DE19802905A1 - Verfahren zur bevorzugten Herstellung nur eines Stranges selektierten Genmaterials für massenspektrometrische Messungen - Google Patents
Verfahren zur bevorzugten Herstellung nur eines Stranges selektierten Genmaterials für massenspektrometrische MessungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung und selektiven, enzymatischen Verviel
fältigung von Genmaterial, beispielsweise von Desoxy-Ribo-Nukleinsäure (DNA) aus Bioma
terial durch PCR (polymerase chain reaction), für die massenspektrometrische Analyse zur
Feststellung bestimmter genetischer Merkmale im Biomaterial, vorzugsweise in Flugzeit
massenspektrometern (TOF) mit matrixunterstützter Laser-Desorption und -Ionisierung
(MALDI).
Die Erfindung besteht darin, nur einen Strang eines Abschnitts des doppelsträngigen Genmate
rials in einem enzymatischen Verfahren bevorzugt zu vervielfältigen, indem in herkömmlicher
Art mit einem Erst-Primerpaar genügend viele Zyklen mit exponentieller Vervielfältigung bei
der Stränge durchlaufen werden, wonach durch Zugabe eines einzigen Zweit-Primers in hohem
Überschuß in weiteren Zyklen im wesentlichen eine lineare Vervielfältigung des durch den
Zweit-Primer ausgewählten Einzelstrangs vorgenommen wird. Der Zweit-Primer kann, muß
aber nicht mit einem der Erst-Primer identisch sein. Die Erst-Primer können dabei durch weite
re Zugaben blockiert werden.
Das "genetische Fingerabdruckverfahren" ("DNA fingerprinting" oder "DNA typing") revolu
tioniert zur Zeit die individuelle Identifizierung und die Charakterisierung der Erbanlagen
(einschließlich der Anlagen zu Krankheiten) von Menschen, Tieren und Pflanzen. Es beruht
letztendlich auf der Molekulargewichtsbestimmung selektiv vervielfältigter, hochvariabler
DNA-Segmente ("hypervariable DNA regions", "polymorphic DNA segments"), beispielsweise
sogenannter Mikrosatelliten (oder auch STR genannt = short tandem repeats), die aus einer
variierenden Zahl von Wiederholungen einer kleinen Sequenz von zwei bis fünf Nukleotiden
bestehen, aber auch anderer polymorpher Formen, wie zum Beispiel die der 2-alleligen Poly
morphismen, die auf Punktmutationen beruhen. Die Messung der Molekulargewichte geschieht
zur Zeit noch durch das langsame und nicht voll automatisierbare Verfahren der Polyacryl
amid-Gelelektrophorese (abgekürzt PAGE). Alle diese Arten der Genotypisierung können aber
wesentlich besser und genauer durch massenspektrometrische Messungen der Molekularge
wichte angegangen werden, wobei für die letztere Art der Polymorphismen besondere Arten
der Probenvorbereitung (beispielsweise mit einem mutationsabhängigen Zerschneiden der
DNA oder mit einer sogenannten Primer-Extention unter Weglassen einer der vier Triphos
phatnukleotide in der PCR-Reaktionslösung) erforderlich sind.
Die Medizin kennt heute weit über 6000 monogene Krankheiten, die auf solche mutierten Ver
änderungen einzelner Gene zurückzuführen sind, die noch weiter verbreiteten polygenen
Krankheiten sind noch weitgehend unerforscht. Es steht zu erwarten, daß wir in fünf Jahren
alle Gene kennen, in zehn Jahren alle Mutationen. Es sind heute für den Menschen bereits etwa
10000 Mikrosatelliten bekannt, es ist zu erwarten, daß es mehr als zehnmal so viele gibt.
Die DNA besteht bekanntlich aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechselnden
Nukleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilden. Die Nukleotide bestehen jeweils
aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe und einer Base. Je zwei Basen sind
zueinander komplementar. Zucker und Phosphorsäure bilden die fortlaufende Kette der DNA
(oder das sogenannte Rückgrat), die vier charatcteristischen Basen sind jeweils seitliche Ab
zweigungen; sie sind n-glycosidisch an der Zuckergruppe befestigt. Die beiden komplementä
ren Ketten der DNA sind in Form einer Doppelhelix angeordnet, wobei jeweils zwei komple
mentare Nukleotide über zwei oder drei Wasserstoffbrücken zwischen den Basen miteinander
verbunden sind.
Grundlage des Fingerprint-Analysenverfähren ist die selektiv arbeitende PCR ("polymerase
chain reaction"), eine einfache Vervielfaltigungsmethode für gezielt aussuchbare DNA-Stücke
im Reagenzglas, die erst 1983 von K. B. Mullis (dafür Nobelpreis 1993) entwickelt wurde und
nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen einen beispiellosen Siegeszug durch die
genetischen Laboratorien angetreten hat.
Ähnliche enzymatische Amplifikationsverfähren (in-vitro-Transkription) gibt es heute auch für
die RNA (Ribo-Nukleinsäure).
