DE19813979A1

DE19813979A1 - Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, wasserstoffperoxidbildenden Systemen, Peroxidasen und Oxidasen bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen

Info

Publication number: DE19813979A1
Application number: DE1998113979
Authority: DE
Inventors: Reimar Krieg; Karl-Juergen Halbhuber
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Jenlab 07743 Jena De GmbH
Priority date: 1998-03-28
Filing date: 1998-03-28
Publication date: 1999-09-30
Anticipated expiration: 2018-03-29
Also published as: DE19813979C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, wasserstoffperoxidbildenden Systemen, Peroxidasen und Oxidasen bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen. DOLLAR A Aufgabe war es, ein einfaches und gut anwendbares Verfahren für die spezifische und zuverlässige Bestimmung von Peroxidase/Hydroperoxiden zu schaffen, welches bei hoher Nachweisempfindlichkeit in weitem Umfang leicht modifizierbar ist und damit an unterschiedliche Aufgabenstellungen angepaßt werden kann. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden sekundäre Arylmethyl- bzw. Heteroarylmethylaminderivate mit dem allgemeinen Strukturelement (Het-)Ar-CH(R·1·)-NH-R·2· und deren Applikationsformen als Chromogene eingesetzt. Diese können selbst oder durch Additive so zugeschnitten werden, daß die für den Nachweis bewirkten Farbveränderungen bzw. farbigen Präzipitate hinsichtlich Nachweisempfindlichkeit, Handhabbarkeit oder aus anderen Gründen möglichst vorteilhaft ausgewertet werden können. Die erfindungsgemäßen Chromogene und die sich daraus ableitenden Bestimmungsmethoden für den Nachweis von Peroxidaseaktivität/Hydroperoxiden vereinen somit die Vorzüge hoher Empfindlichkeit und großer Variabilität des chromogenen Reaktionsproduktes mit den Vorteilen der guten Zugänglichkeit und praktikablen Durchführbarkeit der Bestimmungsmethode. DOLLAR A Das Reaktionsverhalten der Reagenzien gegenüber Peroxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid oder ähnlichen Systemen und die Zusammensetzung des gebildeten Reaktionsproduktes läßt sich in ...

Description

Die Bestimmung von Peroxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid und verwandten Häm-Enzym/Oxidationsmittel-Systemen ist von herausragender Bedeutung sowohl für die Medizin als auch für die analytische Chemie und Biochemie. In den letzten Jahren hat dabei insbesondere die Verwendung von Peroxidase als Markierungsenzym in Enzymimmunoassays eine Schlüsselrolle eingenommen (vgl. z. B. A. Mayer, S. Neuenhofer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 (33), 1044-1072). Insbesondere die Enzymimmunobestimmungen (EIA) von Haptenen, Antigenen und Antikörpern sind außerordentlich empfindliche Verfahren, welche daher auch entsprechend hohe Anforderungen an die Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der dabei verwendeten Marker-Enzyme stellen.

Dies gilt neben katalytischen Enzymnachweis- und enzym immunohistochemischen Techniken auch für die zahlreichen Nachweisverfahren, bei denen Wasserstoffperoxid als Zwischenprodukt gebildet wird und Peroxidase oder peroxidatisch wirksame Substanzen, wie z. B. Hämoglobin, als Katalysatoren für chromogene Folgereaktionen eingesetzt werden, die optisch erfaßt werden und mit der Menge an gebildeten Wasserstoffperoxid in einer quantitativen Beziehung stehen.

Beispiele für wasserstoffperoxidbildende Systeme mit großer analytischer Relevanz auf Grundlage von Oxidasen sind: Glucose-Glucoseoxidase, L-Aminosäure-L-Aminosäureoxidase, Cholesterin-Cholesterinoxidase, Harnsäure-Uricase oder Glyzerin-Glyzerinoxidase.

Die Bestimmung von Peroxidaseaktivität beruht darauf, daß das Enzym in Gegenwart von geeigneten Peroxiden die Oxidation einer idealerweise farblosen organischen Verbindung unter Bildung farbiger ("Chromogene") oder fluoreszierender ("Fluorogene") Folgeprodukte katalysiert. Die Auswertung kann dabei je nach Aufgabenstellung in homogener Lösung (kolorimetrisch, photometrisch, spektroskopische Verfahren) oder an Fest- bzw. heterogenen Mehrphasensystemen (z. B. in Form von Präzipitaten am histologischen Schnitt, densitometrische Tüpfelplatten- oder Blot- Auswertungen).

Reagenzien für den Nachweis von Peroxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid und verwandten Systemen sollten idealerweise in der Praxis folgende Kriterien erfüllen: Hohe Nachweisempfindlichkeit und Spezifität, hoher Farbkontrast, gute Reproduzierbarkeit und große Anwendungsbreite für unterschiedlichste Aufgabenstellungen bei gleichzeitig geringer Enzymtoxizität.

Bei Fest- und Mehrphasensystemen kommen Forderungen nach geringer Löslichkeit und Diffusionsstabilität der chromogenen Reaktionsprodukte bei gleichzeitig guter Löslichkeit des Ausgangsreagenzes hinzu.

Reagenzien für die Enzym- bzw. Enzymimmunohistochemie müssen weitere sehr spezielle Kriterien erfüllen: Strukturgetreue, möglichst nicht- (mikro)kristalline sondern fein-amorphe Präzipitate ohne "Diffusionshöfe" oder andere Lokalisationsartefakte; dies setzt eine spezielle, primär vom eingesetzten Reagenz und den von ihm vorgegebenen Inkubations bedingungen (Konzentration, Zusätze, Temperatur, Zeit, . . .) bestimmte Präzipitationskinetik zur Vermeidung von Diffusionsartefakten während des Präzipitationsprozesses voraus. Bei Dauerpräparaten, welche in organischen Medien wie Kanadabalsam, Entellan® oder pertex® eingedeckt werden sollen, müssen die Präzipitate sowohl in wässrigen Puffersystemen als auch Alkoholen und aromatischen Kohlenwasserstoffen völlig unlöslich und über lange Zeiträume chemisch stabil und diffusionsfest sein.

Von den bekannten Reagenzien werden diese Kriterien in ihrer Gesamtheit nicht erfüllt:
Fluorophore und Chemieluminesz-Marker ermöglichen zwar prinzipiell ausgezeichnete Detektionsempfindlichkeiten (Übersicht: A. Mayer, S. Neuenhofer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 (33), 1044-1072), sind aber nur kurzzeitig und einmalig auswertbar ("Bleaching") und nicht für Dauerpräparationen geeignet.

Aus homogener Lösung präzipitierende und zur histochemischen Lokalisation von Peroxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid geeignete fluoreszenzaktive Reagenzien bzw. deren Vorstufen sind nicht bekannt.

Spektrophotometrische und kolorimetrische Methoden basierend auf 1,2- bzw. 1,4-Phenylendiamin (A. Mayer, S. Neuenhöfer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 (33), 1044-1072), 3,3'-Diaminobenzidin (V. Herzog, H. D. Fahimi, Anal. Biochem. 1973 (55), 554-562), Antipyrin mit aromatischen Kupplern (Indikatoren nach Trinder; Ann. Clin. Biochem. 1969 (6), 24-27), Leukofarbstoffen (P. A. Clapp, D. F. Evans, Anal. Chim. Acta. 1991 (243), 217-220) und "geschützten" Leukofarbstoffen (R. Hermann, Chimia 1991 (45), 58-59) wurden beschrieben.

Diese Methoden wurden speziell für (homogen-)flüssige Phasen, wie z. B. Seren, entwickelt und sind z. B. für die Histologie nicht relevant.

Präzipitierende chromogene Peroxidasesubstrate zur Bestimmung von Peroxidase/Wasserstoffperoxid und verwandten Systemen sind nach wie vor eine Domäne in Routine und Forschung und werden in heterogenen und Festphasensystemen eingesetzt. Dabei nehmen Benzidinderivate eine Spitzenstellung ein, so vor allem das

- 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; U. Beisiegel, Electrophoresis 1986 (7), 1-18; D. I. Scott, J. Immunol. Methods 1985 (119), 153-187; J. Chayen, L. Bitensky in: Practical Histochemistry, John Wiley & Sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapur, 2nd ed. 1991).
- 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) ist im allgemeinen vergleichbar DAB sensitiv. TMB führt aber zu oft feinkristallinen und leichter löslichen Oxidationsprodukten, wird aber in der Neurohistologie als Tracer empfohlen: E. S. Boss et al.; J. Immunoassay 1981 (2), 187; H. Galati, J. Pracht, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985 (23), 453; S. Jhaveri, L. Carman, J. On Hahm, J. Histochem. Cytochem. 1988 (36), 103-105.

Eingesetzt wurden ferner auch

- 3,3'-Dimethoxybenzidin (o-Dianisidin; J. Pütter, Hoppe Seyler's Z. Phys. Chem. 1962 (329), 40; J. Jungquist, J. O. Josefsson, Anal. Biochem. 1971 (4]), 567),
- 2,7-Diaminofluoren (S.-I. Kaiho, K. Mizuno, Anal. Biochem. 1985 (149), 117-120), das sog.
- Hanker-Yates-Reagenz (p-Phenylendiamin/Brenzcatechin; J. S. Hanker, W. A. Anderson, F. E. Bloom, Science 1972 (175), 991; J. Hanker, Prog. Histochem. Cytochem. 1979 (12), 1-87),
- 1-Naphtol (G. S. Graham, J. Med. Res. 1916 (16), 557; O. Costa et al., Phatol. biol 1987 (35), 1095),
- 4-Chlor-1-naphthol ("4-CN"; P. K. Nakane, Acta Endocrinol. Suppl. 1971 (153), 190; P. K. Nakane, J. Histochem. Cytochem. 1968 (16), 557-560; L. Miribel et al., Protides Biol. Fluids 1986 (34), 753),
- Guajacol und 2,3',6-Trichlorindophenol (zitiert in: V. Herzog, H. D. Fahimi, Anal. Biochem. 1973 (55), 554-562). Einzig
- 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC; R. C. Graham, Jr., U. Lundholm, J. Histochem. Cytochem. 1965 (13), 150-152; M. S. Burstone, J. Histochem. Cytochem. 1960 (8), 63-70) ergibt abweichend zu den braunschwarzen oder blauschwarzen Oxidationsprodukten oben genannter Chromoge rotbraune Präzipitate. Dem steht u. a. für histochemische Dauerpräparationen die leichte Löslichkeit in organischen Solventien einschränkend entgegen.

Trotz der Vielzahl bekannter Indikatorsysteme zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, Peroxidaseaktivität oder peroxidatisch wirksamen Substanzen schränken im konkreten Anwendungsfall spezielle Anforderungen die Anwahl stark ein. So wird immer noch nach leistungsfähigen Reagenzien und Verfahren gesucht, welche den o.g. allgemeinen hohen Anforderungen bei sehr unterschiedlichen Aufgabenstellungen möglichst umfassend gerecht werden bzw. an diese leicht anpaßbar sind und gleichzeitig unterschiedliche Test- und Auswertemethoden zulassen. Solche Reagenzien wären insbesondere im Zusammenhang mit den oft extrem hohen Anforderungen der Histochemie bzw. Immunhistochemie von entscheidender Bedeutung. Bislang wird für eine bestimmte Aufgabenstellung eines der bekannten Reagenzien anhand von Erfahrungswerten ausgewählt und, soweit möglich oder sinnvoll, durch Variation der Inkubationsbedingungen bzw. ggf. durch Zusätze optimiert.

So werden auch gegenwärtig immer noch bevorzugt klassische Reagenzien, wie Diaminobenzidinderivate, 3-Amino-9-ethylcarbazol oder das Hanker- Yates-Reagenz (p-Phenylendiamin/ Brenzcatechin), in der Histochemie eingesetzt.

Farbliche Modifizierungen und Stabilisierung der Reaktionsprodukte dieser Reagenzien sind nur bedingt möglich: Zur Stabilisierung der oft blau bis blauschwarzen Oxidationsprodukte von Benzidinderivaten, welche nach wie vor eine Spitzenstellung einnehmen, sind beispielsweise bei dem in der Neurohistologie favorisierten Tetramethylbenzidin (TMB) Natriumnitro prussiat (M.-M. Mesulam in: Tracing neural connections with Horseradish Peroxidase; John Wiley & Sons; Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapur; 1982) oder Ammoniumheptamolybdat (F. Olucha, F. Martinez- Garzia, C. Lopez-Garzia; J. Neuroscience Meth. 1985 (13), 131-138) als stabilisierende Zusätze vorgeschlagen worden.

Die gleichzeitige Darstellung unterschiedlicher peroxidasegekoppelter Antigene mit jeweils anderen Farben ist neben prinzipiellen Gründen (Überlagerung der einzelnen Markerenzymaktivitäten) auch auf Grund der sehr ähnlichen braun bis braunschwarzen Reaktionsprodukte praktisch nicht oder nur sehr eingeschränkt möglich. Dies zeigt die Bemühung um die gleichzeitige farblich unterschiedliche Darstellung zweier mit Peroxidase gekoppelter Antigene durch NiSO₄-Modifizierung von Diaminobenzidin (DAB: braun; DAB + NiSO₄: blau- bis braunschwarz; in: M. B. Hancock, The American Journal of Anatomy, 1986 (175), 343-352). In diesem Zusammenhang sind ebenfalls mit mäßigem Erfolg Metallsalz-Additive zur farblichen Modifizierung der DAB-Oxidationsprodukte vorgeschlagen worden (S.-M. Hsu, E. Soban; J. Histochem. Cytochem. 1982 (30), 1079-1083).

Einzig 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) ergibt rot bis rotbraune Präzipitate in Gegenwart von Wasserstoffperoxid/Peroxidase, neigt aber häufig zu konzentrationsabhängigen Artefakten. Außerdem sind die Reaktionsprodukte im wäßrigen Milieu zeitlich nur begrenzt stabil. Die Einbettung in optisch oft vorteilhaftere, stärker lichtbrechende wasserfreie Medien, wie z. B. Kanadabalsam, ist auf Grund der guten Löslichkeit nicht möglich.

Die Fähigkeit des primären Oxidationsproduktes von 1-Naphthol zur Adhäsion von basischen Farbstoffen wie Azur A, Toluidinblau, Kristallviolett oder Safranin wurde als multichrome Alternative zu immunohistologischen monochromen DAB-Tchniken vorgeschlagen, konnte sich aber bislang nicht durchsetzten (A. Mauro, I. Germano, G. Giaccone, M. T. Giordana, D. Schiffer; Histochemistry 1985 (83), 97-102). Die Nachteile dieser Methode sind eine durch die eingesetzten Farbstoffe bedingte unspezifische Hintergrundfärbung und ein gegenüber DAB-Methoden geringerer visueller Kontrast.

Für die elektronenmikroskopische Lokalisation von Peroxidasen bzw. Wasserstoffperoxid haben sich nach dem derzeitigen Stand der Technik einzig DAB-Techniken bewährt. Um den geringen elektronenoptischen Kontrast der DAB-Oxidationsprodukte praktisch auswertbar zu machen, wird in einem zweiten Inkubationsschritt durch die Nachbehandlung mit Schwermetallverbindungen wie dem toxischen Osmiumtetroxid im Zuge einer (relativ unspezifischen) Redoxreaktion am primären Reaktionsprodukt Osmiumschwarz angelagert, wobei leicht unspezifische Artefakte auftreten.

Hier sind leistungsfähige Chromogene wünschenswert, welche zusätzlich durch metallbindende oder komplexierende Donorfunktionen in der Lage sind, Metalle mehr oder wenig spezifisch zu binden und so elektronendichte metallhaltige Präzipitate zu bilden. Die entsprechenden Metallverbindungen sollten dann vorzugsweise bereits im primären Inkubationsschritt mit vorgelegt werden, um so spezifisch im Reaktionsprodukt der enzymatischen Oxidation gebunden zu werden.

Beim Einsatz entsprechender Radio-Isotope in Gegenwart derartiger chelatisierender und präzipitierender Chromogene wären auch RIA-An wendungen direkt ableitbar (Enzymlokalisation bei gleichzeitig quantitativer Auswertung).

Insbesondere im Zusammenhang mit DAB-Techniken ist die empfindlichkeitssteigernde Wirkung von Metallzusätzen, wie z. B. die von Ni²⁺ Salzen, bekannt.

So wurden erst kürzlich in organisch-präperativem Zusammenhang neuartige katalytische Systeme zur Dehydrierung (von u. a. Benzylaminen) mit Sauerstoff beschrieben. Diese basieren auf durch Protononendonatoren steuerbaren reversiblen Redoxinteraktionen von konjugierten Polyanilinen oder Polypyrrolen mit Übergangsmetallen (M. Higuchi, I. Ikeda, T. Hirao; J. Org. Chem. 1997, 62, 1072-1078).

Metallbindungsstellen am Chromogen sollten im Rahmen der erfindungsgemäßen Zielstellung derartige metallkatalytische Effekte wesentlich effizienter mit intramolekularer Chelataktivierung und gleichzeitig gebremster Enzymtoxizität des Metalls durch Chelatmaskierung zum Tragen kommen lassen.

Aus dem aufgezeigten Stand der Technik läßt sich somit ein weiterer Bedarf an leistungsfähigen Reagenzien ableiten, welche den genannten Anforderungen genügen sollten sowie entweder leicht herstellbar oder/und in ihrer Applikationsform leicht modifizierbar sein sollten:

- durch Variation des Metalls unter Nutzung metallkatalytischer Effekte oder
- durch farbkuppelnde Zusätze und/oder
- durch chemische Variation des Chromogens selbst.

