DE19633858C2 - Process for the continuous biotechnological production of poly-beta-hydroxybutyric acid - Google Patents
Process for the continuous biotechnological production of poly-beta-hydroxybutyric acidInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Bakterien/Substrat-Kombina tionen, die eine effiziente kontinuierliche Fermenta tion zur Herstellung von Poly-β-hydroxybuttersäure nach dem Chemostat-Prinzip gewährleisten.The invention relates to new bacteria / substrate combinations ions that have an efficient continuous fermenta tion for the production of poly-β-hydroxybutyric acid guarantee the chemostat principle.
Eine Vielzahl von Bakterien unterschiedlicher taxonomi scher Stellung bilden unter bestimmten Bedingungen aus Kohlenstoffverbindungen, die sie auch als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und Vermehrung nutzen können, Polyhydroxyalkansäuren. Die am längsten be kannte und intensiv untersuchte Polyhydroxyalkansäure ist Poly-β-hydroxybuttersäure (PHB).A variety of bacteria of different taxonomi training under certain conditions Carbon compounds, which they also call carbon and use energy sources for growth and reproduction can, polyhydroxyalkanoic acids. The longest be known and intensively studied polyhydroxyalkanoic acid is poly-β-hydroxybutyric acid (PHB).
Dieser Polyester hat Eigenschaften wie Polypropylen und Polyethylen. Im Gegensatz zu diesen sogenannten Kunststoffen ist PHB biologisch abbaubar, woraus sich eine besondere Bedeutung für den Umweltschutz ergibt. Die Bildung von PHB ist nicht an ein bestimmtes Substrat oder an einen bestimmten Ernährungstyp gekoppelt. Sie kann also aus Kohlendioxid genauso erfolgen, wie aus organischen Kohlenstoffverbindungen.This polyester has properties like polypropylene and Polyethylene. In contrast to these so-called Plastics is biodegradable, which is what makes PHB is of particular importance for environmental protection. The formation of PHB is not related to any particular one Substrate or to a certain diet type coupled. So it can do the same from carbon dioxide take place as from organic carbon compounds.
Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Poly-β- Hydroxybuttersäure sind bekannt. Die am häufigsten eingesetzten Substrate sind Kohlenhydrate, bevorzugt Glukose und Saccharose. Weiterhin werden auch Alkohole, besonders Methanol, als Kohlenstoffquelle genutzt. Die am häufigsten verwendeten Bakterien zur PHB-Synthese sind Alcaligenes eutrophus und Alcaligenes latus.Process for the microbial production of poly-β- Hydroxybutyric acid is known. The most common The substrates used are carbohydrates, preferred Glucose and sucrose. Furthermore, alcohols, especially methanol, used as a carbon source. The most commonly used bacteria for PHB synthesis are Alcaligenes eutrophus and Alcaligenes latus.
Bei den meisten der in der Literatur beschriebenen PHB- Synthesen wird PHB im Ergebnis von Imbalanzen im Nährstoffangebot akkumuliert, bei batch-Kultivierung in der stationären Phase, die durch entstehenden Mangel eingeleitet wird. Voraussetzung ist ein Überangebot an Kohlenstoff-Substrat im Vergleich zu z. B. Stickstoff, Sauerstoff und/oder Phosphat. Das heißt, in batch- Verfahren sind die Bedingungen zwar für die Überproduktion von PHB optimal, aber nicht für das Wachstum und die Vermehrung der Bakterienstämme. PHB- Bildung setzt bei diesen Verfahren ein, wenn Wachstum und Vermehrung gedrosselt werden bzw. gar nicht mehr möglich sind. Die wirtschaftlichen Nachteile der batch- Fermentation sind bekannt und liegen in der geringeren Raum-Zeit-Ausbeute und in den schlechteren Möglichkeiten für eine automatische Steuerung und Kontrolle, was sich auf die Qualität des Produktes auswirkt, die im Falle des Homopolyesters allein durch die Molmasse bestimmt wird. Most of the PHB- described in the literature PHB is synthesized as a result of imbalances in the Nutrient supply accumulated in batch cultivation in the stationary phase caused by lack is initiated. A requirement is an oversupply Carbon substrate compared to e.g. B. nitrogen, Oxygen and / or phosphate. That is, in batch Procedures are the conditions for Overproduction of PHB optimal, but not for that Growth and multiplication of the bacterial strains. PHB- Education begins with these processes when growth and propagation are throttled or no longer at all possible are. The economic disadvantages of batch Fermentation are known and are in the lower Space-time yield and in the worse Possibilities for automatic control and Control what affects the quality of the product affects that in the case of homopolyester alone the molecular weight is determined.
