DE19860343C1

DE19860343C1 - Verfahren zum Anreichern und quantitativen Bestimmen des Galactomannan-Antigens und Luftfiltrationskeimsammler zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE19860343C1
Application number: DE1998160343
Authority: DE
Inventors: Lothar Reckert; Klaus Senkpiel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2000-07-20
Anticipated expiration: 2018-12-25

Abstract

Verfahren zum Anreichern und quantitativen Bestimmen des Galactomannan-Antigens aus luftgetragenen Aspergillussporen und weiteren aerogenen Mikroorganismen, mittels eines eine Filtermembran aufweisenden Luftfiltrationskeimsammlers und entsprechender Analysengeräte, dadurch gekennzeichnet, daß der Sammler batteriebetrieben und an der Arbeitskleidung einer Person während ihrer gesamten Arbeitszeit getragen oder in geschlossenen Räumen aufgestellt wird, und währenddessen 40-70 l/h Umgebungsluft durch die Filtermembran saugt und die angesaugten Keime auf letztere abscheidet, und wobei nach einer flüssigen Extraktion und/oder Auflösung der Filtermembran ein an sich bekannter Platelia-(R)-Aspergillus-Test durchgeführt wird, welcher dadurch modifiziert wird, daß keine Wärmevorbehandlung bei 100 DEG C für 3 Minuten erfolgt, statt einer cut-off Probe Galactomannan-Standard von 0,5 bis 6,5 ng und ein Referenzwert in Form einer flüssigen Extraktion von einem unbeaufschlagten Filter mitgeführt wird und daß unter Verzicht auf ein Anzüchtungsverfahren das Zellwand-Galactomannan-Antigen innerhalb einiger Stunden detektiert wird, und daß Verdünnungsstufen zur Herstellung des linearen Meßbereiches des Enzymimmunoassays angelegt werden, und daß ein Sporenaufschluß durchgeführt wird, um lösliches und zellwandgebundenes Galactomannan zu erfassen, wodurch die Nachweisgrenze unter 1 ng/ml abgesenkt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anrei chern und quantitativen Bestimmen des Galactomannan-Antigens aus luftgetragenen Aspergillussporen und weiteren aerogenen Mikroorganismen mittels eines Luftfiltrationskeimsammlers und entsprechenden Analysengeräten und einen Luftfiltrati onskeimsammler zur Durchführung des Verfahrens.

Die WO 90/10282 A beschreibt ein Verfahren und eine Vorrich tung zum Vorsehen einer Alarmanzeige, wenn Allergenpartikel ein vorbestimmtes Niveau überschreiten. Ein Gehäuse wird vorgesehen, das in einem Durchgang einen Ventilator besitzt, der auf ein Strömungssteuerungssignal anspricht, um einen Luftstrom in einer ersten Richtung zu erzeugen. Ein Filter wird im Durchgang vorgesehen, um diejenigen Partikel zu ent fernen, die größer sind als die Allergenpartikel. Ein Aller gen-Partikeldetektor wird im Durchgang vorgesehen, um ein Erfassungssignal vorzusehen. Eine Steuerung wird im Gehäuse angeordnet und mit dem Ventilator und dem Allergendetektor gekoppelt, um in Zeitintervallen das Strömungssteuerungs signal zu erzeugen. Die Steuerung spricht auf das Erfas sungssignal zum Erzeugen eines Alarmsignals an, wenn das Er fassungssignal ein vorbestimmtes Niveau erreicht, das über mäßige Allergenpartikel in der Umgebung anzeigt.

Die US 3,980,524 betrifft ein tragbares Instrument zum Te sten von Luft oder anderen gasförmigen Stoffen in fremden Substanzen, z. B. Keime oder Bakterien, wobei eine Kultur eingesetzt wird, die mit Atmosphären Luft durch einen Venti lator beaufschlagt wird.