Letztere Modifikation läßt die effizienteste Einflußnahme auf chemische und physikalische Eigenschaften erwarten, schließt aber aus praktischen Gründen eine breitere Anwendung prinzipiell aus.

Sekundäre Arylmethyl- bzw. Heteroarylmethyl-amine und deren Derivate sind teilweise in anderem Zusammenhang beschrieben:
Veröffentlicht wurden bislang Aryl-CR¹R²R³-Derivate (Aryl auch Hetaryl) im Zusammenhang mit di- und triarylsubstituierten Methan- und Methanol- Derivaten (EP 0 206 316 und EP 0 159 870), N- und arylsubstituierte Diphenylaminderivate und davon formal abgeleitete Heterocyclen (EP 0 045 220 und EP 0 124 287, US 4 384 042 und US 4 916 058) sowie Methylenbis-(N,N-dialkylanilin)-Derivate (EP 0 553 427).

ω-Substituierte N-Mono- und N,N-Dialkylanilinderivate mit Carbonsäure- und Sulfonsäurefunktionen (US 4 492 754) sowie solche mit Hydroxy- und funktionalisierten Aminogruppen (US 4 260 679) wurden ebenfalls beschrieben.

In jüngerer Zeit finden Chelate mit Hydroxybenzylamin-Strukturfragment zunehmendes Interesse, so als Enzymmodelle für die reaktiven Zentren von Haloperoxidasen (W. Plass, Inorg. Chim. Acta 1996 (244), 221-229) und Galactose Oxidase (D. Zurita, C. Scheer, J.-L. Pierre, E. Saint-Aman; J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1996 (23), 4331-4336; D. R. Bereman, G. D. Shields, J. R. Dorfman, J. Bordner; J. Inorg. Biochem. 1983 (19), 75-93) bzw. Oxidase-Mimetica (C. A. Dewar, C. J. Suckling, R. Higgens; J. Chem. Res., Synop. 1979 (10), 335) sowie als Inhibitoren der Monoamin-Oxidase (C. H. Williams, B. Belshaw; Biochem. Soc. Trans. 1985 (13), 469-470; G. Bremanis, T. Dumpis, B. Grinberga; Latv. PSR Zinat. Akad. Vestis., Kim. Ser. 1978 (5), 597-602; S. Patane, R. Arrigo Reina; Boll. Soc. Ital. biol. Sper. 1969 (45), 1079-1081), als bifunktionelle Chelate für Radiometall- Konjugate (C. J. Mathias, Y. Sun, J. M. Connet, G. Philpott, M. J. Welch, J. Michael, A. E. Martell; Inorg. Chem. 1990 (29), 1475-1480) und im Zusammenhang mit Struktur-Eigenschafts-Betrachtungen bei Metaboliten des Antibiotikums Amodiachin (M. T. Labro, J. El Benna, Antimicob. Agents Chemother. 1991 (35), 824-830).

Anwendungen zur Bestimmung einer Peroxidaseaktivität/Wasserstoffperoxid von Arylmethyl- bzw. Heteroarylmethyl-aminen mit Aryl-CHR¹R²-NHR Strukturfragmenten oder Het-Aryl-CHR¹R²-NHR Strukturfragmenten sind nicht bekannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und gut anwendbares Verfahren für die spezifische und zuverlässige Bestimmung von Peroxidaseaktivität/Hydroperoxiden zu schaffen, welches für einen möglichst empfindlichen Nachweis in weitem Umfang modifizierbar ist und damit leicht an unterschiedliche Aufgabenstellungen angepaßt werden kann.

Es hat sich gezeigt, daß sekundäre Arylmethyl- bzw. Heteroarylmethyl-amin derivate mit dem allgemeinen Strukturelement (Het-)Ar-CH(R¹)-NH-R² und deren Applikationsformen sehr gut als empfindliche und leicht modifizierbare sowie an unterschiedlichste Aufgabenstellungen anpaßbare Chromogene für den Nachweis von Peroxidase/Wasserstoffperoxid und verwandten Häm- Enzym/Oxidationsmittel-Systemen eingesetzt werden können.

Chromogene der im Anspruch 1 genannten allgemeinen Strukturformel I können durch chemische Variation des Substituentenmusters, z. B. im Zuge ihrer in situ Darstellung in einer "Eintopfreaktion" aus entsprechenden Aldehyden und Carbonylverbindungen oder durch zahlreiche Zusätze so zugeschnitten werden, daß ein bezüglich der Nachweisempfindlichkeit, Handhabbarkeit oder aus anderen Gründen für die jeweilige Zielstellung vorteilhaftes (an sich bekanntes) Auswerteverfahren zum Einsatz kommen kann. Die erfindungsgemäßen Chromogene und die sich daraus ableitenden Bestimmungsmethoden für Peroxidaseaktivität/Hydroperoxide vereinen somit die Vorzüge hoher Empfindlichkeit und großer Variabilität der farbigen Reaktionsprodukte mit den Vorteilen ihrer guten Zugänglichkeit.

Die neuen Reagenzien lassen sich leicht aus handelsüblichen Ausgangs verbindungen darstellen, so z. B. in einer Zweistufensynthese über die entsprechenden Azomethine aus Carbonylverbindungen und primären Aminen. Die Vielzahl der so generierbareren und potentiell interessanten chromogenen Peroxidase-Substrate wird somit prinzipiell durch die verfügbaren Edukte bestimmt und ist, wie die sehr unterschiedlichen Ausführungsbeispiele andeuten, aus heutiger Sicht noch nicht vollständig absehbar. Hinzu kommt, daß sich das Reaktionsverhalten der erfindungsgemäßen Reagenzien gegenüber Peroxidaseaktivität/Wasserstoff peroxid oder ähnlichen Systemen - und damit auch die physikochemischen Eigenschaften der entstehenden Reaktionsprodukte - in weitem Umfang durch Zusätze oder elektronenreiche aromatische Verbindungen bzw. Protonen donatoren, steuern lassen. Neu ist auch, daß bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Reagenzien metallkatalytische Effekte durch chemisches Design der Edukte (Einbau von Chelatbindungstellen) durch einen intramolekularen Reaktionsmechanismus sehr effizient ausgenutzt werden können und darüber hinaus zur Modifizierung der Reaktionsprodukte direkt beitragen können, z. B. in Form von für die Elektronenmikroskopie relevanten metallhaltigen Präzipitaten.

Die Nachweisgrenzen aktueller und etablierter Reagenzien werden dabei in Abhängigkeit vom Substituentenmuster häufig erreicht und mitunter deutlich übertroffen.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Applikationsformen der erfindungsgemäßen Arylmethyl- bzw. Heteroarylmethyl-aminderivate enthalten. Diese besitzen teilweise eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Peroxidaseaktivität/Hydroperoxiden und verwandten oxidativ wirksamen Systemen. Sie wurden deshalb in Gegenwart von Meerrettich- Peroxidase (HRP) und Wasserstoffperoxid in unterschiedlichen Varianten getestet. Eine Auswahl solcher Applikationsformen wird in den Ausführungsbeispielen 3-5 aufgezeigt.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Applikationsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1 zeigt dabei allgemeine Synthesevorschriften, Ausfüh rungsbeispiel 2 eine Vielzahl von Substanzbeispielen.

In den Ausführungsbeispielen 3 und 4 sind präzipitierende Reagenzien für histologische Anwendungen am Beispiel von Inkubationsansätzen zur Lokalisierung von endogener Peroxidaseaktivität am fixierten Dünnschnitt erläutert.

Eine spezielle Anwendung für die Elektrophorese wird als Ausführungs beispiel 5 am Blot demonstriert. Tabelle 2 mit den Beispielen 1 bis 45 zeigt in diesem Zusammenhang die erreichbaren hohen Sensitivitäten im Vergleich mit aktuellen Reagenzien (Tabelle 1): HRP-Verdünnungsreihen wurden auf Nitrocellulose geblottet und mit ausgewählten Reagenzien in unterschied lichen Applikationsformen ausgewertet.

Ausführungsbeispiel 1: (allgemeine Synthesevorschriften) a) Azomethine (Formel I, R⁴-R⁵ = zusätzliche Bindung) Allgemeine Vorschrift 1

2.0 mmol des jeweiligen Amins und 2.1 mol-Äquivalente der entsprechenden Carbonylverbindung (Formel I; n = 1 : 2.1 mmol, n = 2 : 4.2 mmol, n = . . .) werden in 20 ml absolutem Methanol 1-2 h bei Raumtemperatur gerührt. Bei Ketonen oder auch weniger reaktiven Aminen mit elektronenziehenden Substituenten ist ggf. bis zu 8 h bei höherer Temperatur (Rückfluß) zu arbeiten. Aufgearbeitet wird durch Einengen am Rotationsverdampfer, Kühlen und Absaugen. Nach dem Waschen mit Ethanol, Ether oder Wasser wird das erhaltene Rohprodukt direkt weiterverarbeitet oder ggf. umkristallisiert.

b) Reduktion der Azomethine zu sekundären Aminen (Formel I, R⁴ = R⁵ = H) Allgemeine Vorschrift 2

(Die erfindungsgemäßen Amine sind mit zunehmendem Substitutionsgrad an Hydroxy- oder Amino-Gruppen häufig luftempfindlich, so daß sich das Arbeiten unter Inertgasen, wie Argon oder Stickstoff oder besser die direkte Weiterverarbeitung ohne Isolation der Amine nach der unter c) genannten allgemeinen Vorschrift 3 empfiehlt.)

Bei Raumtemperatur wird 1.0 mmol des jeweiligen Azomethins, ggf. auch in Form der Z/E-Isomerengemische, in 6 ml absolutem Ethanol (bei weniger reaktiven Azomethinen auch Methanol, evtl. auch bei 40-50°C) mit 80 mg (2.1 mmol) Natriumborhydrid versetzt. Nach Aufhellung der meist intensiv gelb-orangen bis roten Farbe des Azomethins wird noch ca. 10 min gerührt und dann durch Eingießen in Eiswasser oder Zusatz von Ammoniumchlorid- Lösung und bei gut chelatisierenden Derivaten durch Zusatz von wenig Essigsäure hydrolysiert. Man fällt mit Wasser aus, saugt ab und trocknet im Exsikkator über Phosphorpentoxid.

c) Reduktion der Azomethine zu sekundären Aminen (Formel I, R⁴ = R⁵ = H) Allgemeine Vorschrift 3 für luftempfindliche oder gut wasserlösliche Aminderivate

Man verfährt nach der unter b) beschriebenen allgemeinen Vorschrift 2, arbeitet aber durch Zugabe von 10%iger wässriger Ammoniumchloridlösung oder Natriumacetatlösung auf säuert nach dem Nachlassen der Wasserstoff entwicklung zur Hydrolyse evtl. noch vorliegender Borverbindungen mit verdünnter Essigsäure an und füllt entsprechend der vorgesehenen Applikation mit Wasser oder einem Puffersystem auf das benötigte Endvolumen auf. Die reaktionsbedingten Nebenprodukte (Borsäure, Na⁺, NH₄⁺, Cl⁻, CH₃COO⁻) beeinflussen den weiteren Reaktionsverlauf und Sensitivität der Nachweisreaktion nicht, so daß diese Vorschrift mit Vorteil zur in situ Darstellung der erfindungsgemäßen Reagenzien generell angewendet werden kann. Je nach pH-Wert liegen diese dann als freie Amine oder in Form ihrer Ammoniumsalze vor (Formel I, R⁴ = R⁵ = H, a = 1; vgl. Vorschrift 4 unter d).

d) Darstellung von Salzen der sekundären Amine nach Formel I (R⁴ = R⁵ = H, a = 1) Allgemeine Vorschrift 4

Im Falle gut wasserlöslicher Amine wird das Amin in Tetrahydrofuran (THF) gelöst und mit der entsprechenden Säure unter gelinder Kühlung versetzt, ggf. die Fällung noch durch Zusatz von Ether oder Hexan vervollständigt, abgesaugt, mit Ether oder Hexan gewaschen sowie getrocknet.

Die Aufarbeitung unter Zusatz von Ammoniumchloridlösung nach der unter b) genannten Vorschrift 2 ergibt im Fall stark basischer Amine bereits die entsprechenden Hydrochloride (für n ≧ 2 zumeist mono-Hydrochloride), ebenso die unter c) beschriebene in situ Variante bei pH < 7. Weniger basische und schlecht wasserlösliche Amine werden durch Hydrolyse mit entsprechenden Säuren analog der besagten Vorschrift 2 in die Ammonium salze überführt.

e) Darstellung der Amine entsprechend Formel I (R⁴ = R⁵ = H) im "Eintopfverfahren" - ausgehend von entsprechenden Carbonylverbindungen und primären Aminen.

Allgemeine Vorschrift 5

Nach der unter a) genannten Vorschrift 1, werden äquimolar Carbonyl- und Aldehydkomponente in einem möglichst kleinem Volumen absolutem Ethanol (ca. 5 ml pro mmol Formelumsatz), ggf. auch in Suspension oder unter Zusatz von lösungsvermittelnden und gegenüber den eingesetzten Reduktionsmitteln inerten Lösungsmitteln, wie z. B. THF, zur Reaktion gebracht und je nach Reaktivität nach 10 min bis 2 h, wie unter b) oder c) beschrieben, reduziert und aufgearbeitet.

Ausführungsbeispiel 2 Erfindungsgemäße Benzylamin-Derivate 1-60, dargestellt entsprechend den allgemeinen Arbeitsvorschriften a) bis d) unter Ausführungsbeispiel 1 1. Substanz 1: 9-Ethyl-3-(2-hydroxybenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = H, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₂₀N₂O, M = 316.40 g/mol;
Ausbeute: 82% der Theorie nach Umkristallisation aus Methanol, hellbeige flache Nadeln, Fp = 139-140°C.
Berechnet:
C 79.72, H 6.37, N 8.85;
Gefunden:
C 79.48, H 6.40, N 8.76%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.391 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.307 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 4.511 (s, 2 H, NH-CH ₂-Ar), 6.872-6.956 (m, überl., 2 H, 2 × H-Ar'), 7.049 (dd, ³J = 8.6 Hz, ⁴J = 2.2 Hz, 1 H, 2-H), 7.162-7.293 (m, überl., 4 H, 1-H, 6-H, 2 × H-Ar'), 7.366 (d, ³J = 8.1 Hz, 1 H, 8-H), 7.453 (dd, 2 × ³J = 7.0 Hz, 1 H, 7-H), 7.605 (d, ⁴J = 2.1 Hz, 1 H, 4-H), 8.005 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, 5-H).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.77, 37.53, 51.07, 107.96, 108.49, 109.08, 116.67, 116.69, 118.40, 119.75, 120.39, 122.45, 123.01, 123.43, 125.72, 128.55, 129.09, 135.84, 139.38, 140.40, 157.39.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1586 (m, Ar), 3322 (s, NH bzw. OH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2-hydroxyphenyl)methylenimino]carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Methanol.

(E)-9-Ethyl-3-[(2-hydroxyphenyl)methylen]iminocarbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₈N₂O, M = 314.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit Salicylaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 72% der Theorie nach Umkristallisation aus Methanol, dottergelbe Nadeln, Fp = 107-108°C.
Berechnet:
C 79.72, H 6.37, N 8.85;
Gefunden:
C 79.48, H 6.40, N 8.76%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.437 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.307 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 6.942 (dd, 2 × ³J = 9.2 Hz, 1 H, Ar'-H), 7.051 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.253-7.494 (m, überl., 7 H, 3 × Ar'-H und 4 × Ar-H), 8.044 (d, ³J = 1.9 Hz, 1 H, Ar-H), 8.114 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, 5-H), 8.761 (s, 1 H, N=CH), 13.721 (s, breit, 1 H, Ar'-OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.78 (CH₃), 37.69 (CH₂), 108.75 (CH), 108. (CH), 112.56 (CH), 117.11 (CH), 118.88 (CH), 119.10 (CH), 119.64 (quat. C), 119.73 (CH), 120.59 (CH), 122.87 (quart. C), 123.55 (quart. C), 126.11 (CH), 131.81 (CH), 132.37 (CH), 139.08 (quart. C), 140.17 (quart. C), 140.57 (quart. C), 159.82 (CH), 161.01 (CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1568 (w-m), 1594 (m) und 1613 (s, Ar); 1628 (s, CH=N), 3435 (w, breit, OH assoziiert).

