DE19859486A1

DE19859486A1 - Peptide mit besonderen antiproliferativen Eigenschaften

Info

Publication number: DE19859486A1
Application number: DE1998159486
Authority: DE
Inventors: Razvan Tudor Radulescu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2000-07-06

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft antiproliferative Peptide, die in besonderem Maße antiproliferativ wirksam sind. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für diese Peptide kodieren, Peptidnukleinsäuren, deren Struktur homolog ist zu der der Nukleinsäuren, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten. Die Erfindung findet Verwendung in der Therapie von Erkrankungen, die mit einer Hyperproliferation von Zellen einhergehen, insbesondere von Krebs, Atherosklerose und Psoriasis.

Description

Derzeitiger Stand der Technik/Forschung

Im Bereich der Onkologie gibt es derzeit zahlreiche feststehende Behandlungsschemata (basierend vor allem auf Chemotherapie, Strahlentherapie und chirurgischen Operationsverfahren). Allerdings haben sich die gängigen Therapien gegen Krebs als wenig erfolgreich erwiesen. Laut einer aktuellen amerikanischen Statistik erkrankt jeder dritte lebende Amerikaner an Krebs und jeder fünfte stirbt daran. Diese Zahl dürfte weltweit zutreffen, vor allem in den hochindustrialisierten Ländern. Weiterhin ist festzuhalten, daß sich seit zwanzig Jahren die Qualität der Krebsbehandlung nicht verbessert hat, denn die Fünf-Jahres- Überlebensraten für die Mehrzahl der Krebsarten sind gleichgeblieben (R. N. Proctor, The Sciences, März/April 1995, pp. 20-24).

Einen vielversprechenden Ansatz in der Behandlung von Krebs stellen spezifische Peptide dar, die Krebs verursachende Substanzen, vor allem onkogene Proteine, blockieren. Erstmalig weltweit habe ich zusammen mit meinem Kollegen Clemens M. Wendtner einen solchen Ansatz vorgeschlagen und ausführlich beschrieben (Radulescu, R. T. & Wendtner, C. M. (3. 11. 1992) Anmeldung am Deutschen Patentamt. Aktenzeichen P 42 37 129.5; Wendtner, C. M. & Radulescu, R. T. (1992) J. Mol. Recognit. 5, 125-132). In der Folgezeit testeten v.a. zwei weitere Forschergruppen Peptide auf ihre Fähigkeit hin, die Zellteilung in vitro zu bremsen, mit Erfolg (Renschler, M. F. et at (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3623-3627; Fahraeus, R. et al. (1996) Curr. Biol. 6, 84-91).

Problem

Das Ziel meiner Überlegungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, war, antineoplastische bzw. antiproliferative Peptide zu bauen, die gegenüber den Peptiden AB bzw. BA, die in Radulescu, R. T. (1997) Deutsches Patent Nr. 196 53 445 offenbart wurden, möglichst

a) bei gleicher Konzentration wie die Peptide AB bzw. BA, die in Radulescu, R. T. (1997) Deutsches Patent Nr. 196 53 445 offenbart wurden, eine vergleichsweise viel stärkere antineoplastische bzw. antiproliferative Wirkung entfalten;
b) aufgrund des Arguments in a) Substanz einsparen, bzw. ökonomischer sind, weit der erwünschte antineoplastische bzw. antiproliferative Effekt nach kürzerer Behandlungszeit eintritt bzw. insgesamt weniger Substanz bzw. eine geringere Substanzdosis nötig ist, um den gleichen Effekt zu erzielen.

Lösung/Erreichte Vorteile/Weitere Ausgestaltung der Erfindung

Die Lösung für das obige Problem habe ich auf zweierlei Weise erreicht:

1. indem ich als Teil B eine Aminosäurensequenz, die die Konsensus- Aminosäurensequenz KRKRS für die nukleären Lokalisationssequenzen (NLS) bei Mensch und Maus umfaßt, eingesetzt habe. Obwohl die Interferone mit dem Tumorsuppressor Retinoblastomprotein (RB) funktionell verbunden sind, wie dem Fachmann bekannt ist, war es dennoch überraschend, festzustellen, wie sehr das erfindungsgemäße Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLAGKRKRSQ, das die humane gamma-Interferon-Aminosäurensequenz GKRKRSQ enthält, zum einen gegen humane Bronchialkarzinomzellen in vitro wirkt, und zwar gegen die kleinzellige Bronchialkarzinom-Zell-Linie H2O9 (RB-negativ) sowie die nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom-Zell-Linien H596 (RB-negativ) und A549 (RB-positiv), und zum anderen gegen die humane Brustkrebs- bzw. Mammakarzinom-Zell-Linie MCF-7(RB-positiv).