Die heute durch diese Verfahren ausführbar gewordenen gelelektrophoretischen Analysen ge
ringster Anfangsmengen von DNA werden in sogenannten Sequenzern auf Basis des oben er
wähnten PAGE-Verfahrens durchgeführt. Dieser Art von Analyse wird jedoch von Fachleuten
keine Zukunft vorhergesagt, da sie sich durch häufig auftretende, verschiedenartige Artefakte
einer oft versuchten Automatisierung immer wieder entzieht und daher sehr personalaufwendig
ist. Außerdem ist sie langsam und durch einen relativ hohen Verbrauch an Reagenzien auch
recht teuer. Dieses Verfahren war eine Pioniermethode, erweist sich aber zunehmend als Eng
paß für die weitere Verbreiterung der Methode.
Ein vielversprechendes Verfahren ist die Kapiliarelektrophorese mit einer Vielzahl von Kapilla
ren, das gerade in einer ersten kommerziellen Version auf den Markt kommt. Bislang waren
solche Geräte mit nur einer einzigen Kapillare erhältlich.
Es ist zu erwarten, daß massenspektrometrische Messungen des Molekulargewichts mit weit
höheren Geschwindigkeiten und höherer Zuverlässigkeit möglich sein werden als die Bestim
mung der Mobilität mit der Gelektrophorese oder Kapillarelektrophorese. Der gegenwärtig
rasche Fortschritt in der MALDI-Technik führt zu hohem Automatisierungsgrad der Proben
ionisierung und zu kurzen Analysenzeiten pro Probe. Es werden damit Molekulargewichtsbe
stimmungen auch sehr großer Analytmoleküle in Mengen von einigen hundert Attomol in
Meßdauern von wenigen Sekunden möglich. Auf einem Probenträger können viele Tausende
von Proben untergebracht werden. Die Automatisierung und die hohe Dichte an Proben eröff
nen mit der massenspektrometrischen Analyse die Möglichkeit zu einer massiv-parallelen Ver
arbeitung von einigen zehntausend Proben pro Tag.
MALDI (matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung) ist ein Ionisationsverfahren für
großmolekulare Analytsubstanzen auf Oberflächen. Die Analytsubstanzen werden zusammen
mit geeigneten Matrixsubstanzen eines relativ zu den Analytmolekülen kleinen Molekularge
wichts in Lösung auf eine Oberfläche gebracht, dort eingetrocknet und mit einem Laserpuls
von wenigen Nanosekunden Dauer bestrahlt. Es verdampft eine geringe Menge an Matrixsub
stanz, einige Moleküle davon als Ionen. Die in der Matrix sehr verdünnte Analytsubstanz, de
ren Moleküle in der Verdünnung vereinzelt sind, wird dabei mit verdampft, auch wenn ihr
Dampfdruck normalerweise für eine Verdampfung nicht ausreicht. Die relativ kleinen Ionen der
Matrixsubstanz reagieren mit den großen Molekülen der Analytsubstanz mit der Folge, daß die
Analytsubstanzmoleküle durch Protonenübergang als Ionen zurückbleiben. Doppelstrangige
DNA (dsDNA) wird dabei in der sauren Matrix zu einsträngiger DNA (ssDNA) reduziert.
Massenspektrometer mit MALDI- oder ESI-Techhik (ESI = Elektrosprüh-Ionisierung) werden
bereits für die Sequenzierung der DNA nach dem Sanger-Schema unter Benutzung von
PCR-Verfahren eingesetzt, siehe dazu PCT/US 94/00193.
Einen Überblick über den Stand massenspektrometrischer DNA-Analysen gibt der Artikel
"Analysis of Polymerase Chaln Reaction-Amplified DNA Products by Mass Spectrometry
Using Matrix-Assisted Laser Desorption and Electrospray: Current Status" by M. J. Doktycz
et al., Analytical Biochemistry 230, 205-214 (1995).
PCR ist die gezielte Vervielfaltigung eines genau ausgesuchten Stückes der zweisträngigen
DNA. Die Auswahl des DNA-Segments erfolgt durch ein Paar von sogenannten Primern,
zweier ssDNA-Stücke mit je etwa 20 Basen Länge, die (etwas verkürzt und vereinfacht be
schrieben) an beiden Seiten (den zukünftigen Enden) des ausgesuchten DNA-Stückes hybridi
sieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch ein Enzym namens Polymerase, das eine chemische
Fabrik in einem Molekül darstellt, in einem einfachen Temperaturzyklus. Die PCR-Reaktion
läuft in wäßriger Lösung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs-DNA und genügende
Mengen an Polymerase, Primern, Nukleinsäuren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem
Temperaturzyklus (beispielsweise Aufschmelzen der Doppelhelix bei 92°C, Hybridisieren der
Primer bei 55°C, Wiedervervollstandigung zu einer Doppelhelix durch Anbau neuer DNA-
Glieder durch die Polymerase bei 72°C) wird das ausgewählte DNA-Segment im Prinzip ver
doppelt. In 30 Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang der DNA als Ausgangsma
terial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt (In strenger Beschreibung hybridisieren die
beiden Primer auf den beiden verschiedenen Einzelsträngen der DNA und die Verkürzung auf
das ausgewählte DNA-Segment von einem Primer zum anderen tritt erst statistisch bei weite
rem Vervielfachen auf).
