DE19813234A1

DE19813234A1 - Verfahren zur Herstellung hochsulfatierter Hyaluronsäuren

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Publication number: DE19813234A1
Application number: DE1998113234
Authority: DE
Inventors: Stephanie Moeller; Hans-Peter Kloecking; Peter-Juergen Mueller; Joerg Ozegowski
Original assignee: KLOECKING HANS PETER; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: KLOECKING HANS PETER; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 1999-09-30

Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von hochsulfatierter Hyaluronsäuren mit einem Sulfatierungsgrad von größer als 3,5 pro Disaccharideinheit des Hyaluronsäuremoleküls - und damit größer als bei den aus dem Stand der Technik bekannten Sulfatierungsverfahren mit z. B. Chlorsulfonsäure/Pyridin oder dem Schwefeltrioxid/Pyridin-Komplex, als Sulfatierungsreagentien - wird vorgestellt. Durch gezielte Prozeßführung und Überführung der Hyaluronsäure in ein Ammoniumsalz wird die vollständige Löslichkeit in einem technisch gebräuchlichen, organisch dipolar aprotischen Lösungsmittel erreicht. Das Sulfatierungsreagens Schwefeltrioxid/Dimethylformamid-Komplex ermöglicht die Sulfatierung in homogener Phase, wobei je nach Konzentration des Sulfatierungsreagens und der Reaktionszeit der Sulfatierungsgrad eingestellt werden kann. Dabei wird die Verwendung der ökologisch bedenklichen und bei der Aufarbeitung schwer handhabbaren Pyridins vermieden. DOLLAR A Die verfahrensgemäß erhältlichen sulfatierten Hyaluronsäuren zeigen heparinähnliche Wirkungen hinsichtlich ihres profibrinolytischen und antikoagulierenden Wirkprofils und schaffen so die Möglichkeit eines vielfältigen medizinischen Einsatzes, z. B. zur Thromboseprophylaxe oder als Wirkstoffe in transdermalen therapeutischen Systemen. Die erhältlichen sulfatierten Hyaluronsäuren erweisen sich auch als starke Inhibitoren der Hyaluronidase.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung sulfatierter Polysaccharide, insbesonde re hochsulfatierter Hyaluronsäuren.

Der Versuch der Darstellung sulfatierter Polysaccharide, einschließlich die der Hyaluron säuresulfatester, beruht auf deren schon zeitig erkannter Ähnlichkeit mit dem natürlich vorkommenden Heparin, sowohl auf struktureller Ebene als auch in Bezug auf pharmazeu tisch nutzbare Wirkungen. Der hohe Preis der Heparine war vor altem der Anlaß, die Herstellung synthetischer oder halbsynthetischer Präparate mit Heparinwirkung zu versu chen. Als Biopolymer-Derivate mit zum Teil den synthetischen Polymeren überlegenen Spezialeigenschaften finden sie in zahlreichen Einsatzgebieten der Medizin, Medizintechnik und Pharmazie wichtige Anwendungsmöglichkeiten.

So sind die antikoagulanten und anti-inflammatorischen Wirkungen sulfatierter Hyaluron säuren seit langem bekannt und Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (US 4 240 163, WO 88/07060, US 5 262 403). Ebenso spielt die Verwendung substituierter, also auch sulfatierter, Polysaccharide zur Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen wie Arthrose (WO 92/13541) eine zunehmende Rolle. Bekannt ist auch die anti-enzymatische Aktivität sulfatierter Hyaluronsäuren. In einer Publikation von E. A. Balazs et. al. (Acta Phys. Scandinav. 23, 1951, 169-175) wird auf die inhibierende Wirkung von sulfatierten Hyaluronsäuren eingegangen.

Neuere Anwendungen zielen auf Hydrokolloide bzw. Hydrogele auf der Basis von Hyalu ronsäure und sulfatierten Hyaluronsäuren hin, die meistens mit weiteren polymeren Werk stoffen und Hydrokolloidgelsystemen zu medizinischen Produkten kombiniert bzw. in pharmazeutischen Präparaten eingesetzt werden.

Bei den angestrebten Produkten handelt es sich in erster Linie um hydroaktive Wund verbände auf der Basis von Hyaluronsäure/Cellulose-Kombinationen mit Wirkstoffen sowie um Hygieneprodukte mit verbesserten Eigenschaften wie Kondome, Windeln, Binden und Tampons. Bei diesen Produktentwicklungen werden die guten kosmetischen Eigenschaften und die wundheilende und entzündungshemmende Wirkung der Hyaluronsäure und ihrer Derivate genutzt.

Die aufgeführten Anwendungsbeispiele von sulfatierten Hyaluronsäuren zogen eine Vielzahl von Publikationen mit möglichen Herstellungsverfahren für diese sulfatierten Polysaccharide nach sich.