Dabei erreicht das erfindungsgemäße Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLAGKRKRSQ im MTT Assay, so wie er dem Fachmann geläufig ist, eine 80-95%ige Hemmung des Zellwachstums der im vorherigen Absatz genannten Tumorzell-Linien bei 50 mikromolarer Konzentration. Im Vergleich dazu bewirkt das Peptid AB (all-D) LFYKKVRQIKIWFQNRRMKWKK, das in Radulescu, R. T. (1997) Deutsches Patent Nr. 196 53 445 offenbart wurde, auch eine deutliche, jedoch vergleichsweise geringere Hemmung des Wachstums der gleichen Tumorzellen im gleichen Assay von ca. 50-60% bei 50 mikromolarer Konzentration.

Im Gegensatz zu der oben beschriebenen, nachhaltigen Wirkung auf Tumorzellen, führt das erfindungsgemäße Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLAGKRKRSQ bei 50 mikromolarer Konzentration nach 72stündiger Inkubation mit normalen humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNC) dazu, daß ca. 80 ± 10% dieser Zellen überleben bzw. lediglich ca. 20 ± 10% dieser Zellen absterben, wie anhand der Trypanblau-Methode, so wie sie dem Fachmann bekannt ist, dokumentiert werden kann.

1. indem ich als Teil A eine nach N- und C-terminal erweiterte LFYKKV-Sequenz einsetzte, und zwar so wie natürlicherweise in RB vorkommend. Aus einem anderen Zusammenhang ist zwar bereits bekannt (Baranyi, L. et al. (1995) Nature Med. 1, 894-901), daß eine solche Erweiterung um jeweils vier Aminosäuren nach N- und C-terminal, biochemisch gesehen, die Affinität der betreffenden, so erweiterten Sequenz gegenüber der Affinität der nicht erweiterten Sequenz, was die Bindung an die Zielstrukturen angeht, um einen Faktor von ca. 500 steigern kann. Dennoch war die deutliche Steigerung des biologischen Effekts überraschend, da eine Erhöhung der Bindungsaffinität eines Peptids an sein Ziel nicht immer zu einer Erhöhung der biologischen Aktivität desselben Peptids führt, s. dazu z. B. Lunec, J. et al. (1992) Melanoma Res. 2, 5-12). Das Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLARQIKIWFQNRRMKWKK gemäß der vorliegenden Erfindung ist dabei besonders wirksam zum einen gegen humane Bronchialkarzinomzellen, und zwar gegen die kleinzellige Bronchialkarzinom-Zell-Linie H2O9 sowie die nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom-Zell-Linien H596 und A549, und zum anderen gegen die humane Brustkrebs- bzw. Mammakarzinom-Zell-Linie MCF-7.

Dabei erreicht das Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLARQIKIWFQNRRMKWKK gemäß der vorliegenden Erfindung im MTT-Assay eine 80-95%ige Hemmung des Zellwachstums der im vorherigen Absatz genannten Tumorzell-Linien bei 50 mikromolarer Konzentration. Im Vergleich dazu bewirkt das Peptid AB (all-D) LFYKKVRQIKIWFQNRRMKWKK, das in Radulescu, R. T. (1997) Deutsches Patent Nr. 196 53 445 offenbart wurde, auch eine deutliche, jedoch vergleichsweise geringere Hemmung des Wachstums der gleichen Tumorzellen im gleichen Assay von ca. 50-60 % bei 50 mikromolarer Konzentration.

Im Gegensatz zu der oben beschriebenen, nachhaltigen Wirkung auf Tumorzellen, führt das erfindungsgemäße Peptid AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLARQIKIWFQNRRMKWKK bei 50 mikromolarer Konzentration nach 72stündiger Inkubation mit normalen humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNC) dazu, daß ca. 70 ± 10% dieser Zellen überleben bzw. lediglich ca. 30 ± 10% dieser Zellen absterben, wie anhand der Trypanblau-Methode dokumentiert werden kann.

Demgegenüber hemmt das klassische Chemotherapeutikum VP16 (= Etoposid) bei 50 mikromolarer Konzentration im MTT-Assay das Wachstum der o. g. Tumorzell-Linien H2O9, H596, A549 und MCF-7 zwar auch zu ca. 90%, so wie die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung (s.o.), jedoch, im Gegensatz zu diesen erfindungsgemäßen Peptiden, hat VP16 den grundlegenden Nachteil, daß es in gleicher Konzentration auch den Zelltod der Mehrheit (< 60%) der normalen Zellen, und zwar von humanen PBMNC, wie im Trypanblau-Test zu sehen, herbeiführt. Damit ist offensichtlich, daß die Zytotoxizität von VP16 nicht selektiv ist für Tumorzellen, sondern daß VP16 sowohl für Tumorzellen als auch für normale Zellen gleichermaßen toxisch ist. Dies ist auch die Ursache dafür, daß klassische, unspezifische Chemotherapeutika im Patienten erhebliche Nebenwirkungen verursachen, insbesondere eine Zytopenie, die einhergeht mit einer erheblichen Infektionsgefährdung aufgrund des Mangels an normalen Leukozyten (= weißen Blutkörperchen), einer Blutungsgefahr aufgrund des Mangels an normalen Thrombozyten (= Blutplättchen) sowie einer Anämie (= Blutarmut) und der daraus resultierenden Gefährdung der Sauerstoffversorgung des Körpers, insbesondere des Herzens und des Zentralnervensystems, aufgrund des Mangels an normalen Erythrozyten (= roten Blutkörperchen). All diese Nebeneffekte der Chemotherapie gefährden also das Leben des Patienten.

