DE19910143C2

DE19910143C2 - Process for the continuous biotechnical production of poly-beta-hydroxybutyric acid

Info

Publication number: DE19910143C2
Application number: DE1999110143
Authority: DE
Inventors: Joerg-Uwe Ackermann; Gisela Mothes; Wolfgang Babel
Original assignee: SAECHSISCHES INST fur ANGEWAN
Current assignee: SAECHSISCHES INST fur ANGEWAN
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2019-02-27
Also published as: DE19910143A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Poly-β-hydroxy buttersäure (PHB).The invention relates to a new process for the continuous production of poly-β-hydroxy butyric acid (PHB).

Bakterien unterschiedlicher taxonomischer Einordnung können aus Kohlenstoffverbindungen, die sie für Wachstum und Vermehrung nutzen, unter bestimmten Bedingungen PHB bilden. Als Substrate kommen organische Kohlenstoffverbindungen wie Zucker, Alkohole und organische Säuren ebenso in Betracht wie Kohlendioxid. Das Polymer ist biologisch abbaubar, woraus sich eine Bedeutung für den Umweltschutz ergibt. Seine Biokompatibilität macht es als Werkstoff für medizinische Anwendungen interessant.Bacteria of different taxonomic classification can be made from carbon compounds that use them for growth and reproduction, form PHB under certain conditions. As Substrates come from organic carbon compounds such as sugar, alcohols and organic ones Acids as well as carbon dioxide. The polymer is biodegradable, which results in has an impact on environmental protection. Its biocompatibility makes it a material for medical applications interesting.

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von PHB sind bekannt. Am häufigsten werden als Substrate Kohlenhydrate, insbesondere Glucose und Saccharose, Alkohole, bevorzugt Methanol, sowie Methan eingesetzt. Die am häufigsten verwendeten Bakterienstämme gehören den Gattun gen Alcaligenes, Methylobacterium und Methylocycstis an. So beschreibt DE 196 30 175 A1 ein Verfahren unter Verwendung von Methylobacterium rhodesianum und Glycerol als Substrat und DE 196 42 105 A1 Verfahren zur Nachfütterung des Substrates Methanol.Methods for the microbial production of PHB are known. The most common are Substrates carbohydrates, especially glucose and sucrose, alcohols, preferably methanol, as well as methane. The most commonly used bacterial strains belong to the genus against Alcaligenes, Methylobacterium and Methylocycstis. This is how DE 196 30 175 A1 describes it Method using Methylobacterium rhodesianum and glycerol as substrate and DE 196 42 105 A1 Process for refilling the substrate methanol.

Üblicherweise werden die Prozesse zur Synthese von PHB bei einem Überangebot an Kohlen stoffsubstrat ausgeführt. Bei den meisten in der Literatur beschriebenen Varianten wird das Polymer in den Zellen akkumuliert, wenn Wachstum und Vermehrung infolge Mangels eines Nährstoffes wie z. B. Ammonium, Phosphat, Sauerstoff limitiert werden; das heißt, Wachstum und Produktbildung verlangen unterschiedliche Bedingungen. Diese unterschiedlichen Bedingun gen entstehen üblicherweise in batch-Fermentationen. Diese Verfahren haben mit ihrer diskonti nuierlichen Betriebsweise wirtschaftliche Nachteile aufgrund der "unproduktiven" Zwischenpha sen. Darüber hinaus können, wenn überhaupt, solche Substrate, die schon bei niedrigen Konzen trationen (< 1 g/l) eine starke Hemmwirkung auf Wachstum und Produktbildung aufweisen, nur unter Einsatz aufwendiger fed-batch Techniken genutzt werden. In seltenen Fällen werden wachstumsassoziierte PHB-Synthesen beschrieben, die sich für eine kontinuierliche Verfahrens gestaltung anbieten (DE 196 33 858 A1).Usually the processes for the synthesis of PHB with an oversupply of coal fabric substrate executed. Most of the variants described in the literature will Polymer accumulates in the cells when growth and proliferation occur due to lack of one Nutrient such as B. ammonium, phosphate, oxygen are limited; that is, growth and product formation require different conditions. These different conditions genes usually arise in batch fermentations. These procedures have their discounts Nuclear operation economic disadvantages due to the "unproductive" intermediate phase sen. In addition, if at all, such substrates can be used even at low concentrations trations (<1 g / l) have a strong inhibitory effect on growth and product formation, only using complex fed-batch techniques. In rare cases growth-associated PHB syntheses described that are suitable for a continuous process Offer design (DE 196 33 858 A1).