Es ist bekannt, daß der Sulfatierungsgrad für die biologische Wirksamkeit eine entscheiden de Rolle spielt; mit steigender Anzahl der Sulfatgruppen im Molekül ist oftmals eine erhebliche Wirkungssteigerung auszumachen.

Sulfatierungen der Hydroxylgruppen von Hyaluronsäure (maximal 4 OH-Gruppen pro Disaccharideinheit im Hyaluronsäure-Molekül) mit ClSO₃H in Pyridin werden von T. Wada et. al. (Chemistry Letters 1994, 2027-2030) und in US 2 599 172 bzw. EP 11 322 be schrieben. "Supersulfatiertes" Heparin wird mit Hilfe eines Gemisches aus konz. H₂SO₄ und ClSO₃H hergestellt, der Sulfatierungsgrad wird mit 2,5 angegeben (EP 0 116 801). In FR 2 584 728 wird die Sulfatierung von Glucosaminoglycanen offenbart, unter anderem auch die von Hyaluronsäure, mit SO₃/Pyridin- oder SO₃/Trimethylamin-Komplexen in Dimethyl formamid (DMF) als Lösungsmittel. Hier wird als reaktive Form das Triethylammoniumsalz des Glucosaminoglycans eingesetzt. Ein Prozeß der Sulfatierung von Glucosaminoglycanen und ihren biologischen Applikationen ist Gegenstand von US 5 013 724. Ausgehend von einem Ammoniumsalz eines Glucosaminoglycans wird in einem dipolar aprotischen Lö sungsmittel mit einem SO₃/Trimethylamin- bzw. SO₃/Pyridin-Komplex sulfatiert. Der Sulfatierungsgrad wird mit mehr als 2,5 angegeben. WO 95/25751 und Publikationen in Gazetta Chimica Italiana (125 (1995) 169-181) sowie in Carbohydrate Research (158 (1986) 183-190) beschreiben neue, dem Heparin ähnliche, sulfatierte Polysaccharide mit einem Sulfatierungsgrad von 0,5 bis 3,5. Sulfatierungsreagens ist hier auch der schon mehrmals erwähnte SO₃/Pyridin-Komplex.

Eine sowohl strukturelle als auch in ihrer Wirkung vergleichbare Ähnlichkeit mit dem Heparinmolekül wird durch sulfatierte Aminopolysaccharide erreicht. US 2 832 766 und US 3 027 363 gehen von deacetylierten Aminopolysacchariden aus und sulfatieren mit ClSO₃H in Pyridin bzw. mit SO₃/Pyridin-Komplex in wässrig alkalischem Medium. Während bei erstgenannter Methode sowohl NH₂- als auch OH-Gruppen reagieren, konnte in US 3 027 363 eine selektive Sulfatierung der NH₂-Gruppe erreicht werden. In EP 0 340 628 und US 5 008 253 werden Sulfoamino-Derivate von Chondroitinsulfaten, Dermatansulfat und Hyaluronsäure durch Deacetylierung der entsprechenden Verbindungen in Gegenwart von wasserfreiem Hydrazin bzw. Hydrazinsulfat und anschließender Sulfatierung derselben mit SO₃/Triethylamin-Komplex oder ClSO₃H/H₂SO₄ hergestellt. Der Sulfatierungsgrad wird mit einem DS von 1,5 bis 2,3 angegeben.

Eine weitere Methode zur Darstellung hochsulfatierter Glucosaminoglycane wird in WO 88/0211 beschrieben. Es wird hier die Möglichkeit genutzt, mittels NaBH₄ die endständigen Gruppen der Polysaccharidkette zu Hydroxylgruppen zu reduzieren und anschließend das gesamte Molekül mit ClSO₃H in Pyridin zu sulfatieren. Dabei wird von kürzerkettigen Polysacchariden mit relativ niedrigen Molmassen ausgegangen.

All die hier aufgeführten Beispiele zeigen die vielfältigen Möglichkeiten der Sulfatierung von verschiedenartigsten Oligo- und Polysacchariden.