Die Polymerase kann unter optimalen Bedingungen etwa 500 bis 1000 Basen pro Sekunde an
den Primer anbauen. Bei genügendem Überschuß an Primern, Polymerase und Substraten
hängt die Zykluszeit praktisch nur von der Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit ab, die wie
derum vom Flüssigkeitvolumen, Gefäßvolumen, Wärmeleitfähigkeit u. a. abhängt. Auf jeder
Temperaturstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden vonnöten.
Die Primer werden Teil der vervielfältigten DNA-Segmente, sie verbrauchen sich auf diese
Weise während der PCR-Vervielfältigung. Andererseits ist das von Vorteil: an den künstlich
hergestellten Primern lassen sich beispielsweise chemische Gruppen anbauen, die für die späte
re Detektion benutzt werden können (wie etwa fluoreszierende oder besonders gut ionisieren
de Gruppen).
Durch die Zugabe nur eines Primerpaares lassen sich uniforme DNA-Segmente vervielfachen.
Werden andererseits gleichzeitig mehrere verschiedenartige Primerpaare zugegeben, so werden
auch gleichzeitig mehrere uniforme DNA-Segmente vervielfältigt ("multiplexed PCR").
Diese Art der Multiplex-PCR wird häufig angewandt und hat oft besondere Vorteile. Für das
sogenannte "Fingerprinting" zur Identifizierung von Individuen durch DNA-Segmente varia
bler Länge (Methoden der "VNTR = Variable Number of Tandem Repeats" oder "AMP-FLP
= Amplified Fragment Length Polymorphism") macht es die Analysen schneller. Dabei kann
durch die Wahl der Primer, deren Abstand das mittlere Molekulargewicht der DNA-Segmente
bestimmt, erreicht werden, daß die Variationen der Molekulargewichte der durch die verschie
denen Primerpaare gebildeten DNA-Segmente sich nicht oder nur selten überlappen. Diese Art
der Multiplex-PCR bedingt einen Analysator, der zur gleichzeitigen Messung eines großen
Bereichs der Molekulargewichte fähig ist.
Besondere Vorteile hat das Verfahren beispielsweise zur Identifizierung von infektiösen Lebe
wesen, da gleichzeitig bis zu 20 Bakteriensorten (oder Viren, Hefen, Pilze) mit einer einzigen
PCR-Vervielfältigung nachgewiesen werden können.
Die Massenspektrometrie als Meßmethode für die Größe der vervielfältigten DNA-Segmente
hat beträchtliche Vorteile: es wird nicht die Ionenmobilität in Flüssigkeit oder polymerisiertem
Gel gemessen, sondern direkt die Masse der Ionen. Die Ionenmobilität hängt in kritischer Wei
se von Formfaktoren ab und es kann daher vorkommen, daß die (manchmal zufällig angenom
mene) Faltungsstruktur der Moleküle eine Verfälschung der Messungen ergibt. Aber auch der
(manchmal zufällig abweichende) Polymerisierungsgrad des Gels beeinflußt die Wanderungs
geschwindigkeit der DNA-Segmente, so daß es häufig zu Artefakten kommt.
Mit diesen Arten von Artefakten ist in der Massenspektrometrie nicht zu rechnen. Die Massen
spektrometrie bietet darüberhinaus prinzipiell eine höhere Genauigkeit der Massenbestimmung.
Aber auch die massenspektrometrische Messung der Massen der DNA-Segmente unterliegt
Einschränkungen. Die Messung der DNA allgemein und insbesondere die Genauigkeit der
Massenbestimmung ist besonders durch drei Effekte beeinflußt: (1) Adduktbildung durch ubi
quitäre Na- oder K-Ionen, die sich in zufalligen Mengen an die DNA-Segmente anlagern,
(2) die Bildung von Doppelpeaks durch verschiedene Massen der beiden DNA-Einzelstränge
und (3) die Fragmentierung der zu messenden ssDNA-Segmente während des MALDI-Pro
zesses, meist durch Abspalten der Basen während der Ionisierung. Alle drei Effekte führen zu
einer Verschmierung der Peaks: Adduktbildung zu höheren Massen hin, Fragmentierung zu
niedrigeren Massen, und die Doppelpeakbildung zu einer oft nicht mehr als Doppelpeak er
kennbaren Verbreiterung. Im hohen Massenbereich wirken diese Effekte so, daß nicht mehr auf
ein Nukleotid genau gemessen werden kann. Die massenspektrometrische DNA-Analyse ist
daher heute auf Längen der DNA von etwa 40 bis 60 Basen beschränkt, wenn nicht besondere
Maßnahmen zur Verbesserung der Messungen ergriffen werden.