Die DE 34 10 990 A1 betrifft eine Vorrichtung zur Prüfung der Luft auf ihren Keimgehalt mit schnell rotierendem Flü gelrad in einem Zylinder, auf dessen Mantelinnenseite sich eine mit Nährmedium beschichtete Trägerfolie befindet, wird ein weiterer Partikelgrößenbereich mit fast gleicher Effek tivität erfaßt, kann der Luftdurchsatz mit einfachen Mitteln bestimmt und die Abscheidewirkung genau getestet werden, wenn die Trägerfolie mitrotiert, die Flügel einen flachen Anstellwinkel zur Drehebene des Flügelrades aufweisen, ein getrennter Luftein- und -austritt durch Eintrittsöffnungen von oben und Austrittsöffnungen von unten erfolgt und die Rotorinnenwand unterhalb der Lüftekammer als Leitzylinder ausgebildet ist.

Die DE 93 06 607 betrifft einen Luftkeimsammler mit einem Kunststoff-Gehäuse, das einen Antrieb für einen Rotor hal tert, der zeitgesteuert in einer Lüfterkammer umläuft und von einer abnehmbaren Stahl-Schutzhaube mit einer mittigen Öffnung für Ansaugluft übergriffen wird, welche entlang ei ner entnehmbaren Nährbodenschicht an der Rotor-Innenwand ge führt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse eine mit der Schutzhaube zusammenwirkende, dem Antrieb vorgeschaltete Sicherungseinrichtung aufweist.

Die JP 05196623 A in WPIDS auf STN, DERWENT AN 1993-283006, AB betrifft eine Reagenzschicht, die Latexpartikel enthält, welche mit einer immunreaktiven Substanz und einer wasser löslichen, synthetischen Hochpolymerverbindung empfindlich gemacht worden ist und auf der Fläche einer Rutsche zur Dia gnose angeordnet wird. Eine in der Körperflüssigkeit nur ge ring vorhandene Substanz kann festgestellt werden. Die Rea genzschicht auf der Rutschenfläche ist nicht klebrig und die Wiederauflösungseigenschaften und die Stabilität der Rea genzschicht sind gut.

Die vorbekannten Verfahren waren insofern nachteilig, als daß sie langwierige Anzüchtungsverfahren erforderten, die mindestens mehrere Tage erforderten. Auch konnten die hierzu eingesetzten Luftfiltrationskeimsammler nicht an der Ar beitskleidung einer Person während ihrer gesamten Arbeits zeit getragen werden, da sie hierfür viel zu schwer und vo luminös waren.

Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrun de, das Verfahren zum Anreichern und quantitativen Bestimmen des Galactomannan-Antigens aus luftgetragenen Aspergil lussporen und weiteren aerogenen Mikroorganismen mittels eines eine Filtermembran umfassenden Luftfiltrationskeim sammlers und entsprechender Analysengeräte derart zu verbes sern, daß eine mikrobielle Exposition von Patienten und Krankenhauspersonal als Kurzzeit- und Langzeit-Monitoring und gleichzeitig die Ergebnisse in Form eines Schnelltests innerhalb weniger Stunden ermittelt werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren bzw. durch den im Anspruch 5 gekennzeichneten Luftfiltrationskeimsammler gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet überraschenderwei se durch die Kombination von Luftfiltrationsanreicherung und nachfolgender immunochemischer Nachweismethode, die Detektion des Zellwand-Galactomannan-Antigens innerhalb von zwei bis drei Stunden, so daß man hier von einem Schnell test zum Nachweis luftgetragener Aspergillussporen und weiterer aerogener Mikroorganismen sprechen kann.

Der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte, batte riebetriebene Luftfiltrationskeimsammler bietet darüber hinaus die Möglichkeit der Erfassung einer persönlichen Expositionsüberprüfung nicht nur in Form eines Kurzzeit- sondern ebenfalls Langzeit-Monitorings. Der erfindungsge mäße Luftfiltrationskeimsammler ermöglicht durch seine Miniaturisierung bei geräuscharmer Aktivität eine einfach und schnell zu handhabende Luftprobennahme, die jegliche Nachteile einer sporadischen Luftprobennahme überwindet.

Für die analytische Bestimmung von Galactomannan-Antigen aus luftgetragenen Aspergillussporen wird der bislang ausschließlich für die Bestimmung von Aspergillen in Munsae ren (Aspergillose) entwickelte Platelia^(R)-Aspergillus Enzymimunoassay (Sanofi Diagnostics Pasteur) nach Modifi kation nunmehr auf dem Gebiet der Umwelthygiene/Arbeitsmedi zin eingesetzt.

