DE19801120A1 - Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung - Google Patents
Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen
mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen, ein Gen
konstrukt enthaltend dieses Gen oder seine Homologen und dessen
Verwendung. Die Erfindung betrifft außerdem Vektoren oder
Organismen enthaltend ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen
mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Uracil auxotrophen Mikroorganismen sowie ein Verfahren zum
Einbringen von DNA in Uracil auxotrophe Mikroorganismen.
Vitamin B2, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier
essentiell. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund-
und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Haut
falten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, ver
minderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen
und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme
auftreten. Vitamin B2 hat daher wirtschaftliche Bedeutung ins
besondere als Vitaminzusatz bei Vitaminmangel und als Futter
mittelzusatz. Daneben wird es als Lebensmittelfarbstoff, bei
spielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. eingesetzt.
Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder
mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in:
Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim).
Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel
in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei
relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, ein
gesetzt werden müssen. Eine Alternative zur chemischen Synthese
von Riboflavin ist die Herstellung dieses Stoffes durch Mikro
organismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Roh
stoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von
Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii
oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et
al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie
z. B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B.
Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin-
Produzenten beschrieben.
In der DE 44 20 785 wurden sechs Riboflavin-Biosynthesegene aus
Ashbya gossypii beschrieben, sowie Mikroorganismen, die mit
diesen Genen transformiert wurden und die Verwendung solcher
Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese.
Bisher werden Gene über die Marker leu2 (Leucin-Auxotrophie),
thr4 (Threonin-Auxotrophie) oder kan (Kanamycin-Resistenz) in
pilzliche Riboflavinproduzenten wie Ashbya gossypii eingebracht
(WO 92/00379). In Hefen wird als weiterer Marker met15
(Methionin-Auxotrophie, Cost et al., Yeast, Vol. 12, 1996:
939-941) beschrieben. Von Nachteil bei diesen Marker ist, daß ent
weder die Transformationseffizienz sehr gering ist und/oder aber
zur Selektion ständig Antibiotika gegeben werden muß. In jedem
Fall ist jedoch eine Gegenselektion auf den Verlust des Markers
unter Erhalt der eingebrachten Gene im Mikroorganismen nicht oder
nur unter einem sehr hohen Aufwand möglich, so daß weitere Gene
mit diesen Markern in der Regel nicht mehr in die Mikroorganismen
eingebracht werden können. Es ist deshalb wünschenswert einen
Selektionsmarker, der eine hohe Transformationseffizienz auf
weist, leicht selektionierbar ist und eine Gegenselektion er
möglicht, zu haben.
Das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) aus
Saccharomyces cerevisiae ist einer der klassischen Marker, der
die gewünschten Eigenschaften besitzt und mit dessen Hilfe Gene
in Mikroorganismen wie Hefen und Pilze transformiert werden
können. In einer Reihe von Arbeiten wird die Isolierung art
spezifischer URA3-Gene bzw. die Isolierung des entsprechenden
Gens aus Pilzen (= pyrG) sowie deren Sequenzen aus Pichia
stipitis, Candida boidinii, Kluyveromyces marxianus, Yamadazyma
ohmeri, Candida maltosa, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Aspergillus nidulans, Mucor circinelloides, Phycomyces blakes
leeanus, Penicillium chrysogenum, und Aspergillus awamori be
schrieben (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 60, No. 12, 1994
4245-4254, Nucl. Acids Res., Vol. 18, No. 23, 1990: 7183,
J. Ferment. Bioeng., Vol. 73, No 4, 1992: 255-260, Yeast,
Vol. 9, 1993: 677-681, Yeast, Vol. 10, 1994: 1601-1612, Curr.
Genet., Vol. 23, 1993: 205-210, Nucl. Acids Res., Vol. 16,
No. 5, 1988: 2339, Curr. Genet., Vol. 16, 1989: 159-163, Gene,
Vol. 61, 1987: 385-399, Gene, Vol. 116, 1992: 59-67, Mol. Gen.
