DE19919121A1

DE19919121A1 - Multimeres CMV-Antigen

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Publication number: DE19919121A1
Application number: DE1999119121
Authority: DE
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2000-11-09
Anticipated expiration: 2019-04-28
Also published as: DE19919121B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein zum analytischen Nachweis des humanen Cytomegalovirus (CMV) geeignetes Antigen sowie Nachweisverfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein zum analytischen Nachweis von Antikörpern gegen humanen Cytomegalovirus (CMV) geeignetes Antigen sowie Nachweisverfahren.

Das Cytomegalovirus (CMV) gehört zur Unterfamilie β-Herpesviridae der Herpesviren. Die lineare doppelsträngige DNA hat eine Länge von ca. 230 kbp. Das CMV ist der Erreger der Cytomegalie, einer generalisierten Infektionskrankheit von Kindern. Kongenitale CMV-Infektionen können zu Mißbildungen und Entwicklungsstörungen insbesondere bei Kindern führen. Das Virus erzeugt gewöhnlich latente Infektionen. Eine Reaktivierung oder eine Erstinfektion kann z. B. bei Patienten erfolgen, die nach einer Organtransplantation unter immunsuppressiver Therapie stehen oder sich im Endstadium einer HIV-Infektion befinden. CMV-Infektionen können durch Blutkontakte oder andere Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin und Muttermilch übertragen werden.

Es besteht daher ein großes Bedürfnis, Verfahren zum zuverlässigen Nachweis von CMV bereitzustellen.

WO 96/01321 beschreibt die Verwendung rekombinanter CMV-Antigene, bei denen es sich um Fusionsproteine handelt, die Bereiche aus unterschiedlichen CMV-Polypeptiden wie etwa pp52 und pp150, pp65 oder pp38 enthalten. Diese Fusionsproteine werden vorzugsweise als Gemisch rekombinanter Antigene in einem Verfahren zur Bestimmung von CMV- Antikörpern eingesetzt.

WO 98/02746 offenbart rekombinante Polypeptide zum Nachweis von CMV- Antikörpern, die ein aus dem CMV-Protein pp150 (UL32) stammendes Peptid und ein oder mehrere Peptide ausgewählt aus den CMV-Proteinen pp52 (UL44), pp28 (UL99) oder gB (UL55) enthalten. Ein bevorzugtes pp52- Peptid enthält mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz zwischen Position 266 und 293. Auf Seite 12, ff, wird auf die Möglichkeit verwiesen, CMV-Antigene mittels rekombinanter DNA-Techniken auch in Form von Tandemsequenzen herzustellen. Es findet sich jedoch keinerlei Hinweis auf CMV-pp52-(UL44)-Antigene in multimerer Form.

Ein Nachteil bekannter CMV-IgM-Testformate besteht darin, daß die für ein zuverlässiges Nachweisverfahren notwendige Kombination von hoher Sensitivität (richtige Erkennung positiver Proben) und ausreichender Spezifität (keine irrtümliche Einstufung negativer Proben als positiv) nur schwer zu erreichen ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Verwendung eines CMV-Antigens, das mindestens zwei Einheiten eines mindestens 15 Aminosäuren langen Abschnitts zwischen Position 264 und 293 des CMV p52 (pp52; UL44)-Antigens enthält und eine Länge von maximal 60 Aminosäuren aufweist, die Bereitstellung eines Testverfahrens ermöglicht, welches sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Spezifität besitzt. Hingegen zeigt weder die Verwendung des Peptids in monomerer Form noch die Verwendung einer längeren Peptidsequenz (Aminosäuren 202 bis 293) des CMV p52-Antigens in multimerer Form zufriedenstellende Resultate.

Ein erster Aspekt der Erfindung ist somit ein CMV-Antigen umfassend mindestens zwei Einheiten von bis zu 60 Aminosäuren langen Peptidsequenzen aus dem CMV p52-Antigen, wobei jede der Peptidsequenzen einen mindestens 15 Aminosäuren langen Abschnitt zwischen Position 264 und 293 des CMV p52-Antigens enthält. Die Nummerierung bezieht sich auf die bei Chee et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154 (1990), 125) angegebene Sequenz des CMV p52-Antigens, die in SEQ ID NO 1 und 2 dargestellt ist. Das CMV-Antigen enthält vorzugsweise mindestens drei Einheiten von CMV-Peptidsequenzen und besonders bevorzugt 4 bis 8, insbesondere 4, 5 oder 6 Einheiten von CMV- Peptidsequenzen. Die CMV-Peptidsequenzen können jeweils gleich oder verschieden sein, wobei das Vorhandensein von gleichen Peptidsequenzen im allgemeinen bevorzugt ist.

