DE19829982A1 - Verfahren zur Ansteuerung eines Laser-Scanning-Mikroskopes mit einem kippbaren Feinfokussiertisch - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Darstellung von dreidimensionalen Punktverteilungen in einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einem kippbaren Feinfokussiertisch, DOLLAR A wobei eine tatsächliche abgerasterte erste Rasterpunktverteilung (OR1) mit einer rechnerisch erzeugten zweiten Rasterpunktverteilung (OR2) verglichen wird und bei Übereinstimmung von Rasterpunkten in beiden Verteilungen die ersten Rasterpunkte zur Darstellung in der zweiten Rasterpunktverteilung (OR2) herangezogen werden, während bei Nichtübereinstimmung DOLLAR A aus in der Umgebung von zweiten Rasterpunkten liegenden Punkten der ersten Rasterpunktverteilung (OR1) Zwischenwerte gebildet werden, deren Lage der Lage der zweiten Rasterpunkte entspricht, DOLLAR A oder besonders vorteilhaft anhand einer rechnerisch vorgegebenen zwei- oder dreidimensionalen Rasterpunktverteilung eine Verstellung der X/Y-Scanner des Mikroskops und/oder DOLLAR A der Tischverkippung derart erfolgt, daß die in und/oder auf einem Objekt abgetasteten Rasterpunkte vollständig oder teilweise mit einer vorgegebenen, vorzugsweise abgespeicherten, Rasterpunktverteilung übereinstimmt.

Description

Aus DE 196 50 392 ist ein kompakter Mikroskoptisch zur Feinfokussierung bekannt.

Eine schnelle und hochpräzise Feinfokussierung (Translation) eines Objektes in Richtung der optischen Achse z wird weiterhin mit einem Feinfokussiertisch ermöglicht, der aus einem Rahmen besteht, in welchem sich eine Zunge bewegt, die auf einer Seite über ein Festkörpergelenk mit dem Rahmen verbunden ist, auf der anderen Seite mit einem hochpräzisen Galvanometer-Scanner in die gewünschte z-Position gestellt wird. Die Winkelbewegung des Scanners wird über ein Zugmittel, welches über die Welle des Scanners abläuft, auf die Tischzunge übertragen. Die Tischzunge, und damit das dort gehalterte Objekt werden somit im Zuge der Feinfokussierbewegung um die Achse des Festkörpergelenkes gekippt bzw. gedreht und damit unter einen Winkel q¹90° zur optischen Achse z gestellt. Als Folge dieser Kippbewegung tritt ein Lateralversatz Dr des Objektes in der xy-Ebene auf, der insbesondere dann von nicht vernachlässigbarer Größe ist, wenn sich das Objekt wie in den meisten praxisrelevanten Fällen, nicht exakt in derjenigen Ebene befindet, in welcher die Drehachse der Tischzunge liegt. Die Drehachse A der Tischzunge ist, wie in den Bildern gezeigt stets senkrecht zur optischen Achse z orientiert.

Bisher wurde stets ein Seil als Zugmittel zur Übertragung der Scannerbewegung auf die Tischzunge verwendet (DE 196 50 392).

Das bietet vielfältige Nachteile: Das Seil besteht im allgemeinen aus einigen verdrillten Drähten, weil ein Einzeldraht entweder nicht flexibel genug (zu dick) oder nicht belastbar genug (zu dünn) ist. Beim Ablaufen des durch die Gewichtskraft der Zunge und durch die Federkraft der Federgelenke gespannten Seils über die Scannerachse werden diese Einzeldrähte nun im Wechsel auf- und wieder zusammengedrillt. Das verursacht eine Längenänderung des Seils, welche sich unmittelbar auf die Tischzunge überträgt. Damit wird die Präzision bzw. Reproduzierbarkeit, mit welcher die Tischzunge in eine beliebige Position gestellt werden kann, nachhaltig verschlechtert. Außerdem treten bedeutende Umkehrlose auf, welche wiederum die Präzision verschlechtern. Ebenfalls ist die Belastbarkeit eines solchen Seiles sehr begrenzt. Daher ist ein derartiger Tisch für das Feinfokussieren im sub-100 nm Bereich, für welchen er eigentlich konzipiert wurde, in der Praxis faktisch untauglich.