Die Sulfatierungsgrade (degree of sulfatation = DS) pro Disaccharideinheit eines Hyaluron säuremoleküls, die mit den in der Literatur aufgeführten Verfahren erreicht wurden, über steigen nicht den DS von 3,5. Eine mögliche Ursache dafür und somit auch ein nicht zu übersehender Nachteil dieser Verfahren besteht in der oft auftretenden Inhomogenität der Reaktionslösungen. Das bezieht sich nicht auf die Löslichkeit des Ausgangspolymers in einem organisch aprotischen Lösungsmittel, denn mit der Darstellung der Ammonium verbindungen des Polymermoleküls konnte eine sehr gute Löslichkeit in entsprechenden Lösungsmitteln erreicht werden. Jedoch ist es häufig der Fall, daß z. B. bei Sulfatierungen mit dem SO₃/Pyridin-Komplex das Reaktionsprodukt, nämlich das sulfatierte Polysaccharid, noch während der Reaktion ausfällt und somit die Reaktion regelrecht abgestoppt oder zumindestens, infolge der Inhomogenität, in ihrer Reaktionsgeschwindigkeit stark verlang samt wird. Niedrigere, nicht einstellbare Sulfatierungsgrade sind die Folge.

Darüberhinaus bringt die Verwendung des Pyridins, wie bei Sulfatierungsreaktionen mit ClSO₃H beschrieben, grundsätzliche Probleme und Nachteile mit sich. Das betrifft be sonders die Verwendung erheblicher Mengen des ökologisch bedenklichen Pyridins als Lösungsmittel und die Schwierigkeiten, die bei dessen vollständiger Abtrennung vom polymeren Endprodukt auftreten.

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von hochsulfatier ten Hyaluronsäuren mit einem DS < 3,5 pro Disaccharideinheit des Hyaluronsäuremoleküls. Durch eine geeignete Prozeßführung und Vorbehandlung der Hyaluronsäure soll eine vollständige Löslichkeit in einem technisch gebräuchlichen, organischen Lösungsmittel erreicht werden. Durch ein geeignetes Sulfatierungsreagens soll eine in vollkommen homo genem Medium durchzuführende Sulfatierung ermöglicht werden, wobei je nach Konzen tration des Sulfatierungsreagens und der Reaktionszeit der Sulfatierungsgrad wahlweise eingestellt werden kann. Die Reaktionslösungen sollen auch nach Reaktionsende noch vollkommen homogen sein, um einen vorzeitigen Reaktionsabbruch zu verhindern.

Die so hergestellten sulfatierten Hyaluronsäureproben sollen medizinisch verwertbare Eigenschaften besitzen, so z. B. hinsichtlich ihrer heparinähnlichen Wirkungen oder ihres Einsatzes als Hydrokolloide bzw. -gele in Kombination mit weiteren polymeren Wirkstoffen wie beispielsweise Cellulose und Cellulosederivate.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von hoch sulfatierten Hyaluronsäuren zu entwickeln, das es gestattet, vollständig homogene Sulfatie rungsreaktionen durchzuführen und lösliche sulfatierte Hyaluronsäuren in gezielt einstell baren DS-Bereichen zu synthetisieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man die Na-Form der Hyaluron säure in eine in geeigneten, technisch gebräuchlichen, organischen Lösungsmitteln lösliche Form überführt. Dies erfolgt durch Versetzen der wässrigen Hyaluronsäurelösung (Na- Form) mit einem Ionenaustauscher (H-Form) und nachfolgender Umsetzung der ent standenen H-Form der Hyaluronsäure mit einem Trialkyl- (insbesondere Tri-C₁-C₅-alkyl-) oder Triarylamin (insbesondere Triphenylamin) bzw. einem cyclischen aliphatischen Amin (z. B. Piperidin, Morpholin) oder mit einer quarternären Aminoniumverbindung (z. B. einem Tetra-C₁-C₅-alkylammoniumhalogenid, wie Tributylammoniumchlorid) zu einer Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure.

Insbesondere wird das Ammoniumsalz der Hyaluronsäure dadurch erhalten, indem man eine wässrige Lösung des Alkalimetallsalzes der Hyaluronsäure mit einer wässrigen Amin- Lösung bis zu einem pH-Wert von ca. 9 bei einer Temperatur zwischen 25 und 60°C und einer Reaktionszeit zwischen 15 und 60 min umsetzt und anschließend die Reaktionslösung gegen Wasser dialysiert und gefriertrocknet. Das Ammoniumsalz wird dann vorzugsweise in einem dipolar aprotischen Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und die Lösung mit einem Sulfatierungsreagens versetzt. Für das erfindungsgemäße Verfahren kommt als Sulfatierungsreagens der SO₃/Dimethylformamid-Komplex (SO₃/DMF-Komplex) zur Anwendung. Dieser wird als Feststoffim Molverhältnis OH/SO₃ = 1 : 1 bis 1 : 30, vorzugsweise 1 : 15, zur Hyaluronsäurelö sung gegeben, wobei er innerhalb weniger Minuten in Lösung geht.

