DE19819962A1

DE19819962A1 - Hochaktive alkalische Phosphatase

Info

Publication number: DE19819962A1
Application number: DE19819962A
Authority: DE
Inventors: Werner Hoelke; Rainer Mueller; Helmut Burtscher; Jose Luis Millan
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-05-05
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 1999-11-11
Also published as: ZA993079B; EP0955369B1; EP0955369A2; NZ335500A; EP0955369A3; AU2692699A; US6406899B1; AU765392B2; DE59913343D1; ATE323769T1; JPH11332586A; JP4295386B2

Abstract

DNA kodierend eine eukaryontische hochaktive Alkalische Phosphatase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg, wobei der Aminosäurerest an der Position 322 kleiner als Aspartat ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA kodierend eine eukaryontische hochaktive alkalische Phospha tase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA, sowie einen Vektor enthaltend die erfindungsge mäße DNA sowie eine Zellinie enthaltend diesen Vektor. Die Erfindung betrifft weiterhin eine rekombinante hochaktive alkalische Phosphatase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg, die durch die erfindungsgemäße DNA kodiert wird.

Alkalische Phosphatasen (AP) sind dimere, zinkhaltige, nichtspezifische Phosphomonoesterasen, die in allen Organismen, von E.coli bis Säugern vorkommen (McComb et al., 1979). Der Ver gleich der Primärstruktur verschiedener alkalischer Phosphatasen ergab einen hohen Homo logiegrad (25-30% Homologie zw. E. coli- und Säuger-AP) (Millán, 1988; Harris, 1989).

Im Menschen und höheren Tieren besteht die AP-Familie aus vier Mitgliedern, die auf verschie denen Genloci codiert sind (Millán, 1988; Harris 1989). Zur alkalischen Phosphatase-Familie zählen die gewebespezifischen APs (Placenta-AP (PLAP), Keimzellen-AP (GCAP) und Darm- AP (IAP)) und die nicht-gewebespezifischen APs (TNAP), die vorwiegend in Leber, Niere und Knochen lokalisiert sind.

Eine entscheidende Eigenschaft der bislang bekannten APs ist die große Variabilität in der kata lytischen Aktivität der Säuger-APs, die eine 10-100-fach höhere spezifische Aktivität besitzen als die E.coli AP. Unter den Säuger-APs zeigt die AP aus dem Rinderdarm (bIAP) die höchste spe zifische Aktivität. Diese Eigenschaft macht die bIAP attraktiv für biotechnologische Anwen dungen wie Enzymkonjugate als diagnostisches Reagenz oder Dephosphorylierung von DNA. Besman und Coleman belegten 1985 die Existenz zweier IAP-Isoenzyme im Rinderdarm, die IAP aus dem Kälberdarm und die IAP aus dem Darm eines erwachsenen Kindes (bIAPs) durch aminoterminale Ansequenzierung der chromatographisch aufgereinigten AP-Fraktionen. Dabei wurde eine klare Unterscheidung am Aminoterminus zwischen der bIAP des erwachsenen Kin des (LVPVEEED) und der bIAP aus dem Kälberdarm (LIPAEEEN) beschrieben. Weissig et al. gelang 1993 durch Klonierung eine genaue biochemische Charakterisierung einer rekombinanten bIAP (bIAP I) mit einer spezifischen Aktivität von ca. 3000 U/mg und dem N-Terminus LVPVEEED. Es sind jedoch auch bIAPs aus Kälberdarm mit spezifischen Aktivitäten bis zu 8000 U/mg kornmerziell erhältlich (Boehringer Mannheim, Biozyme, Oriental Yeast), die aber bislang nicht weiter charakterisiert waren. Sämtliche Versuche, diese hochaktiven alkalischen Phosphatasen zu klonieren, schlugen fehl. Die Herstellung einer rekombinanten, hochaktiven alkalischen Phosphatase war daher nicht möglich. Um jedoch eine wirtschaftliche Herstellung der hochaktiven alkalischen Phosphatase zu sichern, ist die Möglichkeit der rekombinanten Herstellung zwingend erforderlich.

Demzufolge war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, hochaktive alkalische Phosphatasen zur Verfügung zu stellen, die zudem klonierbar sind. Hochaktiv im Sinne der vorliegenden Erfin dung bedeutet, daß die erfindungsgemäße alkalische Phosphatase eine um mindestens 10% ge steigerte Aktivität gegenüber vorbekannten alkalischen Phosphatasen aufweist.

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung einer DNA kodierend eine eukaryontische hochaktive alkalische Phosphatase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg, bevorzugt mindestens 3500 U/mg, wobei der Aminosäurerest an der Position 322 kleiner ist als Aspartat. Bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine eukaryontische DNA. Besonders bevorzugt ist eukaryontische cDNA, das heißt eine DNA, die keine Introns mehr ent hält. Unter dem Ausdruck "Aminosäurerest kleiner als Aspartat" ist jede Aminosäure, bevorzugt sind natürliche bzw. von diesen abgeleitete Aminosäuren, zu verstehen, die eine kleinere räumli che Ausdehnung als die Struktur der Aminosäure Aspartat aufweist. Bevorzugt ist die erfin dungsgemäße DNA, bei der der Aminosäurerest 322 Glycin, Alanin, Threonin, Valin oder Serin ist. Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße DNA, bei der der Aminosäurerest 322 Gly cin oder Serin ist. Ganz besonders bevorzugt ist, daß der Aminosäurerest 322 Glycin ist. Eine DNA gemäß SEQ ID No.: 1, 3 und 5 (Fig. 1, 3, 5) und die zugehörige Aminosäuresequenz ge mäß SEQ ID No.: 2, 4 und 6 (Fig. 2, 4, 6) sind Teil der vorliegenden Erfindung. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls solche cDNAs, die sich von den obengenannten nur darin unterscheiden, daß der N-Terminus länger oder kürzer ist im Vergleich zu den cDNAs gemäß SEQ ID No.: 2, 4 und 6. Entsprechend verändert sich dann die Bezeichnung für die Position 322 gemäß SEQ ID No.: 2, 4 und 6. Ist beispielsweise der N-Terminus um x Aminosäuren gegenüber der SEQ ID No.: 2, 4 und 6 verlängert oder verkürzt, wird die relevante Position 322 ebenfalls um x Aminosäuren verschoben.