Eine CMV-Peptideinheit des multimeren Antigens enthält 15 bis 60 aus dem CMV p52-Antigen stammende Aminosäurereste und ist vorzugsweise frei von weiteren Aminosäuresequenzen aus dem CMV p52-Antigen. Der N- Terminus der CMV-Peptideinheiten liegt vorzugsweise jeweils im Bereich zwischen Position 244 und 275, besonders bevorzugt im Bereich von Position 254 und 275 und am meisten bevorzugt im Bereich von Position 259 und 270 des CMV p52-Antigens. Der C-Terminus liegt vorzugsweise jeweils im Bereich zwischen Position 290 und 303 und besonders bevorzugt zwischen Position 290 und 298 des CMV p52-Antigens.

Eine Peptideinheit des CMV-Antigens weist eine Länge von 15 bis 40, insbesondere von 20 bis 35 Aminosäuren auf. Gute Ergebnisse wurden mit einem multimeren Antigen zusammengesetzt aus 30 Aminosäuren langen Peptideinheiten jeweils von Position 264 bis 293 des CMVp52-Antigens erhalten. Die Lokalisierung von immunologisch reaktiven Teilbereichen, die sich innerhalb des Bereichs zwischen Position 264 und 293 befinden, kann nach bekannten Methoden des Epitopmapping (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3998-4002; Wilcheck und Bayer, Annal. Biochem. 74 (1988), 1; Wienhues et al., Clin. Biochem. 26 (1993), 295 und DE-A-41 22 160) ermittelt werden.

Die Sequenz der Peptideinheiten des erfindungsgemäßen multimeren CMV- Antigens basiert vorzugsweise auf der Sequenz des CMV-Virusstammes AD 169 und Varianten davon, wie sie bei Chee et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154 (1990), 125-169; WO 96/01321 und Dargan et al., J. Virol. 71 (1997), 9833 ff) angegeben sind. Weiterhin kann die Aminosäuresequenz auch auf Basis der p52-Sequenzen anderer CMV-Isolate wie sie beispielsweise bei Martin et al. (Am. J. Pathol. 145 (1994) 440 bis 451) beschrieben sind, konstruiert werden. Vorzugsweise hat die Aminosäuresequenz der einzelnen CMV-Peptideinheiten jedoch mindestens 95% Identität zu der in SEQ ID NO. 1/2 angegebenen Sequenz des p52 Antigens aus dem CMV-Stamm AD169.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße CMV- Antigen ein genetisch kodiertes lineares Fusionspolypeptid, d. h. ein Fusionspolypeptid welches von einer rekombinanten Nukleinsäure kodiert ist und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden kann. In solchen rekombinanten Fusionspolypeptiden können einzelne CMV-Peptideinheiten gegebenenfalls durch heterologe Peptidsequenzen getrennt sein, die eine Länge von beispielsweise bis zu 10 Aminosäuren, insbesondere 2 bis 5 Aminosäuren aufweisen. Weiterhin können am N- oder/und am C-Terminus zusätzliche heterologe, d. h. CMV-fremde Peptidsequenzen vorhanden sein. Diese heterologen Sequenzen können als Spacer-Sequenzen (insbesondere zwischen den einzelnen Peptideinheiten), expressionsverstärkende Sequenzen (insbesondere am N-Terminus), Aufreinigungs-Hilfssequenzen, sog. Tag-Sequenzen, z. B. Poly-His-Sequenzen (insbesondere am N- oder/und C-Terminus), proteolytische Spaltsequenzen (am N- oder/und C-Terminus) oder/und Sequenzen zur Kopplung von Markierungsgruppen, z. B. Lys- oder Cys-Reste, dienen.

Beispiele solcher genetisch kodierten Fusionsproteine sind das dimere und das tetramere Fusionsprotein, die in Fig. 2 und 3 gezeigt sind. Am N- Terminus befindet sich eine die Expression in E.coli verbessernde Sequenz (Met-Asp-Ala) gefolgt von einer Enterokinase-Erkennungsstelle (Asp-Asp- Asp-Asp-Lys), einer hydrophilen Tag-Sequenz. Anschließend folgt eine Sequenz von insgesamt vier monomeren Peptideinheiten (Glu-Asn-Phe. . . Gly-Gly) die jeweils durch zwei Aminosäuren lange Spacer-Sequenzen (Arg- Ser) getrennt sind. Am C-Terminus befindet sich eine 8 Histidinreste umfassende His-Tag-Sequenz, die die Aufreinigung des Proteins durch Affinitätschromatographie über ein Metallchelat ermöglicht.

Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße CMV-Antigen jedoch auch ein durch chemische Peptidsynthese oder/und Kopplung an einen Träger hergestelltes multimeres Antigen sein, wie es z. B. in WO 96/03652 beschrieben ist. Ein bevorzugtes derartiges multimeres Antigen weist eine Struktur der allgemeinen Formel (I) auf:

T(-P)_n

wobei T einen Träger bedeutet, P eine Peptid- oder Polypeptidsequenz bedeutet, die mindestens eine CMV-Peptideinheit wie zuvor definiert enthält und kovalent an den Träger gekoppelt ist und n eine Zahl von ≧ 2 ist, wobei n keine ganze Zahl bedeuten muß, da die Belegung des Trägers mit Epitopen in einem Reaktionsansatz statistisch erfolgen kann.

Die an den Träger gekoppelten CMV-Antigensequenzen umfassen vorzugsweise synthetische Peptidsequenzen mit einer Länge von 15 bis 60 Aminosäuren, die gegebenenfalls neben dem eigentlichen Epitopbereich noch eine Spacerbereich mit einer Länge von vorzugsweise 1-10 Aminosäuren enthalten können. Die Peptidepitope können über den N- Terminus, den C-Terminus oder über reaktive Gruppen in der Seitenkette an den Träger gekoppelt werden. Eine Möglichkeit der Kopplung besteht darin, die Trägermoleküle durch Reaktion mit bekannten Linkersubstanzen an einer NH₂-Gruppe zu aktivieren und ein SH-aktiviertes Peptid-Derivat kovalent an den Träger zu koppeln. Beispiele für geeignete Träger sind Peptide, Polypeptide oder synthetische Träger wie etwa Dextrane, Goldpartikel oder synthetische Polymere. Beispiele für Polypeptide sind Albumine, unspezifische Immunglobuline, Immunglobulinfragmente, β-Galactosidase, Polylysin etc. Vorzugsweise wird der Träger derart gewählt, daß er keine störende Kreuzreaktivität mit CMV-Antikörpern oder anderen in humanen Proben vorkommenden Substanzen zeigt.

Weiterhin kann das CMV-Antigen eine Struktur der allgemeinen Formel (II) aufweisen:

P¹{P²[P³(P⁴)_t]_s}_r

wobei P¹, P², P³ und P⁴ Peptidsequenzen mit einer Länge bis zu 60 Aminosäuren bedeuten und mindestens zwei dieser Peptidsequenzen eine CMV-Peptideinheit wie zuvor definiert enthalten, r 1 oder 2 ist, s eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und t eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist, wobei das Antigen mindestens eine Verzweigungsstelle enthält.

Das Antigen der Formel (II) bildet eine baumartige Struktur mit maximal 7 Verzweigungsstellen, wenn P¹, P², P³ und P⁴ lineare Peptidsequenzen sind und enthält vorzugsweise 2 bis 8 immunologisch reaktive CMV- Epitopbereiche. Diese Epitopbereiche sind vorzugsweise nicht direkt, sondern über Spacerbereiche wie zuvor definiert miteinander verknüpft. Die Verzweigungen in der Struktur werden durch Verwendung trifunktioneller Linkermoleküle, insbesondere trifunktioneller Aminosäuren, z. B. Lysin oder Ornithin in die Struktur eingebaut.