Ein dreidimensionales (3D-)Bild, das mit einem konfokalen Laser-Scanning- Mikroskop (K.LSM) aufgezeichnet wird, besteht im allgemeinen aus einer Anzahl (Stapel) von punkteweise abgetasteten xy-Schnittebenen, welche sukzessive bei schrittweise aufeinanderfolgenden Positionen entlang der z-Achse eingezogen werden. Das xy-Raster der einzelnen Schnittebenen wird dabei erzeugt, indem ein Laserstrahl mittels eines Strahlablenkungssystems (z. B. mittels zweier Galvanometer-Scanner) auf die einzelnen Bildpunkte gelenkt wird. Dieses Raster ist für alle Ebenen des Stapels dasselbe. Das z-Raster wird erzeugt, indem das Objekt parallel entlang der z-Achse verschoben wird.

Das rechnergestützte Bildverarbeitungssystem des KLSM ordnet die den einzelnen Schnittebenen zugehörenden Bildpunkte nun parallel übereinander, d. h. in einem Quader-Raster an, um daraus das 3D-Bild zu rekonstruieren. Das Quader-Raster wird in Fig. 1a gezeigt. Hierbei wird vorausgesetzt, daß alle tatsächlichen Schnittebenen im Objekt 1.) exakt parallel zueinander verlaufen und 2.) entlang der z-Achse exakt übereinanderliegen. Werden diese Voraussetzungen erfüllt, so ist das vom Rechner rekonstruierte Bild eine 1 : 1 Abbildung der Realität. Das ist aber nur der Fall, wenn die z-Bewegung des Objektes entlang der optischen Achse erfolgt.

Wird hingegen ein z-Tisch mit galvanometrisch angetriebener Kippzunge bei der Aufnahme des 3D-Bildes eingesetzt so sind diese Voraussetzungen nicht länger erfüllt. Wegen des Kippens der Zunge sind 1) die einzelnen Schnittebenen nicht parallel zueinander und wegen des Lateralversatzes, der eine Funktion von z ist, liegen sie 2.) nicht übereinander. Die z-Bewegung des Objektes bezüglich der optischen Achse erfolgt auf einem Kreisabschnitt (Fig. 1b).

Das Raster im Objekt (Bildfeld) ist damit kein Quader-Raster. Um die Abweichungen vom Quader-Raster zu untersuchen, reicht es aus, eine Ebene zu betrachten, welche parallel zur optischen Achse orientiert ist.

In Fig. 2 wurden eine solche Ebene Ei aus dem Objekt-Raster und eine Ebene E2 aus dem Quader-Raster übereinandergelegt, um die Abweichungen sichtbar zu machen.

Wird das 3-D-Bild des abgetasteten Objektes auf konventionelle Art und Weise der KLSM vom Rechner rekonstruiert, so erfolgt die Zuordnung der Rasterpunkte aus dem Objekt der Ebene El auf das Quader-Raster der Ebene E2 gemäß einem Algorithmus, der durch die Pfeile in Fig. 2 dargestellt ist. Damit ist die 1 : 1 Abbildung aber nicht länger gegeben. Durch die Transformation des Rasters findet eine unvorteilhafte Verzerrung des realen Bildes statt.

Aufgabe der Erfindung ist eine hochpräzise und verzerrungsfreie dreidimensionale Abtastung mittels eines Laser-Scanning-Mikroskopes.

Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Vorteilhaft wird in einem kippbaren Feinfokussiertisch anstelle eines Seiles ein Band eingesetzt. Dieses Band kann beispielhaft aus Edelstahl, Kupfer-Berillium, glas- oder kohlefaserverstärktem Kunstoff ausgeführt sein. Durch Laborversuche wurde mit einem Band der Dicke 0.2 mm und der Breite 3 mm nachgewiesen, daß die genannten Nachteile dann nicht länger auftreten. (D.h. es wurden eine Präzision von 30 nm und Einzelschritte sowie Umkehrlose 10 nm erreicht, was mit einem Seil unmöglich war).