Für solche Substrat/Mikroorganismus-Kombinationen, bei denen der wachstumsassoziierte Anteil der PHB-Synthese für eine effektive Herstellung nicht ausreicht oder wo die PHB-Anrei cherung erst mit der Limitation eines anderen Nährstoffes als dem Kohlenstoffsubstrat einsetzt, kann eine kontinuierliche Herstellung von PHB durch ein zweistufiges kontinuierliches Prozeß regime unter Verwendung von zwei Kulturgefäßen erreicht werden. In dem ersten Gefäß erfolgt vorwiegend die Zellvermehrung, in dem zweiten bevorzug die Produktbildung. So beschreibt DE 33 43 551 A1 ein Verfahren zur PHB-Herstellung mit Alcaligenes latus. Die Zellen werden kontinuierlich unter unlimitierten Bedingungen in einem ersten Fermenter vermehrt, das heißt, alle Nährstoffe werden "balanciert" angeboten. In einer zweiten Stufe wird die Kultivierung unter verminderter Gelöstsauerstoff-Konzentration fortgesetzt.For those substrate / microorganism combinations in which the growth-associated Proportion of PHB synthesis is insufficient for effective production or where the PHB preparation only begins with the limitation of a nutrient other than the carbon substrate, can produce PHB continuously by a two-stage continuous process regime can be achieved using two culture vessels. In the first vessel predominantly cell proliferation, in the second prefer product formation. This is how DE describes it 33 43 551 A1 a process for PHB production with Alcaligenes latus. The cells will continuously increased under unlimited conditions in a first fermenter, i.e. all nutrients are offered "balanced". In a second stage, the cultivation is under decreased dissolved oxygen concentration continued.

Die vorliegende Erfindung hat ein Fermentationsverfahren zum Ziel, das bei sehr niedrigen Konzentrationen an Kohlenstoffsubstrat sowohl eine gleichbleibende Zellvermehrung als auch eine hohe Produktanreicherung über einen beliebigen Zeitraum gestattet. Bei niedrigen Substrat konzentrationen sind Substratverluste geringer als bei zu hohen Konzentrationen. Sie ermögli chen ferner die Verwendung von Mischungen mehrerer Substrate bei der Kultivierung, die bei höheren Konzentrationen nicht gleichzeitig verwertet werden. Für Substrate, die bei Überschuß Wachstum und/oder Produktbildung hemmen, sind niedrige Konzentrationen für die Prozeß optimierung notwendig. So soll insbesondere ein kontinuierliches Verfahren bereitgestellt werden, das bei Verwendung derartiger Substrate auf einfache Weise die Einhaltung niedriger Konzentrationen gewährleistet und eine hohe PHB-Anreicherung ermöglicht.The present invention aims at a fermentation process which at very low Concentrations of carbon substrate both constant cell proliferation as well a high product enrichment over any period allowed. With low substrate Concentrations are less substrate loss than at too high concentrations. It enables Chen also the use of mixtures of several substrates in the cultivation, which in higher concentrations cannot be used simultaneously. For substrates with excess Inhibiting growth and / or product formation are low concentrations for the process optimization necessary. In particular, a continuous process is to be provided be, the compliance with lower when using such substrates in a simple manner Concentrations guaranteed and a high PHB enrichment enables.

Diese Aufgabe wird mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausgestaltun gen sind Gegenstand der Unteransprüche 2-6.This object is achieved with the method according to claim 1. Preferred embodiment conditions are the subject of subclaims 2-6.