Genet., Vol. 224, 1990: 269-278, Nucl. Acids Res., Vol. 16,
No. 16, 1988: 8177, Nucl. Acids Res., Vol. 18, No. 23, 1990: 7183
und Curr. Genet., Vol. 27, 1995: 536-540).
Arbeiten von Rose et al. (Gene, Vol. 29, 1984: 113-124)
zeigten, daß das URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae sogar eine
entsprechende Mutation (pyrF-Gen = URA3) in Prokaryonten wie
Escherichia coli komplementieren kann und als Selektionsmarker
sinnvoll verwendet werden kann.
Bei genetischen Arbeiten zur Riboflavinsynthese von Ashbya
gossypii (Vitamin B2-Synthese) zeigte sich jedoch, daß das
URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder das pyrF-Gen aus
Escherichia coli keine Uracil auxotrophen Ashbya gossypii-Mutan
ten komplementieren können und deshalb diese Gene zur Klonierung
von Genen in Ashbya gossypii nicht verwendet werden kann.
Es wurde deshalb versucht, da daß dem URA3-Gen oder pyrF-Gen
entsprechende Gen aus Ashbya gossypii unbekannt ist, dies zu
klonieren. Versuche zur Klonierung des Ashbya-Gens nach den in
der Literatur beschriebenen Methoden über beispielsweise Hybridi
sierung mit URA3-Gen-Fragmenten oder über degenerierte Oligo
nukleotide auf Basis konservierter Aminosäuresequenzen verschie
dener Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasen und Screening einer
"cDNA-library" mit diesen Oligonukleotiden und der PCR-Technik
waren erfolglos (Bergkamp et al. Yeast, Vol. 9, 1993: 677-681,
Piredda et al., Yeast, Vol. 10, 1994: 1601-1612, Benito et al.,
Gene, Vol. 116, 1992: 59-67 und Diaz-Minguez et al., Mol. Gen.
Genet., Vol. 224, 1990: 269-278).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, deshalb einen leicht
selektionierbaren, mit hoher Ausbeute transformierbaren und ein
fach gegenselektionierbaren Marker zur Verfügung zu stellen, der
das Einbringen von Genen in Mikroorganismen ermöglicht.
Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäße Orotidin-5'-Phosphatde
carboxylase mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine
Homologen, die mindestens 80% Homologie zur Sequenz SEQ ID NO: 1
aufweisen, gelöst.
Unter Homologe des erfindungsgemäßen Orotidin-5'-Phosphatde
carboxylase-Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise
Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 80% Homologie auf
der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 90% Ho
mologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% Homologie auf
weisen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist
SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere
funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Sub
stitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten
Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der
abgeleiteten synthetisierten Proteine vorteilhafterweise für
das Einbringen eines oder mehrerer Gene jedoch erhalten bleiben
sollte. Sollen mit Hilfe der SEQ ID NO: 1 und seiner Homologen
im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Uracil auxo
trophen Mikroorganismen jedoch Mutanten im Orotidin-5'-Phosphat
decarboxylase-Gen hergestellt werden, so werden nicht funktio
nelle Gene das heißt Gene, die zu enzymatisch inaktiven Proteinen
führen, verwendet. Dabei werden vorteilhafterweise Sequenzen ver
wendet, die Homologien zur SEQ ID NO: 1 oder seinen Homologen
vorteilhaft am 3'- und 5'-Ende aufweisen.
Weiterhin sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise
pilzliche oder pflanzliche Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel
strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-
Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf
DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt von
mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80%, ganz
besonders bevorzugt von mindestens 90% über den gesamten in
SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.
Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei
spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die
den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können
durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en)
und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio
nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des
weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz
in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere
Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren
Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startkodon
so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protein
expression verändert bevorzugt erhöht wird.
Bevorzugt läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus
Mikroorganismen der Familie Metschnikowiaceae, besonders bevor
zugt aus Mikroorganismen der Gattungen Eremothecium, Ashbya oder
Nematospora, ganz besonders bevorzugt aus Mikroorganismen der
Gattung und Art Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii iso
lieren.