Durch ein Ansteuerverfahren gemäß Anspruch ergeben sich folgende Vorteile:

• 1. Es ist nunmehr möglich Bilder von einzelnen Ebenen oder Linien aufzuzeichnen, welche eine völlig beliebige Orientierung im xyz-Raum des Objektes aufweisen.
• 2. Ein Bildstapel muß nicht mehr zwangsläufig aus einzeln abgerasterten xy-Ebenen bestehen, welche sukzessive entlang der z-Achse eingezogen wurden. Vielmehr ist es nun ebenfalls möglich, den Stapel aus xz-Ebenen oder yz-Ebenen aufzubauen, welche sukzessive entlang der y bzw. x Achse eingezogen werden. Im allgemeinsten Fall besteht der Stapel aus parallelen Ebenen, welche beliebig im xyz-Raum orientiert sind. Das sukzessive Einziehen der Bildpunkte einzelner Ebenen erfolgt dann entlang derjenigen Achse, welche senkrecht auf dieser beliebig orientierten Ebene steht.
• 3. Aus einem frei festlegbaren Raster im Objekt - vorzugsweise einem Quader- Raster - können beliebige einzelne Rasterpunkte ausgewählt werden und in völlig freier Reihenfolge abgetastet werden. Das 3-D-Bild wird dann nicht länger aus einzelnen Ebenen aufgebaut, sondern vielmehr aus einer beliebigen Anzahl von einzelnen Bildpunkten in beliebiger Abfolge. Innerhalb des Rasters (z. B. des Quader-Rasters) werden lediglich diese Bildpunkte dargestellt.

In Fig. 6 sind schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein Scankopf S dargestellt, die eine gemeinsame optische Schnittstelle über eine Zwischenabbildung aufweisen und ein LSM bilden. . Der Scankopf S kann sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskopes sowie auch an einen seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskopes angesetzt werden. Es ist ein zwischen Auflichtscan und Durchlichtscan mittels eines schwenkbaren Spiegels 14 umschaltbarer mikroskopischer Strahlengang dargestellt, mit Lichtquelle 1, Beleuchtungsoptik 2, Strahlteiler 3, Objektiv 4, Probentisch 5, Kondensor 6, Lichtquelle 7, Empfängeranordnung 8 , einer ersten Tubuslinse 9, einem Beobachtungsstrahlengang mit einer zweiten Tubuslinse 10 und einem Okular 11 sowie einem Strahlteiler zur Einkopplung des Scanstrahls dargestellt.

Ein Lasermodul 13.1, 13.2 nimmt die Laser auf und ist über Monomode- Lichtleitfasern 14.1, 14.2 mit der Lasereinkoppeleinheit des Scankopfes S verbunden.

Die Einkopplung der Lichtleitfasern 14.1, 14.2 erfolgt mittels einer verschieblichen Kollimationsoptik sowie Strahlumlenkelementen 17.1, 17.2. Mittels eines teildurchlässigen Spiegels 18 wird ein Überwachungsstrahlengang in Richtung einer Monitordiode 19, der, vorteilhaft auf einem nicht dargestellten drehbaren Filterrad Linienfilter 21 sowie Neutralfilter 20 vorgeordnet sind, ausgeblendet.

Die eigentliche Scaneinheit besteht aus Scanningobjektiv 22, X/Y-Scanner 23, Hauptstrahlteiler 24 und einer gemeinsamen Abbildungsoptik 25 für Detektionskanäle 26.1-26.4.

Ein Umlenkprisma 27 hinter der Abbildungsoptik 25 spiegelt die vom Objekt 5 kommende Strahlung in Richtung dichroitischer Strahleiler 28 im konvergenten Strahlengang der Abbildungsoptik 25, denen in Richtung und senkrecht zur optischen Achse verstellbare und in ihrem Durchmesser veränderbare Pinholes 29, individuell für jeden Detektionskanal sowie Emissionsfilter 30 und geeignete Empfängerelemente 31 (PMT) nachgeordnet sind.

Ansteuereinheit/Rechnereinheit 34 ist vorgesehen, die unter anderem mit dem Tisch 5 und den Scannern 23 verbunden ist und sie ansteuert.