SEQ ID No.: 1 enthält den DNA-Code für die Sequenz des hochaktiven bIAPII-Isoenzyms. Das native Enzym war bekannt, jedoch nicht charakterisiert und nicht klonierbar. Somit ist Gegen stand der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Aminosäuresequenz des hoch aktiven bIAPII-Isoenzymes. Zur Sequenzbestimmung wurde eine hoch aufgereinigte Fraktion mit hoher spezifischer Aktivität aus dem Kälberdarm (Boehringer Mannheim) verwendet. Durch Spaltung mit den Endoproteinasen LysC, AspN, GluC, Trypsin sowie Bromcyan wurden peptide maps der hochaktiven AP erzeugt. Die so erzeugten Peptide wurden getrennt und mittels reversed phase HPLC isoliert. Über Elektrospray Massenspektroskopie wurde jedes Peptid analysiert und mit tels Edman-Abbau sequenziert. Die so erhaltenen Sequenzen wurden mit der veröffentlichten Se quenz der bIAP I (Weissig et al., 1993) verglichen. Wie erwartet besitzt der Aminoterminus von bIAP II die Startsequenz LIPAEEEN, wie von Besman und Coleman beschrieben (J. Biol. Chem. 260, 11 190-11 193 (1985)). Die komplette Aminosäuresequenz der bIAP II ist gemäß SEQ ID No.: 2 (Fig. 2) dargestellt. Danach weist die bIAP II insgesamt 24 Aminosäureaustausche zu bIAP I auf. Die Zahl der Aminosäuren beträgt im isolierten hochaktiven bIAP II Isoenzym 480 Aminosäuren. Die Nukleotidsequenz von 1798 bp (Fig. 1) beinhaltet einen kodierenden Be reich von 514 Aminosäuren. Die von Position 481 bis einschließlich 514 möglichen Amino säuren können dabei in weiten Grenzen variieren.

Die vorliegende Erfindung beschreibt des weiteren die Klonierung und vollständige Charakteri sierung von zwei neuen, bislang unbekannten bIAPs (bIAP III und bIAP IV). Von RNA-Proben aus verschiedenen Kinderdarmabschnitten wurden Northern Blot Analysen durchgeführt. Von den Proben mit dem stärksten Hybridisierungssignal wurde mit einem Oligo dT-primer (Strata gene, San Diego, CA, USA) eine cDNA-Bank in den Vektor IZAP II (Stratagene, San Diego, CA, USA) angelegt. Die vollständige Bank (1,0 × 10⁶ rekombinante Klone) wurde mit dem 1075 bp HindIII-Fragment von bIAP I, das einen Bereich von Exon I bis VIII des bIAP I-Gens ab deckt, gescreent. 65 Klone wurden isoliert und sequenziert. Dabei wurden zwei neue bIAPs iden tifiziert (bIAP III und bIAP IV), die weder zu bIAP I noch zu bIAP II, deren Charakterisierung weiter unten beschrieben ist, vollständig homolog waren. Die Nukleotidsequenzen von bIAP III und IV sind in Fig. 3 und 5 abgebildet. Die Sequenzunterschiede der bIAPs I-IV sind in Fig. 7 dargestellt. Keine der neuen bIAPs besitzt jedoch den erwarteten N-Terminus LIPAEEEN. Die cDNA der beiden neuen bIAP-Isoenzyme wurde mit entsprechenden Restriktionsenzymen nach geschnitten und in den CHO-Expressionsvektor pcDNA-3 (z. B. der Fa. Invitrogen, San Diego, CA, USA) durch Ligation insertiert. Die Klone, die die neuen bIAP-Isoenzyme enthielten, wur den gemäß dem von Invitrogen beschriebenen Verfahren zur Expression gebracht und die Isoen zyme charakterisiert. In WO 93/18139 wird die Expression eines bIAP-Gens in verschiedenen Wirten beschrieben (CHO-Zellen, E. coli, Baculovirus-System). Die dort beschriebenen Verfah ren, Vektoren und Expressionssysteme gehören zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind des weiteren die nativen und rekombinanten hoch aktiven alkalischen Phosphatasen bIAP III und bIAP IV. Besonders bevorzugt sind die alkali schen Phosphatasen gemäß SEQ ID No.: 4 und 6. CHO-Zellinien enthaltend das bIAP III bzw. bIAP IV Gen wurden hinterlegt bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38 124 Braunschweig (DSM ACC 2349, DSM ACC 2350).

Des weiteren beschreibt die Erfindung die Konstruktion der bIAP II-Sequenz durch Ligation von mutierten- und Wildtyp-Fragmenten von bIAP I, III und IV. Durch diesen Prozeß wurden eine Reihe von intermediären Zwischenprodukten (L1N8, INT1, INT2 und INT3) generiert, die für funktionelle Isoenzyme codieren. Zur Konstruktion dieser intermediären Zwischenprodukte wur de jeweils ein Teilstück der zu verändernden bIAP-cDNA mit entsprechenden Restriktionsen zymen berausgeschnitten und durch ein die gewünschten Mutationen enthaltendes Teilstück einer anderen bIAP-cDNA, das durch Verdau mit Restriktionsenzymen kompatible Enden be sitzt, ersetzt. Mutationen, die nicht durch Ligation von Teilstücken verschiedener bIAP-cDNAs eingeführt werden konnten, wurden via ortsgerichteter Mutagenese eingebracht. Das mutierte Fragment wurde anschließend mit den entsprechenden Restriktionsenzymen nachgeschnitten und in ein ebenfalls geschnittenes bIAP-cDNA Teilstück mit kompatiblen Enden ligiert (Fig. 8).

