DE19740806C2 - Mikrotiterplatte aus Kunststoff - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte aus transparentem Kunststoff mit spalten- und zeilenförmig zu einer Rundwabenstruktur angeordneten kleinen Kavitäten, die zumindest an den Wandungen mit einer Innenbeschichtung versehen sind.

Mikrotiterplatten besitzen eine Vielzahl von spalten- und zeilenförmig angeordneten, eine Rundwabenstruktur bildenden sehr kleinen Reaktionsräumen, auch Kavitäten genannt, in die jeweils kleinste Anteile einer Flüssigkeitsprobe, z. B. einer Blutprobe für die Diagnose von im Blut erkennbaren medizinischen Parametern oder Krankheiten, oder einer Wasserprobe für die Überwachung der Wasserqualität, eingebracht werden, die anschließend jeweils mit einem unterschiedlichen Reagenz aus einer Bürette oder eine Pipette in Kontakt gebracht werden, um so eine chemische oder biologische Reaktion oder dergleichen hervorzurufen, welche von einem optischen Effekt, z. B. Färbung oder Entfärbung in der Flüssigkeitsprobe begleitet wird. Diese Farbänderung als Ergebnis der Reaktion wird üblicherweise visuell oder fotometrisch überwacht, weshalb die Mikrotiterplatten aus einem transparenten Material aufgebaut sind. Anstelle viele eingefüllte Teile derselben Flüssigkeitsprobe mit unterschiedlichen Reagenzien zu versetzen, können die Mikrotiterplatten auch in der Weise bei der Titration verwendet werden, indem man viele unterschiedliche eingebrachte Flüssigkeitsproben mit demselben Reagenz reagieren läßt.

Die Mikrotiterplatten sind dabei mit unterschiedlichen Durchmessern der Kavitäten, beispielsweise im Bereich von 3 bis 7 mm, d. h. mit unterschiedlich großen Reaktionsräumen bzw. Kavitäten im Handel. Sie weisen typischerweise eine Abmessung von 120 × 80 mm auf.

Es ist bekannt, Mikrotiterplatten aus Glas oder transparentem Kunststoff herzustellen.

Mikrotiterplatten aus Glas haben eine hohe chemische Beständigkeit, sind jedoch sehr aufwendig in der Herstellung und damit teuer. Wie bei allen Glasprodukten bestehen Bruchgefahr und nur sehr begrenzte Design- Möglichkeiten. Ferner sind die mit Glas erreichbaren Toleranzen werkstoff- und verfahrensbedingt sehr viel schlechter als bei typischerweise spritzgegossenen Kunststoffteilen.

Es ist auch bekannt, Mikrotiterplatten aus Kunststoff herzustellen. In der Fig. 4 ist eine solche bekannte Mikrotiterplatte dargestellt. Sie besteht aus einem plattenförmigen Grundkörper 30 aus transparentem Kunststoff, wie Polyvinylchlorid, vorzugsweise Polystyrol oder aus Polymethylmethacrylat (PMMA), in dem in einer wabenartigen Struktur zahlreiche Reaktionsvertiefungen, die Kavitäten 20 mit Öffnungen 21 und mit geraden oder abgerundeten Böden 22 ausgeformt sind, die die Kavitäten für die miteinander reagierenden Flüssigkeiten bilden. Teilweise sind ihre Oberflächen modifiziert, um eine verbesserte Adsorption von Reagenzien zu gewährleisten. Die miteinander reagierenden Flüssigkeiten, Proben wie Reagenzien, werden aus einer Bürettenanordnung tropfenweise in jede Kavität 20 fallengelassen. Nach Ende der jeweiligen Reaktion bzw. Behandlung werden die erhaltenen Ergebnisse durch optische Mittel festgestellt, indem beispielsweise ein sehr schmaler Lichtstrahl axial auf den Inhalt der Kavitäten gerichtet und die Intensität oder Färbung des aus dem Bodenteil austretenden durchgelassenen Lichtes bestimmt wird.