Für die Massenspektrometrie ist es aber auch aus Gründen der Massenbestimmungsgenauigkeit
wesentlich, mit möglichst geringen Molekulargewichten zu arbeiten, also möglichst nur mit
Einzelsträngen der DNA. Beim MALDI-Verfahren werden glücklicherweise automatisch nur
Einzelstränge gemessen: entweder werden durch das Zugeben der in der Regel sehr saure Ma
trixlösung die verbliebenen DNA-Doppelstränge (oder durch Anlagerung von Primern entstan
denen Teil-Doppelstränge) praktisch vollstandig getrennt, oder die Trennung erfolgt im
MALDI-Prozeß selbst Dadurch aber gibt es das erwähnte Problem der Doppelpeaks.
Im PCT-Patent PCT/GB 96/00476 (WO 96/27681) ist eine Methode beschrieben, wie man
DNA-Analoge herstellen kann, die für den MALDI-Prozeß wesentlich besser geeignet sind. Es
lassen sich für die MALDI-Massenspektrometrie in die Primer elektrisch geladene Gruppen
einbauen, die den MALDI-Prozeß der Ionisierung so unterstützen, daß eine sehr hohe Ionen
ausbeute und damit eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird. Anderseits lassen sich die negati
ven Gruppen des DNA-Rückgrats neutralisieren, was sowohl für eine bessere Stabilität sorgt,
als auch besonders die Adduktbildung unterdrückt.
Diese Methode läßt sich besonders gut und fehlerfrei nur ausführen, wenn eine Zweischritt-
PCR angewandt wird, wobei nach anfänglich herkömmlicher PCR-Vervielfältigung ein Schritt
folgt, in dem modifizierte Primer und modifizierte Substrate (Triphosphatnukleotide) einge
setzt werden. Dabei wird gleichzeitig auch die Selektion eines einzigen DNA-Stranges vorge
nommen. Das erfordert aber zwischen den beiden Schritten eine zwischenzeitliche Bindung der
DNA an eine Oberfläche, um die PCR-Reaktionslösung auswaschen und durch eine neue er
setzen zu können. Diese Methode liefert dabei automatisch nur einen der beiden Stränge der
DNA; sie erfordert aber einen besonderen Aufwand, und läßt sich zudem nicht einfach in her
kömmlichen Pipettierrobotern automatisieren.
Andererseits gibt es alternative Methoden zur Unterdrückung der Adduktbildung durch beson
dere Methoden der automatischen Aufreinigung der vervielfältigten Produkte (beispielsweise
automatisierte Reinigung von allen Salzen in Pipettenspitzen von Pipettierrobotern), und be
sondere Präparationsmethoden der MALDI-Trägerplatten zur Unterdrückung der Adduktbil
dung.
Für die Stabilisierung der ssDNA gegen Verlust der Basen sind auch bereits Maßnahmen be
kannt, wie beispielsweise die Verwendung von Deaza-Nukleotidtriphosphaten.
Damit bleibt häufig die Bildung der Doppelpeaks durch die beiden Stränge der DNA das stö
rendste Element der massenspektrometrischen DNA-Analyse in bezug auf eine präzise Mas
senbestimmung. Die Nukleotide der DNA besitzen unterschiedliche Massen, die Massendiffe
renzen zwischen den vier Nukleotiden betragen jeweils 9 bis 20 atomaren Masseneinheiten. Die
statistische Verteilung der vier Nukleotide auf die beiden Einzelstränge bewirkt, daß die beiden
Einzelstränge in aller Regel unterschiedliche Massen aufweisen. Nur in extrem seltenen Fällen
sind beide Einzelstrange genau gleich schwer.
Für die massenspektrometrische Analyse ist es daher hinderlich, daß bei der DNA-Verviel
fältigung durch die PCR immer beide Einzelstränge der DNA im gleichen Maße erzeugt wer
den. Es entsteht im Massenspektrum praktisch immer ein Doppelpeak, dessen Abstand zwi
schen beiden Peaks von Analysenaufgabe zu Analysenaufgabe schwankt Wegen der zusätzli
chen Verbreiterung beider Peaks durch die Isotopenverteilung ergibt sich ein Massenspektrum,
das nicht sehr bequem auszuwerten ist. Es ist daher bei der Verwendung der Massenspektro
metrie ein wünschenswertes Ziel, DNA-Analysen mit nur einem der beiden Einzelstränge aus
führen zu können. Eine dieser Möglichkeiten ist in der bereits oben erwähnten Patentschrift
WO 96/27681 angegeben, nachteilig ist dabei jedoch - wie ebenfalls erwähnt - der Zwang zur
intermediären Befestigung der DNA-Segmente an einer Oberfläche, die den Arbeitseigenschaf
ten der Pipettierroboter, die systeminhärent nur mit Flüssigkeiten arbeiten, entgegensteht.