Die so eingeführten Mutationen wurden anschließend via Restriktionsanalyse und Sequenzierung überprüft.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung der erfindungs gemäßen DNA, dadurch gekennzeichnet, daß mutierte und Wildtyp-Fragmente der DNA von einer oder mehreren alkalischen Phosphatasen ligiert wurden. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine cDNA, die funktionelle Isoenzyme kodiert und die als Zwischen produkte während des obengenannten erfindungsgemäßen Verfahrens entsteht. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfinder ein Vektor enthaltend die erfindungsgemäße cDNA.

Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Zellinie enthaltend den erfindungs gemäßen Vektor. Geeignete Zellen sind beispielsweise eukaryontische Zellen wie CHO, Pichia, Hansenula oder Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus oder prokaryontische Zellen, wie E. coli. Besonders bevorzugt sind E. coli, Hefe- und CHO-Zellen. Geeignete Ausgangsvektoren für E. coli-Stämme sind beispielsweise pTE, pTaq, pPL, Bluescript. Als E. coli-Stämme kommen beispielsweise XL1-Blue, HB 101, RR1 D M15, BL21(DE), MC 1000 etc. in Frage. Geeignete Pichia Vektoren sind beispielsweise pGAPZ A a und pPICZa (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Ein geeigneter Vektor für CHO-Zellinien ist beispielsweise pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Eine CHO-Zellinie enthaltend das bIAP II Gen wurde hinterlegt bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38 124 Braunschweig (DSM ACC 2348).

Die kinetische Charakterisierung der rekombinanten bIAP I, II, III und IV-Isoenzyme ergab deutliche Unterschiede hinsichtlich der katalytischen Eigenschaften (Fig. 9). bIAP II zeigt bei spielsweise eine um über 300% gesteigerte, d. h. über dreifach höhere spezifische Aktivität (ca. 8600 U/mg) als bIAP I (ca. 2700 U/mg). Aber auch bIAP III und bIAP IV zeigen eine etwa 1,8-fach (ca. 4700 U/mg) bzw. etwa 2,6-fach (< 6700 U/mg) höhere Aktivität als bIAP I (Fig. 9), was einer prozentualen Steigerung von ca. 170% bzw. 250% entspricht. Zudem war ein beträcht licher Unterschied der Isoenzyme bezüglich der Stabilität gegenüber Hitze meßbar. bIAP I ist das hitzestabilste Isoenzym, der T_m-Wert von bIAP II und III liegt 7°C niedriger und der T_m-Wert von bIAP IV 13°C niedriger als bIAP I (Fig. 9). Unter dem T_m-Wert ist der Temperaturwert zu verstehen, bei dem 50% Restaktivität gemessen wird.

Des weiteren beschreibt die Erfindung die Identifikation der Aminosäurereste, die Einfluß auf die spezifische Aktivität der bIAPs besitzen. Dabei waren die intermediären Zwischenprodukte hilfreich. Die Expression der intermediären Chimären L1N8, INT1, INT2 und INT3 ermöglich ten es, bereits II der 24 Aminosäuren als Effektor für die Aktivitätserhöhung auszuschließen (Fig. 7).

- Das L1N8-Mutantenenzym zeigte eine vergleichbare spezifische Aktivität wie bIAP I, demnach sind die hier eingeführten Mutationen V2I, V4A und D8N für die Erhöhung der spezifischen Aktivität nicht relevant. Die Bezeichnung V2I bedeutet, daß in Posi tion 2 die Aminosäure Valin gegen Isoleucin ersetzt wird.
- Die INT1-Mutante besitzt eine vergleichbare spezifische Aktivität mit bIAP II, dem zufolge ist dieser Bereich entscheidend.
- Die INT2-Mutante besitzt eine vergleichbare spezifische Aktivität wie INT1 und bIAP II, demzufolge können die Mutationen S380G, D411G, D416E, Q420R, Q427L, E453Q und T480A aus INT2 ebenfalls ausgeschlossen werden.
- Bei der Generierung der INT3-Mutante konnte ebenfalls keine Änderung der hohen spezifischen Aktivität festgestellt werden, somit ist ein Effekt der Mutation N192Y auszuschließen.

Zur Identifikation, welche der 13 verbliebenen Reste entscheidend für die hohe spezifische Akti vität ist, wurde in der vorliegenden Erfindung die bIAP II-cDNA als Template für Einzelmuta tionen gegen die entsprechende Aminosäure von bIAP I verwendet. Es wurden die Einzelmu tanten N122K, I133M, A142S, K180M, M205K, E210V, E236A, G322D, und 1332G sowie eine kombinierte A289Q-A294V-Q297R-L299V-bIAP II-Mutante erstellt (Fig. 9).

Überraschenderweise konnte hierbei festgestellt werden, daß hauptsächlich die Mutation G322D in der Lage ist, die hohe spezifische Aktivität von bIAP II (ca. 8600 U/mg) um mehr als den Fak tor 3 zu senken (2817 U/mg) und somit in die vergleichbar niedrige spezifische Aktivität der bIAP I umzuwandeln.