Überraschend wurde gefunden, daß bei niedrigen Substratkonzentrationen, selbst wenn sie die PHB-Synthese limitieren, eine hohe PHB-Anreicherung erhalten wird. Die gleichbleibend niedrige Konzentration wird erfindungsgemäß durch die zweistufige kontinuierliche Prozeß führung erreicht.Surprisingly, it has been found that at low substrate concentrations, even if they do Limit PHB synthesis, a high PHB enrichment is obtained. The constant Low concentration is achieved by the two-stage continuous process leadership achieved.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die kontinuierliche Syn these mit Species der Gattungen Paracoccus oder Methylobacterium unter Belüftung und Rührung bei 25-40°C und einem pH-Wert von 5-8 durchgeführt, wobei als Substrate Ess igsäure bzw. Acetat, Ethanol, Methanol oder Mischungen mit diesen Substanzen verwendet werden.In a particularly preferred embodiment of the invention, the continuous syn with species of the genera Paracoccus or Methylobacterium under aeration and Stirring at 25-40 ° C and a pH of 5-8 carried out, with Ess Acetic acid or acetate, ethanol, methanol or mixtures with these substances used become.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird die kontinuierliche Synthese mit der Spezies Paracoccus denitrificans und Essigsäure als Substrat ausgeführt. In den Fermentoren werden Verweilzeiten zwischen 1,5 und 8 bzw. 5 und 25 Stunden eingestellt. Der PHB-Gehalt der Zellen liegt zwischen 40 und 80% der Zelltrockenmasse.In a very particularly preferred embodiment, the continuous synthesis with the Species Paracoccus denitrificans and acetic acid as a substrate. In the fermenters dwell times between 1.5 and 8 or 5 and 25 hours are set. The PHB content the cells are between 40 and 80% of the dry cell mass.

Die Erfindung soll an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzu schränken.The invention will be explained in more detail using exemplary embodiments, without going into it restrict.