In der Biochemie und der Molekulargenetik haben sich für die parallele (synchrone) Verarbei
tung vieler Proben sogenannte Mikrotiterplatten durchgesetzt. Es gibt bereits heute kommer
ziell erhältliche Probenvorbereitungssysteme (Pipettierroboter), die mit Mikrotiterplatten arbei
ten. Diese enthielten ursprünglich auf einer nutzbaren Fläche von 72 mal 108 Millimeter 96
kleine Reaktionsgefäße in einem 9-mm-Raster. Heute haben sich Platten der gleichen Größe
mit 384 fest im Kunststoff eingelassenen Reaktionsgefäßen im 4,5-mm-Raster durchgesetzt.
Platten mit 1536 Reaktionsgefäßen im 2,25-mm-Raster sind im Kommen, und noch viel höhere
Dichten sind in Diskussion.
Die häufig "massiv-parallel" genannte Verarbeitung von Proben, beispielsweise in der moleku
laren Genetik, besteht nun einerseits darin, nicht nur mit einer einzigen solchen Mikrotiterplatte
zu arbeiten, sondern mit einer großen Anzahl solcher Platten parallel. Beispielsweise können
bei gleichzeitiger Behandlung von 120 solcher 384er-Platten in einer einzigen PCR-Apparatur
mehr als 46 000 DNA-Proben gleichzeitig in einer Zeit von etwa 3 Stunden jeweils milliarden
fach vervielfältigt werden. Kommerziell erhältlich sind PCR-Automaten, die mit vier Mikroti
terplatten parallel arbeiten und die 30 PCR-Zyklen in weniger als drei Stunden abarbeiten. Sie
lassen sich einfach in Pipettierroboter integrieren. Beim Übergang zu bereits erhältlichen
1536er-Platten würden sich im rund-um-die-Uhr-Betrieb rund 50 000 Proben täglich verarbei
ten lassen.
Andererseits ist zu erwarten, daß sich die PCR-Zeit für eine Vermilliardenfachung mit miniatu
risierten Reaktionssystemen in naher Zukunft auf weniger als 10 Minuten reduzieren wird, wo
bei sich durch die Verkleinerung der Reaktionssysteme auf wenige Mikroliter Inhalt mehr als
Tausend solcher Reaktionsysteme auf der Fläche einer heutigen Mikrotiterplatte unterbringen
lassen. Die Einführung der Mikrosystemtechnik kann zu weiterer Verkleinerung führen. Die
synchrone Übertragung aller Proben aus diesen Mikroreaktoren auf MALDI-Trägerplatten
wird folgen.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein möglichst einfach und in kommerziell hergestellten Pipet
tierrobotern automatisiert durchführbares Verfahren zur Amplifikation von zweisträngigem
Genmaterial zu finden, mit dem sich ausreichende Mengen fehlerfrei amplifizierter Segmente
nur eines Stranges des Genmaterials für die massenspektrometrische Analyse herstellen lassen.
Das Verfahren soll in einfacher Weise in Mikrotiterplatten ausführbar sein, ohne daß in den
Platten Oberflächenfixierung des Genmaterials und schlecht durchführbare Waschvorgänge
erforderlich sind. Es sind weitere Aufgabe der Erfindung, die einstrangigen Segmente zu stabi
lisieren und mit einer eingebauter Ladung für einen hochempfindlichen Ionisierungsprozeß zu
versehen.
Die Erfindung wird hier am Beispiel der Amplifikation von DNA durch die Polymerase-Ketten
reaktion (PCR) dargestellt, soll aber prinzipiell für alle enzymatisch gesteuerten Amplifikati
onsverfahren von Genmaterial gelten.
Es ist die Grundidee der Erfindung, zunächst eine Phase mit Zyklen einer exponentiellen PCR-
Amplifikation der DNA-Segmente mit einem ersten Paar von Primern ("Erst-Primer") durchzu
führen, dann durch Zugabe eines Zweit-Primers im großen Überschuß und durch Änderung der
PCR-Bedingungen zu einer Phase mit Zyklen einer im wesentlichen linear verlaufenden
PCR-Amplifikation überzugehen, in der im wesentlichen nur noch ein ausgesuchter Strang der
DNA-Segmente weiter vervielfältigt wird. Diese lineare Amplifikation wird solange fortge
setzt, bis der selektierte Einzelstrang genügend Überschuß über den anderen Einzelstrang
zeigt, um sich in der nachfolgenden massenspektrometrischen Spektrennahme (beispielsweise
mit MALDI-Ionisierung) genügend herauszuheben. Dabei kann entweder mit nativen Nukleo
tidtriphosphaten, aber auch vorteilhafterweise bereits mit stabilisierenden Modifikationen wie
Diaza-Verbindungen gearbeitet werden.
Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß er sich in kommerziell hergestellten Pipettierau
tomaten bisheriger Konstruktion mit angeschlossenen PCR-Automaten vollkommen automa
tisch durchführen läßt. Es sind keine komplizierenden Vorgänge wie Oberflächenfixierung und
Waschen, die den Arbeitseigenschalten der Pipettierroboter entgegenstehen, erforderlich. Der
PCR-Automat wird allerdings zweimal in Anspruch genommen, einmal für die exponentielle
Amplifizierung und einmal für die lineare.