Zur Verifikation dieses Ergebnisses wurde in der vorliegenden Erfindung die umgekehrte Muta tion D322G in bIAP I eingeführt. Überraschenderweise konnte hier der umgekehrte Effekt, näm lich ein Anstieg der spezifischen Aktivität um mehr als Faktor 3 auf 10 148 U/mg gemessen wer den und somit ein vergleichbarer Wert mit bIAP II erzielt werden (Fig. 9). Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der relativ höheraktiven bIAP III (ca. 4700 U/mg) und der höheraktiven bIAP IV (< 6700 U/mg) bestätigt dieses Ergebnis nochmals. bIAP III besitzt in Position 322 ein Serin, bIAP IV wiederum ein Glycin.

Des weiteren wurden in der vorliegenden Erfindung die erzeugten Mutanten wiederum auf Stabi lität gegenüber Hitze untersucht. Demzufolge ist der Unterschied in der Hitzestabilität zwischen bIAP I und bIAP II auf einen Kombinationseffekt von mehr als einem Austausch zurückzufüh ren. Sowohl die [G³²²]bIAP I- wie auch die [D³²²]bIAP II-Mutante zeigen Stabilitätswerte, die zwischen denen der bIAP I- und bIAP II-Isoenzyme liegen (Fig. 9). Die D322G-Mutation hat einen geringen destabilisierenden Effekt (annähernd 4°C in T₅₀) auf das bIAP I-Isozym, während die Substitution G322D in bIAP II eine entsprechende Erhöhung der Stabilität dieses Mutanten enzymes zufolge hat. Jedoch wird die Stabilität gegenüber Hitze der Wildtyp-bIAP I nicht er reicht.

Somit besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung insbesondere darin, eine hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase mit einer Aktivität über 3000 U/mg zur Verfügung zu stel len, die durch eine eukaryontische cDNA kodiert wird. Besonders bevorzugt ist die erfindungs gemäße hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase, wobei an der Position 322 ein Glycin, Alanin, Threonin, Valin oder Serin ist. Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße alkalische Phosphatase, wobei an der Position 322 ein Glycin ist.

Die erfindungsgemäße hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase kann bevorzugt zu sätzlich an einer oder mehreren der folgenden Positionen eine Mutation aufweisen:
Aminosäurereste in Position 1, 108, 125, 149, 181, 188, 219, 221, 222, 223, 224, 231, 252, 258, 260, 282, 304, 321, 330, 331, 354, 383, 385, 400, 405, 413, 428, 431 und 461, wobei durch die Mutation eine Aktivitätssteigerung bewirkt wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen hochaktiven alkalischen Phos phatase. Die erfindungsgemäßen alkalischen Phosphatasen können durch gezielte Mutagenese auch weiter verbessert werden, z. B. hinsichtlich ihrer Thermostabilität.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen hochaktiven alkalischen Phosphatase wurde nach E. Möss ner et al., Z. Physiol. Chem. 361 (1980), 543-549 bestimmt; mit dem Unterschied, daß der Test nicht, wie in der Publikation beschrieben, bei 25°C, sondern bei 37°C durchgeführt wurde. Die Bestimmung bei 37°C ist die weltweit übliche Temperatur, mit der die Aktivität im Diethanol puffer (BM Test Method 5426) gemessen wird.

Die Proteinbestimmung der erfindungsgemäßen und bekannten APs erfolgte durch Messen der Absorption der Proteinlösung bei 280 nm gegen Wasser. Die Extinktion einer nieder und hoch aktiven AP-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml ist bei 280 nm 1,0 (A 280 nm (1 mg/ml) gleich 1).

Die spezifische Aktivität wird durch Verhältnisbildung von Aktivität mit der zugehörigen Proteinmenge ermittelt.

Erläuterung der Figuren

Fig. 1:
SEQ ID No.: 1 Nukleotidsequenz von bIAP II (1798 bp)
Start des kodierenden Bereiches für die reife bIAP II in Pos 108, Ende in Pos 1649

Fig. 2:
SEQ ID No.: 2 Aminosäuresequenz von bIAP II (480 Aminosäuren) mit Spaltstellen

Fig. 3:
SEQ ID No.: 3 Nukleotidsequenz von bIAP III (2460 bp)
Start des kodierenden Bereiches für die reife bIAP III in Pos 123, Ende in Pos 1655

Fig. 4:
SEQ ID No.: 4 Aminosäuresequenz von bIAP III (511 Aminosäuren)

Fig. 5:
SEQ ID No.: 5 Nukleotidsequenz von bIAP IV (2542 bp) Start des kodierenden Bereiches für die reife bIAP IV in Pos 122, Ende in Pos 1654

Fig. 6:
SEQ ID No.: 6 Aminosäuresequenz von bIAP IV (511 Aminosäuren)

Fig. 7:
Aminosäureunterschiede zwischen bIAP I, bIAP II, bIAP III und bIAP IV Isoenzymen. Lediglich die unterschiedlichen Reste werden gezeigt. Mit einem Stern werden solche Positionen identifiziert, die zur individuellen Mutagenese ausgewählt wurden, um die Reste zu identifi zieren, die für die erhöhte katalytische Aktivität der bIAP II verantwortlich sind.

