in vitro gebildeten Peptids beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: 100 µl angereinigte PPS wird mit allen Substrataminosäuren der PPS (jeweils 2 mM), SAM (2 mM), ATP (10 mM) und MgCl2 (20 mM) in einem Gesamtvolumen von 150 µl für 25 min bei 30°C inkubiert. Gegebenenfalls können der Inkubation auch weitere Enzyme, welche mit der zu testenden PPS zusammenarbeiten, zugesetzt werden (Pfennig et al. (1999) JBC 274: 12508-12515). Es werden mehrere Inkubationen parallel angesetzt, wobei sich die Zahl der Ansätze nach der Anzahl der Module in der PPS richtet und in jedem Ansatz die dem Modul entsprechende Aminosäure 14C-markiert eingesetzt wird. Aus jedem Ansatz wird die PPS wie oben beschrieben mit TCA gefällt, das Syntheseprodukt mit Performsäure abgespalten und das gebildete Peptid nach dem Einengen in Ethanol:Wasser (Volumen 1 : 1) gelöst und durch chromatographische Methoden nachgewiesen. Zum Nachweis der Threonyl-N-methyl-Valin Peptidverknüpfung durch die in Beispiel 2 und 3 konstruierte PPS kann beispielsweise folgendermaßen verfahren werden: 20 µl des von der PPS freigesetzten Peptids aus jedem Ansatz (ein Ansatz mit 14C-markiertem Threonin und ein Ansatz mit 14C-markiertem Valin) werden auf einer Kieselgel 60 DC-Folie (Merk) mit dem Laufmittel n-Butanol : Eisessig : H2O (Volumen 80 : 20 : 20) chromatographiert. Die bei beiden Ansätzen entstehenden Produkte mit identischem Rf-Wert werden durch Extraktion mit Ethanol : Wasser (Volumen 1 : 1) isoliert, im Vakuum eingeengt und die Aminosäuren durch saure Hydrolyse (6 N HCl, 110°C, 20 h) aus den Peptiden freigesetzt. Die Identifikation der freigesetzten 14C-markierten Aminosäuren erfolgt durch erneute Chromatographie auf DC-60 Platten mit dem gleichen Laufmittel, Hierdurch können die Komponenten Threonin und N-Methyl-Valin im gebildeten Peptid nachgewiesen werden. Besteht ferner die Möglichkeit, ein Referenz-Peptid auf chemischen Weg zu synthetisieren, kann dieses direkt mit dem enzymatisch gebildeten und 14C-markierten Peptid verglichen werden, beispielswseise durch HPLC mit einer zur Trennung von Peptiden geeigneten Säule wie der SuperPac Pep-5-Säule von Pharmacia.
Tabelle 1
Verwendete Ausgangsplasmide zur Durchführung der Beispiele
Tabelle 2
Bei den Beispielen verwendete PCR-Oligonukleotide
Nukleotidsequenz des bei der Durchführung der Beispiele verwendeten BamHI-Fragments aus dem acmC-Gen

Claims (10)

1. Verfahren zur Einführung von N-Methyltransferase-Domänen in PPS-Aktivierungsdomänen durch Veränderung von DNA-Sequenzen, welche für diese Domänen kodieren.
2. Verfahren zur Kombination von Genen oder Genabschnitten kodierend für PPS-Module ohne N-Methyltransferase-Domäne mit Genen oder Genabschnitten kodierend für Module mit N- Methyltransferase-Domäne.
3. Verfahren aus Anspruch 1 wobei die Veränderung durch Insertion einer DNA-Sequenz, welche für eine N-Methyltransferase-Domäne kodiert, in eine DNA-Sequenz, welche für eine PPS- Aktivierungsdomäne kodiert, erfolgt.
4. Verfahren aus Anspruch 1-3 wobei das für die N-Methyltransferase-Domäne kodierende DNA- Fragment zusammen mit DNA-Linker-Sequenzen inseriert wird.
5. Verfahren aus Anspruch 1-4 wobei bei der Insertion der DNA-Sequenz, welche für eine N- Methyltransferase-Domäne kodiert, gleichzeitig auch DNA-Sequenzen verändert werden, welche für die ACP-Domäne oder Aktivierungs-Domäne kodieren.
6. Verwendung der nach Anspruch 1-5 hergestellten DNA-Sequenzen für die Veränderung natürlicher PPS-Gene, bereits veränderter PPS-Gene oder Teilen davon, sowie die Verwendung zur Neukonstruktion von PPS-Genen oder Teilen davon.
7. Verwendung der nach Anspruch 1-6 hergestellten DNA-Sequenzen für die Veränderung natürlicher Gene von Polyketidsynthetasen (PKS), bereits veränderter PKS-Gene oder Teilen davon, sowie die Verwendung zur Neukonstruktion von PKS-Genen oder Teilen davon.
8. Verwendung der nach Anspruch 1-7 hergestellten DNA-Sequenzen für die Konstruktion von Plasmiden und genetisch veränderten Organismen zur Synthese der durch die DNA-Sequenzen kodierten Proteine.
9. Verwendung der nach Anspruch 8 hergestellten Proteine zur enzymatischen in vivo und in vitro Synthese von Aminosäuren, Polypeptiden, Peptidyl-Acetyl-Mischstrukturen welche N-methylierte Aminosäuren oder deren Derivate enthalten.
10. Verwendung der nach Anspruch 8 hergestellten Proteine zur fermentativen Synthese von Aminosäuren, Polypeptiden, Peptidyl-Acetyl-Mischstrukturen welche N-methylierte Aminosäuren oder deren Derivate enthalten, wobei die Fermentation sowohl mit als auch ohne Zufütterung von Aminosäuren, Acetaten oder anderen organischen Zwischenprodukten erfolgen kann.
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