Unter dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt sind die URA3-Gen
sequenzen SEQ ID No. 1 und seine Homologen zu verstehen, die mit
einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur
Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Bei
spielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen
um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so
die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen
neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser
Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein
und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die
natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene
erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut
sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale
vor die Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen inseriert und
der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent
fernt. Statt dessen wurde die natürliche Regulationssequenz so
mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression
gesteigert wird. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafter
weise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen"
funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine er
höhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am
3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequen
zen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder
Terminatoren. Die URA3-Gene können in einer oder mehreren Kopien
im Genkonstrukt enthalten sein, wobei das oder die Gene auch in
aktiviert sein können. Mit Hilfe dieses oder dieser inaktivierten
Gene können im erfindungsgemäßen Verfahren Uracil-auxotrophe
Mutanten erzeugt werden. Zum Einbringen weiterer Gene in einen
Mikroorganismus sind im Genkonstrukt vorteilhafterweise weitere
Gene enthalten. Diese Gene können innerhalb eines URA3-Genes
liegen, wobei vorteilhaft eine intakte Kopie des URA3-Gens
und/oder ein anderes selektierbares Gen wie leu2, thr4 oder kan im
Konstrukt enthalten sein sollte, oder sie können außerhalb des
URA3-Genes liegen. Auch im Falle eines intakten URA3-Gens im
Genkonstrukt können noch weitere Marker wie die oben genannten
gegebenenfalls zur Selektion im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver
fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-,
tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-,
gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die
vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden.
Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in
den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder
Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH
oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp,
STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor ent
halten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der
Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise
Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für
die Regulation verwendet werden.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren
Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs
gemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch
synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Im Genkonstrukt können wie oben beschrieben noch weitere Gene,
die in die Mikroorganismen eingebracht werden sollen, enthalten
sein. Diese Gene können innerhalb oder außerhalb der Markergene
wie ura3, leu2, thr4 oder kan inseriert sein. Prinzipiell können
alle Arten von Genen mit Hilfe des erfindungsgemäßen URA3-Gens
mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen in Mikro
organismen eingebracht werden. Vorteilhafterweise lassen sich
regulatorische Gene wie Gene für Induktoren, Repressoren oder
Enzyme, die über ihre enzymatische Aktivität in die Regulation
eingreifen, oder ein oder mehrere oder alle Gene eines Bio
syntheseweges wie die Gene der Riboflavinbiosynthese wie bei
spielsweise die rib-Gene oder Gene von Biosynthesewegen, die
zu anderen Feinchemikalien, Sekundärmetaboliten oder Proteinen
führen wie die Gene der Biotin-, Lysin-, Methionin-, Vitamin B12-
oder Carotinoidbiosynthese, oder Gene, die zu Aroma-, Wuchs- oder
Geruchsstoffen führen oder einzelne Gene für Enzyme wie Proteasen
oder Lipasen über die URA3-Sequenz in Wirtsorganismen einbringen
und exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen
Ursprungs sein. Die eingebrachten Gene können einen eigenen
Promotor haben oder aber unter der Regulation des Promotors der
Sequenz SEQ ID No. 1 oder seiner Homologen liegen.
Das Genkonstrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirts
organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise
einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das
eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete
Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,
puCl8, pUCl9, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200,
pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101,
pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder
pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1,
pIL2 oder pBB116, in Hefen 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23
oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51.
Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen
Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und
können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels
P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985
ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Genkonstrukt zur Expression der
weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5, Termi
nale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die
je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine
optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression
der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei
spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst
nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es
sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs
weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein
flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der
regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Trans
kriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie
Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber
auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispiels
weise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfin
dungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer
linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über
heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts
organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem
linearisierten Plasmid oder nur aus dem Genkonstrukt als Vektor
bestehen.