Diese bekannten Mikrotiterplatten aus Kunststoff sind zwar einfach sterilisierbar, z. B. durch eine Strahlensterisilation, sowie kostengünstig herstellbar, weisen jedoch eine für moderne Anwendungen nur sehr begrenzte chemische Resistenz, insbesondere gegenüber organischen Lösungsmitteln und eine geringe thermische Belastbarkeit auf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die eingangs bezeichnete Mikrotiterplatte so auszubilden, daß sie bei kostengünstiger Herstellung eine deutlich erhöhte chemische Resistenz auch gegenüber aggressiven Lösungsmitteln bzw auch bei erhöhten Temperaturen aufweist.

Diese Aufgabe wird durch eine Mikrotiterplatte gelöst, bei der zur Erhöhung der chemischen Resistenz gegenüber Lösungsmitteln die Beschichtung aus einer Schicht aus SiO_xC_yH_z und/oder TiO_xC_yH_z besteht, die mit dem PICVD- Verfahren aufgebracht ist.

Durch diese Beschichtung weist die Kunststoff-Mikrotiterplatte eine drastisch erhöhte chemische Resistenz, insbesondere auch gegenüber den organischen Lösungsmitteln wie Azeton, Methyl-Ethylketon (MEK), Isopropanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dymethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Toluol, Xylol etc., auch bei erhöhten Temperaturen, auf. Dadurch, daß die Schicht nach dem PICVD-Verfahren aufgebracht ist, läßt sich überraschenderweise eine hinreichend gleichförmige Beschichtung der Mikrotiterplatte, die durch die Vielzahl der Kavitäten an sich eine recht komplexe Geometrie besitzt, erzielen.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung auch verhältnismäßig thermolabile Kunststoffbasismaterialien für die Mikrotiterplatte, wie Polystyrol oder Polymethylmethacrylat (PMMA) nach dem PICVD-Verfahren beschichtbar sind und sich die chemische Beständigkeit gravierend erhöhen läßt.

Durch die US 4,725,388 ist eine Mikrotiterplatte aus transparentem Kunststoff mit spalten- und zeilenförmig zu einer Rundwabenstruktur angeordneten kleinen Reaktionsräumen, die innen mit einer Beschichtung, einer Barriere, versehen sind, bekannt geworden, jedoch ist die Zusammensetzung und Ausbildung dieser Schicht, auch weil sie eine völlig andere Aufgabe erfüllen soll, anders als im Fall der Erfindung.

Im Fall der bekannten Mikrotiterplatte geht es darum, bei Fluoreszenzuntersuchungen des Kavitäten-Inhaltes ein Eindringen von Licht in das Material der Mikrotiterplatte, die dieses zur Fluoreszenz anregen könnte, zu vermeiden, da dies das Meßergebnis verfälschen würde. Die Kavitäten werden daher im Inneren mit einer Pigmentschicht ausgekleidet, die als Barriere ein Eindringen von zur Fluoreszenz anregendem Licht in das umgebende Material der Mikrotiterplatte verhindert. Die Pigmente können dabei unterschiedliche Farben haben, vorzugsweise schwarz und weiß. Als ein Beispiel für einen weißen Pigmentstoff wird Titandioxid angeführt.

Im Fall der Erfindung geht es jedoch darum, zur Erhöhung der chemischen Resistenz der Kunststoff-Mikrotiterplatte gegenüber Lösungsmitteln, die in die Kavitäten mit den Proben gelangen, eine Schicht aus SiO_xC_yH_z und/oder TiO_xC_yH_z im Innern der Kavitäten vorzusehen. Während im bekannten Fall eine unregelmäßige Schicht mit Pigmenten aus - nur - TiO₂, also ein rein anorganisches Material, verwendet wird, hat die erfindungsgemäße Schicht durch den Einbau von Kohlenstoff und Wasserstoff neben dem SiO_x bzw. TiO_x einen organischen Charakter mit völlig anderen Eigenschaften, die im Fall der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte gezielt ausgenutzt werden. Ferner wird im Fall der Erfindung eine möglichst homogene, gleichförmige Schicht mit amorphem Charakter erzeugt.