2. Substanz 2: 9-Ethyl-3-(2,3-dihydroxybenzylamino)carbazol monohydrochlorid

Formel I mit a = 1, n = 1, A = Cl, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Di hydroxyphenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₂₁ClN₂O₂,
M = 368.86 g/mol;
Ausbeute: 74% der Theorie, hellbeiges amorphes Pulver, Fp ≧ 215°C (Zers.).
Berechnet:
C 68.38, H 5.74, N 7.60, Cl 9.61;
Gefunden:
C 68.48, H 5.72, N 8.41, Cl 9.61%.
MS (70 eV, 100°C): m/z [%] = 332 (3) [M⁺-HCl], 313 (2) [M⁺-HCl-H₃O], 218 (92) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺], 195 (100) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺-CH₃].
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃, durch Hydrochlorid z. T. sehr breite Signale): δ [ppm] = 1.368 (t, ³J = 7.1 Hz, 3 H, CH₃), 4.283 (q, ³J = 7.1 Hz, 2 H, CH₂), 4.476 (s, 2 H, NH-CH ₂-Ar), 5.906 (s, sehr breit, 2 H, N⁺-H₂), 6.410-7.472 (überl., breit, H_n-Ar), 7.567 (s, 1 H, 7-H), 7.970 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, 5-H).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.74 (CH₃), 37.50 (CH₂), 50.99 (CH₂).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1603 (w-m, Ar), 3322 (s, breit, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-[(2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₈N₂O₂, M = 330.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 85% der Theorie nach Umkristallisation aus Ethanol/Essigsäure ethylester, feine orangerote Nadeln, Fp = 157-158°C.
Berechnet:
C 76.35, H 5.49, N 8.45;
Gefunden:
C 76.31, H 5.58, N 8.58%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.413 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.313 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 6.800 (dd, 2 × ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar'-H), 6.948 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴ J = 1.4 Hz, 1 H, Ar-H), 7.044 (dd, ³ J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.4 Hz, 1 H, Ar-H), 7.266 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.338-7.495 (m, überl., 4 H, Ar-H), 8.008 (d, J = 1.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.086 (d, ³J = 8.1 Hz, 1 H, 5-H), 8.670 (s, 1 H, N=CH).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.76 (CH₃), 37.65 (CH₂), 108.79 (CH), 108.99 (CH), 112.43 (CH), 116.82 (CH), 118.44 (CH), 119.18 (CH), 119.29 (CH), 120.59 (CH), 122.52 (CH), 122.74 (quart. C), 123.56 (quart. C), 126.23 (CH), 138.50 (quart. C), 139.11 (quart. C), 140.57 (quart. C), 145.40 (quart. C), 150.64 (quart. C), 159.08 (CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1572 (w), ca. 1585 (m, sh) und 1613 (s, Ar); 1632 (s, CH=N), 3446 (w, breit, OH assoziiert).

3. Substanz 3: 9-Ethyl-3-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-3-methoxy phenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₂H₂₂N₂O₂, M = 346.42 g/mol;
Ausbeute: 77% der Theorie, ockerfarbenes amorphes Pulver, Fp = 140-142°C (Zers.).
Berechnet:
C 76.28, H 6.40, N 8.08;
Gefunden:
C 75.47, H 6.37, N 7.41%.
MS (70 eV, 110°C): m/z [%] = 346 (12) [M⁺], 218 (92) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺], 195 (100) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺-CH₃].
¹H-NMR (400 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.357 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 3.884 (s, 3 H, Ar'OCH₃), 4.284 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 4.666 (s, 2 H, NH-CH ₂-Ar), 6.824 (d, ³J = 4.5 Hz, 1 H, 5'-H), 6.839 (s, 1 H, 6'-H), 6.899 (m_c, 1 H, 4'-H), 6.985 (dd, ³J = 8.6 Hz, ⁴J = 2.3 Hz, 1 H, 2-H), 7.161 (ddd, 2 × ³J = 7.2 Hz, ⁴J = 1.0 Hz, 1 H, 6-H), 7.237 (d, ³J = 8.6 Hz, 1 H, 1-H), 7.340 (d, ³J = 8.4 Hz, 1 H, 8-H), 7.422 (ddd, 2 × ³J = 7.2 Hz, ⁴J = 1.0 Hz, 1 H, 7-H), 7.509 (d, ⁴J = 2.2 Hz, 1 H, 4-H), 8.003 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, 5-H).
¹³C-NMR (100 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.86 (CH₃-CH₂-N), 37.51 (CH₃-CH₂-N), 47.62 (CH₂), 56.01 (HN-CH₂-Ar), 105.87 (C-5), 108.39 (C-7), 109.07 (C-8), 110.40 (C-5' oder C6'), 115.92 (C-2), 118.10 (C-6), 119.52 (C-5' oder C6'), 120.42 (C-5), 121.10 (C-4'); 122.60, 123.48 und 124.52 (quart. C); 125.45 (C-7); 134.93, 140.33, 140.67, 145.11 und 147.30 (quart. C).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1585 (w-m, Ar), 3323 (s, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylenimino] carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-[(2-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxy-3-methoxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₂H₂₀N₂O₂, M = 344.41 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2-Hydroxy-3-methoxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 88% der Theorie nach Umkristallisation aus Ethanol/Wasser, feinkristallines ockerfarbenes Produkt, Fp = 129-131°C.
Berechnet:
C 76.72, H 5.85, N 8.13;
Gefunden:
C 76.54, H 6.16, N 8.14%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.433 (t, ³J = 7.1 Hz, 3 H, CH₃), 3.944 (s, 3 H, OCH₃), 4.360 (q, ³J = 7.1 Hz, 2 H, CH₂), 6.843-6.905 (m, 2 H, Ar-H), 6.972 (dd, ³J = 8.1 Hz, ⁴J = 1.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.050 (dd, ³J = 8.1 Hz, ⁴J = 1.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.240 (ddd, überl. mit CDCl₃-Signal, 2 × ³J ca. 8 Hz, ⁴J = 1.2 Hz, 1 H, Ar-H), 7.383-7.517 (m, überl., 3 H, Ar-H), 8.039 (d, J = 1.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.110 (dd, ³J = 8.6 Hz, ⁴J = 1.0 Hz, 1 H, Ar-H), 8.770 (s, 1 H, N=CH), 14.167 (s, 1 H, Ar-OH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1570 (vw) und 1620 (m, Ar); 1609 (m-s, CH=N), 3440 (w, breit, OH assoziiert).

4. Substanz 4: 9-Ethyl-3-(2,3,4-trihydroxybenzylamino)carbazol monohydrochlorid

Formel I mit a = 1, n = 1, A = Cl, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3,4-Tri hydroxyphenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₂₀N₂O₃, M = 348.40 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2,3,4-trihydroxyphenyl)methylenimino] carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol unter Inertgas.

(E)-9-Ethyl-3-[(2,3,4-trihydroxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,3,4-Trihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₈N₂O₃, M = 346.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2,3,4-Tri hydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute bei Aufarbeitung: 44% der Theorie nach Umkristallisation aus Essigsäureethylester/Hexan, oranges bis ockerfarbenes amorphes Pulver, Fp = 290-302°C (Zers.).
Berechnet:
C 72.82, H 5.24, N 8.09;
Gefunden:
C 72.62, H 5.26, N 7.95%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.417 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.335 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 6.453 (d, ³J = 8.7 Hz, 1 H, Ar-H), 6.833 (d, ³J = 8.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.240 (dd, überl. mit CHCl₃, 2 × ³J ca. 8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.357-7.520 (überlagert, 4 H, Ar-H), 7.995 (d, J = 1.5 Hz, 1 H, Ar-H), 8.080 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.880 (s, 1 H, N=CH).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.80 (CH₃), 37.74 (CH₂), 107.22, 108.23, 109.20 (2 ×, überlagert ?), 111.54, 111.93, 118.55, 119.24, 120.66, 122.62, 123.67, 124.16, 126. 37, 132.35, 135.87, 138.81, 140.65, 148.16, 157.51.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1496 (m), 1510 (w, sh) und 1552 (w, Ar); 1628 (s, CH=N), 3430 (s, breit, OH assoziiert).

5. Substanz 5: 9-Ethyl-3-(2,4,6-trihydroxybenzylamino)carbazol monohydrochlorid

Formel I mit a = 1, n = 1, A = Cl, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4,6-Tri hydroxyphenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁R₂₀N₂O₃, M = 348.40 g/mol;
Ausbeute: 70% der Theorie, beiges amorphes Pulver, Fp < 260°C (Zers.).
Berechnet:
C 65.54, H 5.50, N 7.28; Gefunden:
C 65.21, H 5.28, N 7.26%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1580 (s, Ar), 3429 (m-s, breit, XH), kein C=N
vorzugsweise in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2,4,6-trihydroxyphenyl) methylenimino]carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol unter Inertgas.

(E)-9-Ethyl-3-[2,4,6-trihydroxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,4,6-Trihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₈N₂O₃, M = 346.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2,4,6-Tri hydroxybenzaldehyd in Methanol.
Ausbeute bei Aufarbeitung: 74% der Theorie nach Umkristallisation aus Ethanol, leuchtend ockerfarbenes amorphes Pulver, Fp ≧ 280°C (Zers.).
Berechnet:
C 72.82, H 5.24, N 8.09;
Gefunden:
C 72.79, H 5.50, N 8.19%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1493 (m-s) und 1555 (w, Ar); 1623 (s, CH=N), 3203 (w, breit, OH assoziiert).

6. Substanz 6: 9-Ethyl-3-(3,5-di-tert-butyl-2-hydroxy benzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 3,5-Di-tert-butyl-2-hydroxy phenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₉H₃₆N₂O, M = 428.61 g/mol;
Ausbeute: 82% der Theorie, farblose Schuppen, Fp = 124-125°C.
Berechnet:
C 81.27, H 8.47, N 6.54, Cl 0.00;
Gefunden:
C 81.33, H 8.67, N 6.02, Cl 0.00%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.330 (s, 9 H, C(CH₃)₃), 1.375 (t, ³ J = 7.0 Hz, 3 H, CH₃), 1.457 (s, 9 H, C(CH₃)₃), 4.313 (q, ³J = 7.0 Hz, 2 H, CH₂), 4.487 (s, 2 H, NH-CH ₂-Ar), 7.059 (m_c, 1 H, Ar-H), 7.096 (d, J = 2.2 Hz, 1 H, Ar-H), 7.158-7.420 (m, z. T. überl., 5 H, Ar-H), 7.639 (d, J = 2.1 Hz, 1 H, Ar-H), 8.016 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.78 (CH₃- CH₂-N), 18.36, 29.67 (C(CH₃)₃), 31.66 (C(CH₃)₃), 34.20, 34.96, 37.54 (CH₃-CH₂-N), 51.80, 58.40 (HN-CH₂-Ar), 107.92 (C-5), 108.46 (C-7), 109.02 (C-8), 117.08, 118.37, 120.36, 121.54, 122.50, 122.60, 123.42, 123.57, 125.45, 125.66, 135.77, 136.36, 139.58, 140.38, 141.28, 152.61, 153.80.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1472 (s) und 1605 (w, Ar), 2959 (s, C-H), 3322 (s, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(3,5-di-tert-butyl-2-hydroxyphenyl)methylen imino]carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-[(3,5-di-tert-butyl-2-hydroxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 3,5-Di-tert-butyl-2-hydroxy-phenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₉H₃₄N₂O, M = 426.60 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 3,5-Di-tert- butyl-2-hydroxy-benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 75% der Theorie nach Umkristallisation aus Ethanol/Wasser, dottergelbe Nadeln, Fp = 164-165°C.
Berechnet:
C 81.65, H 8.03, N 6.57;
Gefunden:
C 81.36, H 8.07, N 6.53%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.377 (s, 9 H, C(CH₃)₃), 1.451 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 1.536 (s, 9 H, C(CH₃)₃), 4.368 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 7.223-7.302 (m, 2 H, Ar-H), 7.390-7.530 (m, überl., 5 H, Ar-H), 8.074 (d, J = 1.9 Hz, 1 H, Ar-H), 8.119 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.819 (s, 1 H, N=CH), 14.167 (s, breit, 1 H, Ar-OH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1612 (s, CH=N), 1623 (m, sh, Ar), 2958 (s, C-H), 3427 (w, breit, OH assoziiert).

7. Substanz 7: 9-Ethyl-3-(ferrocenylmethylamino)carbazol monohydrochlorid

Formel I mit a = 1, n = 1, A = Cl, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = Ferrocenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₈H₅N₂ClFe, M = 500.97 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(ferrocenylmethylenimino)carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol unter Inertgas.

(E)-9-Ethyl-3-(2',3',4'-trihydroxyphenyl-methylen)iminocarbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = Ferrocenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₈H₄₂N₂Fe, M = 462.50 g/mol;
erhalten in situ durch Umsetzung äquimolarer Mengen von 3-Amino-9-ethyl carbazol mit Ferrocencarbaldehyd in Ethanol oder mit Zwischenaufarbeitung nach: F. D. Popp, E. B. Moynahan, J. Hererocycl. Chem. 1970 (7), 739-741 (ca. 50% Ausbeute, F = 195-199°C).

8. Substanz 8: 9-Ethyl-3-[4(3-hydroxy-5-hydroxymethyl-2-methyl pyridyl)methyl]aminocarbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 3-Hydrox-5-hydroxymethyl-2-methyl pyrid-4-yl, R⁴ = R⁵ = H, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₂H₂₃N₃O₂, M = 361.44 g/mol;
Ausbeute: 65% der Theorie nach Umkristallisation aus Methanol/Wasser, hellbeige Tafeln, Fp = 171-172°C.
Berechnet:
C 73.11, H 6.41, N 11.63, Cl 0.00;
Gefunden:
C 71.99, H 6.90, N 10.74, Cl 0.00%.
MS (70 eV, 100°C): m/z [%] = 361 (19) [M⁺], 218 (92) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺], 195 (100) [M_{3-Amino-9-ethylcarbazol}⁺-CH₃].
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [pm] = 1.241 (t, ³J = 7.0 Hz, 3 H, CH₃), 2.355 (s, 3 H, Ar'-CH₃), 4.294 (q, ³J = 7.0 Hz, 2 H, CH₃-CH ₂), 4.507 (s, 2 H, NH-CH ₂-Ar'), 4.622 (s, 2 H, HO-CH ₂-Ar), 7.008-7.013 (m, 1 H, Ar-H), 7.097 (dd, 2 × ³J = 7.5 Hz, 1 H, 2-H), 7.345-7.408 (m, überl., 3 H, Ar-H), 7.476 (d, ³J = 8.2 Hz, 1 H, Ar-H), 7.565 (d, J = 2.1 Hz, 1 H, Ar-H), 7.263-8.012 (m, überl., 2 H, Ar-H), 10.233 (s, sehr breit, X-H).
¹³C-NMR (100 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.73 (CH₃-CH₂-N), 19.35 (CH₃-Ar'), 36.88 (CH₃-CH₂-N), 42.11, 59.14 (HN-CH₂-Ar'), 104.41, 108.90, 109.59, 115.87, 115.92, 117.91, 120.20, 121.98, 125.32, 129.95, 133.47, 134.05, 139.29, 139.80, 141.21, 145.68, 150.68.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1414 (m), 1464 (s) und 1414 (m, Ar); 3345 (m-s, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[4(3-hydroxy-5-hydroxymethyl-2-methylpyridyl) methylenimino]carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol und anschließender wässrig-ammoniakalischer Aufarbeitung.

(E)-9-Ethyl-3-[4(3-hydroxy-5-hydroxymethyl-2-methylpyridyl)methylen imino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 3-Hydroxy-5-hydroxymethyl-2-methyl pyrid-4-yl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₂H₂₁N₃O₂, M = 395.88 g/mol;
erhalten durch äquimolare Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit Pyridoxalhydrochlorid in Ethanol und Absaugen des körnig-rotbraunen Rohproduktes und anschließender direkter Weiterverarbeitung.

9. Substanz 9: 9-Ethyl-3-(2,5-dihydroxybenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,5-Dihydroxyphenyl, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₂₀N₂O₂, M = 332.40 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-[(2,5-dihydroxyphenyl)methylenimino] carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-[(2,5-dihydroxyphenyl)methylenimino]carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,5-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₈N₂O₂, M = 330.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2,5-Di hydroxybenzaldehyd in Methanol. Aufarbeitung durch Einengen am Rotationsverdampfer.
Ausbeute: praktisch quantitativ als Rohprodukt in Form eines hellbraunen Öles.
Berechnet:
C 76.35, H 5.49, N 8.45;
Gefunden:
C 76.69, H 5.81, N 8.47%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.420 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.341 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH₂), 6.861-6.944 (m, überl., 3 H, Ar-H), 7.235 (dt, ³J = 6.2 Hz, ⁴J = 1.0 Hz, 1 H, Ar-H), 7.351-7.511 (m, überl., 4 H, Ar-H), 8.012 (d, J = 1.9 Hz, 1 H, Ar-H), 8.086 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, 5-H), 8.645 (s, 1 H, N=CH).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.80 (CH₃), 37.72 (CH₂), 108.77 (CH), 108.95 (CH), 112.66 (CH), 171.13 (CH), 117.83 (CH), 119.15, 119.50, 119.74, 120.34, 120.63, 122.88 (quart. C), 123.57 (quart. C), 126.16 (CH), 139.16 (quart. C), 140.11 (quart. C), 140.59 (quart. C), 147.95 (quart. C), 155.07 (quart. C), 159.24 (CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1601 (m-s, Ar); 1630 (m-s, CH=N), 3432 (s, breit, OH assoziiert).

10. Substanz 10: N,N'-Bis-(2,3-dihydroxybenzyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy-phenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₂₀N₂O₄, M = 352.38 g/mol;
Ausbeute: 72% der Theorie (Rohprodukt); beiges, sich an der Luft langsam bräunlich verfärbendes amorphes Pulver, Fp < 300°C (Zers. ab ca. 220°C).
Berechnet:
C 68.15, H 5.72, N 7.95, Cl 0.00;
Gefunden:
C 63.94, H 5.64, N 7.79, Cl 0.42%.
¹H- und ¹³C-NMR (400 und 100 MHz, in DMSO-D₆): breite Banden, salzartig.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1463 (s), 1512 (w), 1606 (m, Ar); 3395 (m, XH), kein C=N
erhalten aus 1,3-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₁₆N₂O₄, M = 348.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 87% der Theorie, orange-rote Schuppen, Fp = 201-203°C.
Berechnet:
C 68.96, H 4.63, N 8.04;
Gefunden:
C 68.87, H 4.44, N 7.89%.
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.796 (t, ³J = 7.8 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.952 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.2 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.119 (dd, ³J = 7.7 Hz, ⁴J = 1.1 Hz, 2 H,2 × Ar-H), 7.341 (dd, ³J = 7.9 Hz,⁴J = 2.0 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.510-7.550 (m, 2 H, 2 × Ar-H), 9.006 (s, 2 H, 2 × CH=N).
¹³C-NMR (100 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 114.02, 119.27, 119.60, 119.80, 123.28, 130.85, 146.11, 149.60, 149.83, 165.04.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1465 (m-s) und 1578 (s, Ar); 1623 (s, CH=N), 3435 (vs, breit, OH assoziiert).