Als Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Genkonstrukt kommen
prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen
in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikro
organismen wie Bakterien, Pilze, Hefen, tierische oder pflanz
liche Zellen verwendet. Bevorzugt werden Pilze oder Hefen, beson
ders bevorzugt Pilze, ganz besonders bevorzugt Pilze der Familie
Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder Nematospora ver
wendet.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung
von Uracil auxotrophen Mikroorganismen. Zur Erzeugung von Uracil
auxotrophen Mutanten wird das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase
Gen mit der SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen beispielsweise
durch Mutagenese so verändert, daß das durch das Gen codierte
Protein inaktiviert wird. Dieses inaktivierte Gen wird anschlie
ßend in einen Mikroorganismus beipielsweise über Transformation
oder Elektroporation eingeführt. Durch homologe Rekombination in
den Mikroorganismen entstehen schließlich auxotrophe Mutanten,
die über ihre Resistenz gegen 5-Fluororotsäure gescreent werden
können (siehe Boeke et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 197, 1984:
345-346).
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Einbringen
von DNA in Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen
Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) defizienten
Organismus bevorzugt einen Mikroorganismus einen Vektor ein
bringt, der ein intaktes URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1
oder seine Homologen vorteilhafterweise zusammen mit weiterer DNA
vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Gen enthält, und die
sen Organismus auf oder in einem Kulturmedium kultiviert, das
kein Uracil enthält. In diesem Medium können nur diese Organismen
wachsen, die den Vektor erhalten haben. Bevorzugt wird in diesem
Verfahren als Vektor eine lineare DNA verwendet. Als Mikro
organismen werden in diesem Verfahren bevorzugt Pilze besonders
der Familie Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder
Nematosprora, besonders bevorzugt Mikroorganismen der Gattung
Ashbya verwendet.
Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber
ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2 m Plasmids aus S.
cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom
repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Frag
ment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration
kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt
wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al.,
Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987).
Das erfindungsgemäße URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder
seine Homologen lassen sich vorteilhaft als Selektionsmarker im
erfindungsgemäßen Verfahren verwenden. Bevorzugt lassen sich Gene
unter Verwendung dieses Selektionsmarkers Gene in Ashbya gossypii
einbringen.
Von Vorteil ist weiterhin, daß man bei der Transformation von
Ashbya gossypii mit Hilfe dieses Genes selektionieren kann, ohne
Fremd-DNA (d. h. DNA, die nicht aus Ashbya gossypii stammt) ver
wenden zu müssen.
Bei der Transformation von Ashbya gossypii mit dem Gen mit der
SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen können beliebige weitere Gene
miteingebracht werden. Dadurch ist es möglich, Stämme zu kon
struieren, die einzelne Gene oder mehrere Gene in weiteren Kopien
entweder auf Plasmiden oder im Genom tragen.
Des weiteren ist es möglich, Ashbya-Stämme zu konstruieren, bei
denen chromosomale Kopien von Genen durch die Insertion des URA3
Gens mit der SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen zerstört wurden.
Ein besonderer Vorteil des AgURA3 Gens ist die Möglichkeit, den
Marker mehrfach hintereinander im gleichen Stamm zu verwenden.
Wenn man 5' und 3' des Gens identische Nukleotidsequenzen in
gleicher Orientierung (sogenannte direct repeats) setzt, kann man
den AgURA3 Marker bei Bedarf durch Homologe Rekombination und
Selektion auf Uracil- und FOA-haltigen Medium wieder entfernen
und dann in einer weiteren Runde zusätzliche DNA mit Hilfe dieses
Gens einbringen. Ein weiterer Vorteil ist die deutlich höhere
Transformationseffizienz im Vergleich zu den Markern thr, leu
oder kan.
Im erfindungsgemäßen Verfahren enthält der Vektor als weiteres
Gen mindestens ein Gen der Riboflavinsynthese. Unter Gene der
Riboflavinsynthese sind solche Gene zu verstehen, die an der
Synthese im gesamten Stoffwechsel von Riboflavinproduzenten wie
Ashbya beteiligt sind.