Für die Anwendung in einem Testverfahren ist es oft zweckmäßig, ein CMV- Antigen zu verwenden, welches mindestens eine Markierungsgruppe oder/und mindestens eine Festphasenbindegruppe enthält. Bevorzugt sind nichtradioaktive Markierungsgruppen, die indirekt oder/und indirekt an das Antigen gekoppelt werden können. Bei einer direkten Markierung ist die ein nachweisbares Meßsignal erzeugende Gruppe direkt auf dem Antigen lokalisiert. Beispiele für solche direkt signalerzeugenden Gruppen sind Chromogene (fluoreszierende oder lumineszierende Gruppen, Farbstoffe), Enzyme, Elektrochemilumineszenzgruppen oder Metallpartikel, die auf bekannte Weise an das Antigen gekoppelt werden können. Eine andere Art der Markierung ist die indirekte Markierung, bei der das CMV-Antigen mit einer indirekt nachweisbaren Gruppe gekoppelt ist, mit einer Biotin- oder Haptengruppe, die durch Reaktion mit einem geeigneten Bindepartner (Streptavidin, Avidin bzw. Anti-Hapten-Antikörper), der wiederum eine signalerzeugende Gruppe trägt, nachweisbar ist. Beispiele für Festphasenbindegurppen sind Biotin oder Haptene, die mit einer Streptavidin- oder Anti-Hapten-Antikörper-beschichteten Festphasen oberfläche bindefähig sind.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein multimeres CMV-Antigen, wie zuvor definiert, kodiert. Die für einzelne CMV-Peptideinheiten kodierende Nukleotidsequenz kann aus CMV- Virusisolaten gewonnen werden, gegebenenfalls entsprechend der Kodonnutzung in der für die rekombinante Expression verwendeten Wirtszelle modifiziert und durch bekannte Techniken wie Amplifikation, Restriktionsspaltung oder/und Subklonierung in eine multimere Form überführt werden. Besonders bevorzugt ist eine hinsichtlich der Kodonnutzung in E.coli optimierte Nukleinsäuresequenz. Weiterhin betrifft die Erfindung einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure wie zuvor definiert in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz enthält. Beispiele für geeignete Vektoren sind bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor, Laboratory Press) angegeben. Neben der für das Antigen kodierenden Sequenz und der Expressionskontrollsequenz enthalten die rekombinanten Vektoren vorzugsweise ein Selektionsmarkergen und einen Replikationsursprung. Bevorzugte Vektoren sind Plasmide, insbesondere prokaryontische Plasmide.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine rekombinante Zelle, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Vorzugsweise ist die rekombinante Zelle eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine E.coli Zelle.

Die erfindungsgemäßen multimeren CMV-Antigene können als Nachweisreagenz in einem Verfahren zur Bestimmung von CMV-Antikörpern oder CMV-Antigenen in einer zu testenden Probe, insbesondere einer humanen Probe wie etwa einer Körperflüssigkeit, z. B. Serum, Plasma, Speichel etc. verwendet werden. Besonders bevorzugt eignen sich die multimeren CMV-Antigene in Verfahren zum Nachweis von CMV-IgM- Antikörpern, wie sie zur Früherkennung von CMV-Primärinfektionen, CMV- Sekundärinfektionen und einer Reaktivierung von CMV nach einer Latenzphase eingesetzt werden. Der Nachweis von CMV-Antigenen kann durch kompetitive Verfahren erfolgen, wobei die erfindungsgemäßen multimeren Antigene vorzugsweise in markierter Form eingesetzt werden.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum immunologischen Nachweis eines Analyten ausgewählt aus CMV- Antikörpern und CMV-Antigenen in einer Probe, wobei man die Probe mit einem Nachweisreagenz, das ein erfindungsgemäßes CMV-Antigen enthält, und gegebenenfalls weiteren Reagenzien in Kontakt bringt und das Vorhandensein oder/und die Menge des Analyten in der Probe bestimmt. Vorzugsweise verwendet man ein heterogenes Testverfahren und bestimmt den Analyten über Bindung an eine Festphase, z. B. an die Wände eines Reaktionsgefäßes oder einer Mikrotiterplatte, an einen Biochip oder an eine partikuläre Festphase. Besonders bevorzugt verwendet man partikuläre Festphasen wie etwa Kunststoffbeads oder magnetische Beads.

Für den Nachweis von CMV-IgM-Antikörper wird vorzugsweise ein Test nach dem µ-Capture-Prinzip verwendet, welcher folgende Schritte umfaßt:

a) Inkontaktbringen einer zu testenden Probe mit einer Festphase und einem IgM-spezifischen Reagenz, z. B. einem monoklonalen oder polyklonalen gegen humanes IgM gerichteten Antikörper, das (a) an der Festphase immobilisiert ist oder (b) an der Festphase immobilisiert werden kann, und Immobilisieren von IgM-Antikörpern aus der Probe an der Festphase,
b) Abtrennen von nichtgebundenen Probenbestandteilen, um störende Antikörper anderer Klassen, insbesondere IgG zu entfernen, oder/und Zugeben eines Entstörungsreagenz, welches gegen Antikörper einer von IgM verschiedenen Klasse gerichtet ist,
c) Zugeben eines für CMV-Antikörper spezifischen Nachweisreagenz enthaltend ein erfindungsgemäßes Antigen, das (a) eine Markierungsgruppe trägt oder (b) mit einer Markierungsgruppe bindefähig ist, und
d) Bestimmen des Vorhandenseins oder/und der Menge von CMV-IgM- Antikörpern in der Probe durch Bestimmung der an die Festphase gebundenen Markierungsgruppen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf das µ-Capture-Format beschränkt, sondern es können auch andere Testformate eingesetzt werden wie etwa der Doppelantigenbrückentest, bei dem ein festphasenseitiges und ein markiertes lösliches Antigen zur Bildung von immobilisierten Immunkomplexen mit den nachzuweisenden CMV-Antikörpern verwendet werden oder ein sog. indirekter Test, bei dem ein festphasenseitiges Antigen zur Immobilisierung von CMV-Antikörpern verwendet wird und anschließend ein Nachweis der gebundenen Antikörper durch Verwendung eines gegen die konstante Region des gebundenen Antikörpers gerichteten Reagenz durchgeführt wird. Ebenso können die erfindungsgemäßen multimeren Antigene auch in kompetitiven Verfahren zum Nachweis von CMV-Antigenen eingesetzt werden.