11. Substanz 11: N,N'-Bis-(2-hydroxybenzyl)-1,2-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-phenyl, Z = 1,2-Pheny len, C₂₀H₂₀N₂O₂, M = 320.37 g/mol;
Ausbeute: 72% der Theorie, hellbeiges amorphes Pulver, Fp = 113-114°C (Zers., aus Methanol).
Berechnet:
C 74.98, H 6.29, N 8.74;
Gefunden:
C 74.77, H 6.03, N 8.57%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.221 (d, ³J = 5.1 Hz, 2 H, 2 × NH-CH ₂-Ar), 5.043 (t, ³J = 5.2 Hz, 2 H, 2 × NH), 6.376-6.475 (m, 4 H, Ar-H), 6.727 (t, ³J = 7.4 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.817 (d, ³J = 7.6 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.043 (t, ³J = 7.5 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.194 (d, ³J = 7.4 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 9.556 (s, 2 H, 2 × Ar-OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 42.27, 110.13, 114.92,117.35, 118.84, 125.75, 127.53, 128.50, 136.24, 155.13.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1605 (s, Ar), 3290 (s, XH), kein C=N
erhalten aus 1,2-Bis-[((E)-2-hydroxyphenyl)methylenimino]benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,2-Bis-[((E)-2-hydroxyphenyl)methylenimino]benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2-Hydroxy phenyl, Z = 1,2-Phenylen, C₂₀H₁₆N₂O₂, M = 316.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,2-Phenylendiamin mit 2-Hydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 93% der Theorie (Rohprodukt), flache gelbe Nadeln, Fp = 163-165°C.
Berechnet:
C 75.94, H 5.10, N 8.86;
Gefunden:
C 76.05, H 5.02, N 8.74%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1562 (m-s) und 1585 (m, Ar); 1616 (vs, CH=N), 3057 (vw, OH).

12. Substanz 12: N,N'-Bis-(2,3-dihydroxybenzyl)-1,4-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy-phenyl, Z = 1,4-Phenylen, C₂₀H₂₀N₂O₄, M = 352.38 g/mol;
in situ erhalten aus 1,4-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,4-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = 1,4-Phenylen, C₂₀H₁₆N₂O₄, M = 348.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,4-Phenylendiamin mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: praktisch quantitativ dunkel rotbraunes Rohprodukt, Fp < 330°C (Subl. ab 275°C, ab 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 68.96, H 4.63, N 8.04;
Gefunden:
C 68.33, H 4.78, N 8.10%.
MS (70 eV, 100°C; FAB, 3-NBA): m/z = 349 [M+1]⁺.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1462 (s), 1511 (s) und 1562 (w, Ar); 1618 (s, CH=N), 3334 (s, breit, OH assoziiert).

13. Substanz 13: N,N'-Bis-(2,3-dihydroxybenzyl)-3,5-diamino benzencarbonsäure

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Phenyl-3,5-diyl-carbonsäure, C₂₁H₂₀N₂O₆, M = 396.38 g/mol;
in situ erhalten aus 3,5-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino] benzencarbonsäure
durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

3,5-Bis-[((E)-2,3-dihydroxyphenyl)methylenimino]benzencarbonsäure:
Formel I mit a = 0, n = 2, R = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Di hydroxyphenyl, Z = Phenyl-3,5-diyl-carbonsäure, C₂₀H₁₆N₂O₄, M = 348.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2,3-Dihydroxybezaldehyd mit 3,5-Di aminobenzoesäure in Ethanol.
Ausbeute: 76% der Theorie, dunkel weinroter Feststoff, Fp = 274-277°C (Zers., aus THF/Ethanol umkristallisiert, Fällung durch Wasserzusatz vervollständigt).
Berechnet:
C 64.28, H 4.11, N 7.14;
Gefunden:
C 63.64, H 4.69, N 7.12%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1464 (m-s) und 1580 (s, Ar); 1624 (s) und 1716 (m; CH=N und COOH); 3416 (m, breit, OH assoziiert).

14. Substanz 14: 4-(2,3-Dihydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Carboxy-2-hydroxy-phen-4-yl, C₁₄H₁₃NO₅, M = 275.24 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-4-[(2,3-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-4-[(2,3-Dihydroxyphenyl)ethylenimino]alicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₄H₁₁NO₅, M = 273.24 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol bei 50°C.
Ausbeute: 92%, leuchtend orange-roter amorpher Feststoff, Fp = 188-190°C.
Berechnet:
C 61.54, H 4.06, N 5.13;
Gefunden:
C 61.96, H 4.15, N 5.14%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 8.922 (s, 1 H, N=CH). IR (KBr): ν [cm^-1] = 1601 (m, sh) und 1615 (s, Ar), 1630 (s) und 1658 (m-s, CH=N und COOH), 3422 (s, breit, OH assoziiert).

15. Substanz 15: 4-(2,4-Dihydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₄H₁₃NO₅, M = 275.24 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-4-[(2,4-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-4-[(2,4-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₄H₁₁NO₅, M = 273.24 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit 2,4-Di hydroxybenzaldehyd in Ethanol bei 50°C.
Ausbeute: 85%, leuchtend citronengelber amorpher Feststoff, Fp = 184-187°C.
Berechnet:
C 61.54, H 4.06, N 5.13;
Gefunden:
C 61.57, H 4.15, N 5.18%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1446 (m), 1510 und 1593 (s, sh, Ar); 1617 (s, sh, CH=N und COOH), 3073 (w-m, breit, OH assoziiert).

16. Substanz 16: 4-(4-Diethylamino-2-hydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 4-Diethylamino-2-hydroxy phenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₂₂N₂O₅, M = 346.37 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-4-[8(4-Diethylamino-2-hydroxyphenyl)methylen imino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-4-[(4-Diethylamino-2-hydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 4-Diethylamino-2-hydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₂₀N₂O₅, M = 344.37 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit 4-Diethylamino-2- hydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 53%, ockerfarbener amorpher Feststoff, Fp = 206-210°C.
Berechnet:
C 62.78, H 5.85, N 8.14;
Gefunden:
C 62.51, H 6.02, N 8.56%.
IR (KBr): ν [cm¹] = 1444 (m) und 1523 (s; Ar), 1606 (s, relativ breit; CH=N und COOH, überl.), 3421 (vw, breit, OH assoziiert).

17. Substanz 17: 4-(2-Hydroxynaphth-1-ylmethylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₁₅NO₄, M = 309.30 g/mol;
Ausbeute: 75% der Theorie (Rohprodukt), hellbeiges amorphes Pulver, Fp = 160-165°C (Zers).
Berechnet:
C 69.90, H 4.89, N 4.53, Cl 0.00;
Gefunden:
C 71.91, H 5.56, N 3.17, Cl 1.81%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1438 (s-m), 1469 (m) und 1517 (s, Ar); 1626 (vs, COOH), 3416 (vs, breit, X-H assoziiert)
erhalten aus (E)-4-(2-Hydroxynaphth-1-ylmethylenimino)salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-4-(2-Hydroxynaphth-1-ylrnethylenimino)salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₁₃NO₄, M = 307.30 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit 2-Hydroxy naphthalin-1-carbaldehyd in Ethanol bei 60°C.
Ausbeute: 85%, leuchtend oranger amorpher Feststoff, Fp = 250-253°C.
Berechnet:
C 70.36, H 4.26, N 4.56;
Gefunden:
C 70.73, H 4.51, N 4.58%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1430 (m, sh), 1493 (m-s), 1527 (s) und 1548 (s, Ar); 1609 (vs) und 1658 (s, CH=N und COOH), 3025 (m, breit, OH assoziiert).

18. Substanz 18: 5-(2,3-Dihydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₄H₁₃NO₅, M = 275.24 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-[(2,3-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-[(2,3 Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₄H₁₁NO₅, M = 273.24 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol bei 75°C.
Ausbeute: 70%, leuchtend orange-roter Feststoff, Fp = 273-275°C (Subl. ab 235°C; aus i-Propanol/Essigester umkristallisiert).
Berechnet:
C 61.54, H 4.06, N 5.13;
Gefunden:
C 61.07, H 3.96, N 4.96%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): 3 [ppm] = 6.765 (t, ³J = 7.7 Hz, 1 H, 5'-H), 6.921 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, 4' oder 6'-H), 7.049 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, 6' oder 4'-H), 7.077 (d, ³J = 8.9 Hz, 1 H, 3-H), 7.645 (dd, ³J = 8.7 Hz, ⁴J = 2.5 Hz, 1 H, 4-H), 7.812 (d, ⁴J = 2.4 Hz, 1 H, 6-H), 8.917 (s, 1 H, N=CH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 113.60, 118.18, 2 × 118.77, 119.46, 122.50, 122.71, 128.76, 139.32, 145.51, 148.98, 160.06, 162.42 (C=NH), 171.46 (COOH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1495 (s), 1558 (w, Ar); 1627 (s, CH=N), 1666 (m-s, C=O), 3336 (s, breit, OH assoziiert).

19. Substanz 19: 5-(2,4-Dihydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₄H₁₃NO₅, M = 275.24 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-[(2,4-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-[(2,4-Dihydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ =Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₄H₁₁NO₅, M = 273.24 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit 2,4-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol bei 75°C.
Ausbeute: 92%, goldockerfarbener amorpher Feststoff, Fp < 280°C (Zers.).
Berechnet:
C 61.54, H 4.06, N 5.13;
Gefunden:
C 61.68, H 4.20, N 5.07%
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1504 (s, Ar), 1603 (s, sh) und 1617 (s; CH=N und COOH), 3406 (w, breit, OH assoziiert).

20. Substanz 20: 5-(4-Diethylamino-2-hydroxybenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 5-Diethylamino-2-hydroxy phenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₂₂N₂O₅, M = 346.37 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-[(4-Diethylamino-2-hydroxyphenyl)methylen imino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-[(4-Diethylamino-2-hydroxyphenyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 5-Diethylamino-2-hydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₂₀N₂O₅, M = 344.37 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit 4-Diethylamino-2-hydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 77%, goldockerfarbener amorpher Feststoff, Fp = 263-266°C.
Berechnet:
C 62.78, H 5.85, N 8.14;
Gefunden:
C 63.05, H 6.06, N 8.24%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1530 (m, Ar), 1611 (vs, br.; CH=N und COOH, überl.), 3422 (w, breit, OH assoziiert).

21. Substanz 21: 5-(2-Hydroxynaphth-1-yl-methylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₁₅NO₄, M = 309.30 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-(2-Hydroxynaphth-1-yl-methylenimino)salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-(2-Hydroxynaphth-1-yl-methylenimino)salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₁₃NO₄, M = 307.30 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit 2-Hydroxy naphthalin-1-carbaldehyd in Ethanol bei 75°C.
Ausbeute: 91% der Theorie (Rohprodukt), dunkelockerfarbenes amorphes Pulver, Fp < 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 70.36, H 4.26, N 4.56;
Gefunden:
C 69.78, H 4.43, N 4.48%.
IR (KBr): ν [cm¹] = 1492 (s), 1520 (m, sh) und 1548 (m-s; Ar); 1619 (s, CH=N), 1664 (s, C=O), 3427 (w, breit, OH assoziiert).

22. Substanz 22: 4,4'-Bis-(2,3-Dihydroxybenzylamino)-3,3'-dimethoxy biphenyl

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy-phenyl, Z = 3,3'-Dimethoxy-biphen-4,4'-diyl, C₂₈H₂₈N₂O₆, M = 488.50 g/mol;
in situ erhalten aus 4,4'-Bis-[(E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]-3,3'-di methoxy-biphenyl
durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4,4'-Bis-[(E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]-3,3'-dimethoxy biphenyl:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = 3,3'-Dimethoxy-biphen-4,4'-diyl, C₂₈H₂₄N₂O₆, M = 484.50 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4,4'-Diamino-3,3'-dimethoxybiphenyl mit 2,3-Dihydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: praktisch quantitativ dunkel weinrotes Rohprodukt, Fp = 292-296°C (Zers. < 200°C).
Berechnet:
C 69.41, H 4.99, N 5.78; Gefunden:
C 68.67, H 5.17, N 5.83%.
MS (70 eV, 100°C; FAB, 3-NBA): m/z = 485 [M+1]⁺.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1462 (s), 1496 (m), 1547 (w-m) und 1578 (m, Ar); 1623 (s, CH=N), 3421 (s, breit, OH assoziiert).

23. Substanz 23: 9-Ethyl-3-(2-pyrrolylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² =R⁴ =R⁵ H, R³ = Pyrrol-2-yl, Z = 9-Ethylcabazol-3-yl, C₁₉H₁₉N₃, M = 289.38 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(2-pyrrolyl-methylenimino)carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Methanol.

(E)-9-Ethyl-3-(2-pyrrolyl-methylenimino)carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = Pyrrol-2-yl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl cabazol-3-yl, C₁₉H₁₇N₃, M = 287.37 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit Pyrrol-2- carbaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 63% der Theorie (aus Essigester/Hexan umkristallisiert), Fp = 189-192°C (Zers.), ockerbrauner feinkristalliner Feststoff.
Berechnet:
C 79.42, H 5.96, N 14.62;
Gefunden:
C 79.37, H 5.86, N 14.38%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.437 (t, ³J = 7.1 Hz, 3 H, CH₃), 4.361 (q, ³J = 7.1 Hz, 2 H, CH ₂-CH₃), 6.289 (t, J = 2.7 Hz, 1 H, Ar-H), 6.681 (dd, J = 3.5 Hz, J' = 1.2 Hz, 1 H, Ar-H), 6.886 (m_c, 1 H, Ar-H), 7.220 (t, ³J = 6.9 Hz, 1 H, Ar-H), 7.238-7.498 (m, überl., 4 H, Ar-H), 7.961 (m_c, 1 H, Ar'-H), 8.085 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.449 (s, 1 H, CH=N).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 13.84 (CH₃), 37.68 (CH₂); 108.62, 108.79, 110.27, 112.04, 115.66, 118.79, 119.87, 120.55 und 122.54 (jeweils CH); 123.03 und 123.56 (jeweils quart. C), 125.83 (CH); 131.24, 138.43, 140.53 und 143.76 (jeweils quart. C); 147.97 (CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1470 (s), 1475 (s, sh), und 1490 (s; Ar); 1621 (s, CH=N), 3195 (w-m, X-H).

24. Substanz 24: N-(2,3-Dihydroxybenzyl)-2-aminophenol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = 2-Hydroxyphenyl, C₁₃H₁₃NO₃, M = 231.24 g/mol;
in situ erhalten aus 2-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)phenol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

2-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)phenol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = 2-Hydroxyphenyl, C₁₃H₁₁NO₃, M = 229.23 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Aminophenol mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 76% der Theorie, leuchtend orange flache Nadeln, Fp = 175-178°C (Subl. 240°C; aus 85%igem Methanol umkristallisiert).
Berechnet:
C 68.12, H 4.84, N 6.11;
Gefunden:
C 68.56, H 5.03, N 6.05%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.703 (t, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 6.866 (m_c, überl., 2 H, Ar-H), 6.961 (dd, ³J = 8.1 Hz, ⁴J = 1.1 Hz, 1 H, Ar-H), 7.022 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.119 (dt, ³J = 7.4 Hz, ⁴J = 1.5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.396 (dd, ³J = 7.9 Hz, ⁴J = 1.2 Hz, 1 H, Ar-H), 8.930 (s, 1 H, CH=N), 9.022 (s, 1 H, Ar-OH), 9.833 (s, 1 H, Ar-OH), 14.192 (s, 1 H, Ar-OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 116.45, 117.85, 118.02, 118.97, 119.17, 119.62, 122.45, 127.93, 133.95, 146.02, 150.82, 151.56, 161.20.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1465 (m-s) und 1578 (s, Ar); 1623 (s, CH=N), 3435 (vs, breit, OH assoziiert).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1463 (s), 1498 (m), 1546 (m) und 1595 (m, Ar); 1632 (vs, CH=N), 3390 und 3513 (s, breit, sh, OH assoziiert).

25. Substanz 25: N-(2,3-Dihydroxybenzyl)-3-aminophenol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = 3-Hydroxyphenyl, C₁₃H₁₃NO₃, M = 23 1.24 g/mol;
in situ erhalten aus 3-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)phenol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

3-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)phenol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Di hydroxyphenyl, Z = 3-Hydroxyphenyl, C₁₃H₁₁NO₃, M = 229.23 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Aminophenol mit 2,3-Di hydroxybenzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 76% der Theorie, tiefrote feine Kristalle, Fp = 191-193°C (aus 80%igem Methanol umkristallisiert).
Berechnet:
C 68.12, H 4.84, N 6.11;
Gefunden:
C 68.58, H 4.98, N 6.05%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.706-6.839 (m, 3 H, Ar-H), 6.935 (d, ³J = 7.9 Hz, 1 H, Ar-H), 7.082 (d, ³J = 7.9 Hz, 1 H, Ar-H), 7.235 (t, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.852 (s, 1 H, CH=N).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 108.09, 111.91, 114.03, 118.66, 118.87, 119.25, 122.76, 130.19, 145.61, 149.00, 149.50, 158.32, 163.48.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1459 (m-s, sh), 1502 (s), 1543 (s) und 1598 (s, Ar); 1638 (s, CH=N), 3289 (s, breit, OH assoziiert).