Von besonderer medizinischer Relevanz sind luftgetragene Aspergillussporen, die bei Hochrisikopatienten (z. B. nach Organtransplantation, malignen Grundleiden, chronischen Erkrankungen, wie Diabetes mellitus, Alkoholismus, Tuberku lose, Aids) eine invasive Aspergillusinfektion verursachen können.

Nach umwelthygienischen und arbeitsmedizinischen Anforderun gen muß Aspergillus fumigatus als thermotoleranter Haupt keim bei der aeroben Biokompostierung auch auf Grund seiner allergischen Wirkungen (exogen-allergisches Asthma bronchia le) und der toxischen Wirkungen (Mykotoxine: z. B. Glioto xin, Fumagillin, Verrulogen) in Form eines Langzeitmonito rings erfaßt werden. Dieses wird durch das erfindungsgemäße Verfahren geleistet.

Durch Verwendung der Filterextraktionslösung bzw. aufgelö ster Filterproben nach der Anreicherung für Anzüchtung und Differenzierung sowie Bestimmung von Sporenanzahl und mittlerer Sporendurchmesser, bestimmt mittels Cell-Counter, ist eine Zuordnung bei Mitbeteiligung anderer Spezies möglich.

Weitere Vorteile und Merkmale gehen aus den Unteransprüchen hervor, die auch gemeinsam mit dem Hauptanspruch von erfin derischer Bedeutung sein können.

Im folgenden werden zwei Ausführungsbeispiele zum besseren Verständnis der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläu tert.

Es zeigt:

Fig. 1a eine Querschnittsansicht des erfin dungsgemäßen Luftfiltrationskeimsammlers im Maßstab 1 : 1;

Fig. 1b eine Draufsicht auf das Ansaugteil;

Fig. 1c eine Draufsicht auf das Filterauflageteil;

Fig. 2 Prinzipschema des modifizierten Platealia^R Aspergillus Immunoassays.

In Fig. 1a ist der erfindungsgemäße Mini-Luftkeimsammler allgemein mit 10 bezeichnet. Er weist eine zylindrische Form auf, die einen Durchmesser von 40 mm und eine Länge von 95 mm besitzt. Das Gesamtgewicht beträgt 90 g. Der Mini-Luftkeimsammler läßt sich deshalb bequem in der Brust tasche der Arbeitskleidung unterschiedlicher Personen (nicht gezeigt) tragen. Am oberen Ende des erfindungsgemä ßen Mini-Luftkeimsammlers 10 ist ein kreisrundes, mit Gewinde versehenes Ansaugteil 12 befestigt, unter dem ein ebenfalls kreisrundes Filterauflageteil 14 angeordnet ist, das über dem Radialverdichter 16 angeordnet ist. Am unteren Ende weist der erfindungsgemäße Mini-Luftkeimsammler eine Bodenplatte 18 auf, an der im inneren die Batterie und die gewünschte Elektronik befestigt sind (nicht gezeigt). Letztere werden vom Fachmann frei gewählt und sind im Handel in unterschiedlichsten Ausführungsformen erhältlich.

Das verwendete Radialgebläse 16 im Luftfiltrationskeimsamm ler ist besonders dadurch gekennzeichnet, daß es eine Deckscheibe, eine zentrische Bohrung zur Befestigung an einer Antriebswelle, eine Vielzahl teilspiralförmig von außen zur Bohrung verlau fender Laufradschaufeln umfaßt, wobei der Querschnitt A_k des Laufradschaufelkanals in seinem letzten Drittel zur Um fangskante hin kleiner wird oder konstant bleibt, in dem die Dicke der Laufradschaufel entsprechend profilartig ge staltet ist, wobei der Schaufeleintrittswinkel β₁ einen Wert < 40° aufweist, insbesondere von 55 bis 80° bei einem Gesamtgewicht einschließlich Motor von < 10 g bei einer Lei stungsaufnahme von 0,054 Watt.

Im folgenden wird ein erfindungsgemäßes Beispiel zur Durch führung der Galactomannan-Antigenbestimmung nach Modifikati on des Platelia^(R) Aspergillus-Testes (Fa. Sanofi) be schrieben.