Entsprechend ist das Verfahren zur Herstellung von sulfatierter Hyaluronsäure durch Sulfatierung von Hyaluronsäure dadurch gekennzeichnet, daß Hyaluronsäure oder ein Alkalimetallsalz davon in ein Ammoniumsalz überführt wird, welches in dipolar aprotischen Lösungsmitteln löslich ist, und das erhältliche Ammoniumsalz der Hyaluronsäure mit dem Schwefeltrioxid/Dimethylformamid-Komplex als Sulfatierungsreagens sulfatiert wird, wobei der Sulfatierungsgrad DS größer als 3,5 ist.

Die Reaktionstemperatur wird zwischen 0°C und 60°C, vorzugsweise 25°C (Raum temperatur) gewählt, die Reaktionszeit beläuft sich auf 4 bis 24 h. Die Reaktion ist im Gegensatz zu Sulfatierungen mit anderen Sulfatierungsmitteln dadurch gekennzeichnet, daß es hierbei nicht zum Ausfallen sulfatierter Hyaluronsäure schon während und somit zum unkontrollierten Abstoppen der Reaktion kommt, sondern es liegt auch nach Reaktionsende noch eine homogene, klare Lösung vor. Die Reaktion wird durch Zugabe einer geringen Menge an Wasser abgestoppt, wobei überschüssiger SO₃/DMF-Komplex zerstört wird. Die Aufarbeitung der Polymerlösung erfolgt analog den in der Literatur beschriebenen Verfah ren. In den meisten Fällen wird das Polymer durch Eintropfen in Ethanol bzw. Aceton ausgefällt, neutralisiert, gewaschen und gegen Wasser dialysiert. Die so gereinigte Polymer lösung wird anschließend gefriergetrocknet. Erfindungsgemäß werden sulfatierte Hyaluron säuren mit einem DS größer als 3,5 erhalten. Der Schwefelgehalt und somit der DS des Polymers wird mittels elementaranalytischer und NMR-spektroskopischer Untersuchungen bestimmt. Die Bestimmung des Restwassergehaltes, der auch nach Trocknung der Polymer proben noch im Polymer vorliegt, erfolgt durch Thermoanalysen und Karl-Fischer-Titratio nen.

Der Vorteil der Sulfatierung mit SO₃/DMF-Komplex liegt in der vollkommen homogenen Reaktionsführung, wobei die Homogenität der Reaktion eindeutig mit dem Löseverhalten von sulfatierter Hyaluronsäure bzw. seiner Ammoniumverbindung in DMF zusammenhängt. Das Auftreten des ökologisch bedenklichen und bei der Aufarbeitung schwer handhabbaren Pyridins, welches beim Einsatz von SO₃/Pyridin-Komplex als Sulfatierungsmittel entsteht, wird somit vermieden. Durch die Wahl der Menge an dem Sulfatierungsreagens SO₃/DMF- Komplex, der Reaktionstemperatur und Reaktionszeit ist es möglich, den Sulfatierungsgrad des Polymers gezielt einzustellen und die Reaktionsführung zu beherrschen.

Desweiteren soll im Rahmen dieser Erfindung eine bevorzugte Variante der Herstellung des Ausgangsmaterials, eine neue Möglichkeit zur Darstellung der Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure, als Vorstufe zur Sulfatierung, vorgestellt werden. Hierbei wird eine wäss rige Hyaluronsäurelösung (Na-Salz) erwärmt, vorzugsweise auf 50°C, und mit einer Aminlösung, insbesondere 75%iger Tributylaminlösung, solange versetzt, bis der pH-Wert der Lösung sich auf den pH-Wert 9 eingestellt hat. Die Lösung wird noch ca. 1 h bei oben angegebener Temperatur gerührt und anschließend gegen Wasser dialysiert. Die so von überschüssigem Amin gereinigte Polymerlösung wird gefriergetrocknet und zur Sulfatie rung, wie oben beschrieben, eingesetzt. Vorteil dieser Methode ist die Einsparung des relativ teuren Ionenaustauschers und des Umweges über die H-Form des Polymers.

Bei der erfindungsgemäßen Sulfatierungsmethode kommt es zu einem Molmasseabbau des Polymermoleküls. Ausgehend von Polymermolmassen von etwa 1 Mill. werden im sulfatier ten Endprodukt Molmassen zwischen 60.000 und 300.000 erreicht.

Die erfindungsgemäß hergestellten sulfatierten Hyaluronsäuren haben interessante biologisch-medizinische Wirksamkeiten.

So sind die sulfatierten Hyaluronsäurederivate nicht direkt fibrinolytisch wirksam. Sie entfalten aber in Gegenwart von Gefäßendothel eine profibrinolytische Wirkung, indem sie den Gewebeaktivator (t-PA), der für die körpereigene Fibrinolyse von entscheidender Bedeutung ist, vermehrt freisetzen.