Der im Überschuß zugegebene Zweit-Primer kann einer der Erst-Primer des ursprünglichen
Erst-Primerpaares sein, aber auch ein neuer Zweit-Primer, dessen Ansatzpunkt zum Inneren
des DNA-Segmentes hin verschoben ist ("nested primer"). Dadurch wird das linear zu amplifi
zierende DNA-Segment gegenüber dem ursprünglich exponentiell vervielfaltigten Segment
verkürzt, so daß es sich auch massenmäßig von den ursprünglich durch die Erst-Primer verviel
fältigten DNA-Segmenten abhebt.
Das Ablagern aller Primer (Hybridisierung oder englisch auch "annealing" genannt) geschieht
in der Zyklusphase niedrigster Temperatur, etwa zwischen 50 und 60°C. In dieser Zyklusphase
können entweder die in der Zyklusphase des Schmelzens abgetrennten Gegenstränge (unter
Rekonstruktion der Doppelhelix) angelagert werden, oder die alten Erst-Primer der exponen
tiellen Vervielfältigung, oder der neu im Überschuß zugegebene Zweit-Primer. Es hängt dabei
primär von der Konzentration ab, welche Arten von DNA-Stücken in welchen Prozentzahlen
angelagert werden. In zweiter Linie spielt auch die Größe der anzulagernden DNA-Stücke eine
Rolle, da sie die Diffusionsgeschwindigkeit und damit die Geschwindigkeit der Zuwanderung
bestimmen. Die großen DNA-Gegeneinzelstrange sind hier per se im Nachteil. Drittens geht
die Hybridisierungstemperatur in die Verhältnisse der Anlagerung ein, wenn auch nur sehr
schwach. Höhere Temperaturen erhöhen die Diffusionsgeschwindigkeit, verringern aber die
Bindungskräfte der Wasserstoffbrücken, die die Anlagerung bewirken.
Der Prozeß der Anlagerung selbst folgt einer Funktion (1-e-k(T,c)*t), wobei t die Zeit bedeutet,
und k(T,c) die Reaktionskonstante, die wiederum von der Temperatur T und der Konzentration
c abhängt. Durch Wahl insbesondere der Hybridisierungsgesamtzeit t (abhängig von der ge
wählten Hybridisierungstemperatur T) und der Konzentration czweit des Zweit-Primers gegen
über der Konzentration cerst des Erst-Primers kann man es erreichen, daß die Hybridisierung
der ausgewählten DNA-Stränge mit den neuen Zweit-Primern zu einem hohen Prozentsatz
abgeschlossen werden kann, während die Hybridisierung der Gegenstränge mit den alten Erst-
Primern (und die Hybridisierung mit den Gegensträngen) nur zu einem verschwindend kleinen
Teil erfolgt. Dadurch werden in der Zyklusphase des Wiederaufbaus praktisch nur die neuen
Zweit-Primer ergänzt. Wiederholt man jetzt den Zyklus Schmelzen/Hybridisierung/Wiederauf
bau etwa 30mal, so hat der durch den Zweit-Primer erzeugten Einzelstrang eine Konzentrati
on, die etwa 20- bis 25mal so hoch ist wie die der beiden durch den Erst-Primer erhaltenen
Stränge.
Man kann dabei auch den Effekt ausnutzen, daß sich das Erst-Primerpaar während der expo
nentiellen Vervielfältigungsphase verbraucht. Wählt man die ursprüngliche Konzentration des
Erst-Primerpaares nicht sehr hoch, so wird dieser Verbrauch merklich, doch vermindert man
dabei die Effektivität der PCR sehr stark. Dieses Verfahren ist daher kaum zu empfehlen.
Man kann aber den Erst-Primer für die Amplifizierung des nicht erwünschten Gegenstranges
durch einen weitere Idee dieser Erfindung weitgehend unwirksam machen. Dazu gibt man,
zusammen mit dem Überschuß an neuem Zweit-Primer, auch einen Blockade-Primer im Über
schuß hinzu. Dieser kann beispielsweise ein DNA-Gegenstrang des alten Erst-Primers sein. Es
erfolgt dann ganz vorzugsweise eine Hybridisierung des Erst-Primers mit seinem Blockade-
Primer, wodurch die Hybridisierung des unerwünschten DNA-Gegenstrangs wegen der extre
men Verarmung an Erst-Primern weitgehend unterbleibt.
Dieser Blockade-Primer wird sich auch an den weiter zu vervielfältigen ausgewählten DNA-
Einzelstrang anhybridisieren. Dieser Vorgang kann, je nach Art und Ausbildung des Endes des
Blockade-Primers, die Erneuerung des Gegenstranges durch die Polymerase bei Erreichen des
Blockade-Primers stoppen. Normale DNA-Primer werden durch die Polymerase beim Wieder
aufbau entfernt und vertrieben; aber besondere Arten von Primern, beispielsweise solche mit
einer Amonsäurekette als Rückgrat, an denen die Basen befestigt sind, haften so fest, daß der
Wiederaufbau hier stoppt. Dieser Effekt kann wiederum in positivem Sinn ausgenutzt werden,
um den vervielfältigten Einzelstrang auf den wirklich effektiv massenspektrometrisch zu mes
senden Teil zu verkürzen.