Jeweils 50 µl Konjugat (R6) werden in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert, anschließend 50 µl Galactomannan- Standard-Lösung verschiedener Konzentrationen (0,5-6,5 ng/ml) bzw. 50 µl der zu bestimmenden Probe. Desweiteren wurde eine unbeaufschlagte Cellulosenitratmembran/5 ml für 30 min geschüttelt (200/min) und als Referenzwert mitgeführt (OD_{450 nm} = 0.120-0.130).

Die so beschickte Mikrotiterplatte wurde bei 30°C für 90 min inkubiert. Anschließend erfolgt eine 5malige Waschung mit R2-Puffer. Anschließend wurden 200 µl Substrat zugegeben (R8-Reagenz). Danach erfolgte die Inkubation bei Raumtemperatur (18-25°C) für 30 min. Abschließend wurde mit 1,5 N Schwefelsäure die enzymatische Reaktion gestoppt und bei 450 nm mittels ELISA-Readere (Softmax^R für Window^TM Molecular Devices Corp.; Ca USA) die optische Dichte be stimmt.

Untersuchungsproben: Die nach max. 7 h Ansaugzeit aus dem Luftfiltrationskeimsammler entnommenen Cellulosenitrat-Membranfilter wurden bei Raumtemperatur für 30 min unter Schütteln (200/Min) mit 5 ml steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung extrahiert. Hiervon wurden für den Immunoassay 50 µl Bestimmung des Galactomannans eingesetzt.

Die Tabelle 1 zeigt die persönliche Exposition eines Fah rers in der Kabine eines Biomüllfahrzeuges über 5 Tage hinweg, während die Tabelle 2 die persönliche Exposition eines Biomüllwerkers (Vorarbeiters) während eines Arbeitsta ges an 5 verschiedenen Tagen aufzeigt.

Claims

1. Verfahren zum Anreichern und quantitativen Bestimmen des Galactomannan-Antigens aus luftgetragenen Aspergillussporen und weiteren aerogenen Mikroorganismen, mittels eines eine Filtermembran aufweisenden Luftfiltrationskeimsammlers und entsprechender Analysengeräte, dadurch gekennzeichnet, daß der Sammler batteriebetrieben und an der Arbeitskleidung einer Person während ihrer gesamten Arbeitszeit getragen oder in geschlossenen Räumen aufgestellt wird, und während dessen 40-70 l/h Umgebungsluft durch die Filtermembran saugt und die angesaugten Keime auf letztere abscheidet, und wobei nach einer flüssigen Extraktion und/oder Auflö sung der Filtermembran ein an sich bekannter Platelia ^(R)-Aspergillus-Test durchgeführt wird, welcher dadurch modifiziert wird, daß keine Wärmevorbehandlung bei 100°C für 3 Minuten erfolgt, statt einer cut-off Probe Galactoman nan-Standard von 0,5 bis 6,5 ng und ein Referenzwert in Form einer flüssigen Extraktion von einem unbeaufschlagten Filter mitgeführt wird und daß unter Verzicht auf ein Anzüchtungsverfahren das Zellwand-Galactomannan-Antigen innerhalb einiger Stunden detektiert wird, und daß Verdün nungsstufen zur Herstellung des linearen Meßbereiches des Enzymimmunoassays angelegt werden, und daß ein Sporenauf schluß durchgeführt wird, um lösliches und zellwandgebunde nes Galactomannan zu erfassen, wodurch die Nachweisgrenze unter 1 ng/ml abgesenkt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die Anreicherung über einen Zeitraum von einem Arbeitstag (8 Std.) bis zu 4 Wochen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge kennzeichnet, daß der Luftfiltrationskeimsammler 40 bis 70 l/h durch die Filtermembran saugt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der Luftfiltrationskeimsammler an der Arbeitsklei dung in Nähe der Atmungsorgane, insbesondere an der Brustta sche, getragen wird.

5. Luftfiltrationskeimsammler zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch eine zylindrische Form mit einem Durchmesser im Bereich von 30 bis 50 mm und einer Länge von 60 bis 100 mm, die eine Filtermembran und ein batteriebe triebenes Radialgebläse bei einem Gesamtgewicht im Bereich von 90 g bis 100 g aufweist.

6. Luftfiltrationskeimsammler nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er bei einem Durchmesser von 40 mm eine Länge von 80 mm und ein Gesamtgewicht von 90 g aufweist.