Im Humanzitratplasma entfalten die sulfatierten Hyaluronsäurederivate konzentrations abhängig eine antikoagulierende Wirkung.

In den Gruppentesten - Thrombinzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit und Thrombo plastinzeit, ausgeführt im Humanzitratplasma - lassen sich für die sulfatierten Hyaluronsäu rederivate Angriffspunkte an Faktoren im intrinsischen Gerinnungssystem und am Thrombin erkennen.

Die erfindungsgemäßen sulfatierten Hyaluronsäuren zeigen heparinähnliche Wirkungen hinsichtlich der profibrinolytischen und der antikoagulierenden Wirkung. Dabei ist die profibrinolytische Wirkung erheblich stärker ausgeprägt als beim unfraktionierten Heparin.

Aufgrund des antikoagulierenden und profibrinolytischen Wirkprofils der sulfatierten Hyaluronsäurederivate sind diese vielfältig medizinisch einsetzbar: Zur prä-, peri- und postoperativen Thromboseprophylaxe in der Allgemeinchirurgie, zur Prophylaxe und Therapie oberflächlicher und tiefer Beinvenenthrombosen, zur Thrombo-Embolie-Prophy laxe, zur Therapie der Becken-Venen-Thrombose, zur Antikoagulation beim extrakorpora len Kreislauf (Herz-Lungen-Maschine) und der künstlichen Niere (Dialyse), in der hyper koagulatorischen Phase der Verbrauchskoagulophathie, die sich bei zahlreichen Erkrankun gen und Vergiftungen im Verlauf des Grundleidens entwickeln kann, zur Verhütung von Gefäßverschlüssen durch Blutgerinnsel nach Hüftgelenkoperationen, zur Auflösung von frischen fibrinhaltigen Gefäßverschlüssen, zur Verhinderung der Restenose nach Herz infarkt, Herzinfarktlangzeitbehandlung, wenn ein erhöhtes Risiko für thromboembolische Komplikationen gegeben ist.

Als Wirkstoff in transdermalen therapeutischen Systemen (z. B. Pflaster) können sulfatierte Hyaluronsäurederivate zur Behandlung oberflächlicher Thrombosen mit Begleitentzündung (oberflächliche Thrombophlebitis) als eine aussichtsreiche Anwendung in Erwägung gezo gen werden.

Zur Untersuchung der inhibierenden Wirkung von sulfatierter Hyaluronsäure wurden sulfatierte Hyaluronsäureproben mit einem Sulfatierungsgrad zwischen 13,6% und 8,3% Schwefel eingesetzt. Die sulfatierte Hyaluronsäure ist ein starker Inhibitor für Hyaluronida se, während die Aktivität von Hyaluronatlyase nur schwach gehemmt wird. Innerhalb des untersuchten Bereiches von Sulfatierungsgraden besteht kein Zusammenhang zwischen Sulfatierungsgrad und Inhibitorwirkung. Die sulfatierte Hyaluronsäure besitzt im Vergleich zum Heparin eine 1000-fach höhere inhibierende Aktivität gegenüber Hyaluronidase. 0,1 µg/ml sulfatierte Hyaluronsäure hat die gleiche inhibierende Wirkung wie 100 µg/ml Heparin sowohl gegenüber Hyaluronidase wie auch Hyaluronatlyase.

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber in keiner Weise einschränken.

Ausführungsbeispiel 1 (HYA-DS 37)

500 mg (1,24 mmol) Hyaluronsäure (Na-Salz) und 100 ml Wasser (bidest.) werden in einem geschlossenen Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Lösung des Polymers gerührt. Die klare viskose Lösung wird auf 0°C gekühlt, mit 2,5 g Ionenaustau scher (Dowex WX 8, H-Form) versetzt und 30 min gerührt. Die vom Ionenaustauscher abzentrifugierte Polymerlösung wird durch Zugabe von 10%-iger ethanolischer Tributyla minlösung auf den pH-Wert 9 eingestellt. Anschließend wird die Lösung dreimal mit Diethylether bzw. tert.-Butyl-methylether extrahiert, 24 h gefriergetrocknet und bei 50°C im Vakuum getrocknet.