Bei dem bevorzugten µ-Capture-Testprinzip und auch bei anderen Testformaten wird oftmals ein Nachweisreagenz verwendet, das neben dem erfindungsgemäßen Antigen noch weitere CMV-Antigene enthält. Diese weiteren CMV-Antigene können beispielsweise aus angereicherten nativen CMV-Antigenen oder/und rekombinanten CMV-Antigenen, insbesondere Mischungen solcher rekombinanter CMV-Antigene ausgewählt werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Kombination des erfindungsgemäßen multimeren CMV-Antigens mit angereicherten nativen CMV-Antigenen.

Darüber hinaus kann während des Testverfahrens ein Entstörungsreagenz zugesetzt werden, um unerwünschte Wechselwirkungen von Komponenten des Nachweisreagenz mit Probenbestandteilen zu vermeiden. Insbesondere beim klassenspezifischen Nachweis von CMV-Antikörpern, z. B. CMV-IgM- Antikörpern, kann ein Entstörungsreagenz eingesetzt werden, welches gegen Antikörper einer von IgM verschiedenen Immunglobulinklasse, insbesondere gegen IgG gerichtet ist. Ein Beispiel für ein solches Entstörungsreagenz ist in WO 96/14337 beschrieben und besteht aus einer Antikörperzusammensetzung, die gegen die Fd-Region der schweren Kette einer spezifischen Immunglobulinklasse, z. B. gegen die Fd-Gamma-Region gerichtet ist. Ein weiteres Beispiel für ein Entstörungsreagenz ist der in WO 98/23955 beschriebene Zusatz von Bindepartnern der nachzuweisenden Antikörper in monomerer Form, die bevorzugt an IgG-Antikörper, nicht aber an IgM-Antikörper binden.

Schließlich betrifft die Erfindung auch noch einen Reagenzienkit zum Nachweis von CMV in einer Probe, welcher ein erfindungsgemäßes multimeres CMV-Antigen sowie gegebenenfalls andere Testkomponenten, z. B. eine Festphase, ein Anti-IgM-Reagenz sowie übliche Puffer und Verdünnungsmittel enthält.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert. Es zeigen:

Abb. 1: Die Nukleotidsequenz eines monomeren synthetischen CMV-Gens und die Aminosäuresequenz des korrespondierenden monomeren CMV-Antigens.

Abb. 2: Die Nukleotidsequenz eines dimeren synthetischen CMV-Gens und die Aminosäuresequenz des korrespondierenden dimeren CMV-Antigens.

Abb. 3: Die Nukleotidsequenz eines tetrameren synthetischen CMV-Gens und die Aminosäuresequenz des korrespondierenden tetrameren CMV-Antigens.

SEQ ID NO. 1/2: Die Nukleotidsequenz des CMV-p52-Antigens und die korrespondierende Aminosäuresequenz.

Beispiele 1. Konstruktion eines für ein monomeres CMV-Antigen kodierenden Plasmids

Die für die Aminosäuren 264 bis 293 des CMV-Antigens p52 (UL44) kodierende Nukleotidsequenz wurde in das von Qiagen bezogene Expressionsplasmid pQE 60 kloniert.

Diese Aminosäuresequenz wurde mit dem Programm Backtranslat von Genetic Computer Group Inc. unter Verwendung der für häufige E.coli Proteine spezifischen Codons revers transkribiert. Die DNA wurde am 5'- Ende mit einer für Met-Asp-Ala kodierenden Sequenz gefolgt von einer für eine Enterokinase-Erkennungsstelle (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), einer hydrophilen Tag-Sequenz, kodierenden Nukleotidsequenz verlängert. Am 3'- Ende der CMV-Sequenz wurde eine BgIII-Erkennungsstelle angefügt, die für die anschließende Multimerisierung der Nukleotidsequenz benötigt wird. Weiterhin wurde am 3'-Ende eine für ein Histidin-Tag mit 8 Histidinresten kodierende Nukleinsäuresequenz angefügt. Zusätzlich wurden die Codons für zwei Lysinreste in die Histidin-Tag-Sequenz eingefügt, um eine bessere chemische Derivatisierung des rekombinanten Proteins über die Aminoseitengruppen von Lysin zu ermöglichen. Die Nukleotidsequenz des rekombinanten Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz ist in Fig. 1 gezeigt. Alle Prozeduren erfolgten nach Vorschriften gemäß "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, sofern nicht anders angegeben.