Embodiments example 1

Es wird der Stamm Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) verwendet. Der Stamm wird in einem 5 Liter fassenden Fermenter bei pH 6-8 (vorzugsweise bei pH 7,0) und 35°C vermehrt. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: 310 mg/l P (aus äquimolaren Konzentrationen von KH₂PO₄ und K₂HPO₄), 10,69 g/l NH₄Cl, 3,0 g/l Hefeextrakt und Spurensalze (in mg/l):
CaCl₂ × 2 H₂O (55,1), MgSO₄ × 7 H₂O (1068), CuSO₄ × 5 H₂O (11,7), ZnCl₂ × 7 H₂O (6,5), MnSO₄ × 4 H₂O (3,75), Na₂MoO₄ × 7 H₂O (73,3), CoSO₄ × 7 H₂O (4,5), FeSO₄ × 7 H₂O (74,7). Zur Anzucht der Bakterien werden zunächst 1/3 der Nährmedienkonzentration in einem Volu men von 4,0 l eingesetzt und mit 100 ml einer Vorkultur des Stammes beimpft. Die restliche Menge an Nährlösung wird in 2 Portionen nach einem Biomassezuwachs von jeweils 6 g/l zu gegeben. Als Kohlenstoffsubstrat werden dem Medium zu Beginn 0,5 g/l Natriumacetat × 3 H₂O zugesetzt. Weiteres Kohlenstoffsubstrat wird als Säurevorlage zur pH-Regulation bestehend aus einem Gemisch von Natriumacetat × 3 H₂O (79 g/l) und Essigsäure (133 g/l), kontinuierlich zu geführt. Dieses Gemisch wird bei Beendigung der batch-Phase gegen 2 N H₂SO₄ ausgetauscht. Die Fermentation wird unter Belüftung und Rührung bis zu einer Bakteriendichte von ca. 17 g/l durchgeführt. Dann werden kontinuierlich 705 g/h Medium der oben angegebenen Konzentration unter Zusatz von 31,78 g/l Natriumacetat × 3 H₂O, 35,28 g/l Essigsäure und 1 ml/l Silikon- Antischaumemulsion zugeführt. Das überzählige Kulturvolumen wird periodisch in einen 20 Liter fassenden zweiten Fermenter steril überführt. Das entspricht einer Durchflußrate von 0,18 h^-1. Nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes hat dieses Kulturmedium folgende Zusammenset zung: eine Biomassekonzentration von 20 g/l mit einem PHB-Gehalt von 6%, eine Ammoni umstickstoffkonzentration von 0,15 g/l und eine Essigsäurekonzentration von 0,03 g/l. Der Füllstand des zweiten Fermenters soll 12,8 kg betragen; das überzählige Kulturmedium wird periodisch abgepumpt. Als Regelgröße dient die Fermentermasse. Das Kohlenstoffsubstrat Essigsäure einer Konzentration von 560 g/l wird nach Erreichen des berechneten Füllvolumens mit einer Geschwindigkeit von 131 g/h zugeführt. Die Verweilzeit im zweiten Fermenter beträgt 14,5 h, der PHB-Gehalt der Biomasse 65% und die Restsubstratkonzentration an Essigsäure 0,08 g/l.The Paracoccus denitrificans strain (ATCC 17741) is used. The strain is grown in a 5 liter fermenter at pH 6-8 (preferably at pH 7.0) and 35 ° C. The nutrient medium has the following composition: 310 mg / l P (from equimolar concentrations of KH ₂ PO ₄ and K ₂ HPO ₄ ), 10.69 g / l NH ₄ Cl, 3.0 g / l yeast extract and trace salts (in mg / l):
CaCl ₂ × 2 H ₂ O (55.1), MgSO ₄ × 7 H ₂ O (1068), CuSO ₄ × 5 H ₂ O (11.7), ZnCl ₂ × 7 H ₂ O (6.5), MnSO ₄ × 4 H ₂ O (3.75), Na ₂ MoO ₄ × 7 H ₂ O (73.3), CoSO ₄ × 7 H ₂ O (4.5), FeSO ₄ × 7 H ₂ O (74 , 7). To grow the bacteria, first 1/3 of the nutrient medium concentration is used in a volume of 4.0 l and inoculated with 100 ml of a pre-culture of the strain. The remaining amount of nutrient solution is added in 2 portions after a biomass increase of 6 g / l each. 0.5 g / l sodium acetate × 3 H ₂ O are initially added to the medium as the carbon substrate. Additional carbon substrate is fed continuously as an acid charge for pH regulation consisting of a mixture of sodium acetate × 3 H ₂ O (79 g / l) and acetic acid (133 g / l). This mixture is exchanged for 2 NH ₂ SO ₄ at the end of the batch phase. The fermentation is carried out with aeration and stirring up to a bacterial density of approx. 17 g / l. Then 705 g / h of medium of the concentration given above are continuously added with the addition of 31.78 g / l sodium acetate × 3 H ₂ O, 35.28 g / l acetic acid and 1 ml / l silicone antifoam emulsion. The surplus culture volume is periodically transferred sterile to a 20 liter second fermenter. This corresponds to a flow rate of 0.18 h ^-1 . After reaching equilibrium, this culture medium has the following composition: a biomass concentration of 20 g / l with a PHB content of 6%, an ammonium nitrogen concentration of 0.15 g / l and an acetic acid concentration of 0.03 g / l. The fill level of the second fermenter should be 12.8 kg; the excess culture medium is pumped out periodically. The fermenter mass serves as the control variable. The carbon substrate acetic acid with a concentration of 560 g / l is supplied after reaching the calculated filling volume at a rate of 131 g / h. The residence time in the second fermenter is 14.5 h, the PHB content of the biomass is 65% and the residual substrate concentration of acetic acid is 0.08 g / l.