26. Substanz 26: 5-Hydroxy-2-(2-hydroxynaphth-1-yl- methylamino)benzoesäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₈H₁₅NO₄, M = 309.30 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-Hydroxy-2-(2-hydroxynaphth-1-yl- methylenimino)benzoesäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-Hydroxy-2-(2-hydroxynaphth-1-yl-methylenimino)benzoesäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxynaphth-1-yl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₈H₁₃NO₄, M = 307.30 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Amino-5-hydroxybenoesäure mit 2-Hydroxy naphthalin-1-carbaldehyd in Ethanol bei 75°C.
Ausbeute: 95% (Rohprodukt), leuchtend orange-roter amorpher Feststoff, Fp 273-277°C.
Berechnet:
C 70.36, H 4.26, N 4.56;
Gefunden:
C 70.05, H 4.51, N 4.79%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.844 (d, ³J = 9.2 Hz, 1 H, Ar-H), 7.097 (dd, ³J = 8.8 Hz, ⁴J = 2.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.265 (t, ³J = 7.4 Hz, 1 H, Ar-H), 7.536 (d, ³J = 2.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.467 (t, ³J = 7.4 Hz, 1 H, Ar-H), 7.689 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.802 (d, ³J = 8.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.825 (d, ³J = 8.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.357 (d, ³J = 8.4 Hz, 1 H, Ar-H), 9.340 (s, 1 H, CH=N), ca. 9.9 (s, breit, 1 H, OH), ca. 13.7 (s, sehr breit, 1 H, OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 108.47, 116.73, 120.00, 120.51, 120.71, 123.15, 123.64, 123.93, 126.31, 127.99, 128.93, 133.72, 135.05, 137.21, 151.53, 155.32, 167.25, 173.29.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1490 (m), 1545 (s) und 1575 (s, Ar); 1621 (s) und 1696 (m, CH=N und COOH), 3422 (s, breit, OH assoziiert).

27. Substanz 27: 5-Hydroxy-2-(3-hydroxynaphth-2-yl- methylamino)benzoesäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 3-Hydroxynaphth-2-yl, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₈H₁₅NO₄, M = 309.30 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-Hydroxy-2-(3-hydroxynaphth-2-yl-methylenimino)- benzoesäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-Hydroxy-2-(3-hydroxynaphth-2-yl-methylenimino)benzoesäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 3-Hydroxynaphth-2-yl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₈H₁₃NO₄, M = 307.30 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Amino-5-hydroxybenoesäure mit 3-Hy droxynaphthalin-2-carbaldehyd in Ethanol bei 75°C.
Ausbeute: 90% (Rohprodukt), oranger amorpher Feststoff, Fp < 310°C (Zers.).
Berechnet:
C 70.36, H 4.26, N 4.56;
Gefunden:
C 70.03, H 4.31, N 4.40%.

28. Substanz 28: 5-Hydroxy-2-(2,3-dihydroxybenzylamino)benzoesäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₄H₁₁NO₅, M = 273.24 g/mol;
Ausbeute: 35% (Rohprodukt), farblose bis hellgraue schuppige Kristalle, Fp < 260°C (Zers.).
Berechnet:
C 61.54, H 4.06, N 5.13;
Gefunden:
C 60.01, H 4.59, N 4.99%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.239 (s, 2 H, CH₂-Ar), 6.513-6.637 (m, überl., 3 H, Ar-H), 6.667 (dd, ³J = 7.4 Hz, ⁴J = 2.0 Hz, 1 H, Ar-H), 6.827 (dd, ³J = 8.9 Hz, ⁴J = 3.0 Hz, 1 H, Ar-H), 7.209 (d, ⁴J = 3.0 Hz, 1 H, Ar-H), 8.637 - ca. 11 (sehr breit, ca. 3 H, XH).
¹³C-NMR (60 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 41.61 (CH₂), 110.40 (quart. C); 112.78, 114.02, 116.41, 118.68, 118.81, 122.95 (jeweils CH); 126.18, 143.09, 144.76, 144.88, 146.20 und 169.56 (jeweils quart. C).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1480 (s), 1498 (w) und 1588 (s, Ar), 1600 (m, sh, COOH), 3178 (s, breit, OH assoziiert)
erhalten aus (E)-5-Hydroxy-2-(2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino)benzoe säure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-Hydroxy-2-(2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino)benzoesäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Carboxy-5-hydroxyphen-2-yl, C₁₄H₉NO₅, M = 271.24 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Amino-5-hydroxybenoesäure mit 2,3-Di hydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 85% (Rohprodukt), orangefarbener amorpher Feststoff, Fp = 272-274°C (Subl. ab 235°C).
Berechnet:
C 62.00, H 3.34, N 5.16;
Gefunden:
C 61.78, H 3.36, N 5.25%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.767 (t, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 6.919 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.043 (d, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.086 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.655 (dd, ³J = 8.7 Hz, ⁴J = 2.7 Hz, 1 H, Ar-H), 7.812 (d, ⁴J = 2.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.927 (s, 1 H, CH=N), 9.161 (s, breit, 1 H, Ar-OH), ca. 13.2 (s, sehr breit, 1 H, Ar-OH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1494 (s) und 1558 (w, Ar), 1626 (s) und 1664 (m, CH=N und COOH), 3340 (s, breit, OH assoziiert).

29. Substanz 29: N-(2,4-Dihydroxybenzyl)-2-amino-5-nitrophenol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, Z = 2-Hydroxy-4-nitrophenyl, C₁₃H₁₂N₂O₅, M = 276.24 g/mol;
in situ erhalten aus 2-(2,4-Dihydroxyphenyl-methylenimino)-5-nitrophenol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

2-(2,4-Dihydroxyphenyl-methylenimino)-5-nitrophenol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,4- Dihydroxyphenyl, Z = 2-Hydroxy-4-nitrophenyl, C₁₃H₁₀N₂O₅, M = 274.23 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Amino-5-nitrophenol mit 2,4-Di hydroxybenzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 44% der Theorie, aus Methanol umkristallisiert; orange-rotes amorphes Pulver, Fp = < 300°C (Zers. ab 165°C).
Berechnet:
C 56.94, H 3.68, N 10.22;
Gefunden:
C 56.72, H 3.74, N 10.19%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1466 (m), 1508 (m) und 1548 (m; Ar); 1627 (s) und 1654 (vs; CH=N und NO₂), 3441 (vs, breit, sh, OH assoziiert).

30. Substanz 30: N-(2,3-Dihydroxybenzyl)-2-amino-5-nitrophenol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = 2-Hydroxy-4-nitrophenyl, C₁₃H₁₂N₂O₅, M = 276.24 g/mol;
Ausbeute: 44% der Theorie, aus 40%igem Ethanol umkristallisiert; blaß citronengelbe Nadeln, Fp = 191-195°C.
Berechnet:
C 56.52, H 4.38, N 10.14 Cl 0.00;
Gefunden:
C 56.67, H 4.40, N 10.24 Cl 0.55%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.357 (s, 1 H, Benzyl-H), 4.374 (s, 1 H, Benzyl-H), 6.451 (d, ³J = 9.0 Hz, 1 H, Ar-H), 6.531-6.684 (m, überl., 3 H, 3 × Ar-H), 67.474 (d, ⁴J = 2.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.613 (dd, ³J = 8.9 Hz, ⁴J = 2.5 Hz, 1 H, Ar-H), ca. 9.3 (s, sehr breit, 2 H, 2 × Ar-OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 40.92, 107.10, 107.32, 114.10, 118.38, 118.75, 125.28, 135.26, 142.86, 142.89, 144.40, 144.48, 144.90.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1473 (s), 1480 (s), 1546 (s) und 1608 (s; Ar); 1615 (s, NO₂); 3266 (s, breit), 3413 (s) und 3460 (s, XH assoziiert)
erhalten aus 2-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)-5-nitrophenol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

2-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)-5-nitrophenol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3- Dihydroxyphenyl, Z = 2-Hydroxy-4-nitrophenyl, C₁₃H₁₀N₂O₅, M = 274.23 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2-Amino-5-nitrophenol mit 2,4-Di hydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 80% der Theorie, aus 80%igem Methanol umkristallisiert; dunkel rotbraune Fasern, Fp = 265-267°C.
Berechnet:
C 56.94, H 3.68, N 10.22;
Gefunden:
C 56.77, H 3.85, N 9.87%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 7.384-7.480 (m, überl., 3 H, Ar-H), 8.045-8.098 (m, überl., ca. 2 H, Ar-H), 8.527-8.622 (m, überl., ca. 2 H, Ar-H), 9.458 (s, ca. 1 H, CH=N); anteilig tautomeres Gleichgewicht; Oxazolidin-Tautomer < 5%: 5.673 (s, NH-CH-O-Ar).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 49.85, 55.97, 62,17, 124,89, 125.26, 126.51, 128.17, 128.59, 128.80, 129.23, 130.69, 160.78.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1485 (m, sh), 1523 (s) und 1594 (s; Ar und NO₂); 1622 (s, CH=N), 3430 (vs, breit, OH assoziiert).

31. Substanz 31: N,N'-Bis(2,3-dihydroxybenzyl)ethylendiamin

Formel I mit a = 0, n =2, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Ethylen, C₁₆H₂₀N₂O₄, M = 304.34 g/mol;
in situ erhalten aus 1,2-Bis[(E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino]ethan durch Reduktion mit NaBH₄.

1,2-Bis[(E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylemmino]ethan:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Ethylen, C₁₆H₁₆N₂O₄, M = 300.31 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,2-Ethylendiamin mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 57%, aus THF/Essigester (1 : 1) umkristallisiert; dottergelber amorpher Feststoff, Fp = 239-242°C.
Berechnet:
C 63.99, H 5.37, N 9.33;
Gefunden:
C 63.22, H 5.41, N 9.32%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 3.912 (s, 4 H, 2 × CH₂), 6.635 (t, ³J = 7.7 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.815 (d, ³J = 7.5 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.834 (d, ³J = 7.6 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 8.526 (s, 2 H, 2 × CH=N).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 58.00, 117.64, 117.74, 118.09, 121.83, 145.85, 151.14, 167.14.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1464 (s), 1521 (m) und 1548 (m, Ar); 1635 (vs, CH=N); 3253 (s) und 3389 (s, breit, OH assoziiert).

32. Substanz 32: N¹,N³-Bis-(2,4-dihydroxybenzyl)diethylentriamin

Formel I mit a = 0, n =2, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, Z = Triethylamino-2,2',2''-diyl, C₁₈H₂₅N₃O₄, M = 347.41 g/mol;
in situ erhalten aus 2,2'-Bis[(E)-2,4-dihydroxyphenyl-methylenimino]diethyl amin durch Reduktion mit NaBH₄.

2,2'-Bis[(E)-2,4-dihydroxyphenyl-methylenimino]diethylamin:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = Diethylamin-2,2'-diyl, C₁₈H₂₁NO₄, M = 343.38 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von Diethylentriamin mit 2,4-Dihydroxybenz aldehyd analog: J. A. Sclafani, M. T. Maranto, T. M. Sisk, S. A. Van Arman; J. Org. Chem. 1996, 6], 3221-3222.
Ausbeute: 40% aus i-Propanol/Essigester, mit Hexan gefällt; leuchtend gelb oranger amorpher Feststoff, Fp = 177-180°C.
Berechnet:
C 62.96, H 6.16, N 12.24;
Gefunden:
C 62.07, H 6.01, N 11.62%.
MS (70 eV, 110°C): m/z [%] = 345 (0.2) [M⁺+2], 344 (0.8) [M⁺+1], 111 (100).
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 2.780 (t, ³J = 6.0 Hz, 4 H, 2 × CH₂), 3.530 (t, ³J = 6.0 Hz, 4 H, 2 × CH₂), 6.099 (d, ⁴J = 2.2 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.190 (dd, ³J = 8.8 Hz, ⁴J = 2.2 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.097 (d, ³J =8.8 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 8.258 (s, 2 H, 2 × CH=N), ca. 13.8 (s, sehr breit, 1 H, XH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 49.48 (2 × CH₂), 56.35 (2 × CH₂), 102.74 (2 × CH), 106.52 (2 × CH), 111.07 (2 × quart. C), 113.34 (2 × CH), 161.92 (2 × quart. C), 165.06 (2 × CH=N), 166.00 (2 × quart. C).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1477 (m-s, sh, Ar), 1637 (vs, CH=N), 3429 (s, breit, XH assoziiert).

33. Substanz 33: N,N,N-Tris[(2,4-dihydroxybenzylamino)ethyl]amin

Formel I mit a = 0, n = 3, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, Z = N,N,N,-Tris-(eth-2-yl)amin, C₂₇H₃₆N₄O₆, M = 512.60 g/mol;
in situ erhalten aus N,N,N-Tris[2-((E)-2,4-dihydroxyphenyl-methylenimino)- triethyl]amin durch Reduktion mit NaBH₄.

N,N,N-Tris[2-((E)-2,4-dihydroxyphenyl-methylenimino)triethyl]amin:
Formel I mit a = 0, n = 3, R² = H, R³ = 2,4-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = N,N,N-Tris(eth-2-yl)amin, C₂₇H₃₀N₄O₆, M = 306.55 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von N,N,N-Tris(2-aminoethyl)amin mit 2,4-Di hydroxybenzaldehyd
in Ethanol.
Ausbeute: 80%, aus THF/Ethanol/Essigester umkristallisiert; hellgelber amorpher Feststoff, Fp < 300°C (Zers. ab 280°C).
Berechnet:
C 64.02, H 5.97, N 11.06;
Gefunden:
C 63.04, H 6.08, N 10.43%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 2.752 (m, 6 H, 3 × CH₂), 3.469 (m_c, überl., CH₂), 6.104 (m_c, 6 H, 3 × Ar-H), 6.744 (d, ³J = 8.9 Hz, 3 H, 3 × Ar-H), 8.028 (s, 3 H, 3 × CH=N), ca. 13.8 (s, sehr breit, 3 H, OH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 55.08 (überl. ?, 3 oder 6 × CH₂), 102.76 (3 × CH), 106.55 (3 × CH), 111.00 (3 × quart. C), 133.44 (3 × CH), 162.02 (3 × quart. C), 165.04 (3 × CH==N), 166.02 (3 × quart. C).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1476 (m-s, sh) und 1535 (m, Ar), 1636 (vs, CH=N), 3432 (w, breit, OH assoziiert).

34. Substanz 34: N,N,N-Tris[(2,3-dihydroxybenzylamino)ethyl]amin

Formel I mit a = 0, n = 3, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = N,N,N-Tris(eth-2-yl)amin, C₂₇H₃₆N₄O₆, M = 512.60 g/mol;
in situ erhalten aus N,N,N-Tris[2-((E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino)- triethyl]amin durch Reduktion mit NaBH₄.

N,N,N-Tris[2-((E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino)triethyl]amin:
Formel I mit a = 0, n = 3, R² = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = N,N,N-Tris(eth-2-yl)amin, C₂₇H₃₀N₄O₆, M = 306.55 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von Tris(2-aminoethyl)amin mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 75%, aus i-Propanol umkristallisiert; feinkristallines gelbes Produkt, Fp = 206-209°C.
Berechnet:
C 64.02, H 5.97, N 11.06;
Gefunden:
C 63.57, H 5.95, N 10.88%.
MS (70 eV, 110°C): m/z [%] = 507 (100) [M⁺+1].
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 2.828 (t, ³J = 5.6 Hz, 6 H, 3 × CH₂), 3.572 (t, ³J = 5.6 Hz, CH₂), 6.412-6.480 (d + t, überl., ³J jeweils ca. 7.8 Hz, 6 H, 6 × Ar-H), 6.743 (dd, ³J = 7.3 Hz,⁴J = 1.4 Hz, 3 H, 3 × Ar-H), 8.200 (s, 3 H, 3 × CH=N), ca. 10-15 (s, sehr breit, 6 H, OH).
¹³C-NMR (100 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 54.81 (3 × CH₂), 55.33 (3 × CH₂), 116.74 (3 × quart. C); 117.07, 117.34 und 121.90 (jeweils 3 × CH); 146.22 und 153.20 (jeweils 3 × quart. C), 166.43 (3 × CH==N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1464 (m-s), 1513 (m) und 1545 (m, Ar); 1645 (s, CH=N), 3250 (m) und 3390 (m, breit, OH assoziiert).

35. Substanz 35: N,N'-Bis-(2,3-dihydroxybenzyl)-4',4''(5'')-diamino dibenzo-15-crown-5

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Dibenzo-15-crown-5--4',4''(5'')-diyl, C₃₅H₄₀N₂O₁₀, M = 648.70 g/mol;
in situ erhalten aus N,N'-Bis-[(E;)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino]- 4',4''(5'')-dibenzo-15-crown-5 durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

N,N'-Bis-[(E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino]-4',4''(5'')-dibenzo-15- crown-5:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Di hydroxyphenyl, Z = Dibenzo-15-crown-5--4',4''(5'')-diyl, C₃₅H₃₆N₂O₁₀, M = 644.67 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4',4''(5'')-Diamino-dibenzo-15-crown-5 mit 2,3-Dihydroxybenzaldehyd in Ethanol bei 60°C.
Ausbeute: 95% der Theorie (Rohprodukt), leuchtend lachsroter Feststoff, Fp = 223-228°C (analytische Probe: in Essigester/Acetonitril gelöst, mit Hexan gefällt, ¹H-NMR, CH=N-Signal: unverändert 4''/5''-Isomerengemisch zu je gleichen 46988 00070 552 001000280000000200012000285914687700040 0002019813979 00004 46869Anteilen).
Berechnet:
C 65.21, H 5.63, N 4.34;
Gefunden:
C 64.88, H 5.25, N 4.71%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 3.793 (s, 4 H, 2 × CH₂), 4.156-4.215 (m, 4 H, 2 × CH₂), 4.380 (m_c, 4 H, 2 × CH₂), 6.766 (t, ³J = 7.6 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.927-7.227 (überl., insgesamt 10 H, Ar-H), 8.909 und 8.920 (jeweils s gleicher Intensität, 2 H, 4' und 4''/5''-N=CH), 9.130 (s, breit, 2 H, 2 × Ar-OH), 13.377 (s, breit, 2 H, 2 × Ar-OH).
¹³C-NMR (100 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 161.96 (CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1462 (s), 1507 (s) und 1589 (m, Ar); 1620 (s, CH=N), 3415 (m, breit, OH assoziiert).