Vier Oligonukleotide wurden chemisch synthetisiert wie folgt (die Nummerierung der Basenpaare bezieht sich auf die in Fig. 1 gezeigte Sequenz):

1. Oligonukleotid HE-1 forward: Base 1 bis 60 (oberer Strang)
2. Oligonukleotid HE-2 reverse: Base 100 bis 40 (unterer Strang)
3. Oligonukleotid HE-3 forward: Base 80 bis 140 (oberer Strang)
4. Oligonukleotid HE-4 reverse: Base 185 bis 121 (unterer Strang)

Die Synthese des monomeren Gens erfolgte durch PCR in zwei Schritten. Zunächst wurden zwei Teile mit den Oligonukleotiden 1 bis 2 oder 3 bis 4 synthetisiert. Hierzu wurden zwei Reaktionsansätze mit 5 µl 10 × Taq-PCR- Puffer (Pharmacia), 5 µl dNTP (jeweils 1 mM), Oligo HE-1 und HE-2 bzw. HE-3 und HE-4 (jeweils 0,1 nmol) und Wasser auf 45 µl angesetzt. Nach Zugabe von 50 µ1 Öl wurden Reaktionen in einem Perkin Eimer Cycler 9600 mit folgendem Programm durchgeführt:

a) Zyklus 1
98°C für 2 min
50°C für 7 min
72°C für 40 s
b) Zyklen 2 und 3
95°C für 40 s
50°C für 40 s
72°C für 40 s
c) Zyklen 4 bis 12
95°C für 40 s
65°C für 40 s
72°G für 40 s

Die Amplifikationsreaktion wurde 5 min nach Erreichen von 50°C im ersten Zyklus durch Zugabe von 5 µl Polymerasemix (5 U Taq-Polymerase (Pharmacia) und 2,5 U Pfu-Polymerase (Stratagene) in 5 µl 1 × Taq Puffer) gestartet. Die Synthese der PCR-Produkte wurde durch Analyse von 5 µl der Reaktion auf einem 2% Agarosegel nachgewiesen.

Zur Synthese des vollständigen monomeren Gens wurden vier identische Reaktionen angesetzt, die jeweils 5 µl 10 × PCR-Puffer, 5 µl 1 mM dNTP, 20 pmol oligo HE-1 und HE-4, 5 µl DNA (Produkt der Reaktionsstufe I gereinigt mit dem Qiagen PCR Reinigungskit) und Wasser auf 45 µl enthielten. Die Amplifikation wurde wie in Schritt 1 gestartet. Das Amplifikationsprogramm war wie für Reaktion 1 aber mit 12 anstelle von 9 Zyklen in, Schritt (c)

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Ncol und HindIII geschnitten und über Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde dann in dem mit Ncol und HindIII geschnittenen Expressionsvektor pQE60 (Qiagen) ligiert und in kompetente E.coli XL1- Bakterien (Stratagene) kloniert. Ein Klon wurde zur Expression und Sequenzierung ausgewählt. Dieser Klon, der die Aminosäuren 264 bis 293 des CMV-Antigens UL44 in monomerer Form enthielt und die erwartete Sequenz wie in Fig. 1 gezeigt aufwies, wurde pQE60-HEUL44/3 bezeichnet.

2. Konstruktion eines für ein dimeres CMV-Antigen kodierenden Plasmids

Ein rekombinantes Gen, welches zwei Einheiten der CMV-Peptidsequenzen enthält, wurde wie folgt kontruiert: Eine die monomere Sequenz enthaltende DNA Insertion aus dem Plasmid pQE60-HEUL44/3 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI (singuläre Restriktionsstelle 15 bp stromaufwärts der Ncol-Stelle) und BgIII herausgeschnitten. Das Fragment wurde durch Elektrophorese über ein Agarosegel gereinigt und dann in das mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI geschnittene und mit Phosphatase aus Garnelen behandelte Plasmid pQE60-HEUL44/3 ligiert. Der Ligationsansatz wurde in E.coli XL1 transformiert. Ein Klon mit einem Plasmid, das bei Restriktionsspaltung bei BamHI und BgIII ein DNA-Fragment mit der erwarteten Größe von 200 bp ergab, wurde pQE60-HEUL-D1 bezeichnet (Sequenz in Fig. 2 gezeigt).