Das so erhaltene Ammoniumsalz des Polymers wird in ca. 80 ml absolutem Dimethylforma mid (DMF) unter Argon bei Raumtemperatur gelöst, auf 0°C gekühlt und mit 5 g (32,6 mmol) SO₃/DMF-Komplex (OH/SO₃ = 1 : 10) versetzt. Es wird 4 h bei 0°C gerührt. In die nach dieser Zeit immer noch klare Reaktionslösung werden zum Reaktionsabbruch einige ml Wasser (bidest.) gegeben, die Lösung in 700 ml Aceton ausgefällt und mit 1n ethanol. NaOH neutralisiert. Der Niederschlag wird mehrmals mit Ethanol gewaschen, in Wasser (bidest.) gelöst, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird zur weiteren Trocknung bei 50°C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Molgewicht: ~ 63.000
SO₃ ^-/COO^-: ~ 3,8
C(%): 21,5 (ger.: 18,99)
H(%): 3,45 (ger.: 3,12)
N(%): 3,16 (ger.: 1,58)
S(%): 13,81 (ger.: 13,76)
H₂O-Gehalt (%): 12,1
Schwermetalle (%/g): < 10 ppm

Ausführungsbeispiel 2 (HYA-DS 41)

500 mg (1,24 mmol) Hyaluronsäure (Na-Salz) und 100 ml Wasser (bidest.) werden in einem geschlossenen Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Lösung des Polymers gerührt. Die klare viskose Lösung wird auf 50°C erwärmt und eine wässrige 75%-ige Tributylmethylammoniumchlorid-Lösung solange zugetropft, bis die Lösung den pH-Wert 9 erreicht. Anschließend wird noch 1 h bei der oben angegebenen Temperatur gerührt. Die leicht gelblich gefärbte Lösung wird nun gegen Wasser (bidest.) dialysiert, 24 h gefriergetrocknet und bis zur Gewichtskonstanz bei 50°C an der Trockenpistole nach getrocknet.

Die so erhaltene Ammoniumverbindung des Polymers wird in ca. 80 ml absolutem DMF unter Argon bei Raumtemperatur gelöst und mit 6,4 g (41,7 mmol) SO₃/DMF-Komplex (OH/SO₃ = 1 : 15) versetzt. Die Reaktionsmischung wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Die klare Reaktionslösung wird nach Abbruch der Reaktion - durch Zugabe einiger ml Wasser (bidest.) - in 700 ml Aceton oder Ethanol ausgefällt und mit in ethanol. NaOH neutalisiert. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, mehrmals mit Ethanol gewaschen, in Wasser (bidest.) gelöst und gegen Wasser dialysiert. Nach anschließender Gefriertrocknung des Polymers wird noch bis zur Gewichtskonstanz bei 50°C im Vakuum getrocknet.

Molgewicht: ~ 65.000
SO₃ ^-/COO^-: ~ 3,6
C(%): 19,88 (ger.: 19,35)
H(%): 3,18 (ger.: 3,21)
N(%): 2,11 (ger.: 1,61)
S(%): 13,30 (ger.: 13,28)
H₂O-Gehalt (%): 13,00
Schwermetalle (%/g): < 10 ppm

Ausführungsbeispiel 3 Prüfling auf profibrinolytische Wirkung am isoliert durchströmten Gefäßpräparat (Schweineohr)

Am isoliert durchströmten Gefäßpräparat (Schweineohr) wurde der kanulierte Ramus intermedius der Ateria auricularis magna zur Entfernung des Blutes 30 Minuten mit Tyrode lösung durchströmt. Danach wurden Perfusate im Abstand von 2 Minuten fraktioniert gesammelt: Fraktionen 1-4 zur Bestimmung der spontanen Freisetzung von Gewebeakti vator (t-PA), Fraktionen 5 und 6 unter Durchströmung mit prüfsubstanzhaltiger Tyrodelö sung, danach Fraktionen 7-12 unter Durchströmung mit Tyrodelösung ohne Prüfsubstanz. Der Gehalt der Perfusate der Fraktionen 1-12 wurde als fibrinolytische Aktivität mit der Fibrinplattentechnik bestimmt und anhand einer Eichkurve mit Standard-Gewebefaktor in Internationale Einheiten (IE)/ml Perfusat umgerechnet.

In Tabelle 1 ist die durch die Prüfsubstanzen freigesetzte t-PA-Aktivität im Vergleich zu der von unfraktioniertem Heparin und von Pentosanpolysulfat, einem unter den Namen SP-54 oder Fibrezym kommerziell erhältlichen Fibrinolytikum bzw. Präparat zur Thrombose prophylaxe, induzierten Aktivität in Prozent dargestellt.

Im Vergleich mit der Kontrolle steigerten die sulfatierten Hyaluronsäurederivate die t-PA- Freisetzung um 100 bis 200 Prozent, Heparin und Pentosanpolysulfat dagegen nur um 20 bis 30 Prozent.