Genomische DNA aus Ashbya gossypii ATCC10895 wurde nach dem in
WO97/03208 beschriebenen Verfahren präpariert. Die genomische
Genbank, ausgehend von dieser DNA, wurde nach der in Sambrook, J.
et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press bzw. in F.M. et al. (1994) Current proto
cols in molecular biology, John Wiley and Sons beschriebenen Me
thode in pRS314 und in YEp351 (Hill et al., Yeast, Vol. 2, 1986:
163-167) erstellt. Wie beispielsweise WO97/03208 zu entnehmen
ist, sind auch andere Plasmide wie Plasmide der pRS-Reihe
(Sikorski und Hieter, Genetics, 1989: 19-27) oder Cosmiden, wie
z. B. SuperCos1 (Stratagene, La Jolla, USA) für die Herstellung
der Genbank geeignet.
Es wurde zunächst versucht das Gen für die Orotidin-5'-Phosphat
decarboxylase (= OMP-DC) aus Ashbya gossypii über eine funktio
nelle Komplementation einer entsprechenden URA3 auxotrophen
Mutante von Saccharomyces cerevisiae zu klonieren.
Dazu wurde eine Genbank von genomischer Ashbya gossypii DNA in
pRS314 erstellt (wie in Beispiel 1 beschrieben). Mit dieser DNA
wurde der S. cerevisiae Stamm MW3317-21A (Genotyp: MAT α, trp1,
ade8ΔKpn, ura3-52, hom3-10, met13, met4, ade2, his3-Kpn, siehe
z. B. Kramer et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1989: 4432-4440), nach
der Lithiumacetat-Methode (siehe z. B. Kramer et al., Mol. Cell.
Biol. 9, 1989: 4432-4440) transformiert. Es wurde kein Klon
erha1ten, bei dem die genomische Deletion des ura3 Gens des
S. cerevisiae-Stammes durch ein Genfragment aus Ashbya komple
mentiert wurde.
Auch der Versuch über eine funktionelle Komplementation in einer
pyrF-Mutante von E. coli das URA3 Gen von Ashbya gossypii zu
klonieren schlug fehl.
Auch ein Versuch, das OMP-DC-Gen aus Ashbya gossypii über
Hybridisierung mit einem Fragment des entsprechenden Gens aus
Saccharomyces cerevisiae zu klonieren, gelang nicht.
Dazu wurde das komplette URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae
(Genbank entry yscodcd) als Sonde (1,1 kb Länge) verwendet, um
eine genomische Cosmid-Genbank von Ashbya gossypii (siehe Bei
spiel 1) zu screenen. Der Versuch wurde wie in Sambrook, J. et
al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) Current
protocols in molecular biology, John Wiley and Sons beschrieben
durchgeführt, wobei Hybridisierungstemperaturen von 52°C bis 68°C
verwendet wurden. Es konnten keine Klone in der Genbank identi
fiziert werden, die ein positives Signal mit dem URA3-Gen aus
S. cerevisiae als Sonde lieferten.
Im nächsten Ansatz wurde die Klonierung des Gens für OMP-DC aus
Ashbya gossypii über Amplifikation von Genfragmenten mit Hilfe
von degenerierten Oligonukleotiden und der PCR-Technik versucht.
Für diesen Versuch wurden die bekannten Aminosäuresequenzen der
verschiedenen Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylasen aus den folgen
den Organismen miteinander verglichen und Bereiche ausgewählt,
die in allen Enzymen höchstmöglich konserviert sind:
Aspergillus niger (Acc. number: P07817)
Aspergillus nidulans (Acc. number: P10652)
Schizosaccharomyces pombe (Acc. number: P14965)
Penicillium chrysogenum (Acc. number: P09463)
Kluyveromyces lactis (Acc. number: P07922)
Candida albicans (Acc. number: P13649)
Neurospora crassa (Acc. number: P05035)
Ustilago maydis (Acc. number: P15188)
Saccharomyces cerevisiae (Acc. number: P03962)
Drosophila melanogaster (Acc. number: Q01637)
Mouse (Acc. number: P13439)
Human (Acc. number: P11172).