3. Konstruktion eines für ein tetrameres Antigen kodierenden Plasmids

Aus dem in Beispiel 2 hergestellten Plasmid pQE60-HEUL-D1 wurde eine DNA-Insertion, die das dimerisierte Gen enthielt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BgIII herausgeschnitten. Nach Reingung über ein Agarosegel wurde das 205 bp lange DNA-Fragment in den mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI geschnittenen und mit Phosphatase aus Garnelen behandelten Vektor pQE60-HEUL-D1 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation kompetenter E.coli XL1 Bakterien verwendet. Ein Klon mit einem Plasmid, der bei Restriktionsschnitt mit BamHI und BgIII ein DNA-Fragment mit der erwarteten Größe von 385 pb ergab, wurde pQE60-HEULTetra 3 bezeichnet. Die Sequenz dieses Plasmids ist in Fig. 3 gezeigt.

Zur Expression wurde der E.coli Stamm XL2 (Stratagene) mit den Plasmiden pQE60-HEULTetra 3 und pREP4 (Kanamycin-resistentes Repressorplasmid bezogen von Qiagen) cotransformiert. Die Synthese des rekombinanten Proteins wurde bei einer optischen Dichte von 1,2 (600 nm) durch IPTG für 3 h bei 37°C in TB-Medium induziert. Es wurde in hoher Ausbeute ein Protein mit dem erwarteten Molekulargewicht von 8 kD (SDS- Polyacrylamidgelektrophorese) erhalten. Die Reinigung über eine Nickel- NTA-Säule ergab eine Ausbeute von 100 mg/l Kultur.

4. Nachweis von CMV-Antikörpern

Polystyrolbeads mit Durchmessern von 7 mm wurden mit einem monoklonalen Anti-IgM-Antikörper beschichtet. 10 µl Probe (CMV-IgM negative Seren und CMV-IgM positive Seren) wurden mit 250 µl Puffer (60 mM Citrat, 0,4% Tween, 0,4% Casein pH 7,7) und einem beschichteten Bead 15 min lang bei 37°C inkubiert und anschließend gewaschen. Dann wurden 10 µl monomeres oder tetrameres p52 Antigen- Peroxidase-Konjugat (ca. 100 mU_ABTS/ml) und 200 µl Puffer (50 mM Glycinamid, 50 mM KCl, Detergenz und Stabilisatoren pH 8,5) zugegeben und 1 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Waschen wurde die an das Polystyrolbead gebundene Peroxidaseaktivität mit dem Peroxidasesubstrat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und Messung der Extinktion bei 650 nm bestimmt.

Tabelle 1 zeigt einen Vergleich des Tests von CMV-IgM negativen Seren mit p52 Tetramer und p52 Monomer. Es ist zu erkennen, daß die Reaktivität mit p52 Tetramer in allen Fällen erheblich geringer als die Reaktivität mit p52 Monomer ist.

Tabelle 1

CMV IgM Negative Seren

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse mit CMV-IgM positiven Seren. Die Spalte S/M gibt das jeweilige Verhältnis der Extinktion einer positiven Serumprobe zu dem Mittelwert bei negativen Serumproben gemäß Tabelle 1 an. Es ist ersichtlich, daß das Verhältnis der Extinktion bei positiven Seren zur Extinktion bei negativen Seren im Falle des p52 Tetramer signifikant höher als beim p52 Monomer ist. Dies bedeutet eine höhere Testspezifität und Sensitivität.

Tabelle 2

CMV IgM positive Seren

Besonders gute Resultate werden bei Verwendung einer Kombination des erfindungsgemäßen p52 Tetramers mit angereicherten nativen CMV-Antigen erhalten. Das native CMV-Antigen wird dabei vorzugsweise in indirekt markierter Form zusammen mit einem monoklonalen Anti-pp65-Antikörper- Peroxidase-Konjugat eingesetzt.

Die Tetramerisierung eines größeren Bereichs des p52 Proteins (Aminosäuren 202 bis 293) ergab keine zufriedenstellenden Resultate.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. CMV-Antigen umfassend mindestens 2 Einheiten von bis zu 60 Aminosäuren langen Peptidsequenzen aus dem CMV p52-Antigen, wobei jede der Peptidsequenzen einen mindestens 15 Aminosäuren langen Abschnitt zwischen Position 264 und 293 des CMVp52- Antigens enthält.