36. Substanz 36: N-(2,3-Dihydroxybenzyl)-N'-phenyl-1,4-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = 4-(phenylamino)phenyl, C₁₉H₁₈N₂O₂, M = 306.36 g/mol;
in situ erhalten aus 4-((E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)diphenyl amin durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4-((E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)diphenylamin:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Di hydroxyphenyl, Z = 4-(phenylamino)phenyl, C₁₉H₁₆N₂O₃, M = 304.34 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminodiphenylamin mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 89% der Theorie, aus Methanol umkristallisiert, kupferfarbene Tafeln, Fp = 171-173°C (Subl. 240°C; aus Ethanol umkristallisiert).
Berechnet:
C 79.99, H 5.30, N 9.20;
Gefunden:
C 79.20, H 5.31, N 9.10%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.752 (t, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 6.827-6.911 (m, überl., 2 H, Ar-H), 7.033 (dd, ³J = 7.8 Hz, ⁴J = 1.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.083-7.145 (m, überl., 4 H, Ar-H), 7.255 (tt, ³J = 7.3 Hz,⁴J = 1.9 Hz, 2 H, Ar-H), 7.366 (td, ³J = 8.8 Hz, ⁴J = 1.9 Hz, 2 H, Ar-H), 7.382 (s, breit, 1 H, X-H), 8.880 (s, 1 H, CH=N), ca. 11-15 (s, 1 H, X-H).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 116.79, 117.23, 118.22, 118.55, 119.55, 120.18, 122.34, 122.40, 129.22, 139.16, 142.83, 142.92, 145.47, 149.05, 159.91.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1460 (m), 1490 (s), 1516 (s) und 1594 (s, Ar); 1628 (s, CH=N), 3243 (w-m) und 3386 (m-s, OH).

37. Substanz 37: 4,4'-Bis-(9-Anthracenylmethylamino)-3,3'-dimethoxy biphenyl

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 9-Anthracenyl, Z = 3,3'-di methoxy-biphen-4,4'-diyl, C₄₄H₃₆N₂O₂, M = 624.77 g/mol;
in situ erhalten aus 4,4'-Bis-[(E)-9-Anthracenyl-methylenimino]-3,3'-di methoxy-biphenyl
durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4,4'-Bis-[(E)-9-Anthracenyl-methylenimino]-3,3'-dimethoxy-biphenyl:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 9-Anthracenyl, Z = 3,3'-Dimethoxy-biphen-4,4'-diyl, C₄₄H₃₂N₂O₂, M = 620.76 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4,4'-Diamino-3,3'-dimethoxybiphenyl mit 9-Anthracencarbaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: praktisch quantitativ orangefarbenes kristallines Rohprodukt [Fp = 206-209°C, 1 : 1-Gemisch zweier Rotamerer: ¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 3.834 und 4.056 (jeweils s, OMe), 9.770 (s, CH=N)], analytische Probe aus Essigester/Ethanol (3 : 1): Fp 246-249°C (¹H- und ¹³C-NMR: einheitlich).
Berechnet:
C 85.14, H 5.20, N 4.51;
Gefunden:
C 85.13, H 5.20, N 4.33%.
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.059 (s, 3 H, OMe), 7.428-7.508 (m, überl., 6 H, Ar-H), 7.600 (t, ³J = 7.4 Hz, 4 H, Ar-H), 7.665 (dt, ³J = 6.4 Hz, ⁴J = 1.7 Hz, 4 H, Ar-H), 8.179 (d, ³J = 8.3 Hz, 4 H, Ar-H), 8.768 (s, 2 H, Ar-H), 8.724 (d, ³J = 8.7 Hz, 4 H, Ar-H), 9.774 (s, 1 H, CH=N).
¹³C-NMR (100 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 56.94, 111.93, 120.09, 121.59, 125.44, 125.95, 127.67, 128.04, 129.32, 130.53, 130.66, 131.48, 139.34, 142.17, 152.65, 161.17.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1448 (m), 1483 (s), 1520 (w) und 1556 (m, Ar); 1624 (s, CH=N), 3433 (vs, breit, OH assoziiert).

38. Substanz 38: 5-(9-Anthracenylmethylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 9-Anthracenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₂₂H₁₇NO₃, M = 343.36 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-5-(9-Anthracenyl-methyleminino)salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-5-(9-Anthracenyl-methylenimino)salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 9-Anthracenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₂₂H₁₅NO₃, M = 341.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Amino-salicylsäure mit Anthracen-9- carbaldehyd in Ethanol bei 70°C.
Ausbeute: 73%, feinkristallines ockerfarbenes Rohprodukt, Fp = 252-255°C.
Berechnet:
C 77.41, H 4.43, N 4.01;
Gefunden:
C 76.49, H 4.40, N 3.98%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1454 (s), 1484 (s), 1554 (w), 1598 (m, Ar); 1622 (m) und 1668 (s, CH=N und COOH), 3056 (m, OH).

39. Substanz 39: N,N'-Bis-(2,3-dihydroxybenzyl)-2,4-diaminophenol

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Hydroxyphen-2,4-diyl, C₂₀H₂₀N₂O₅, M = 368.38 g/mol;
in situ erhalten aus 2,4-Bis-[(E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino]phenol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

2,4-Bis-[(E)-2,3-dihydroxyphenyl-methylenimino]phenol:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Hydroxyhenyl-2,4-diyl, C₂₀H₁₆N₂O₅, M = 364.36 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2,4-Diaminophenol mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 67% der Theorie (Rohprodukt), roter Feststoff, Fp = 217-220°C.
Berechnet:
C 65.93, H 4.43, N 7.69;
Gefunden:
C 60.20, H 4.64, N 7.08%.
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 6.746 (t, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 6.779 (t, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.042-7.126 (m, überl., 4 H, Ar-H), 7.293 (dt, ³J = 8.6 Hz, ⁴J = 2.5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.658 (d, ⁴J = 2.5 Hz, 1 H, Ar-H), 8.974 (s, 1 H, CH=N), 9.085 (s, 1 H, CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1462 (m, 1513 (m) und 1546 (w, Ar); 1628 (vs, CH = N), 3173 und 3408 (m-s, breit, OH assoziiert).

40. Substanz 40: 9-Ethyl-3-(2-hydroxy-4-methoxybenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-4-methoxy phenyl, Z = 9-Ethylcabazol-3-yl, C₂₂H₂₂N₂O₂, M = 346.42 g/mol;
Ausbeute: 55% der Theorie, aus Essigester/Hexan umkristallisiert; farblose feine Nadeln, Fp = 161-164°C.
Berechnet:
C 76.28, H 6.40, N 8.08;
Gefunden:
C 76.32, H 6.82, N 8.19%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1470 (s), 1490 (m), 1515 (w), 1593 (m) und 1614 (m-w, Ar); 3256 (m, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-4-methoxyphenyl-methylenimino) carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-4-methoxyphenyl-methylenimino)carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxy-4-methoxyphenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₂H₂₀N₂O₂, M = 340.41 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2-Hydroxy-4-methoxy benzaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 67% der Theorie nach Umkristallisation aus Ethanol, ockerfarbene Tafeln oder Nadeln, Fp = 132-134°C.
Berechnet:
C 76.72, H 5.85, N 8.13;
Gefunden:
C 76.57, H 6.07, N 8.13%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 1.435 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 3.843 (s, 3 H, OCH₃), 4.364 (q, ³J = 7.1 Hz, 2 H, CH₂), 6.465-6.535 (m, überl., 2 H, Ar-H), 7.240 (dt, ³J = 6.5 Hz, ⁴J = 1.3 Hz, 1 H, Ar-H), 7.293 (d, ³J = 8.4 Hz, 1 H, Ar-H), 7.372-7.513 (m, überl., 4 H, Ar-H), 8.06 (d, J = 2.1 Hz, 1 H, Ar-H), 8.101 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.669 (s, 1 H, N=CH), 14.237 (s, ca. 1 H, Ar-OH).

41. Substanz 41: 9-Ethyl-3-(2-hydroxy-5-nitrobenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-5-nitro-phenyl, Z = 9-Ethylcabazol-3-yl, C₂₁H₁₉N₃O₃, M = 361.40 g/mol;
Ausbeute: 70% der Theorie, aus Essigester/THF umkristallisiert, Fällung mit Hexan vervollständigen; amorpher, blaß grünlich-beiger Feststoff, Fp = 194-197°C.
Berechnet:
C 69.79, H 5.30, N 11.63;
Gefunden:
C 68.93, H 5.66, N 11.43%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 1.244 (t, ³J = 7.0 Hz, 3 H, CH₃), 4.310 (m_c, überl, 4 H, CH ₂-CH₃ und NH-CH ₂-Ar), 6.888 (dd, ³J = 8.7 Hz, ⁴J = 2.2 Hz, 1 H, Ar-H), 7.017 (d, ³J = 9.0 Hz, 1 H, Ar-H), 7.035 (t, ³J = 8.3 Hz, 1 H, Ar-H), 7.243 (d, ⁴J = 2.1 Hz, 1 H, Ar-H), 7.331 (t, ³J = 8.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.347 (d, ³J = 8.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.451 (d, ³J = 8.8 Hz, 1 H, Ar-H), 7.918 (d, ³J = 8.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.011 (dd, ³J = 9.0 Hz, ⁴J = 2.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.198 (d, ⁴J = 2.8 Hz, 1 H, Ar-H), ca. 8.3-10 (s, breit, ca. 1 H, XH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 13.68 (CH₃), 36.76 (CH₂), 41.61 (CH₂); 101.66, 108.68, 109.60, 114.13, 115.04, 117.53 und 119.96 (jeweils CH); 121.84 und 122.71 (jeweils quart. C); 123.91, 124.07, 125.02 (jeweils CH); 128.05, 123.87, 139.61, 139.67. 141.87 und 161.72 (jeweils quart. C).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1452 (m-s), 1470 (s), 1490 (s), 1513 (m), 1585 (m) und 1616 (w, Ar); 3329 (m, XH), kein C=N
erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-5-nitrophenyl-methylenimino) carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-5-nitrophenyl-methylenimino)carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxy-5-nitrophenyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₇N₃O₃, M = 359.40 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2-Hydroxy-5- nitrobenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 97% der Theorie (Rohprodukt), analytische Probe nach Umkristallisation aus Essigester/Heptan: Fp = 250-252°C, orange Nadeln.
Berechnet:
C 70.18, H 4.77, N 11.69;
Gefunden:
C 69.63, H 4.91, N 11.69%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1452 (m), 1465 (m), 1485 (s), 1527 (w) und 1585 (m, sh; Ar); 1612 (s, CH=N); 3060 (w) und 3487 (vw, breit; XH).

42. Substanz 42: 9-Ethyl-3-(2-hydroxy-1-naphthyl-methylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-1-naphthyl, Z = 9-Ethylcabazol-3-yl, C₂₅H₂₂N₂O, M = 366.45 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-1-naphthyl-methylenimino) carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-(2-Hydroxy-1-naphthyl-methylenimino)carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Hydroxy-1-naphthyl, R⁴ = R⁵ = Bin dung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₅H₂₀N₂O, M = 364.44 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 2-Hydroxy naphthalin-1-carbaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 76% der Theorie (aus Ethanol/Essigester umkristallisiert), Fp = 181-183°C, leuchtend orange-rote feine Nadeln.
Berechnet:
C 82.40, H 5.35, N 7.69;
Gefunden:
C 82.41, H 5.74, N 7.63%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1489 (s), 1546 (m) und 1585 (m, sh; Ar); 1622 (s, CH=N); 3443 (w, breit; OH assoziiert).

43. Substanz 43: 2,7-Bis-(2,3-Dihydroxybenzylamino)fluoren-dihydrochlorid

Formel I mit a = 1, n = 2, A = Cl, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Fluoren-2,7-diyl, C₂₇H₂₆Cl₂N₂O₄, M = 515.41 g/mol;
Ausbeute: 97%, farbloses amorphes Rohprodukt, Fp = 206-212°C (Zers. < 200°C).
Berechnet:
C 62.92, H 5.08, N 5.44, Cl 13.76;
Gefunden:
C 62.75, H 5.32, N 5.38, Cl 13.33%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 3.900 (s, 2 H, Ar-CH ₂-Ar), 4.385 (s, 4 H, 2 × NH-CH ₂-Ar), 6.591 (t, ³J = 7.8 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.791 (d, ³J = 7.6 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.243 (d, ³J = 7.9 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.456 (s, 2 H, 2 × Ar-H), 7.821 (d,³J = 8.2 Hz, 2 H, 2 × Ar-H).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1476 (s), 1509 (m), 1578 (m), 1605 (m-s) und 1630 (w-m, Ar); 3200 und 3480 (jeweils s, breit, XH assoziiert)
erhalten aus 2,7-Bis-[(E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]fluoren durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol (Aufarbeitung durch Fällung mit Eis- Wasser/NH₄Cl/HCl).

2,7-Bis-[(E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]fluoren:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Fluoren-2,7-diyl, C₂₇H₂₀N₂O₄, M = 436.46 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2,7-Diaminofluoren mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: praktisch quantitativ leuchtend rotes Rohprodukt, Fp = 292-296°C (Zers., beginnende Zers. < 240°C).
Berechnet:
C 74.30, H 4.62, N 6.42;
Gefunden:
C 74.36, H 5.05, N 7.09%.
¹H-NMR (400 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.036 (s, 2 H, CH₂), 6.793 (t, ³J = 7.7 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 6.943 (d, ³J = 7.8 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.109 (d, ³J = 8.1 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.684 (s, 2 H, 2 × Ar-H), 7.991 (d, ³J = 8.1 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 9.021 (s, 2 H, 2 × CH=N), 9.197 (s, 2 H, 2 × Ar-OH), 13.331 (s, 2 H, 2 × Ar-OH).
¹³C-NMR (100 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 36.56 (CH₂); 118.00, 118.77 und 118.88 (CH); 119.48 (quart. C); 120.84, 120.92 und 122.76 (CH); 139.58, 144.86, 145.61, 146.56 und 149.38 (quart. C); 163.03 (CH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1465 (s), 1547 (w) und 1578 (m, Ar); 1623 (s, CH=N), 3383 (m-s, breit, OH assoziiert).

44. Substanz 44: 2,7-Bis-(2-hydroxy-1-naphthyl-methylamino)fluoren

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Hydroxy-1-naphthyl, Z = Fluoren-2,7-diyl, C₃₅H₂₈N₂O₂, M = 508.60 g/mol;
in situ erhalten aus 2,7-Bis-[(E)-2-hydroxy-1-naphthyl-methylenimino] fluoren durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

2,7-Bis-[(E)-2-hydroxy-1-naphthyl-methylenimino]fluoren:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2-Hydroxy-1-naphthyl, Z = Fluoren-2,7-diyl, C₃₅H₂₄N₂O₂, M = 504.58 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 2,7-Diaminofluoren mit 2,3-Dihydroxybenz aldehyd in Ethanol bei 60°C.
Ausbeute: 83%, aus THF mit Wasser gefällt, rotbraunes amorphes Produkt, Fp 307-309°C (Zers. < 290°C).
Berechnet:
C 83.32, H 4.79, N 5.55;
Gefunden:
C 83.49, H 5.06, N 5.36%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1469 (m), 1546 (s) und 1569 (s, Ar); 1623 (vs, CH=N), 3441 (vw, breit, OH assoziiert).

45. Substanz 45: 1-(2,3-Dihydroxybenzylamino)anthracen

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Anthracen-1-yl, C₂₁H₁₇NO₂, M = 315.36 g/mol;
in situ erhalten aus 1-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)anthracen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino)anthracen:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Anthracen-1-yl, C₂₁H₁₅NO₂, M = 313.35 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1-Aminoanthracen mit 2,3-Dihydroxy benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 50% der Theorie nach Aufarbeitung des Reaktionsansatzes durch Ausfällen mit ca. 20% Wasser bei 0°C, amorphes rotbraunes Rohprodukt, Fp = 175-178°C.
Berechnet:
C 80.50, H 4.82, N 4.47;
Gefunden:
C 79.70, H 5.06, N 4.45%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1465 (m-s) und 1546 (m, Ar); 1618 (vs, CH=N), 3369 (m, breit, OH assoziiert).

46. Substanz 46: N,N'-Bis-(Ferrocenylmethyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = Ferrocenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₈H₂₈N₂Fe₂, M = 504.23 g/mol;
in situ erhalten aus 1,3-Bis-(Ferrocenylmethylenimino)benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-(Ferrocenylmethylenimino)benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = Ferrocenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₈H₂₄N₂Fe₂, M = 500.20 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit Ferrocencarbaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 90% der Theorie, rotbraunes Öl als Rohprodukt; analytische Probe aus Methylenchlorid/Hexan: Fp = 140-146°C (ab 120°C Zers.), dunkel rotbrauner feinkristalliner Feststoff.
Berechnet:
C 67.24, H 4.84, N 5.60;
Gefunden:
C 66.74, H 5.14, N 6.08%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 4.240 (s, 5 H, cp), 4.472 und 4.795 (jeweils: m_c, 2 H, cp'), 6.501-6.540 (m, 1 H, Ar-H), 6.901-6.994 (m, 2 H, Ar-H), 7.337 (t, ³J = 7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8.370 (s, 1 H, N=CH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1459 (m) und 1584 (s, Ar); 1622 (s, CH=N).