Aspergillus niger (Acc. number: P07817)
Aspergillus nidulans (Acc. number: P10652)
Schizosaccharomyces pombe (Acc. number: P14965)
Penicillium chrysogenum (Acc. number: P09463)
Kluyveromyces lactis (Acc. number: P07922)
Candida albicans (Acc. number: P13649)
Neurospora crassa (Acc. number: P05035)
Ustilago maydis (Acc. number: P15188)
Saccharomyces cerevisiae (Acc. number: P03962)
Drosophila melanogaster (Acc. number: Q01637)
Mouse (Acc. number: P13439)
Human (Acc. number: P11172).
Die in den Klammer angegebenen Nummern stammen aus der SWISS & PIR-
Translated Datenbank Release 103.
Auf Basis dieser Informationen wurden degenerierte Olgonukleotide
synthetisiert.
Unter degenerierten Oligonukleotiden versteht man Oligo
nukleotide, bei denen während der Synthese an mehreren Positionen
Mischungen von Nukleotiden eingebaut wurden.
R steht dabei für G oder A, Y steht dabei für C oder T, W steht
dabei für A oder T, M steht dabei für A oder C, K steht dabei für
G oder T, S steht dabei für C oder G, H steht dabei für A, C oder
T, V steht dabei für A, C oder G, B steht dabei für C, G oder T,
D steht dabei für A, G oder T, N steht dabei für G,A,T oder C.
Es wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
Mit diesen Oligonukleotiden als Primer wurden PCR Reaktionen
durchgeführt mit genomischer DNA von Ashbya gossypii als Matrize
verwendet.
Es wurden folgende Primerkombinationen verwendet:
URA3-A + URA3-B; URA3-A + URA3-D; URA3C + URA3-B and URA3-C +
URA3-D.
Folgende Hybridisierungstemperaturen wurden verwendet:
52°C, 48°C, 44°C, 40°C und 37°C.
Die aus den PCR-Reaktionen entstandenen Produkte wurden nach
üblichen Methoden in den Vektor pGEMT (Promega) kloniert und
sequenziert. Es konnten keine Fragmente amplifiziert werden, die
Homologie zu bekannten oben genannten OMP-DC Genen zeigten.
Wie in DE 44 20 785 A1 (Beispiel 1) beschrieben wurden eine cDNA-
Bank von Ashbya gossypii erstellt.
Von E.coli Klonen, die die in Beispiel 5 beschriebene Genbank von
Ashbya gossypii enthalten, wurden Einzelklone selektiert. Nach
üblichen Methoden wurden die Zellen in geeigneten Medien (z. B.
Luria-Broth mit 100 mg/l Ampicillin) kultiviert und Plasmid-DNA
aus diesen Zellen isoliert.
Es wurde Oligonukleotide, die im Vektoranteil hybridisieren als
Primer für die Sequenzierung der cDNA Klone verwendet. Dabei
wurden Fragmente der klonierten cDNAs erfasst. Die Sequenzen
wurden wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert.
Es wurde eine Computer-unterstützte Analyse der gefundenen
Nukleotidsequenzen über Sequenzvergleiche neu identifizierter
Sequenzen mit bestehenden DNA und Proteindatenbanken mit Hilfe
folgender Algorithmen z. B. mit BLAST Algorithmen (Altschul et al.
(1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410), dem Clustal Algorithmus mit
Hilfe der PAM250 Gewichtungstabelle oder dem Wilbur-Lipman DNA
alignment Algorithmus (wie z. B. in dem Programmpaket MegAlign
3.06 der Firma DNAstar implementiert) durchgeführt. Auf diesem
Weg konnten Ähnlichkeiten der neu entdeckten Sequenzen mit
bereits bekannten Sequenzen entdeckt und neue Gene oder Teil
sequenzen von Genen in ihrer Funktion beschrieben werden.