Fig. 8:
Ligationsstrategie für die bIAP II-DNA

Fig. 9:
Kinetische Parameter und Hitzestabilität der rekombinanten Wildtyp, chimären und durch orts gerichtete Mutagenese veränderten Mutanten der bIAP Enzyme.
* [QVRV]bIAP II ist die Abkürzung für die [Q²⁸⁹, V²⁹⁴, R²⁹⁷, V²⁹⁹]bIAP II Mutante.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 Klonierung

Eine λgt 11 cDNA Bank präpariert aus Darm von erwachsenen Rindern (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) wurde unter Verwendung eines 1075 bp HindIII Fragments vom 5' Ende der bIAP I cDNA (Weissig et al., 1993) als Sonde gescreent. Klone aus dieser cDNA Bank wur den zum Screenen einer EMBL-3 SP6/T7 genomischen cDNA Bank verwendet, die aus der Le ber von erwachsenen Rindern hergestellt war (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). Eine nicht amplifizierte λZAP II cDNA Bank wurde mittels eines Oligo dT-primers (Stratagene, San Diego, CA, USA) aus mRNA angelegt, die unter Verwendung des Trisolv™ Reagenz aus dem Dünndarm eines erwachsenen Rindes isoliert und mit dem 1075 bp HindIII Fragment der bIAP I cDNA als Sonde gescreent wurde. Die Proben wurden unter Verwenden eines random primed DNA labeling kit radiomarkiert (Boehringer Mannheim). Phagen DNA wurde wie beschrieben für λgt 11 und EMBL-3 SP6/T7 Klone hergestellt (Tsonis & Manes, 1988). Das in vivo Schnei den der λZAP II Klone wurde nach der Anweisung des Herstellers durchgeführt (Stratagene, San Diego, CA). Genomische Klone wurden mit Southern blot Analyse, wie beschrieben, charakteri siert (Sambrook et al., 1989). EcoRI cDNA Fragmente von λgt 11 Klonen und unterschiedliche Restriktionsfragmente aus Klonen anderer Banken wurden in den KS⁺-Vektor (Stratagene, San Diego, CA, USA) subkloniert. Plasmid DNA wurde durch alkalische Lyse hergestellt (Sambrook et al., 1989). Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung von Sequenase gemäß Her stellerprotokoll (Amersham). Die für die Sequenzierung von bIAPs III und IV verwendeten Oli gonukleotide sind nachfolgend beschrieben. 1s: SEQ ID No. 7: GCC AAG AAT GTC ATC CTC; 1a: SEQ ID No. 8: GAG GAT GAC ATT CTT GGC; 2s: SEQ ID No. 9: GGT GTA AGT GCA GCC GC; 2a: SEQ ID No. 10: GCG GCT GCA CTT AGA CC; 3s: SEQ ID No. 11: AAT GTA CAT GTT TCC TG; 3a: SEQ ID No. 12: CAG GAA ACA TGT ACA TT; 4s: SEQ ID No. 13: CCA GGG CTT CTA CCT CTT; 4a: SEQ ID No. 14: AAG AGG TAG AAG CCC TGG; 5s: SEQ ID No. 15: ACC AGA GCT ACC ACC TCG; 5a: SEQ ID No. 16: AAG CAG GAA ACC CCA AGA; 6s: SEQ ID No. 17: CTT CAG TGG CTT GGG ATT; 6a: SEQ ID No. 18: AAT CCC AAG CCA CTG AAG. Die Nukleinsäuresequenzen wurden mit dem MacVector Sequenz analysen-Programm analysiert (International Biotechnologies, Inc. New Haven, CT, USA).

Beispiel 2 Bestimmung der Aminosäuresequenz von bIAP II

Ungefähr 500 µg einer gereinigten, hochaktiven (ca. 6000 U/mg) Rinderdarm AP wurde in 450 µl 6M Guanidinhydrochlorid, 0.25 M Tris, 1 mM EDTA, pH 8.5 gelöst und anschließend 30 µl Mercaptoaethanol hinzugefügt. Nach Reduktion in 30 Minuten bei 100°C wurden die Cysteine durch Zugabe von 35 µl Vinylpyridin alkyliert und diese Mischung 45 Minuten bei Raumtem peratur im Dunkeln inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann sofort über eine kurze Rever sed phase HPLC Aquapore RP300 column entsalzt (30 × 2.1 mm, Applied Biosystems, Weiter stadt). Ein Stufengradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure wurde verwendet, um gebundene Enzyme zu eluieren. Protein enthaltende Fraktionen wurden bis zur Trockne einge dampft. Um das Enzym zu deglykosilieren, wurden 125 µg AP in 15 µl destilliertem Wasser und 6 µl Inkubationspuffer (250 mM Na₂HPO₄, 50 mM EDTA, pH 7.2) und 15 U EndoF/PNGase gelöst (Boehringer Mannheim, Penzberg). Die Mischung wurde über Nacht bei 37°C gehalten und anschließend zur Spaltung verwendet. Reduzierte und alkylierte AP wurde mit verschie denen Enzymen gemäß den Anweisungen auf den Datenblättern der einzelnen Enzyme enzyma tisch gespalten (Endoproteinase LysC, Endoproteinase AspN, Endoproteinase GluC und Trypsin (Boehringer Mannheim, Penzberg). Cyanbromid Spaltung wurde mit 10% (w/w) CNBr in 70% (v/v) Ameisensäure über 8 Stunden durchgeführt. Nach Lösen mit Wasser wurde die Lösung mit einem SpeedVac Konzentrator (Savant) im Volumen reduziert und für eine Reversed phase HPLC verwendet. Der Verdau des C-terminalen tryptischen Peptids wurde über 4 Minuten mit Carboxypeptidase Y (8 ng/µl) durchgeführt und die freigesetzten Peptide mit einer Matrix-unter stützten Laserdesorption/Ionisationsmassenspektrometrie über ein Bruker Reflex III Gerät gemäß Anweisung des Herstellers analysiert. 2,5 Dihydroxybenzoesäure (10 mg/ml) in Acetoni tril/Wasser (50/50, v/v) wurde als Matrix verwendet. Peptide aus enzymatischen oder chemi schen Spaltungen wurden mit Reversed phase HPLC auf einer LiChrospher C 18 selB Säule 125 × 2 mm (Merck, Darmstadt) unter Einsatz eines 0.1% Trifluoressigsäure/Acetonitril Lö sungsmittelsystems getrennt. Die Flußrate betrug 300 µl/min. Der Auslauf wurde mit UV Moni tor bei 206 nm detektiert und die Fraktionen manuell gesammelt. Die Massenbestimmung der Peptide wurde mit einem API III Elektrospray Massenspektrometer (PE-Sciex, Langen) nach den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Die Aminosäuresequenz wurde mit einem 492A Pro teinsequenzer (Applied Biosystems, Weiterstadt) gemäß den Herstelleranweisungen ermittelt.