Im Gegensatz zur batch-Fermentation beschreibt EP 0 149 744 A1 ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von PHB unter Verwendung von Alcaligenes latus bei vollständiger und für das Wachstum des Mikroorganismus optimaler Nährstoffversorgung unter unlimitierten Wachstumsbedingungen. Dieses Verfahren ermöglicht entweder durch ein ständiges, periodisches Zufüttern von Substrat (fed-batch-Arbeitsweise) oder durch eine kontinuierliche Arbeitsweise, bei der der Kultur im konstanten Strom frische Nährlösung zugeführt wird und andererseits dem Fermentor eine dem Zufluß äquivalente Menge an biomasschaltigem Kulturmedium entnommen wird, eine sehr gute PHB-Anreicherung.In contrast to batch fermentation, EP 0 149 744 A1 describes a process for biotechnological production of PHB using Alcaligenes latus more complete and for the growth of the microorganism optimal nutrient supply under unlimited Growing conditions. This procedure enables either by constant, periodic feeding of substrate (fed-batch mode of operation) or by a continuous way of working, in which the culture in constant flow of fresh nutrient solution is supplied and on the other hand, the fermentor is equivalent to the inflow Amount of biomass-containing culture medium is removed, a very good PHB enrichment.
Aus EP 0 643 138 A2 ist bereits die kontinuierliche Herstellung von PHB aus Methanol mit Methylobacterium oder Paracoccus bekannt. In EP 0 015 669 A2 ist ein zweistufiges Verfahren zur Kultivierung vom Methylobacterium-organophilum-Stämmen auf Methanol beschrieben.EP 0 643 138 A2 already describes the continuous one Production of PHB from methanol with Methylobacterium or Paracoccus known. In EP 0 015 669 A2 there is a two step process for cultivation of Methylobacterium organophilum strains on methanol described.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere, al ternative Bakterien/Substrat Kombinationen aufzufinden, mit denen unter dem Gesichtspunkt einer guten Raum- Zeit-Ausbeute und optimalen Möglichkeiten für eine au tomatische Steuerung des Prozesses eine kontinuierliche Fermentation nach dem Chemostat-Prinzip durchgeführt werden kann. Insbesondere soll ein Verfahren bereitge stellt werden, dessen kontinuierlicher Betrieb beliebig aufrechterhalten werden kann und mit dem PHB zu jedem Zeitpunkt in gleichbleibender, einheitlicher Qualität, d. h. mit konstanter Molmasse(-verteilung) erzeugt wer den kann.The object of the present invention was to further, al find alternative bacteria / substrate combinations, with those from the point of view of a good spatial Time yield and optimal opportunities for an au automatic control of the process a continuous Fermentation carried out according to the chemostat principle can be. In particular, a method should be ready be, the continuous operation of any can be maintained and with the PHB to everyone Point of time in constant, uniform quality, d. H. who produces with a constant molar mass (distribution) that can.
Es hat sich gezeigt, daß sich mit Spezies der Gattung Methylobacterium oder der Gattung Paracoccus und heterotrophen Substratgemischen gemäß Anspruch 1 die Herstellung von PHB wachstumsassoziiert und kontinuierlich durchführen läßt und gute PHB- Ausbeuten erhalten werden. Erfindungsgemäß wird ein rasches Wachstum der Bakterien bei gleichzeitiger effektiver PHB-Speicherung erzielt.It has been shown that species of the genus Methylobacterium or the genus Paracoccus and according to heterotrophic substrate mixtures Claim 1 the production of PHB growth-associated and can be carried out continuously and good PHB Yields are obtained. According to the invention rapid growth of the bacteria with simultaneous effective PHB storage achieved.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die kontinuierliche Synthese mit Stämmen der Spezies Methylobacterium rhodesianum, insbesondere Methylobacterium rhodesianum MB126 oder der Spezies Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) bei 25-40°C und einem pH-Wert von 6-8 unter Belüftung und Rührung durchgeführt.In a preferred embodiment of the invention continuous synthesis with strains of the species Methylobacterium rhodesianum, in particular Methylobacterium rhodesianum MB126 or the species Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) at 25-40 ° C and pH 6-8 with aeration and stirring carried out.