Nach Untersuchung einer Vielzahl von Klonen wie in Bsp. 6 und 7
(< 100 Klone) beschrieben wurde eine Sequenz gefunden, die
Ähnlichkeiten zu den bekannten OMP-DC Genen zeigte. Mit dieser
homologen Sonde wurde dann die genomische Ashbya Genbank (siehe
Beispiel 1) nochmals gescreent und es konnten Klone bzw. Cosmide
identifiziert werden, die ein spezifisches positives Signal er
gaben und ein gemeinsames 1,3 kb XhoI-EcoRI-Fragment trugen. Die
Sequenzierung der Klone ergab die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1
beschrieben. Die Sequenz zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten URA3
Genen und codiert für ein ca. 29246 Dalton großes Protein.
Unter Disruption eines Genes versteht man die Zerstörung der
Funktionalität einer genomischen Kopie des Gens entweder durch
(a) Entfernen eines Teiles der Gensequenz, oder durch (b) der
Unterbrechung des Gens durch Einfügung eines Stückes Fremd-DNA in
das Gen oder durch (c) Ersatz eines Teil des Gens durch Fremd-
DNA. Die verwendete Fremd-DNA ist beliebig, bevorzugt aber ein
Gen, das Resistenz gegen eine beliebige Chemikalie bewirkt. Zur
Disruption von Genen können beliebige Resistenzgene verwendet
werden.
Zur Disruption des AgURA3-Gens von Ashbya gossypii ATCC10895
wurde das Kanamycin-Resistenzgen aus Tn903, das unter Kontrolle
des TEF-Promotors von Ashbya gossypii (siehe Yeast 10,
S. 1793-1808, 1994 oder WO92/00379) verwendet. Das Gen ist 5,
und 3' von mehreren Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen
flankiert, so daß eine Kassette aufgebaut werden konnte, die be
liebige Konstruktionen von Gen-Disruptionen mit üblichen Methoden
der in vitro Manipulation von DNA ermöglichen.
Das interne 370 bp PstI-KpnI Fragment von AgURA3 (Position
442-892 in der Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde durch eine wie oben skiz
zierte Resistenzkassette ersetzt. Das erhaltene Konstrukt erhielt
den Namen ura3::G418. Das erhaltene Plasmid läßt sich nach Trans
formation in E.coli vermehren. Das XhoI-SphI-Fragment des Kon
struktes ura3::G418 (siehe Fig. 1) wurde über Agarosegel-Elek
trophorese und nachfolgender Elution der DNA aus dem Gel (siehe
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619, 1979) aufgereinigt und
zur Transformation von Ashbya gossypii eingesetzt. Fig. 1 zeigt
in Abb. A eine Restriktionskarte des kodierenden Bereichs
des AgURA3-Gens und der 5'- und 3'-nicht translatierten Regionen
(= 5'-UTR und 3'-UTR). Abb. B zeigt die Situation nach
Insertion der oben beschriebenen Kanamycin-Resistenzkassette
(= TEF-kanR).
Das Fragment wurde entweder über Protoplastentransformation (Gene
109, 99-105, 1991) oder aber bevorzugt durch Elektroporation
(BioRad Gene Pulser, Bedingungen: Küvetten mit Spaltbreite 0,4
mm, 1500 V, 25 µF, 100 Ω) in Ashbya gossypii transformiert. Die
Selektion transformierter Zellen erfolgte auf G418-haltigem Fest
medium (WO 97/03208).
Erhaltene G418-resistente Klone wurden mit üblichen Methoden der
PCR und Southern-Blot Analyse (Sambrook, J. et al. (1989) Mole
cular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press bzw. in F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular
biology, John Wiley and Sons) daraufhin untersucht, ob die
genomische Kopie des AgURA3 Gens tatsächlich zerstört wurde.
Klone, deren AgURA3 Gen zerstört wurde, sind Uracil- auxotroph
und resistent gegen 1 mg/ml 5'-Fluoro-Orotsäure (FOA).
Ein besonderer Vorteil der Verwendung von URA3 Genen ist die
Möglichkeit sowohl auf An- als auch auf Abwesenheit des Genes zu
selektionieren. Man kann mit FOA Mikroorganismen screenen, die
ein funktionell inaktiviertes URA3 Gen besitzen, und mit Hilfe
der Selektion auf Uracil- Prototrophie auf ein funktionell
aktives URA3 Gen selektionieren.