Beispiel 3 Herstellung der bIAP II cDNA und bIAP II Mutagenese

Zur Herstellung einer cDNA, die für bIAP II codiert, wurden Wildtyp Restriktionsfragmente und ortsgerichtet mutagenisierte PCR Fragmente von den cDNAs bIAP I, III und IV miteinander li giert und die LIN8 (3 Fragmente) and INT1 (9 Fragmente) cDNA Zwischenkonstrukte geschaf fen. INT1 und bIAP III dienten dann als Vorlage für die ortsgerichtete Mutagenese und Frag mente hieraus wurden zu der kompletten INT2 (8 Fragmente) cDNA zusammengesetzt. Restrik tionsfragmente von INT2 und ortsgerichtet mutagenisierte Fragmente von INT2 wurden dann zu der INT3 (5 Fragmente) cDNA und schließlich zur bIAP II (4 Fragmente) cDNA zusammen gesetzt. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde nach der Methode von Tomic et al. (1990) durch geführt, wobei Bsa I als Restriktionsenzym verwendet wurde, welches in einem Abstand von seiner Erkennungssequenz schneidet (GGTCTCN1/N5). Alle PCR-Produkte wurden sequenziert, um die Abwesenheit von Sekundär-Mutationen zu verifizieren. Alle Konstrukte wurden durch Sequenzierung und Restriktionsverdau bestätigt. Die Sequenz der verwendeten Oligonukleotid primer zur Amplifikation der ortsgerichteten, mutagenisierten Fragmente sind wie folgt: der Name des primers wird zuerst genannt, gefolgt von der Sequenz (Positionen, die die Mutation anzeigen, sind unterstrichen): KS: SEQ ID No. 19: CGA GGT CGA CGG TAT CG; IL: SEQ ID No. 20: GCA GGT CTC TCA GCT GGG ATG AGG GTG AGG; 8N: SEQ ID No. 21: GCA GGT CTC AGC TGA GGA GGA AAA CCC CGC; 122: SEQ ID No. 22: GCA GGT CTC TGT TGT GTC GCA CTG GTT; 1s: SEQ ID No. 7: GCC AAG AAT GTC ATC CTC; M133I: SEQ ID No. 23: GGT CTC TTT CTT GGC CCG GTT GAT CAC; S142A: SEQ ID No. 24: GGT CTC AAG AAA GCA GGG AAG GCC GTC; 180: SEQ ID No. 25: GGT CTC GTG CAT CAG CAG GCA GGT CGG C; MI80K: SEQ ID No. 26: GGT CTC ATG CAC AGA AGA ATG GCT GCC AG; K205M: SEQ ID No. 27: GGT CTC AAA CAT GTA CAT TCG GCC TCC ACC; V210E: SEQ ID No. 28: GT CTC CAT GTT TCC TGA GGG GAC CCC A; A236E: SEQ ID No. 29: GGT CTC CTG CCA TTC CTG CAC CAG GTT; 236: SEQ ID No. 30: GGT CTC TGG CAG GCC AAG CAC CAG GGA; 289: SEQ ID No. 31: GGT CTC CAG GGT CGG GTC CTT GGT GTG; E289A: SEQ ID No. 32: GGT CTC GAC CCT GGC GGA GAT GAC G; 330: SEQ ID No. 33: GGT CTC CTC AGT CAG TGC CAT ATA; 330E,V332I: SEQ ID No. 34: GGT CTC ACT GAG GCG ATC ATG TTT GAC; XIa: SEQ ID No. 35: TG CAC CAG GTG CGC CTG CGG GCC; N192Y: SEQ ID No. 36: GCC GCA CAG CTG GTC TAC AAC ATG GAT; S380G: SEQ ID No. 37: GCT GTC TAA GGC CTT GCC GGG GGC; N192Y: SEQ ID No. 38: GCC GCA CAG CTG GTC TAC AAC ATG GAT; D411G: SEQ ID No. 39: GGG GGT CTC GCT TGC TGC CAT TAA C; D416E: SEQ ID No. 40: GTT AAT GGT CTC ACA AGC GAG GAA CCC TCG; S428A: SEQ ID No. 41: CCC GTG GGT CTC GCT AGC CAG GGG CAC; D416E: SEQ ID No. 42: GTT AAT GGT CTC ACA AGC GAG GAA CCC TCG; T480S: SEQ ID No. 43: GAT GCT GGT CTC GGT GGA GGG GGC TGG CAG; 480: SEQ ID No. 44: CTG CCA GGT CTC ACC ACC GCC ACC AGC ATC; SP6: SEQ ID No. 45: CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG; 236: SEQ ID No. 46: GGT CTC TGG CAG GCC AAG CAC CAG GGA; Q304R-: SEQ ID No. 47: GTA GAA GCC CCG GGG GTT CCT GCT; Q304+: SEQ ID No. 48: AGC AGG AAC CCC CGG GGC TTC TAC; E321D: SEQ ID No. 49: TGC CAT ATA AGC TTT GCC GTC ATG GTG. Die verschiedenen PCR-Reaktionen sind von 1-16 numeriert, die Vorlagen sind entweder Wildtyp cDNAs bIAP I, III oder IV, oder die chimären Konstrukte INT1 oder INT2. Die Oligonukleotid primer (in Klammern) sind die oben angegebenen. 1. bIAP IV (KS, 1L); 2. bIAP IV (8N, 122); 3. bIAP III (1S, M133I); 4. bIAP I (S142A, 180); 5. bIAP I (M180K, K205M); 6. bIAP I (V210E, A236E); 7. bIAP I (236, 289); 8. bIAP IV (E289A, 330); 9. bIAP III (330E, V3321, XIa); 10. INT1 (N192Y, S380G); 11. INT1 (N192Y,D411G); 12. bIAP III (D416E,S428A); 13. INT1 (D416E,T480S); 14. INT1 (480, SP6); 15. 1NT2 (236, Q304R-); 16. INT2 (Q304R+, E321D). Die folgenden Ligationsreaktionen wurden in allen Fällen unter Verwendung des pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA) Expres sionsvektors durchgeführt. Die Fragmente sind gemäß der oben genannten PCR Reaktions nummer beziffert oder mit dem Namen des Wildtyps oder der chimären cDNA benannt, gefolgt von den Restriktionsenzymen, die zur Bildung des kohäsiven Terminus dieses Fragments benutzt werden. LIN8 = pcDNA-3/EcoRI-XbaI + 1/EcoRI-BsaI + 2/BsaI-BamHI + bIAP I/BamHI-XbaI. INT1 = pcDNA-3/EcoRI-XbaI + L1N8/EcoRI-NcoI + 3/NcoI-BsaI + 4/BsaI + 5/BsaI + 6/BsaI +7/BsaI + 8/Bsa + 9/BsaI-StuI + bIAP I/StuI-XbaI. INT2 = pcDNA-3/EcoRI-NotI + INT1/EcoRI-PstI + 10/PstI-StuI + 11/StuI-BsaI + 12/BsaI + 13/BsaI + 14/BsaI + bIAP I/BsaI- NotI. INT3 = pcDNA-3/EcoRI-XbaI + INT2/EcoRI-NcoI + INT2/NcoI-PvuII +10/PvuII-EagI + INT2/EagI-HindIII + INT2/HindIII-XbaI. bIAP II = pcDNA-3/EcoRI-XbaI + INT3/EcoRI-EagI + 15/EagI-SmaI + 16/SmaI-HindIII + INT3/HindIII-XbaI.