Erfindungsgemäß werden Gemische aus heterotrophen Substraten verwendet, durch deren Proportionierung zueinander der PHB-Gehalt in der Biomasse und der Ertragskoeffizient (g PHB-Kohlenstoff/g Substrat- Kohlenstoff) gesteigert werden können. Die Substratgemische aus Glukose/Essigsäure werden vorzugsweise in einem Verhältnis von 1,6 : 1 bis 1 : 10 (g/g) verwendet. Auch mit Fruktose/Methanol-Gemischen in einem bevorzugten Verhältnis von 2,25 : 1 bis 1 : 1,33 (g/g) werden hohe PHB-Bildungsraten erzielt.According to the invention, mixtures of heterotrophic Substrates used by their proportioning the PHB content in the biomass and the Yield coefficient (g PHB carbon / g substrate Carbon) can be increased. The Mixtures of substrates made of glucose / acetic acid preferably in a ratio of 1.6: 1 to 1:10 (g / g) used. Also with fructose / methanol mixtures in a preferred ratio of 2.25: 1 to 1: 1.33 (g / g) high PHB formation rates are achieved.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird die kontinuierliche Synthese mit dem Stamm Methylobacterium rhodesianum MB126 und einem Fruktose/Methanol-Gemisch in einem Verhältnis 1 : 1 (g/g) durchgeführt. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Stamm Paracoccus denitrificans und Glukose/Essigsäure im Verhältnis 1 : 2 (g/g) eingesetzt. In a very particularly preferred embodiment becomes the continuous synthesis with the strain Methylobacterium rhodesianum MB126 and one Fructose / methanol mixture in a ratio of 1: 1 (g / g) carried out. In another particularly preferred one Embodiment is the Paracoccus denitrificans strain and glucose / acetic acid in a ratio of 1: 2 (g / g) used.
Die bei der Erfindung eingestellten Durchflußraten liegen zwischen 0,04 und 0,4 h-1, vorzugsweise bei Methylobacterium zwischen 0,04 und 0,08 h-1 und bei Paracoccus zwischen 0,1 und 0,3 h-1.The flow rates set in the invention are between 0.04 and 0.4 h -1 , preferably between 0.04 and 0.08 h -1 for Methylobacterium and between 0.1 and 0.3 h -1 for Paracoccus.
Die spezifische Produktbildungsrate bei Methylobacterium liegt zwischen 0,02 und 0,06 kg . m-3 . h-1 und bei Paracoccus zwischen 0,02 und 0,18 kg . m-3 . h-1.The specific product formation rate for Methylobacterium is between 0.02 and 0.06 kg. m -3 . h -1 and with Paracoccus between 0.02 and 0.18 kg. m -3 . h -1 .
Die erfindungsgemäße Synthese hat den großen Vorteil, daß mit den genannten Stämmen und Substraten unter den genannten Bedingungen PHB mit gleichbleibender Qualität, also mit gleichbleibender Molmasse(- verteilung) produziert werden kann, bei Methylobacterium zwischen 300.000 und 450.000 und bei Paracoccocus zwischen 570.000 und 1.100.00.The synthesis according to the invention has the great advantage that with the strains and substrates mentioned among the mentioned conditions PHB with the same Quality, i.e. with constant molecular weight (- distribution) can be produced at Methylobacterium between 300,000 and 450,000 and at Paracoccocus between 570,000 and 1,100.00.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.The invention is based on Embodiments are explained in more detail without them to limit it.
Es wird der Stamm Methylobacterium rhodesianum MB126 verwendet. Der Stamm wird in einem 2 Liter fassenden Fermenter bei pH 6-8, vorzugsweise bei pH 7,0 und 32°C kultiviert. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: 310 mg P/l (aus äquimolaren Konzentrationen von KH2PO4 und K2HPO4), 13,0 g/l Fruktose, 1,52 g/l NH4Cl und Spurensalze (in mg/l): CaCl2 . 6H2O (10,9), MgSO4 . 7H2O (142,4), ZnSO4 . 7H2O (0,88), MnSO4 . H2O (1,22), CuSO4 (1,0), Na2MoO4 . H2O (0,5), Fe(NH4)2(SO4)2 . 6H2O (14,0), CoSO4 . 7H2O (2,3). Dazu werden 1,4 l Nährmedium mit 100 ml einer Vorkultur des Stammes beimpft, wobei das Vorkulturmedium die gleiche Zusammensetzung hat wie das Hauptkulturmedium, jedoch nur 7 g/l Fruktose. Die Züchtung wird unter Belüftung und Rührung (600 U/min) bis zu einer Bakteriendichte von ca. 3 g/l als batch-Kultur durchgeführt. Dann wird kontinuierlich 60 ml/h Medium der oben angegebenen Zusammensetzung zugeführt und Kulturmedium fließt in gleichem Maße ab. Das entspricht einer Durchflußrate von 0,04 h-1. Nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes hat dieses Kulturmedium folgende Zusammensetzung: eine Rest- Fruktosekonzentration von 2,4 g/l und eine Biomassenkonzentration von 4,76 g/l mit einem PHB- Anteil an der Biomasse von 38%. Die Ausbeute der Biomasse in Bezug auf das verbrauchte Substrat (Yx.s) beträgt 0,45 g/g.The strain Methylobacterium rhodesianum MB126 is used. The strain is cultivated in a 2 liter fermenter at pH 6-8, preferably at pH 7.0 and 32 ° C. The nutrient medium has the following composition: 310 mg P / l (from equimolar concentrations of KH 2 PO 4 and K 2 HPO 4 ), 13.0 g / l fructose, 1.52 g / l NH 4 Cl and trace salts (in mg / l): CaCl 2 . 6H 2 O (10.9), MgSO 4 . 7H 2 O (142.4), ZnSO 4 . 7H 2 O (0.88), MnSO 4 . H 2 O (1.22), CuSO 4 (1.0), Na 2 MoO 4 . H 2 O (0.5), Fe (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 . 6H 2 O (14.0), CoSO 4 . 7H 2 O (2.3). For this purpose, 1.4 l of nutrient medium are inoculated with 100 ml of a pre-culture of the strain, the pre-culture medium having the same composition as the main culture medium, but only 7 g / l fructose. The cultivation is carried out with aeration and stirring (600 rpm) up to a bacterial density of approx. 3 g / l as a batch culture. Then 60 ml / h of medium of the composition given above is continuously fed in and culture medium flows off to the same extent. This corresponds to a flow rate of 0.04 h -1 . After reaching equilibrium, this culture medium has the following composition: a residual fructose concentration of 2.4 g / l and a biomass concentration of 4.76 g / l with a PHB portion of the biomass of 38%. The yield of the biomass in relation to the substrate used (Y xs ) is 0.45 g / g.