Es ist eine weitere Idee der Erfindung, den Zweit-Primer mit einer gut ionisierenden Gruppe zu
versehen. Als solche Gruppe kann eine quaternäre Ammoniumgruppe dienen. Diese Gruppe ist
sehr leicht positiv zu ionisieren. Sie erhöht deshalb die MALDI-Ausbeute für diese Ionen und
damit die Empfindlichkeit. Da sich diese Empfindlichkeitserhöhung wiederum nur auf den ge
wünschten Einzelstrang bezieht, wird die Unterdrückung von Doppelpeaks hierdurch weiter
unterstützt.
Das Verfahren wird hier am Beispiel der PCR-Amplifikation von DNA gezeigt, soll aber nicht
auf dieses Verfahren oder Material beschränkt sein. Es kann sich beispielsweise auch um eine
enzymatische Vervielfältigung von RNA handeln, oder um eine der vielen anderen enzymati
schen Amplifikationsmethoden für Genmaterial.
Das Verfahren der DNA-PCR wird insbesondere für das sogenannte "Fingerprinting" einge
setzt, bei dem sogenannte Mikrosatelliten variabler Länge oder STR (short tandem repeats)
gemessen werden. Deren Länge läßt sich leicht über eine massenspektrometrische Molekular
gewichtsbestimmung bestimmen. Als Primer werden Kopien aus beidseitig anschließenden
DNA-Regionen geringer Variabilität benutzt.
In einem besonders bevorzugten Verfahren werden zunächst in üblicher Weise aus der ausge
lösten DNA einer Bioprobe mit mindestens 10 bis höchstens 1000 Zellen (beispielsweise etwa
100 Zellen aus einer Haarwurzel) durch jeweilige Verdoppelung in 26 PCR-Zyklen etwa 600
Millionen bis 60 Milliarden DNA-Segmente gebildet, das entspricht etwa 10 bis 1000 Femto
mol an DNA-Segmenten. Die Primer haben normalerweise Längen von etwa 20 Basen. Es
werden zur späteren Stabilisierung während der MALDI-Ionisierung Diaza-Nukleotidtriphos
phate benutzt.
Nach diesen 26 Zyklen wird der Lösung direkt nach dem Schmelzen bei 90°C, in der sich die
DNA möglichst noch bei hoher Temperatur (zwischen 90 und 70°C) im Einzelstrangzustand
befindet, der Zweit-Primer zugegeben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Zweit-Primer nicht mit einem der
Erst-Primer identisch. Sein Startpunkt ist um etwa 4 Basen verschoben und er ist auf etwa 10
Basen Länge verkürzt. Dadurch wird einerseits das durch ihn erzeugte Produkt um etwa 1000
atomare Masseneinheiten leichter (und dadurch im Massenspektrum deutlich erkennbar), und
andererseits die Hybridisierungsgeschwindigkeit beträchtlich erhöht. Zusammen mit einem et
wa 10-fachen Konzentrationsüberschuß über die Erst-Primer kann so erreicht werden, daß
nach einer beschränkten Hybridisierungszeit 95 Prozent der DNA-Segmente mit dem Zweit-
Primer und nur 5 Prozent mit dem Erst-Primer hybridisiert werden. Dadurch werden 95 Pro
zent der gewünschten Einzelstränge erzeugt, gemessen an den schon gebildeten DNA-
Segmenten. In den nachfolgenden Zyklen findet durch die 5-prozentige exponentielle Erhö
hung beider Stränge noch ein leichtes Wachstum beider Stränge statt, jedesmal werden aber 95
Prozent Einzelstränge der erwünschten Art erzeugt.
Die Ionisierungswahrscheinlichkeit im MALDI-Prozeß kann dabei für den gewünschten Einzel
strang noch erhöht werden, indem dem Zweit-Primer eine chemische Gruppe mit einer positi
ven Ladung ("charge tag") angehängt wird, wie in PCT/GB 96/00476 beschrieben, beispiels
weise eine quaternare Ammonium-Gruppe.
Der Zweit-Primer kann natürlich auch mit einem der beiden Erst-Primer identisch sein. Es ent
steht dann immer noch ein Doppelpeak, aber der Peak des gewünschten Einzelstrangs ist be
trächtlich höher. Der andere Peak erscheint nur noch als eine Art Ausläufer des Hauptpeaks.