47. Substanz 47: N,N'-Bis-(Ferrocenylmethyl)-3,5-diamino benzencarbonsäure

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = Ferrocenyl, Z = Phenyl-3,5-diyl-carbonsäure, C₂₉H₂₈N₂O₂Fe₂, M = 548.25 g/mol;
in situ erhalten aus 3,5-Bis-(Ferrocenylmethylenimino)benzencarbonsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

3,5-Bis-(Ferrocenylmethylenimino)benzencarbonsäure:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = Ferrocenyl, Z = Phenyl-3,5-diyl-carbonsäure, C₂₉H₂₄N₂O₂Fe₂, M = 544.22 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3,5-Diaminobenzoesäure mit Ferrocencarbaldehyd in Methanol.
Ausbeute: 60% der Theorie, rotbraunes amorphes Rohprodukt,Öl als Rohprodukt; Fp < 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 64.00, H 4.44, N 5.15;
Gefunden:
C 63.86, H 4.65, N 4.98%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1447 (w) und 1580 (s, Ar); 1623 (s) und 1705 (m, sh; CH=N und COOH, überl.), 3431 (m, breit, OH assoziiert).

48. Substanz 48: 4-(Ferrocenylmethylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = Ferrocenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₁₇NO₃Fe, M = 349.19 g/mol;
in situ erhalten aus 4-(Ferrocenyl-methylenimino)salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4-(Ferrocenyl-methylenimino)salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = Ferrocenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₈H₁₅NO₃Fe, M = 349.17 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit Ferrocencarbaldehyd in THF bei 50°C, Fällung mit Hexan.
Ausbeute: 40%, schwarzvioletter amorpher Feststoff, Fp < 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 61.92, H 4.33, N 4.01;
Gefunden:
C 21.43, H 4.20, N 4.18%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1442 (m-s), 1469 (m-s) und 1541 (m; Ar); 1629 (vs, breit, CH=N und COOH), 3400 (m-s, OH).

49. Substanz 49: 5-(Ferrocenylmethylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = Ferrocenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₁₇NO₃Fe, M = 349.19 g/mol;
in situ erhalten aus 5-(Ferrocenyl-methylenimino)salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

5-(Ferrocenyl-methylenimino)salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = Ferrocenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₈H₁₅NO₃Fe, M = 349.17 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit Ferrocencarbaldehyd in THF bei 50°C, Fällung mit Hexan.
Ausbeute: 40%, schwarzvioletter amorpher Feststoff, Fp < 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 61.92, H 4.33, N 4.01;
Gefunden:
C 61.53, H 4.58, N 4.21%.
¹H-NMR (250. MHz, in DMSO-D₆; relativ breite Signale): δ [ppm] = 4.264 (s, 5 H, cp), 5.583 (s, 2 H, cp'), 4.837 (s, 2 H, cp'), 8.550 (s, 1 H, CH=N),
IR (KBr): ν [cm¹] = 1449 (m-s), 1487 (s) und 1582 (s, sh, Ar); 1636 (s) und 1669 (s, CH=N und COOH), 3430 (w-m, breit, OH assoziiert).

50. Substanz 50: 4,4'-Bis-(2,3-Dihydroxybenzylamino)diphenylmethan

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy-phenyl, Z = Diphenylmethan-4,4'-diyl, C₂₇H₂₆N₂O₄, M = 442.52 g/mol;
Ausbeute: 85%, hellbeiges amorphes Rohprodukt, Fp < 300°C (Zers.).
Berechnet:
C 73.28, H 5.92, N 6.33, Cl 0.00;
Gefunden:
C 73.51, H 6.04, N 7.72, Cl 0.38%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆, breite Signale): δ [ppm] = 3.572 (s, ca. 2 H, Ar-CH ₂-Ar), 4.127 (s, 4 H, 2 × NH-CH ₂-Ar), 6.400-6.668 (m, überl., Ar-H), 6.863-6.883 (m, überl., Ar-H), 7.087 (s, Ar-H), 7.291 (s, Ar-H).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1463 (s), 1515 und 1614 (m, Ar); 3127 (m-s) und 3406 (m, breit, XH assoziiert)
erhalten aus 4,4'-Bis-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]diphenylmethan durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol. (Aufarbeitung: Hydrolyse mit NH₄Cl/HCl/H₂O, dann mit NH₃ bis pH < 8.5 versetzen und mit verd. Essigsäure bis zur einsetzenden Fällung versetzten bei pH ca. 7.5).

4,4'-Bis-(2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]diphenylmethan:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Diphenylmethan-4,4'-diyl, C₂₇H₂₂N₂O₄, M = 438.49 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4,4'-Diaminodiphenylmethan mit 2,3-Di hydroxybenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 91% der Theorie, leuchtend rotes Rohprodukt, Fp ≅ 207-210°C (Zers. < 195°C).
Berechnet:
C 73.96, H 5.06, N 6.39;
Gefunden:
C 72.81, H 5.30, N 6.22%.

51. Substanz 51: N,N'-Bis-(2-Pyrrolylmethyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Pyrrolyl, Z = 1,3-Phenylen, C₁₆H₁₈N₄, M = 266.34 g/mol;
in situ erhalten aus 1,3-Bis-(2-pyrrolyl-methylenimino)benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-(2-Pyrrolyl-methylenimino)benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2-Pyrrolyl, Z = 1,3-Phenylen, C₁₆H₁₄N₄, M = 262.31 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit Pyrrol-2-carbaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 90% der Theorie, rotbraunes Öl als Rohprodukt, welches erst nach mehreren Tagen kristallisiert; nach Umkristallisation aus Methanol:
Fp = 144-147°C (hellbeige derbe Säulen oder Tafeln).
Berechnet:
C 73.26, H 5.38, N 21.36;
Gefunden:
C 72.13, H 5.68, N 19.70%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 6.255 (m_c, 2 H, Ar-H), 6.675 (dd, ³J = 3.7 Hz, J = 1.4 Hz, 2 H, Ar-H), 6.864 (m_c, 2 H, Ar-H), 7.003 (überl., 1 H, Ar-H), 7.024 (dd, ³J = 9.7 Hz, ⁴J = 2.1 Hz, 2 H, Ar-H), 7.349 (t, ³J = 7.6 Hz, 1 H, 5-H), 8.283 (s, 2 H, 2 × N=CH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1416 (s), 1476 (w-m) und 1580 (s; Ar); 1621 (s, CH=N), 3243 (m, X-H).

52. Substanz 52: N,N'-Bis-(4-brombenzyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 4-Bromphenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₁₈N₂Br₂, M = 446.20 g/mol;
in situ erhalten aus 1,3-Bis-[(4-bromphenyl)methylenimino]benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-[(4-bromphenyl)methylenimino]benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 4-Bromphenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₁₆N₂Br₂, M = 442.17 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit 4-Brombenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 80% der Theorie, amorphes hellgelbes Rohprodukt, Fp = 153-170°C.
Berechnet:
C 54.33, H 3.19, N 6.34, Br 36.14;
Gefunden:
C 54.43, H 3.29, N 6.33, Br 35.84%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 7.020-7.148 (m, überl., 3 H, Ar-H), 7.344 (t, ³J = 8.0 Hz, 1 H, Ar-H), 7.695 (td, ³J = 8.5 Hz, ⁴J = 1.8 Hz, 2 H, Ar'-H), 7.760 (td, ³J = 8.5 Hz, ⁴J = 1.8 Hz, 2 H, Ar'-H), 8.433 (s, 2 H, 2 × CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1486 (s-m), 1566 (s) und 1582 (s, Ar); 1627 (s, CH=N).

53. Substanz 53: N,N'-Bis-(3-brombenzyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 3-Bromphenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₁₈N₂Br₂, M = 446.20 g/mol;
in situ erhalten aus 1,3-Bis-[(3-bromphenyl)methylenimino]benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-[(3-bromphenyl)methylenimino]benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 3-Bromphenyl, Z = 1,3-Phenylen, C₂₀H₁₆N₂Br₂, M = 442.17 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit 3-Brombenzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 85% der Theorie, amorph hellgelbes Rohprodukt, Fp = 170-185°C.
Berechnet:
C 54.33, H 3.19, N 6.34;
Gefunden:
C 54.28, H 3.12, N 6.30%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1471 (m), 1508 (m-s) und 1568 (m-s; Ar), 1621 (vs, CH=N).

54. Substanz 54: 9-Ethyl-3-(4-brombenzylamino)carbazol

Formel I mit a = 0, n = 1, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 4-Bromphenyl, Z = 9-Ethyl cabazol-3-yl, C₂₁H₁₇N₂Br, M = 379.30 g/mol;
in situ erhalten aus (E)-9-Ethyl-3-(4-bromphenyl-methylenimino)carbazol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

(E)-9-Ethyl-3-(4-bromphenylmethylenimino)carbazol:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 4-Bromphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 9-Ethyl-cabazol-3-yl, C₂₁H₁₇N₂Br, M = 377.29 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 3-Amino-9-ethylcarbazol mit 4-Brom benzaldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 72% der Theorie (Rohprodukt), Fp = 104-106°C, ockerbraune Tafeln oder Nadeln.
Berechnet:
C 66.85, H 4.54, N 7.42;
Gefunden:
C 66.76, H 4.84, N 7.22%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 1.434 (t, ³J = 7.2 Hz, 3 H, CH₃), 4.344 (q, ³J = 7.2 Hz, 2 H, CH ₂-CH₃), 7.241 (t, ³J = 8.0 Hz, 1 H, Ar-H), 7.273-7.491 (m, überl., 4 H, Ar-H), 7.611 (d, ³J = 7.6 Hz, 2 H, Ar'-H), 7.800 (d, ³J = 7.6 Hz, 2 H, Ar'-H), 8.342 (d, ⁴J = 1.9 Hz, 1 H, Ar-H), 8.115 (d, ³J = 7.7 Hz, 1 H, Ar-H), 8.579 (s, 1 H, CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1458 (m, sh), 1465 (m, sh), 1488 (s) und 1594 (w-m; Ar); 1614 (m, CH=N).

55. Substanz 55: Poly-[N-(2,3-dihydroxybenzyl)amino]styrol

Formel I mit a = 0, n < 10, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxyphenyl, Z = Polystyryl;
partiell als Hydrochlorid vorliegend entsprechend Formel I mit a = 1, n = 2, A = Cl, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2,3-Dihydroxy-phenyl, Z = Polystyryl;
Ausbeute: nahezu quantitativ nach Fällung mit NH₄Cl/Eis/Wasser, hellbeiges Pulver, Fp ca. 160-215°C (Zers.).
Gefunden:
C 67.64 H 7.18 N 8.58 Cl 2.61.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆; breite Signale): δ [ppm] = 1.048 und 1.316 (jeweils m_c, breit, Alkyl-H), 3.362 (s, breit, Ar-CH(CH₂-)₂ oder X-H), 4.125 (m_c, NH-CH₂-Ar), 6.399 bis ca. 7 (m, Ar-H); 7.028, 7.231 und 7.434 (jeweils s gleicher Intensität, 3 × Ar'-H), kein CH=N).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1463 (s), 1517 (s) und 1614 (s; Ar); 3126 (m) und 3401 (w, breit, X-H assoziiert)
erhalten aus Poly[(E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylenimino]styrol durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol/THF (2 : 1).

Poly-((E)-2,3-Dihydroxyphenyl-methylemmino)styrol:
Formel I mit a = 0, n < 10, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2,3-Dihydroxy phenyl, Z = Polystyryl;
erhalten durch Umsetzung von Poly(aminostyrol) (SERVA) mit 2,3-Di hydroxybenzaldehyd in Methylenchlorid/Methanol (2 : 1) unter Rückfluß bedingungen.

Nach dem Einengen am Rotationsverdampfer wird in nahezu quantitativer Ausbeute ein amorphes bräunlich-rotes Rohprodukt (Fp ca. 186-195°C, Zers.) erhalten, welches direkt weiterverarbeitet wird.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆; jeweils breite Signale): δ [ppm] = 1.016-1.234 (überl., Alkyl-H), ca. 4.13 (s, Ar-CH(CH₂-)₂), 6.36 bis ca. 7.30 (m, Ar-H); 8.841 und 9.147 (jeweils s gleicher Intensität, isomere CH=N-Ar), 13.298 (s, XH).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1464 (m-s), 1515 (s) und 1584 (m; Ar); 1614 (s, CH=N), 3406 (w-m, X-H).

56. Substanz 56: N,N'-Bis-(2-thienylmethyl)-1,3-diaminobenzen

Formel I mit a = 0, n = 2, R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Thienyl, Z = 1,3-Phenylen, C₁₆H₁₆N₂S₂, M = 400.45 g/mol;
in situ erhalten aus 1,3-Bis-(2-Thienyl-methylenimino)benzen durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

1,3-Bis-(2-Thienyl-methylenimino)benzen:
Formel I mit a = 0, n = 2, R² = H, R⁴ = R⁵ = Bindung, R³ = 2-Thienyl, Z = 1,3-Phenylen, C₁₆H₁₂N₂S₂, M = 396.42 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit Thiophen-2-carb aldehyd in Ethanol.
Ausbeute: 50% der Theorie, aus wässrigem Ethanol, Fp = 139-146°C; blaß gelber, amorpher Feststoff.
Berechnet:
C 64.83, H 4.08, N 9.45, S 21.63;
Gefunden:
C 64.30, H 4.17, N 9.35, S 20.89%.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃): δ [ppm] = 7.110 (m_c, 1 H, Ar-H), 7.150 (m_c, 2 H, 2 × Ar-H), 7.224 (m_c, überl., 2 H, 2 × Ar-H), 7.409 (t, ³J = 8.2 Hz, 1 H, 5-H), 7.688 (dd, J = 3.7 Hz, J' = 1.1 Hz, 2 H, 2 × Ar-H), 7.822 (m_c, 2 H, 2 × Ar-H), 8.858 (s, 2 H, 2 × N=CH).
¹³C-NMR (60 MHz, in DMSO-D₃): δ [ppm] = 112.72, 119.22, 128.22, 129.84, 131.26, 133.73, 142.36, 151.71, 154.30.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1427 (s) und 1574 (s; Ar); 1608 (s, CH=N).

58. Substanz 58: 4-(2-Pyrrolylmethylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Pyrrolyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₂H₁₂N₂O₃, M = 232.23 g/mol;
in situ erhalten aus 4-[(2-Pyrrolyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4-[(2-Pyrrolyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Pyrrolyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₂H₁₀N₂O₃, M = 230.22 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit Pyrrol-2-carbaldehyd in Ethanol bei 50°C.
Ausbeute: 87%, blaß gelber amorpher Feststoff, Fp < 300°C (Zers. ab 175°C).
Berechnet:
C 62.61, H 4.38, N 12.17;
Gefunden:
C 62.59, H 4.21, N 12.06%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1449 (s), 1508 (s) und 1554 (m; Ar); 1600 (s), 1620 (w, sh;) und 1687 (s; CH=N und COOH); 3102 (m) und 3423 (vw, breit; XH assoziiert).

59. Substanz 59: 5-(2-Pyrrolyl-methylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 2-Pyrrolyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₂H₁₂N₂O₃, M = 232.23 g/mol;
in situ erhalten aus 5-[(2-Pyrrolyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

5-[(2-Pyrrolyl)methylenimino]salicylsäure:
Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 2-Pyrrolyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-5-yl, C₁₂H₁₀N₂O₃, M = 230.22 g/mol;
erhalten durch Umsetzung von 5-Aminosalicylsäure mit Pyrrol-2-carbaldehyd in Ethanol bei 60°C.
Ausbeute: 94%, blaß gelber amorpher Feststoff, Fp < 300°C (Zers. ab 275°C).
Berechnet:
C 62.61, H 4.38, N 12.17;
Gefunden:
C 62.54, H 4.27, N 12.12%.
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1445 (s), 1510 (m), 1549 (w-m) und 1591 (s, Ar); 1649 (m-s) und 1682 (s, CH=N und COOH); 3099 (w-m), 3180 (w-m) und 3427 (w, breit, XH assoziiert).

60. Substanz 60: 4-(4-Brombenzylamino)salicylsäure

Formel I mit a = 0, n = 1, R¹ = R² = R⁴ = R⁵ = H, R³ = 4-Bromphenyl, Z = Carboxy-2-hydroxyphen-4-yl, C₁₄H₁₂NO₃Br, M = 322.17 g/mol;
Ausbeute: 50%, hellbeiger amorpher Feststoff, Fp = 160-162°C.
Berechnet:
C 52.19, H 3.75, N 4.35;
Gefunden:
C 51.85, H 3.82, N 4.54%.
¹H-NMR (250 MHz, in DMSO-D₆): δ [ppm] = 4.329 (m_c, 2 H, Ar-CH ₂-NH), 5.930 (s, 1 H, X-H), 6.174 (d, ³J = 8.6 Hz, 1 H, Ar-H), 7.074 (t, ³J = 7.5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.304 (d, ³J = 8.7 Hz, 2 H, 2 × Ar'-H), 7.441 (d, ³J = 8.7 Hz, 2 H, 2 × Ar'-H), 7.509 (s, 1 H, Ar-H), 11.440 (s, 1 H, Y-H ), ca. 12.9 (s, breit, Z-H).
IR (KBr): ν [cm^-1] = 1447 (s), 1506 (m-s) und 1586 (s; Ar); 1629 (s, COOH); 3105 (w), 3223 (w-m) und 3376 (m; XH)
erhalten aus 4-[(2-Pyrrolyl)methylenimino]salicylsäure durch Reduktion mit NaBH₄ in Ethanol.