In Fig. 7 ist der erfindungsgemäße Feinfokussiertisch 5 dargestellt. In einer Tischhalterung T ist eine Zunge Z an einer Seite mittels eines Gelenkes G und an der anderen Seite an einem biegewechselfesten Band konstanter Länge B gehaltert.

Das Band ist an einer Bandhalterung BH befestigt, die mittels der (nicht sichtbaren) Welle eines Galsvanometerscanners GS drehbar ist.

Das Ablaufen des Bandes B über die Welle der Bandhalterung wird damit bei einer Drehung der Scannerwelle in eine vertikale Bewegung der Zunge Z übertragen, welche eine Vertikalbewegung des in einer Aussparung A, beispielsweise für eine Petrischale, mittels Objekthalter OH gehalterten Objektes bewirkt.

Der Scanner wird über einen elektrischen Anschluß AS angesteuert, der mit der Ansteuereinheit 34 verbunden ist.

Erfindungsgemäß werden weiterhin Verfahren vorgeschlagen, welche die 1 : 1 Abbildung auch bei Einsatz eines z-Tisches mit galvanometrisch angetriebener Kippzunge sicherstellen.

1. Die Neigung der Zunge (90°-q) und der daraus folgende Lateralversatz Dr eines abgetasteten Punktes (siehe Bild 3) können für jeden Rasterpunkt im Objekt (xyz) während der Bildaufnahme bestimmt und abgespeichert werden. Hierzu gibt es erfindungsgemäß zwei Möglichkeiten: a. Neigung und Lateralversatz werden aus der Ansteuerspannung des Scanners, welcher eine definierte Drehung der Welle zugeordnet werden kann, und aus den bekannten geometrischen Dimensionen (Durchmesser der Wellen und Abstände) berechnet. b. Neigung und Lateralversatz können ebenfalls mit einem separaten Meßsystem bestimmt werden.

Anschließend wird aus diesen Daten mit Hilfe eines Bildverarbeitungsprogrammes das tatsächlich im Objekt abgerasterte 3D-Bildfeld vom Rechner rekonstruiert. Bildinformationen werden grundsätzlich nur in Form des in Bild 1 links gezeigten realen Objekt-Rasters dargestellt und weiterverarbeitet.

Hier tritt aber eine hohe Menge an zu speichernden Daten auf, die rechnerisch zu verarbeiten ist.

Es ist sowohl anschaulicher als auch rechentechnisch einfacher, wenn zur Darstellung des 3-D-Bildfeldes ebenfalls ein Quader-Raster verwendet wird. Das reale Objekt-Raster OR1 wird daher auf ein künstlich durch den Rechner erzeugtes Quader-Raster OR2 projiziert. Wie in Fig. 3 gezeigt wird, werden Raster-Punkte aus dem Objekt-Raster, die mit solchen aus dem Quader-Raster zusammenfallen, beibehalten, d. h. die Bildinformation dieser Punkte wird 1 : 1 übernommen (z. B. Punkt C). Die Bildinformation anderer Punkte des Quader-Rasters (wie A und B), welche nicht im Objekt-Raster enthalten sind, wird durch Inter- bzw. Extrapolation aus der Bildinformation der jeweils benachbarten Punkte im Objekt-Raster gewonnen. Das veranschaulichen die Pfeile in Fig. 3. Rasterpunkt A wird bestimmt aus der Bildinformation der Punkte 1, 2, 3 und 4 im Objekt-Raster Rasterpunkt B aus 2 und 4. Die Bildinformation der Punkte 1, 2, 3 und 4 (2 und 4) wird dabei mit dem Abstand zum Punkt A (B) gewichtet, um dessen Bildinformation zu erhalten.