Der leichte exponentielle Anstieg der Konzentration beider Einzelstränge kann dadurch wirk
sam unterdrückt werden, daß ein Blockade-Primer zugegeben wird, der einen Gegenstrang zu
dem nicht mehr benötigten Erst-Primer bildet. Dieser im Überschuß zugegebene DNA-Strang
hybridisiert mit dem Erst-Primer und blockiert ihn; er kann dann nicht mehr mit den vervielfäl
tigten DNA-Segmenten hybridisieren. Dieser Blockade-Primer hybridisiert aber auch an das
Ende derjenigen Einzelstränge an, die zur Herstellung der gewünschten Einzelstränge für die
massenspektrometrische Analyse dienen. Wenn es sich um einen besonders fest haftenden
Blockade-Primer handelt, kann dadurch der Wiederaufbau der gewünschten Einzelstränge am
Beginn dieses Primers gestoppt werden. Ein solcher sehr fest haftender Blockade-Primer kann
beispielsweise als Aminosäurekette als Rückgrat mit entsprechend angebauten Basen herge
stellt werden. Dieser Blockade-Primer wird nicht mehr von der Polymerase entfernt und es
findet auch keine Verbindung zwischen dem wiederaufgebauten DNA-Strang und dem Bloc
kade-Primer statt. Die so für die massenspektrometrische Analyse erzeugten Einzelstränge sind
also um diesen Blockade-Primer kürzer: ein erwünschter Effekt für die Massenspektrometrie,
bei der die zu analysierenden DNA-Stücke ja so kurz wie möglich sein sollen. Die Länge des
Blockade-Primers interessiert in diesem Zusammenhang nicht, sie ist genau bekannt.
Das beschriebene Verfahren kann natürlich vielfältig variiert werden. So kann - wie jedem
Fachmann auf diesem Gebiet bekannt - auch anderes Genmaterial (beispielsweise RNA) en
zymatisch vervielfältigt und es können auch andere enzymatische Amplifikationsmethoden an
gewandt werden. Das hier wiedergegebene Prinzip läßt sich bei allen diesen Amplifikationsme
thoden anwenden.
Claims (8)
1. Verfahren für eine selektive, enzymatische Vervielfältigung von doppelsträngigem Gen
material (nach der Art der PCR für DNA-Proben) für die massenspektrometrische Analy
se, wobei die Selektivität durch Paare von Erst-Primern bestimmt wird,
dadurch gekennzeichnet,
daß in einem ersten Schritt die durch Paare von Erst-Primern ausgewählten Abschnitte beider Stränge des Genmaterials enzymatisch exponentiell vervielfältigt werden,
daß in einem zweiten Schritt paarlose Zweit-Primer zugegeben werden, die jeweils nur ei nen Strang der zwei zueinandergehörigen DNA-Abschnitte hybridisieren, in einer Konzen tration, die wesentlich über der der Frst-Primer liegt, so
daß im dritten Schritt bei der Fortführung der Amplifikations-Zyklen im wesentlichen nur noch eine lineare, einsträngige Vervielfältigung der durch die Zweit-Primer ausgewählten Einzelstränge stattfindet.
daß in einem ersten Schritt die durch Paare von Erst-Primern ausgewählten Abschnitte beider Stränge des Genmaterials enzymatisch exponentiell vervielfältigt werden,
daß in einem zweiten Schritt paarlose Zweit-Primer zugegeben werden, die jeweils nur ei nen Strang der zwei zueinandergehörigen DNA-Abschnitte hybridisieren, in einer Konzen tration, die wesentlich über der der Frst-Primer liegt, so
daß im dritten Schritt bei der Fortführung der Amplifikations-Zyklen im wesentlichen nur noch eine lineare, einsträngige Vervielfältigung der durch die Zweit-Primer ausgewählten Einzelstränge stattfindet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Amplifikations-Zyklen
mit dem Zweit-Primer die Hybridisierungsbedingungen (Temperatur, Zeit, Konzentration)
so gewählt werden, daß bevorzugt nur die Zweit-Primer zur Hybridisierung gelangen.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der
Zweit-Primer mit einem der Erst-Primer eines Paares identisch ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zweit-
Primer mit einem der Erst-Primer teilidentisch, aber wesentlich kürzer ist, so daß die Ge
schwindigkeit der Hybridisierung mit diesem Zweit-Primer erhöht wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zweit-
Primer nicht mit einem der Erst-Primer identisch ist, sondern durch Verschiebung des
Startpunkt ins Innere der bisher erzeugten Genmaterial-Segmente einen kürzeren Gegen
strang erzeugt, der sich massenspektrometrisch gut von dem Doppelpeak der Genmate
rial-Segmente des Erst-Primers unterscheidet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für
die Amplifizierung modifizierte Nukleotidtriphosphate benutzt werden, wobei die Modifi
zierungen der Stabilierung der Basen im späteren MALDI-Prozeß dienen, wie beispiels
weise Diaza-Verbindungen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu
sätzlich zum Zweit-Primer auch ein Blockade-Primer zugegeben wird, der bevorzugt mit
den unerwünschten Erst-Primern hybridisiert und diese von weiterer Teilnahme an den
Amplifikationen ausschließt
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Blockade-Primer dazu be
nutzt wird, durch besonders feste Haftung bei der Hybridisierung an den linear zu verviel
faltigenden Genmaterial-Segmenten diese zu verkürzen.
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