Tabelle 1

Freisetzung von Gewebeplasminigenaktivator (t-PA) unter Durchströmung mit sulfatierten Hyaluronsäurederivaten am isolierten Gefäßpräparat (Schweineohr)

Ausführungsbeispiel 4 Prüfung auf antikoagulierende Wirkung

Die Prüfung auf antikoagulierende Wirkung wurde in Global- und Gruppentesten in vitro vorgenommen.

a) Thrombelastographische Untersuchungen (Globaltest)

Thrombelastographische Aufzeichnungen wurden mit 0,2 ml Humanzitratplasma, 0,1 ml Tris/NaCl-Pufferlösung unter Zusatz von 0,05 ml CaCl₂ (0,1 M/L) vorgenommen. Kontroll thrombelastogramme wurden ohne Zusatz von Prüfsubstanz aufgezeichnet.

Mit Hilfe des Thrombelastographen wurden im Humanzitratplasma die Reaktionszeit r, die Gerinnselbildungszeit k und die maximale Amplitude ma konzentrationsabhängig in Gegen wart der Prüfsubstanzen ermittelt. Eine Verlängerung der Reaktionszeit r bedeutet eine Verzögerung des Gerinnungsvorganges (Tabelle 2). In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse als Konzentrationen, die bei einer Laufzeit von einer Stunde eine Ungerinnbarkeit des Human zitratplasmas bewirken, aufgelistet. Unfraktioniertes Heparin erwies sich von den geprüften Substanzen als am stärksten wirksam. Um eine Ungerinnbarkeit über 60 Minuten zu bewirken, wurde von den sulfatierten Hyaluronsäurederivaten die ca. 30-fache Substanz menge gegenüber Heparin benötigt. Dieser Befund weist darauf hin, daß die Hyaluronsäure derivate einen im Vergleich zu Heparin anderen Wirkungsmechanismus hinsichtlich ihrer antikoagulierenden Wirkung besitzen.

Tabelle 2

Veränderungen thrombelastographischer Parameter im recalzifizierten Humanplasma durch sulfatierte Hyaluronsäurederivate

TEG (TEG = Thrombobelastogramm) Laufzeit 1 Stunde Substanzkonzen trationen, die eine Ungerinnbarkeit bewirken

b) Bestimmung der Thrombinzeit

Zur Bestimmung der Thrombinzeit wurden 0,2 ml Humanzitratplasma mit 0,2 ml Tris/NaCl-Pufferlösung bzw. 0,2 Tris/NaCl-Pufferlösung mit der Prüfsubstanz gemischt.

Mit 0,1 ml Thrombinlösung (10 NIH-E/ml) wurde der Gerinnungsvorgang gestartet. Die Thrombinzeitbestimmung ist ein Gruppentest. Verlängerte Thrombinzeiten werden hervorgerufen durch Hemmung von Thrombin bzw. durch Beschleunigung der Thrombin- Antithrombin-III-Reaktion im Plasma.

Zur Einschätzung der Wirksamkeit der sulfatierten Hyaluronsäurederivate wurde die Konzentration bestimmt, die eine zweifache Verlängerung der Thrombinzeit bewirkt (Tabelle 3).

Die sulfatierten Hyaluronsäurederivate waren schwächer wirksam als unfraktioniertes Heparin, aber etwa 5-fach stärker wirksam als Pentosanpolysulfat.

Tabelle 3

Antikoagulierende Wirkung von sulfatierten Hyaluronsäurederivaten im Humanzitratplasma

c) Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)

Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit erfaßt als Gruppentest alle intrinsischen (endoge nen) Gerinnungsfaktoren außer Calciumionen und Plättchenfaktor 3. Phospholipidreagens und Humanzitratplasma wurden in Gegenwart der jeweiligen Prüfsubstanzen 3 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend wurde das Gemisch mit Calciumchlorid zur Gerinnung gebracht. Leerwerte wurden ohne Gegenwart von Prüfsubstanzen unter sonst gleichen Bedingungen ermittelt.

Ansatz:

0,1 ml Humanzitratplasma
0,03 ml Trispuffer bzw. Trispuffer + Prüfsubstanz
0,1 ml Phospholipidreagens

3 Minuten bei 37°C inkubieren

0,1 ml Calciumchlorid (0,02 M; 37°C)

Eine Verlängerung der aPTT deutet auf eine Hemmung von mehreren endogenen Ger innungsfaktoren möglicherweise in Verbindung mit Antithrombin III hin.

Alle geprüften sulfatierten Hyaluronsäurederivate verlängerten die aktivierte partielle Thromboplastinzeit bei relativ niedrigen Konzentrationen (ca. 1 µg/Ansatz) um das 2-fache. Heparin erwies sich um den Faktor 10, Pentosanpolysulfat nur um das 1,5 bis 2-fache stärker wirksam.

d) Bestimmung der Thromboplastinzeit (Ouick, TPZ)

Die Thromboplastinzeitbestimmung (TPZ) ist ein einfacher funktioneller Gruppentest für das exogene System und erfaßt daher die Faktoren X, VII, V, II und das Fibrinogen.