Damit ist der Vorteil der Peptide AB (all-D) TSLSLFYKKVYRLAGKRKRSQ und (all-D) TSLSLFYKKVYRLARQIKIWFQNRRMKWKK gemäß dervorliegenden Erfindung gegenüber Chemotherapeutika wie z. B. VP16 offenkundig. Fast die Gesamtheit der Tumorzellen, jedoch nur eine Minderheit der normalen Zellen wird von diesen erfindungsgemäßen Peptiden zerstört. Damit ist die antiproliferative Wirkung dieser besonders wirksamen Substanzen selektiv gegen Tumorzellen und erfüllt damit die Grundvoraussetzung einer optimalen Therapie gegen Krebserkrankungen.

Weiterhin möchte ich anmerken, daß meine vorliegende Erfindung so konzipiert ist, daß sie alle wesentlichen Varianten der o. g. Peptide umfaßt, und zwar die all-L-Formen, die all-D-Formen, die retro-inverso-lsomere der hier vorgestellten Grundgerüste sowie die entsprechenden Permutationen von L- und D-Form jeder einzelnen Aminosäure der jeweiligen Peptide (z. B. für TSLSLFYKKV als Teil A des erfindungsgemäßen Peptids AB bzw. BA ergeben sich 2¹⁰ Varianten, wobei eine mögliche Isoform D-Thr L-Ser L-Leu L-Ser L-Leu L-Phe L-Tyr L-Lys L-Lys L-Val ist).

Jedes der erfindungsgemäßen Peptide wird nach der Solid-Phase-Methode synthetisiert, so wie sie dem Fachmann geläufig ist (s. z. B. Grant, G., Synthetic Peptides, W. H. Freeman & Company, New York, 1992; Jameson, B. A. et al., (1994), Nature 368, 744-746; Brady, L. & Dodson, G., (1994), Nature 368, 692-693; Glass, D. B. (1994), Nature 370, 334).

Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung werden lokal und/oder systemisch, so wie es dem Fachmann geläufig ist, dem Patienten verabreicht. Als lokale Anwendung kommen beispielsweise eine topische und/oder intratumorafe Gabe in Frage. Die systemische Anwendung erfolgt beispielsweise intravenös, oral oder subkutan.

Aufgrund Ihrer Konzeption wirken die erfindungsgemäßen Peptide in besonderem Maße gegen alle Tumorzellen, die ein defektes Retinoblastomgen bzw. -protein aufweisen. Sie wirken jedoch auch gegen Tumorzellen, die ein intaktes Retinoblastomgen bzw. -protein aufweisen. Besondere Wirksamkeit besteht gegen Bronchial- und Mammakarzinomzellen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Besonders wirksames antiproliferatives Peptid AB oder BA bestehend aus:

- einem antiproliferativen Teil (A), der ein Peptid ist, das die Aminosäurensequenz TSLSLFYKKV oder eine dazu hydropathisch homologe Aminosäurensequenz umfaßt,
- einem Teil (B), der ausgewählt ist unter
- a) einem Peptid, das die Aminosäurensequenz KRKRS umfaßt
- b) einem Peptid, das eine zur Aminosäurensequenz KRKRS hydropathisch homologe Aminosäurensequenz umfaßt
- c) einem Peptid, das die Aminosäurensequenz RQIKIWFQNRRMKWKK umfaßt.

2. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid ausgewählt ist unter

a) (all-D) TSLSLFYKKVYRLAGKRKRSQ
b) (all-D) TSLSLFYKKVYRLARQIKIWFQNRRMKWKK

3. Nukleinsäure (DNA/RNA) kodierend für ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2, entsprechend dem genetischen Code.

4. Peptidnukleinsäure, deren Struktur homolog ist zu der einer Nukleinsäure nach Anspruch 3.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein oder mehrere Peptide nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

6. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Proliferation bzw. Hyperproliferation von Zellen einhergehen.

7. Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 3 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Proliferation bzw. Hyperproliferation von Zellen einhergehen.

8. Verwendung einer Peptidnukleinsäure nach Anspruch 4 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Proliferation bzw. Hyperproliferation von Zellen einhergehen.

9. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Proliferation bzw. Hyperproliferation von Zellen einhergehen.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Erkrankung ein benigner Tumor, ein maligner Tumor, Atherosklerose oder Psoriasis ist.