Der Stamm Paracoccus denitrificans (ATCC 17741) wird chemostatisch kultiviert wie in Beispiel 1, jedoch mit einer Durchflußrate von 0,1 h-1. Vor- und Hauptkulturmedium haben folgende Zusammensetzung: 10 g/l Glukose, 0,31 g P/l (aus äquimolaren Konzentrationen von KH2PO4 und K2HPO4), 1,52 g/l NH4Cl, 0,5 g/l Hefeextrakt und Spurensalze (in mg/l): CaCl2 . 6H2O (10,9), MgSO4 . 7H2O (142,4), ZnSO4 . 7H2O (0,9), MnSO4 . H2O (1,2), CuSO4 (1,0), Na2MoO4 . 2H2O (0,5), Fe(NH4)2(SO4)2 . 6H2O (14,0). Die aus der chemostatischen Kultivierung resultierende Biomasse hat einen PHB- Gehalt von 9,5%.The Paracoccus denitrificans strain (ATCC 17741) is cultivated chemostatically as in Example 1, but with a flow rate of 0.1 h -1 . The preculture and main culture medium have the following composition: 10 g / l glucose, 0.31 g P / l (from equimolar concentrations of KH 2 PO 4 and K 2 HPO 4 ), 1.52 g / l NH 4 Cl, 0.5 g / l yeast extract and trace salts (in mg / l): CaCl 2 . 6H 2 O (10.9), MgSO 4 . 7H 2 O (142.4), ZnSO 4 . 7H 2 O (0.9), MnSO 4 . H 2 O (1.2), CuSO 4 (1.0), Na 2 MoO 4 . 2H 2 O (0.5), Fe (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 . 6H 2 O (14.0). The biomass resulting from the chemostatic cultivation has a PHB content of 9.5%.
Wird die Kultivierung in gleicher Weise wie in Vergleichsbeispiel 2 durchgeführt, aber an Stelle von 10 g/l Glukose mit einer Mischung aus 7,5 g/l Glukose und 15 g/l Essigsäure im zulaufenden Medium, so entsteht eine Biomasse mit einem PHB-Gehalt von 32%.If the cultivation is carried out in the same way as in Comparative example 2 carried out, but instead of 10 g / l glucose with a mixture of 7.5 g / l glucose and 15 g / l acetic acid in the incoming medium, see above a biomass with a PHB content of 32% is created.
Der Stamm Methylobacterium rhodesianum MB126 wird kontinuierlich kultiviert wie in Vergleichsbeispiel 1 angegeben. Für die Vorkultur und die batch-Hauptkultur wird jedoch 5,5 g/l Fruktose verwendet. Der kontinuierliche Betrieb wird bei einer Biomassekonzentration von ca 2 g/l angeschaltet. Im zulaufenden Medium sind 5,5 g/l Fruktose und 0,65 Vol.% Methanol enthalten. Nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes enthält die Biomasse (5,32 g/l) 53% PHB.The strain Methylobacterium rhodesianum MB126 is continuously cultivated as in Comparative Example 1 specified. For the preculture and the main batch culture however, 5.5 g / l fructose is used. The continuous operation is at a Biomass concentration of approx. 2 g / l switched on. in the incoming medium is 5.5 g / l fructose and 0.65 vol.% Contain methanol. After reaching the The state of equilibrium contains the biomass (5.32 g / l) 53% PHB.
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