10 zusätzliche Konstrukte wurden hergestellt, um den Rest (die Reste) zu identifizieren, die für die unterschiedlichen kinetischen Eigenschaften von bIAP I und II verantwortlich sind. Alle Konstrukte wurden in pcDNA-3/EcoRI-XbaI subcloniert. 5 Konstrukte wurden durch den Aus tausch von Restriktionsfragmenten zwischen L1N8 oder bIAP I (I) und bIAP II (II) hergestellt. L1N8 EcoRI-PmII und (II) PmII-XbaI wurden ligiert, um die [N122K]bIAP II Mutante cDNA herzustellen. (II) EcoRI-BstEII, (I) BstEII-PvuII, (II) PvuII XbaI wurden für die [K180M] bIAP II Mutante cDNA kombiniert. (II) EcoRI-EagI (I) EagI-BstEII (II) BstEI-XbaI wurden für die [A289Q, A294V, Q297R, L299V] bIAP II Mutante ligiert. (II) EcoRI-EagI (II) EagI-BstEII, (I) BstEII-HindIII, (II) HindIII-XbaI für die [G322D] bIAP II Mutante. (II) EcoRI-HindIII, (I) HindIII-SacI, (II) SacI-XbaI für die [I332G] bIAP II Mutante. 5 andere Positionen erforderten neue ortsgerichtete Mutagenese. Hierfür wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
1133M-: SEQ ID No. 50: GGT CTC TTT CTT GGC CCG GTT CAT CAC; A142S-: SEQ ID No.: 51: TGG TCA CCA CTC CCA CGG ACT TCC CTG; M205K-: SEQ ID No. 52: GGT CTC AAA CAT GTA TTT TCG GCC TCC ACC; E210V+: SEQ ID No. 53: GGT CTC ATG TTT CCT GTG GGG ACC CCA GAC; E236A: SEQ ID No. 54: GGT CTC CTG CCA TGC CTG CAC CAG GTT. Unter Verwendung dieser und der vorher aufgelisteten Oligonukleotide wurden die folgenden 8 PCR Reaktionen (a-h) mit bIAP II als Vorlage durchgeführt: a. 1s, 1133M-; b. S142A+, M205K-; c. 1s, A142S-; d. V210E+, 330-; e. E210V+, 330-; f. M180K+, E236A-; g. 236+, 330-; h. S142A, K205M-. Die hieraus entstandenen Produkte wurden subkloniert und sequenziert und dann Fragmente für die folgenden Ligationen isoliert: (II) EcoRI-NcoI, (a) NcoI-BsaI, (b) BsaI, PvuII, (II) PvuII-XbaI für I133M. (II) EcoRI-NcoI, (c) NcoI-BstEII, (II) BstEII-PvuII, (II) PvuII-XbaI für A142S. (II) EcoRI-BstEII, (b) BstEII-BsaI, (d) BsaI-HindIII, (II) HindIII-XbaI für M205K. (II) EcoRI-BstEII, (h) BstEII-BsaI, (e) BsaI-HindIII, (II) HindIII-XbaI für E210V. (II) EcoRI-NcoI, (II) NcoI-PvuII, (f) PvuII-BsaI, (g) BsaI-HindIII, (II) HindIII-XbaI für E236A.