4-[(4-Bromphenyl)methylenimino]salicylsäure: Formel I mit a = 0, n = 1, R² = H, R³ = 4-Bromphenyl, R⁴ = R⁵ = Bindung, Z = 4-Bromphenyl, C₁₄H₁₀NO₃Br, M = 320.16 g/mol;
in situ erhalten durch Umsetzung von 4-Aminosalicylsäure mit 4-Brom benzaldehyd in Ethanol.

Ausführungsbeispiel 3 Inkubationsansatz zur Darstellung von endogener Peroxidaseaktivität am histologischen Schnitt mit Substanz 2

6 mg der Substanz 2 (18.05 µmol, 0.9 mM bezüglich Endvolumen) werden in 2 ml Tetrahydrofuran vorgelöst und mit 18 ml 0.3 M Acetatpuffer (pH = 5.2), welcher 0.2 mmol (10 mM bezüglich Endvolumen) MnCl₂.4H₂O oder LaCl₃.xH₂O gelöst enthält, aufgefüllt. Man versetzt mit 7.5 µl 3%igem Wasserstoffperoxid (entspricht 1.125.10^-3% bezüglich Envolumen) und inkubiert 30 min bei Raumtemperatur.

Ergebnis: Endogene Peroxidaseaktivität wird durch sehr feine, scharf konturierte dunkelblaue Präzipitate angezeigt. Es tritt keine unspezifische Hintergrundfärbung auf. Die Empfindlichkeit ist vergleichbar mit der der DAB-Methode (dort braune bis braunschwarze Präzipitate).

Ausführungsbeispiel 4:

Vorschrift für Inkubationsansätze zur Darstellung von Peroxidaseaktivität am histologischen Schnitt in Gegenwart farbkuppelnder elektronenreicher Zusätze (z. B. endogene Peroxidaseaktivität an frischen Kryostatschnitten der Ratte: nach 3-5 min Fixierung bei 1°C mit 1%igem Glutaraldehyd/0.1 M Cacodylat-Puffer), allgemeine Vorschrift:
6 mg des Benzylamins werden mit 12 mg einer entsprechenden aromatischen Amino- oder Hydroxyverbindung, wie beispielsweise 4-Aminodiphenylamin oder 1-Naphthol, in 1 ml DMSO vorgelöst, mit 0.3 mmol (15 mM bezüglich Endvolumen) NiCl₂.4H₂O oder anderen Metallsalzen (vorzugsweise Mn²⁺, Co²⁺, La³⁺ versetzt und auf ein Endvolumen von 20 ml mit 35 mM Natriumacetat/Veronalpuffer (pH = 7.0) aufgefüllt. Man versetzt mit 3.3 µl 3%igem Wasserstoffperoxid (entspricht 5.10^-4%) und inkubiert 30 min bei Raumtemperatur.

Ausführungsbeispiel 5 Elektrophorese: Nachweisgrenzen für HRP/H₂O₂ ausgewählter Reagenzien und deren Applikationsformen (Tabelle 2, lfd. Nr. 1-45) am Blot im Vergleich mit etablierten Reagenzien (Tabelle 1) a) Elektrophorese

Es wird die Mini-Gelelektrophorese-Kammer und der Semi-Dry-Blotter SD 1 (Glaskohlenstoff Elektroden) von cti eingesetzt; geometrische Verdünnungsreihe (1 : 2ⁿ) von Peroxidase (M = 40 000, Serva; Startkonzen tration: 1 mg in 100 µl Elektrophoresepuffer, Auftragsvolumen jeweils 3 µl - dies entspricht 30 µg Peroxidase für die Startkonzentration (n = 0), gefolgt von der Verdünnungsreihe 1 : 2ⁿ (Enzymmenge [µg]): 1 : 2 (15), 1 : 4 (7.5), 1 : 8 (3.75), 1 : 16 (1.87), 1 : 32 (0.94), 1 : 64 (0.47), 1 : 128 (0.234), 1 : 256 (0.12), 1 : 512 (0.058), 1 : 1024 (0.029), 1 : 2048 (0.0145), 1 : 4098 (0,0072), 1 : 8196 (0.00362).

Die Verdünnungsreihe wird am SDS-Polyacrylamid Gel nach Doucet (J.-P. Doucet, J.-M. Trifaro; Anal. Biochem. 1988 (168), 265-271) der Elektrophorese unterzogen (Trenngel: 10% Acrylamid, 0.1% N,N'-Methylen bisacrylamid in 0.4% SDS, 5% Glycerol, 200 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 6.7) und 100 mM Glycin; Polymerisation unter Zugabe von 0.15% Ammoniumperoxodisulfat und 0,05% N,N,N',N'-Tertramethylethylendiamin (TEMED), Dauer 60 min; Sammelgel: 4% Acrylamid, 0.04% N,N'-Methylen bisacrylamid; Elektrophorese bei Raumtemperatur, zunächst 20 min bei 60 V, dann 40 min bei 150 V).

Der Transfer erfolgt auf Nitrocellulose (0.45 µm, Schleicher & Schuell) bei 0.8 mA.cm^-2 (Dauer: 2 h). Die Nitrocellulose-Membran wird anschließend vor der chromogenen Entwicklung (Arbeitsvorschriften 1-3) wird mit einem 20 mM Tris-Puffer (pH 7.6), welcher 137 mM NaCl und 0.1% Tween 20 enthält, vorbehandelt.

Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2.

b) chromogene Entwicklung Variante 1 (unter Einsatz der Benzylamine bzw. deren Salze)

3 mg des entsprechenden Reagenzes und ggf. 3 mg einer elektronenreichen und/oder farbkuppelnden aromatischen Verbindung werden in 1 ml DMSO vorgelöst und mit einem Puffer entsprechend den Angaben in Tabelle 1 auf 10 ml aufgefüllt. Es werden 2.5 µl 3%iges Wasserstoffperoxid zugegeben und die Blots mit den Peroxidase-Verdünnungsreihen bei Raumtemperatur 5 min entwickelt. Beim Einsetzten einer Hintergrundfärbung wird nach frühestens 3 min abgebrochen. Es wird mit einem 20 mM Tris-Puffer (pH 7.6), welcher 137 mM NaCl und 0.1% Tween 20 enthält, gestoppt.

Die Auswertung der Elektropherogramme erfolgt visuell und densitometrisch am noch feuchten Blot.

Variante 2 - unter in situ Darstellung der Benzylamine entsprechend Formel I (R⁴ = R⁵ = H) aus den Schiffschen Basen (Formel I, R⁴ = R⁵ = zusätzliche Bindung)

3 mg der entsprechenden Schiffschen Base werden in 400 µl möglichst absolutem Tetrahydrofuran gelöst, mit 2 ml absolutem Ethanol und 10 mg Natriumborhydrid versetzt und 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden zur Hydrolyse 1 ml Wasser und 100 µl Eisessig zugegeben und nach ca. 10 min, wie unter Variante 1 beschrieben, durch Auffüllen mit Puffer auf 10 ml weiter gearbeitet.

Variante 3 - unter in situ Darstellung der Benzylamine entsprechend Formel I (R⁴ = R⁵ = H) aus entsprechenden Aldehyden und Aminen (über die Schiffschen Basen; Formel I, R⁴ = R⁵ = zusätzliche Bindung)

0.01 mmol eines primären Amins oder primären Polyamines werden mit der äquimolaren Menge eines entsprechenden Aldehydes in 400 µl absolutem Tetrahydrofuran gelöst, 2 ml absolutes Ethanol zugegeben und ca. 40 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird, wie unter Variante 2 beschrieben, durch Zugabe von 10 mg Natriumborhydrid weitergearbeitet.

Tabelle 3 Legende zu den Tabellen 1 und 2 (Literaturhinweise und Fußnoten)

Literaturhinweise zu den angegebenen Syntheseverfahren:
[1] R. C. Graham, M. J. Karnovsky, J. Histochem. Cytochem. 1966 (14), 291-302.
[2] K.-J. Halbhuber, C. Scheven, G. Jirikowski, H. Feuerstein, U. Ott; Histochem. Cell. Biol. 1996, 105, 239-249.
[3] F. Gallyas, I. Merchenthaler; J. Histochem. Cytochem. 1988 (36), 807-810.
[4] M.-M. Mesulam in: Tracing Neuronal Connections with Horseradish Peroxidase; John Wiley & Sohns, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singsapore; 1982; vgl. auch [5] b.
[5] a) F. Olucha, F. Martinez-Garzia, C. Lopez-Garzia; J. Neurosci. Methods 1985 (13), 31-138;
b) S. Jhaveri, L. Carman, J. Hahm; J. Histochem. Cytochem. 1988 (36), 103-105.
[6] J. S. Hanker, W. A. Anderson, F. E. Bloom, Science 1972 (175), 991; J. Hanker, Prog. Histochem. Cytochem. 1979 (12), 1-87.
[7] a) R. C. Graham, Jr., U. Lundholm, J. Histochem. Cytochem. 1965 (13), 150-152;
b) M. S. Burstone, J. Histochem. Cytochem. 1960 (8), 63-70.
[8] S.-I. Kaiho, K. Mizuno, Anal. Biochem. 1985 (149), 117-120.
[9] N. Lee, S.-Q. Zhang, D. Testa; J. Immunol. Meth. 1988 (106), 27-30; vgl. auch: P. K. Nakane, Acta Endocrinol. Suppl. 1971 (153), 190; P. K. Nakane, J. Histochem. Cytochem. 1968 (16), 557-560; L. Miribel et al., Protides Biol. Fluids 1986 (34), 753.
[10] Synthese nach: M. Biswas, S. K. Das; J. of Polymer Science - Polymer Chem. Ed. 1981 (19), 3155-3164. (siehe Tabelle 2)

Fußnoten

a) im Gegensatz dazu intensiv dunkelblaue Präzipitate bei der Darstellung endogener Peroxidase-Aktivität am histologischen Schnitt gemäß Ausführungsbeispiel 1
b) im trockenen Zustand
c) intensive, grüne Hintergrundfärbung
d) 2-Hydroxy-benzo[a]carbazol-3-carbonsäure (Fluka)
1) +5% Dextran
2) 0.025%
3) doppelte Menge (12 mg) bezüglich Arbeitsvorschrift (6 mg)
4) vierfache Menge (12 mg) +0.001% 4-Phenylendiamin
5) Puffer enthält 50% Ethanol

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, wasserstoffperoxid bildenden Systemen, Peroxidasen und Oxidasen bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen, bei dem chromogene Reagenzien eingesetzt werden und die dadurch bewirkte Farbveränderung bzw. die entstehenden farbigen Präzipitate ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenzien Verbindungen gemäß der allgemeine Formel
bei welcher
Z einen beliebigen Kohlenstoff tragenden Substituenten mit einer oder mehreren durch n bezifferte C-N-Bindungen darstellt, vorzugsweise beliebig substituierte Aryl- oder Hetaryl- Substituenten mit n = 1-3 und stets n ≠ 0, und
R⁴ = R⁵ = H
R¹-R³ in den nachfolgenden Ansprüchen spezifizierte Reste und
A in den nachfolgenden Ansprüchen spezifizierte Anionen bedeuten, verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenzien der Formel I mit a = 0 und n ≧ 1 verwendet werden, wobei R² und R³ gleich oder ungleich sein können und beliebige Substituenten, einschließlich Wasserstoff, sein können, unter der Voraussetzung, daß zumindest einer dieser Substituenten

- entweder einen aromatischen Rest
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Mkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl, COOHCOOAlkyl, COOAryl
- oder einen heteroaromatischen Rest, aber nicht beschränkt auf folgende
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Alkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, COOH, COOAlkyl, COOAryl, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl,
- oder einen Metallocenrest, wie beispielsweise
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Alkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl,

besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenzien der Formel I mit a = 1 und n ≧ 1 verwendet werden, wobei R² und R³ gleich oder ungleich sein können und beliebige Substituenten, einschließlich Wasserstoff, sein können, unter der Voraussetzung, daß zumindest einer dieser Substituenten

- entweder einen aromatischen Rest
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Alkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl, COOHCOOAlkyl, COOAryl
- oder einen heteroaromatischen Rest, aber nicht beschränkt auf folgende
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Alkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, COOH, COOAlkyl, COOAryl, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl,
- oder einen Metallocenrest, wie beispielsweise
mit X gleich oder ungleich Y = OH, OAlkyl, OAryl, OAcyl, Alkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, Nitro, Amino, Aminoalkyl, Aminoaryl,

besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien bei Vorliegen deprotonierbarer und/oder chelatsierender Substituenten X und/oder Y, wie z. B. OH oder COOH, als Metallate, vorzugsweise entsprechende Wertigkeitsstufen von Übergangsmetallen, wie Ni, Co, Mn, Ag, Os oder Re oder auch Ce, Eu oder B, oder als Komplexe eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß X und/oder Y hydrophile löslichkeitsvermittelnde funktionelle Gruppen mit Elektronendonatoreigenschaften, wie beispielsweise COOH, OH oder NH₂, sind und so konfiguriert sind, daß sie gemäß Formel I metallchelatisierende Eigenschaften besitzen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anion A Halogen, CH₃COO, CF₃COO oder BF₄, jedoch nicht beschränkt auf diese, gebunden wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Substituent Z in Formel I aromatische oder heteroaromatische Reste fungieren, wie beispielsweise für n = 1
R⁴, R⁵, R⁶ = OH, NO₂, Alkyl, Aryl, Acyl, Alkylamino, Halogen, COOH
jedoch nicht beschränkt auf diese

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Substituent Z in Formel I di- und höhersubstituerte aromatische Strukturfragmente (n ≧ 2) gebunden werden, wie beispielsweise
R⁴ = OH, NO₂, Alkyl, Aryl, Acyl, Alkylamino, Halogen, COOH
jedoch nicht beschränkt auf diese.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Substituent Z in Formel I mono- und höhersubstituierte chelatisierende aromatische oder aliphatische Strukturfragmente (n ≧ 1), aber nicht beschränkt auf diese:
R⁷ = H, CH₂-COOH, Alkyl
verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Substituent Z in Formel I für n < 20 von Amino-substituierten Oligomeren bzw. Polymeren, wie beispielsweise Polyaminostyrol, oder auch dendrimeren Polyaminen ableitet.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent Z in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. wasserfreiem Methanol oder Ethanol, mit entsprechenden Aldehyden oder Ketonen zu Azomethinen (R⁴-R⁵ = zusätzliche Bindung) umgesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Azomethine mit Natriumborhydrid oder anderen gebräuchlichen Reduktionsmitteln in geeigneten Lösungsmitteln, wie wasserfreien Alkoholen oder Alkohol/THF-Gemischen, zu den entsprechenden Aminen (R⁴ = R⁵ = H) reduziert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die sekundären Amine mit geeigneten anorganischen oder organischen Säuren bzw. Salzen in die entsprechenden zumeist luftstabileren Ammoniumsalze (R⁴ = R⁵ = H, a = 1) überführt werden.

14. Verfahren nach den Ansprüche 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsschritte ohne Aufarbeitung und Isolierung der jeweiligen Reaktionsprodukte durch in situ Arbeitsweise direkt in die entsprechenden Reagenz-Applikationsformen überführt werden.

15. Verfahren nach den Ansprüche 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminverbindungen (R⁴ = R⁵ = H) auf alternativen Wegen, z. B. durch Alkylierung von primären Aminen mit entsprechenden Benzylhalogeniden bzw. Heteroaryl-halogenmethanderivaten, synthetisiert werden.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den Reagenzien Puffersysteme, wie z. B. Acetatpuffer, Puffer nach Michaelis, HEPES oder PIPES, vorzugsweise im pH-Intervall von 4 bis 8, zugegeben werden.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den Reagenzien Metallverbindungen, z. B. Salze von Übergangsmetallen, wie Ni, Co, Mn, Ti, Os, Re, Ag, Au oder auch Sm, Eu, U oder B, zugegeben werden.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den Reagenzien elektronenreiche aromatische Verbindungen mit radikalübertragenden, ein- oder mehrelektronen-redoxaktiven, farbkuppelnden oder Protonendonator- Eigenschaften, z. B. Phenylen-Derivate, wie 1,2-Dihydroxybenzen, Aminophenole, 1,4-Phenylendiamin und insbesondere dessen N-Phenyl- und N,N-Dialkylderivate, 2,7'-Diaminofluoren, 4,4'-Bis(aminophenyl)methan, oder auch Carbazol-Derivate, wie 3,6'-Diamino-9-methyl-carbazol oder 2- Hydroxy-benzo[a]carbazol-3-carbonsäure (Benzazylsäure) und deren Salze, zugegeben werden.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den Reagenzien stabilisierende, aktivierende, lösungsvermittelnde bzw. chelatisierende Zusätze, wie beispielsweise Dextran oder Natriumdodecylsulfat, zugesetzt werden.

20. Verfahren nach Ansprüchen 16-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusätze nach vorangehender in situ Reduktion der entsprechenden Azomethine (R⁴-R⁵ = zusätzliche Bindung) zu den Aminen (R⁴ = R⁵ = H) und hydrolytischer Spaltung der primären Reduktionsprodukte zugegeben werden.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in situ Synthese der Reagenzien im Eintopfverfahren direkt aus den Amin- und Carbonylkomponenten nach Umsetzung zum Azomethin und nachfolgender Reduktion erfolgt.