2. Der unter 1. beschriebene Rechenaufwand läßt sich a priori vermeiden, wenn im Objekt stets ein 3-D-Quader-Raster abgetastet wird, das aus parallelen und exakt übereinanderliegenden Schnittebenen aufgebaut ist. Erfindungsgemäß wird dabei ein z-Tisch mit galvanometrisch angetriebener Kippzunge eingesetzt. Damit ist es möglich, das Objekt in x,y und z schnell abzutasten. Dabei kommt keiner der 3 Koordinaten eine Vorzugsrolle zu. Diese hohe Symmetrie beim Abrastern des Objektes soll nun erfindungsgemäß genutzt werden. Durch vorteilhafte Synchronisation aller 3 Scanner wird erreicht, daß die Bildinformation nur dann aufgezeichnet wird, wenn der jeweilige Rasterpunkt im Objekt mit einem des Quader-Rasters zusammenfällt. Wird beispielhaft eine xy Ebene (senkrecht zur optischen Achse z) abgerastert, so wird die Neigung q der Zunge dem jeweiligen Abstand r dieses Punktes von der Drehachse A der Zunge angepaßt, so daß alle Raster-Punkte jeder Ebene dieselbe z-Koordinate aufweisen. Fig. 4 illustriert dieses Vorgehen am Beispiel zweier Punkte A und B, welche in einer gemeinsamen Ebene E senkrecht zur optischen Achse z liegen. Sobald die Ablenkung des Laserstrahls mit den xy-Scannern auf Punkt B des zunächst nur vom Rechner erzeugten und dort vorhandenen Rasters OR2 gerichtet ist, wird die Neigung der Tischzunge q1 mit dem z-Scanner über ein Offset eingestellt. Trifft der Laserstrahl hingegen Punkt A so wird synchron dazu die Neigung der Tischzunge q2 eingestellt usw. für alle anderen Punkte jeder Ebene. Die Zunge wird dabei umso stärker geneigt, je näher die Rasterpunkte sich in xy am Drehpunkt der Zunge befinden.

Darüber hinaus kann jeder im Zuge der z-Bewegung der Zunge oder aus anderen Gründen auftretende laterale Versatz Dr eines in einer abgerasterten Ebene liegenden Bildpunktes A kompensiert werden, indem die Ablenkung des Laserstrahles in xy um exakt den Betrag -Dr korrigiert wird. Hierzu wird das Offset der x und y-Galvanometerscanner entsprechend eingestellt.

Durch kontinuierliche, rasterpunktweise Aufeinanderabstimmung der xyz-Auslenker (Scanner) während der Aufnahme eines 3-D-Bildes wird damit im Objekt ein echtes Quader-Raster OR1 abgetastet, das mit konventionellen Methoden der Bildverarbeitung erfindungsgemäß problemlos dargestellt und weiterverarbeitet werben kann, weil es mit dem vom Rechner vorgegebenen und in trivialer Weise unterstützten Quader-Raster OR2 exakt übereinstimmt.

Vorteilhaft kann erfindungsgemäß der in Fig. 5 dargestellte Ablauf bei der Aufnahme eines in der Praxis sehr häufig anzutreffenden 3-D Quaders verwirklicht werden:

Die Drehachse A entspricht der x-Achse, die Auslenkung des Laserstrahles entlang dieser Achse erfolgt mit dem x-Galvanometerscanner. Entlang der y-Achse wird der Strahl mit dem y-Scanner ausgelenkt. Die optische Achse ist z. Die Drehung der Tischzunge erfolgt mit dem z-Scanner um die x-Achse, d. h. die Tischzunge bildet den Winkel q mit der y-Achse und den Winkel 90°-q mit der z-Achse.

Vom Rechner wird der Rasterpunkt 1 als Startpunkt vorgegeben. Der Rechner ermittelt aus den 3 Koordinaten xyz des Punktes, die diesem Punkt im Objekt entsprechende Neigung der Zunge q und den Lateralversatz Dy (Dx=0). Hieraus werden die Ansteuerspannungen für den x, den y und den z-Scanner berechnet und die Scanner entsprechend ausgelenkt, damit der Laserstrahl im Objekt exakt den geforderten Punkt trifft. Anschließend wird die Bildinformation dieses Punktes aufgezeichnet.

Der nächste Rasterpunkt 2 hat dieselbe x-Koordinate wie Punkt 1, beide Punkte befinden sich auf einer Linie. Punkt 2 wird erreicht, indem die Auslenkung des x-Scanners verändert wird, die Auslenkung der y- und z-Scanner wird beibehalten.

Anschließend wird die Bildinformation dieses Punktes aufgezeichnet.

Analog wird verfahren für die darauffolgenden Punkte 3 . . . J, die alle zu dieser Linie gehören.