Zur Disruption der genomischen Kopie des URA3 Gens wurde einfach
heitshalber ein internes Fragment (= PstI-Fragment) des URA3 Gens
aus dem kodierenden Bereich des Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1
deletiert (Position 442 bis 520 in der Sequenz SEQ ID NO: 1).
Die Transformation von Ashbya gossypii mit diesem deletierten
ura3-Fragment wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.
Anstelle der Deletion von Teilbereichen des Gens können prinzi
piell auch alle anderen Methoden zur Inaktivierung des Gens wie
Mutationen über Insertionen, Duplikationen, Reversionen, Aus
tausch mehrerer Nukleotide oder Punktmutationen verwendet werden.
Punktmutationen sind weniger bevorzugt, da sie leicht rever
tieren.
Die Selektion der Transformanten wurde durch Resistenz gegen FOA
durchgeführt. Im Gegensatz zu Wild-Typ-Klonen sind Klone, die
eine Disruption des AgURA3 Gens tragen sind resistent gegen 1
mg/ml FOA.
Das in WO 97/03208 beschriebene Isocitrat1yasegen wurde mit
Hilfe des Plasmids pAG100, wie in WO 97/03208 (Beispiel 4 und 5)
beschrieben, in AgURA3-Disruptionsmutanten A. gossypii (siehe
Beispiel 9 und 10) eingebracht, wobei als Selektionsmarker in
A. gossypii anstelle der beschriebenen G418-Resistenz das AgURA3
Gen verwendet wurde.
Claims (16)
1. Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID
NO: 1 oder seine Homologen, die mindestens 80% Homologie zur
Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweisen.
2. Homologe nach Anspruch 1, deren durch sie codierten Gen
produkte funktionell sind.
3. Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID
NO: 1 oder seine Homologen, dadurch gekennzeichnet, daß das
Gen oder seine Homologen aus Ashbya gossypii stammt.
4. Aminosäuresequenzen codiert durch ein Gen oder seine Homologe
gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
5. Aminosäuresequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich um enzymatisch aktive Proteine handelt.
6. Genkonstrukt enthaltend ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxy
lase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen
nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Gen oder seine
Homologen funktionell mit einem oder mehreren Regulations
signalen verknüpft ist.
7. Genkonstrukt nach Anspruch 6, deren Genexpression durch die
Regulationssignale erhöht wird.
8. Vector enthaltend ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.
9. Mikroorganismus enthaltend mindestens ein Genkonstrukt gemäß
Anspruch 6 oder 7.
10. Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikro
organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Orotidin-5'-
Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder
seine Homologen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 so verändert,
daß das durch das Gen codierte Protein inaktiv ist, und daß
man dieses veränderte Gen in die Mikroorganismen einführt
und über homologe Rekombination in das Genom der Organismen
integriert und anschließend diese Mikroorganismen auf
5-Fluororotsäureresistenz selektioniert.
11. Verfahren zum Einbringen von DNA in Mikroorganismen, dadurch
gekennzeichnet, daß man in einen Orotidin-5'-Phosphat
decarboxylase-Gen defizienten Mikroorganismus einen Vector
einbringt, der ein intaktes Orotidin-5'-Phosphatdecarboxy
lase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen
gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zusammen mit mindestens einem
weiteren Gen enthält, und diesen Mikroorganismus auf oder in
einem Kulturmedium ohne Uracil anzieht.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als
Vector eine lineare DNA verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet,
daß als Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen defizienter
Mikroorganismus ein Ashbya gossypii Stamm verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß als weiteres Gen mindestens ein Gen der Riboflavin
synthese in den Mikroorganismus eingebracht wird.
15. Verwendung einer Gen-Sequenz oder seiner Homologen gemäß
Anspruch 1 bis 3 als Selektionsmarker.
16. Verwendung nach Anspruch 15 in Ashbya gossypii.
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Cited By (3)
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