Beispiel 4 Produktion und Charakterisierung von rekombinanten Enzymen

Alle cDNAs (bIAP I, bIAP II, bIAP III, bIAP IV und entsprechende Mutanten) wurden in den pcDNA-3 Expressionsvektor kloniert (Invitrogen, San Diego, CA, USA), in Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters (CMO Zellen) übertragen und stabile Transfektanten durch Wach sen der Zellen in Gegenwart von 500 µg/ml Geneticin ausgewählt (Gibco, BRL). Recombinante APs wurden aus stabilen übertragenen CHO Zellen wie beschrieben extrahiert (Hoylaerts et al., 1997). Zur Messung von k_cat wurden Mikrotiterplatten, die mit 0.1 µg/ml hochaffinem Anti- Rinder AP monoklonalem Antikörper beschichtet waren (Scottish Antibody Production Unit, Lanarkshire, Scotland), mit zunehmenden Enzymkonzentrationen inkubiert. Die Aktivität des ge bundenen Enzyms wurde als zeitliche Änderung der Absorption bei 405 um und 20°C nach Hin zufügen von 30 mM p-Nitrophenylphosphat (pNPP) als Substrat in 1.0 M Diäthanolamin Puffer (pH 9.8), 1 mM MgCl₂ und 20 pM ZnCl₂ gemessen. Die gebildete p-Nitrophenol Konzentration wurde mit einem Extinktionskoeffizienten von 10,080 liter mole^-1 cm^-1 errechnet. Handelsprä parate mit bekannten spezifischen Aktivitäten (Biozyme Laboratories, 7822 U/mg und Boehrin ger Mannheim, 3073 U/mg) als auch aufgereinigte bIAP II (8600 U/mg) wurden als Standards verwendet. Die Enzymkonzentration in diesen Lösungen, die den Antikörper absättigten (E°), wurde aus einer Standardkurve Aktivität gegenüber bekannten Enzymkonzentrationen unter identischen Testbedingungen berechnet. Die maximale Substratumsetzung (V_max) wurde dann durch E° geteilt, um k_cat zu errechnen. Zur Berechnung von K_m wurde die Substratkonzentration zwischen 0.25-2.0 mM p-Nitrophenylphosphat (pNPP) verändert und die Anfangsreaktionsge schwindigkeit bei 20°C in einem Zeitraum von 10 Minuten gemessen. Regressionskurven von [pNPP]/v gegen [pNPP] (Hanes Kurven) zur x-Achse ergaben -K_m. Teilen der Standardabwei chung des berechneten y-Wertes für jeden x-Wert in der Regression durch die Regressionsnei gung ergab die Standardabweichung von K_m.V_max + Standardabweichung wurde unter Verwen dung der zugehörigen Gleichungen durch Teilen von + Standardabweichung mit dem y-Achsenabschnitt + Standardabweichung berechnet. Die spezifischen Aktivitäten wurden auf der Basis Antikörper-gesättigte Aktivität im Vergleich zu Biozyme errechnet. Hitzestabilitätskurven wurden durch Inkubation von Extrakten bei 45-75°C erstellt, Zunahme in 5°C Schritten je 10 Minuten, wie vorher beschrieben (Weissig et al., 1993). Die Aktivität jeder Probe wurde dann wie oben bestimmt und die Restaktivität als verbleibender Prozentanteil, verglichen mit der nicht erhitzten Probe, berechnet. Die Temperatur, bei der 50% Restaktivität übrigbleibt (T₅₀), wurde aus der Restaktivität gegenüber den Temperaturkurven errechnet.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA kodierend eine eukaryontische hochaktive alkalische Phosphatase mit einer spezifi schen Aktivität über 3000 U/mg, wobei der Aminosäurerest an der Position 322 kleiner ist als Aspartat.

2. DNA gemäß Anspruch 1, wobei der Aminosäurerest 322 Glycin, Alanin, Threonin, Valin oder Serin sein kann.

3. DNA gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminosäurerest 322 Glycin oder Serin sein kann.

4. DNA gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei der Aminosäurerest 322 Glycin ist.

5. DNA gemäß SEQ ID No.: 1 (bIAP II).

6. DNA gemäß SEQ ID No.: 3 (bIAP III).

7. DNA gemäß SEQ ID No.: 5 (bIAP IV).

8. Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekenn zeichnet, daß mutierte und Wildtyp-Fragmente der cDNA von einer oder mehreren alkali schen Phosphatasen zu einem Gen, das für eine aktive alkalische Phosphatase kodiert, ligiert wurden.

9. Eukaryontische cDNA, die funktionelle Isoenzyme mit alkalischer Phosphaten-Aktivität kodiert und die als Zwischenprodukte während eines Verfahrens gemäß Anspruch 8 ent steht.

10. Vektor enthaltend eine cDNA gemäß einem der Ansprüche 1-9.

11. Eurkayontische oder prokaryontische Zelle enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 10.

12. Hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase mit einer spezifischen Aktivität über 3000 U/mg, die kodiert wird durch eine DNA gemäß einem der Ansprüche 1-7.

13. Hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase gemäß Anspruch 12, wobei die Amino säure in Position 322 Glycin ist.

14. Hochaktive rekombinante alkalische Phosphatase gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei zusätzlich in eine oder in mehrere der folgenden Aminsosäurepositionen eine Muta tion eingeführt wurde: 1, 108, 125, 149, 181, 188, 219, 221, 222, 223, 224, 231, 252, 258, 260, 282, 304, 321, 330, 331, 354, 383, 385, 400, 405, 413, 428, 431 und 461.

15. Verfahren zur Herstellung der hochaktiven alkalischen Phosphatase gemäß einem der Ansprüche 12-14, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA gemäß der Ansprüche 1 bis 11 verwendet wird.

16. Native hochaktive alkalische Phosphatase kodiert durch die SEQ ID No.: 4 (bIAP III) oder SEQ ID No.: 6 (bIAP IV).