Example 2

Der Stamm Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) wird in einem Volumen von 700 ml kontinuierlich vermehrt wie in Beispiel 1 angegeben, jedoch mit einer Durchflußrate von 0,3 h^-1. Die Konzentrationen an NH₄Cl, Hefeextrakt, Spurensalzen und Natriumacetat/ Essigsäure betra gen 1/3 der angegebenen Konzentrationen. Nach Einstellung des Gleichgewichtszustandes wird eine Biomassekonzentration von 7 g/l mit einem PHB-Gehalt von 2%, eine Ammoniumstickstoff konzentration von 0,15 g/l und eine Essigsäurekonzentration von 0,03 g/l erreicht. Im zweiten Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 3 l wird ein konstanter Substratfluß von 107 g/h Essigsäure einer Konzentration von 86 g/l eingestellt. Es wird ein PHB-Gehalt von 60% und eine Restsubstratkonzentration an Essigsäure von 0,01 g/l erreicht. Die Verweilzeit im zweiten Fermenter beträgt 9,5 h.The strain Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) is continuously expanded in a volume of 700 ml as stated in Example 1, but with a flow rate of 0.3 h ^-1 . The concentrations of NH ₄ Cl, yeast extract, trace salts and sodium acetate / acetic acid are 1/3 of the stated concentrations. After the equilibrium state has been established, a biomass concentration of 7 g / l with a PHB content of 2%, an ammonium nitrogen concentration of 0.15 g / l and an acetic acid concentration of 0.03 g / l are achieved. In the second fermenter with a working volume of 3 l, a constant substrate flow of 107 g / h acetic acid with a concentration of 86 g / l is set. A PHB content of 60% and a residual substrate concentration of acetic acid of 0.01 g / l is achieved. The residence time in the second fermenter is 9.5 hours.

Example 3

Es wird der Stamm Methylobacterium rhodesianum MB126 in einem Volumen von 1,5 l kontinuierlich vermehrt wie in Beispiel 1 angegeben, jedoch mit einer Durchflußrate von 0,098 h^-1. Die Konzentrationen an NH₄Cl und Spurensalzen betragen 1/5 der angegebenen Konzen trationen. Die Vermehrung erfolgt bei 30°C ohne Hefeextrakt, jedoch mit Zusatz von 2,25 mg/l CoSO₄ × 7 H₂O; als Kohlenstoffsubstrat wird Methanol (20 g/l) verwendet. Die Zuflußrate an Medium beträgt 158 ml/h.. Im zweiten Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 3,1 l wird ein konstanter Substratfluß von 74 g/h Methanol einer Konzentration von 40 g/l eingestellt. Es wird ein PHB-Gehalt von 37% und eine Restsubstratkonzentration an Methanol von 0,01 g/l erreicht. Die Verweilzeit im zweiten Fermenter beträgt 15 h.The strain Methylobacterium rhodesianum MB126 is continuously increased in a volume of 1.5 l as stated in Example 1, but with a flow rate of 0.098 h ^-1 . The concentrations of NH ₄ Cl and trace salts are 1/5 of the given concentrations. Propagation takes place at 30 ° C without yeast extract, but with the addition of 2.25 mg / l CoSO ₄ × 7 H ₂ O; methanol (20 g / l) is used as the carbon substrate. The inflow rate of medium is 158 ml / h. In the second fermenter with a working volume of 3.1 l, a constant substrate flow of 74 g / h of methanol with a concentration of 40 g / l is set. A PHB content of 37% and a residual substrate concentration of methanol of 0.01 g / l is achieved. The residence time in the second fermenter is 15 hours.

Claims

1. A process for the continuous biotechnical production of poly-β-hydroxybutyric acid, characterized in that growth and product formation are carried out spatially separately in two fermenters and in each case at such small concentrations of an assimilable carbon substrate, which do not inhibit growth and product formation, but can limit product formation .

2. The method according to claim 1, characterized, that residence times in the first fermenter from 0.5 to 10 hours and in the second Fermenters can be set from 4 to 30 hours.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized, that the continuous cultivation with aeration and stirring, at 25-40 ° C and a pH of 5-8.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized, that the species Paracoccus denitrificans and acetic acid or acetate as a substrate be used.

5. The method according to claim 1 to 3, characterized, that the species uses Methylobacterium rhodesianum and methanol as a substrate become.

6. The method according to claim 1 to 3, characterized, that the species Paracoccus denitrificans and ethanol are used as substrates.