Ansatz:

0,1 ml Humanzitratplasma
0,03 ml Trispuffer bzw. Trispuffer + Prüfsubstanz
0,1 ml Thrombokinase

2 Minuten bei 37°C inkubieren

0,1 ml Calciumchlorid (0,02 M; 37°C)

Unfraktioniertes Heparin und Pentosanpolysulfat erwiesen sich vergleichsweise als stärker wirksam. Die sulfatierten Hyaluronsäurederivate bewirkten gegenüber Heparin in 3-5-fach höherer Konzentration (6,9-9,0 µg/Ansatz) (Tabelle 3) eine Verdopplung der Thrombopla stinzeiten gegenüber den Kontrollwerten. Der Einfluß auf das exogene System ist allgemein schwächer als im endogenen Gerinnungssystem.

Ausführungsbeispiel 5 Inhibierung von Hyaluronidase und von Hyaluronatlyase durch sulfatierte Hyaluronsäure

0,1 mg einer gereinigten Hyaluronidase aus Streptococcus agalactiae mit einer spezifischen Aktivität von 250 000 IE/mg werden in 1 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer pH = 6,0 gelöst. Die Aktivität dieser Lösung wird durch Trübungsmessung bestimmt. Dafür wurden 0,05 ml Enzymlösung geometrisch mit 0,05 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer pH = 6,0 verdünnt. Diesen Verdünnungen wurden jeweils 0,05 ml einer Hyaluronsäurelösung zugesetzt, die 0,2 mg Hyaluronsäure/ml destilliertes Wasser enthält. Dieses Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden jeder Verdünnung 0,2 ml einer 2,5%-igen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid in 2%-iger Natronlauge (CTA-Lösung) zugesetzt. Nach 20 Minuten wird die entstehende Trübung bei 600 nm vermessen. 1 IE entspricht der Hyaluronidaseaktivität, die 0,03 µg Hyaluronsäure/min abbaut. Zur Inhibierung wurde sulfatierte Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Von dieser Lösung wurde eine geometrische Verdünnungsreihe angelegt. Dieser Verdünnungsreihe wurden jeweils Probenmengen von 0,01 ml entnommen und den jeweiligen geometrischen Verdün nungsstufen der Enzymlösung zugesetzt. Nach der Zugabe wurde für 10 Minuten inkubiert und anschließend die Hyaluronsäuresubstratlösung hinzugesetzt und die Enzymbestimmung in der oben beschriebenen Weise weitergeführt. Als Vergleichsprobe wurden 0,05 ml Natriumacetatpuffer pH = 6,0 mit 0,01 ml sulfatierter Hyaluronsäurelösung des entspre chenden Verdünnungsgrades, 0,05 ml Hyaluronsäuresubstratlösung und 0,2 ml CTA- Lösung gemischt und bei 600 nm vermessen.

Durch Zugabe der sulfatierten Hyaluronsäure kommt es zu einer Inhibierung der Hyaluroni daseaktivität wie in Abb. 1 gezeigt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von sulfatierter Hyaluronsäure durch Sulfatierung von Hyaluronsäure, dadurch gekennzeichnet, daß Hyaluronsäure oder ein Alkalimetallsalz davon in die Ammoniumverbindung derselben überführt wird, welche in dipolar aprotischen Lösungsmitteln löslich ist, und die erhältliche Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure mit dem Schwefeltrioxid/Dimethylformamid-Komplex als Sulfatierungsreagens sulfatiert wird, wobei der Sulfatierungsgrad DS (degree of sulfatation) größer als 3,5 ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Überführung in die Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure mit einem Amin, ausgewählt aus der Gruppe Trialkylamin, Triarylamin oder cyclisches Amin, oder mit einem quarternären Tetralkylammoniumsalz erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure erhalten wird, indem man mittels eines Ionenaustauschers (H-Form) ein Alkalimetallsalz der Hyaluronsäure in deren Säureform überführt und diese mit dem Amin umsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumverbindung der Hyaluronsäure erhalten wird, indem man eine wässrige Lösung eines Alkalimetallsalzes der Hyaluronsäure mit einer wässrigen Amin-Lösung bis zu einem pH-Wert von ca. 9 bei einer Temperatur zwischen 25 und 60°C und einer Reaktionszeit zwischen 15 und 60 min umsetzt und anschließend die Reaktionslösung gegen Wasser dialysiert und gefriertrocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfatierung bei einer Temperatur zwischen 0°C und 60°C in einem Zeitraum von 4 bis 24 h durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis zwischen einer OH-Gruppe der Disaccharideinheit der Hyaluronsäure und dem Sulfatierungsreagens zwischen 1 : 1 und 1 : 30 gewählt wird.