2. CMV-Antigen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 3 Einheiten von CMV-Peptidsequenzen enthält.

3. CMV-Antigen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es 4 bis 8 Einheiten von CMV-Peptidsequenzen enthält.

4. CMV-Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der CMV-Peptideinheiten jeweils im Bereich zwischen Position 244 und 275 des CMV p52-Antigens liegt.

5. CMV-Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus der CMV-Peptideinheiten jeweils im Bereich zwischen Position 290 und 303 des CMV p52 Antigens liegt.

6. CMV-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein genetisch kodiertes lineares Fusionspolypeptid ist.

7. CMV-Antigen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die CMV-Peptideinheiten durch heterologe Peptidsequenzen von bis zu 10 Aminosäuren Länge voneinander getrennt sind.

8. CMV-Antigen nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich am N- oder/und C-Terminus heterologe Peptidsequenzen vorhanden sind.

9. CMV-Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 2 oder Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

10. CMV-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Struktur der allgemeinen Formel (I) aufweist:
T(-P)_n
wobei T einen Träger bedeutet, P eine Peptid- oder Polypeptidsequenz bedeutet, die mindestens eine CMV-Peptideinheit wie Anspruch 1 definiert enthält und kovalent an den Träger gekoppelt ist und n eine Zahl von ≧ 2 bedeutet.

11. CMV-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Struktur der allgemeinen Formel (II) bedeutet:
P¹{P²[P³(P⁴)_t]_s}_r
wobei P¹, P², P³ und P⁴ Peptidsequenzen mit einer Länge bis zu 60 Aminosäuren bedeuten und mindestens zwei dieser Peptidsequenzen eine CMV-Peptideinheit wie in Anspruch 1 definiert enthalten, r 1 oder 2 ist, s eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und t eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist und wobei das Antigen mindestens eine Verzweigungsstelle enthält.

12. CMV-Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Markierungsgruppe oder/und mindestens eine Festphasenbindegruppe enthält.

13. CMV-Antigen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierungsgruppe ausgewählt aus Enzymen, Fluoreszenzgruppen, Lumineszenzgruppen und Elektrochemi lumineszenzgruppen enthält.

14. Rekombinante Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein CMV-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.

15. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie eine Nukleinsäure nach Anspruch 14 in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz enthält.

16. Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Nukleinsäure nach Anspruch 14 oder einem Vektor nach Anspruch 15 enthält.

17. Verwendung eines CMV-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Nachweisreagenz in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus CMV-Antikörpern und CMV-Antigenen in einer Probe.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine humane Probe ist.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 zum Nachweis von CMV- IgM-Antikörpern.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Erkennung von CMV-Primärinfektionen, CMV-Sekundärinfektionen und einer Reaktivierung von CMV nach einer Latenzphase.

21. Verfahren zum immunologischen Nachweis eines Analyten ausgewählt aus CMV-Antikörpern und CMV-Antigenen in eine Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem Nachweisreagenz, das ein CMV- Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält, und gegebenenfalls weiteren Reagenzien in Kontakt bringt und das Vorhandensein oder/und die Menge des Analyten in der Probe bestimmt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyten über Bindung an eine Festphase bestimmt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man eine partikuläre Festphase verwendet.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23 zum Nachweis von CMV-IgM-Antikörpern umfassend die Schritte:

a) Inkontaktbringen einer zu testenden Probe mit einer Festphase und einem IgM-spezifischen Reagenz, das (a) an der Festphase immobilisiert ist oder (b) an der Festphase immobilisiert werden kann, und Immobilisieren von IgM-Antikörpern aus der Probe an der Festphase,
b) Abtrennen von nichtgebundenen Probebestandteilen oder/und Zugeben eines Entstörungsreagenz, welches gegen Antikörper einer von IgM verschiedenen Klassen gerichtet ist,
c) Zugeben eines für CMV-Antikörper spezifischen Nachweisreagenz enthaltend ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das (a) eine Markierungsgruppe trägt oder (b) mit einer Markierungsgruppe bindefähig ist, und
d) Bestimmen des Vorhandenseins oder/und der Menge von CMV-IgM-Antikörpern in der Probe durch Bestimmung der an die Festphasen gebundenen Markierungsgruppen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nachweisreagenz verwendet, das weitere CMV- Antigene enthält.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die weiteren CMV-Antigene aus angereicherten nativen CMV- Antigenen und Mischungen rekombinanter CMV-Antigene ausgewählt werden.

27. Reagenzienkit zum Nachweis eines Analyten ausgewählt aus CMV- Antikörpern und CMV-Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß er neben anderen Testkomponenten ein multimeres CMV-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.