Im Anschluß daran wird in analoger Weise die nächste, übernächste usw. Linie abgerastert.

Beim Anfahren des jeweils ersten zu einer Linie gehörenden Punktes (z. B. J+1) wird die Auslenkung der y- und z-Scanner korrigiert, um die geänderte Neigung und den geänderten Lateralversatz an diesem Punkte wieder zu kompensieren, während die Auslenkung des x-Scanners beibehalten wird.

Am Punkt K sind alle zur obersten Ebene gehörenden Linien mit den entsprechenden Bildpunkten abgetastet, der Punkt K+1 gehört der nächsten Ebene an. Beim Anfahren des ersten zu einer Ebene gehörenden Punktes (z. B. K+1) wird die Auslenkung der y- und z-Scanner korrigiert, um die geänderte Neigung und den geänderten Lateralversatz an diesem Punkte wieder zu kompensieren, während die Auslenkung des x-Scanners beibehalten wird. Jede neue Ebene wird wieder linienweise abgetastet, bis der letzte Bildpunkt N, der zur letzten Linie der letzten Ebene gehört, erreicht ist.

Dieser Ablauf bietet den Vorteil, daß stets mit einem minimalen Aufwand an Auslenkungen der x, y- und z-Scanner von-einem Bildpunkt zum nächsten gelangt wird.

Wegen der Symmetrie des Scannens in den 3 Koordinaten xyz ist diese Vorschrift nicht zwingend einzuhalten, es können beliebige Algorithmen der Scanneransteuerung/Abfolge beim Abtasten eines vorgegebenen Rasters verwirklicht werden, beispielsweise kann der Stapel ebenfalls aus yz-Ebenen usw. aufgebaut werden. Im allgemeinen Fall werden die Auslenkungen der xy und z-Scanner für jeden Punkt des Rasters individuell berechnet und eingestellt, bevor die Bildinformation aufgezeichnet wird.

Es ist nicht notwendig, daß sich die Scanner während der Aufzeichnung der Bildinformation in Ruhe befinden. Die Aufzeichnung kann während der Bewegung der Scanner erfolgen, wenn von der Auswerteelektronik ein Zeitfenster festgelegt wird, innerhalb welchem die Bildinformation gewonnen wird. Dieses Zeitfenster bestimmt dann gleichzeitig die Größe der Rasterpunkte im Objekt.

Claims (3)

1. Feinfokussiertisch, insbesondere für ein Laser-Scanning- Mikroskop, mit einer motorisch oder galvanometrisch verstellbaren Kippzunge, wobei die Anlenkung der Kippzunge an die Verstellmittel mittels mindestens eines biegsamen zugfesten Bandes, insbesondere aus glasfaserverstärktem Kunststoff erfolgt.

2. Verfahren zur Darstellung von dreidimensionalen Punkteverteilungen in einem Laser-Scanning- Mikroskopes mit einem kippbaren Feinfokussiertisch, wobei eine tatsächliche abgerasterte erste Rasterpunktverteilung (OR1) mit einer rechnerisch erzeugten zweiten Rasterpunktverteilung (OR2) verglichen wird und bei Übereinstimmung von Rasterpunkten in beiden Verteilungen die ersten Rasterpunkte zur Darstellung in der zweiten Rasterpunktverteilung (OR2) herangezogen werden, während bei Nichtübereinstimmung aus in der Umgebung von zweiten Rasterpunkten liegenden Punkten der ersten Rasterpunktverteilung (OR1) Zwischenwerte gebildet werden, deren Lage der Lage der zweiten Rasterpunkte entspricht.

3. Verfahren zur Ansteuerung eines Laser-Scanning- Mikroskopes mit einem kippbaren Feinfokussiertisch, wobei anhand einer rechnerisch vorgegebenen zwei- oder dreidimensionalen Rasterpunktverteilung eine Verstellung der X/Y-Scanner des Mikroskopes und/oder der Tischverkippung derart erfolgt, daß die in und/oder auf einem Objekt abgetasteten Rasterpunkte vollständig oder teilweise mit einer vorgegebenen, vorzugsweise abgespeicherten Rasterpunktverteilung übereinstimmt.