Die Beschichtung von Kunststoffen mit einer SiO_xC_yH_z- bzw. TiO_xC_yH_z-Schicht ist an sich durch den Aufsatz "Multilayer barrier coating system produced by plasma-impulse chemical vapor deposition (PICVD), von M. Walther, M. Heming, M. Spallek", veröffentlicht in "Surface and Coatings Technology" 80 (1996) S. 200-202 bekanntgeworden. Im bekannten Fall geht es jedoch um die Erzeugung von Sperrschichten bei Verpackungsbehältern mit wenig komplexer Konfiguration, insbesondere im Pharmabereich, um die Durchlässigkeit der Kunststoffwandung der Verpackung gegenüber Wasserdampf und anderen Dämpfen bzw. Gasen zu verringern. Im Fall der Erfindung geht es dagegen um das Aufbringen einer Schicht bei einem Körper mit komplexer Konfiguration, der Kunststoff-Mikrotiterplatte, zur Erhöhung der chemischen Resistenz dieser Mikrotiterplatte. Für diese Lehre sind in der vorgenannten Literaturstelle keine Hinweise vorhanden.

Weitere Merkmale der Mikrotiterplatte ergeben sich anhand von in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen.

Es zeigen:

Fig. 1 einen stark vergrößerten Ausschnitt aus einem Längsschnitt durch eine Mikrotiterplatte unter Darstellung der Beschichtung einer Kavität,

Fig. 2 in drei Ansichten A, B, C in Form von stark vergrößerten Ausschnitten aus dem Längsschnitt nach Fig. 1, drei verschiedene Fälle für die Struktur der Beschichtung,

Fig. 3 eine blockschaltbildartige Prinzipdarstellung einer PICVD- Beschichtungsstation zur Erzeugung der Schichten nach den Fig. 2, und

Fig. 4 in einer perspektivischen Schnittdarstellung die Struktur einer bekannten Mikrotiterplatte nach dem Stand der Technik.

Die Fig. 1 zeigt in einem sehr vergrößerten Maßstab einen Ausschnitt aus einem Längsschnitt durch eine Mikrotiterplatte 30 unter Darstellung eines ihrer Reaktionsräume, den Kavitäten 1, deren Wandung 2 aus Kunststoff besteht. Typischerweise ist als Kunststoffmaterial wegen der notwendigen Transparenz, Festigkeit und Resistenz gegenüber den üblicherweise verwendeten Proben und Reagenzien Polystyrol oder Polymethylmethacrylat (PMMA) vorgesehen, es können jedoch auch zahlreiche andere, transparente Kunststoffe wie Polycarbonat, Polyethylenterephtalat (PET), Cycloolefincopolymere eingesetzt werden.

Mehrere solcher Kavitäten 1 sind entsprechend der bekannten Mikrotiterplatte nach Fig. 4 spalten- und zeilenförmig zu einer Grundwabenstruktur angeordnet.

Die Auswahl des Kunststoffes für eine beschichtete Mikrotiterplatte kann ohne Rücksicht auf eine geringe chemische Beständigkeit des Kunststoffes erfolgen. So kann z. B. Polycarbonat Verwendung finden, dessen Lösungsmittelbeständigkeit zwar sehr schlecht ist, aber das eine hohe Temperaturbeständigkeit aufweist.

Zur drastischen Erhöhung der chemischen Resistenz der Mikrotiterplatte 30, insbesondere gegenüber organischen Lösungsmitteln wie Azeton oder Dimethylsulfoxid (DMSO), ist gemäß Fig. 1 eine Schicht 3 vorgesehen, die eine Dicke von ca. 20-500 mm hat, die aber, der besseren Darstellung halber, in Fig. 1 nicht maßstäblich im Verhältnis zur Wandung 2, deren Dicke typischerweise bei 0,5-1 mm liegt, dargestellt ist.

Die Schicht 3 kann gemäß Fig. 2, Teil A, aus einer Schicht 3a aus SiO_xC_yH_z oder gemäß Fig. 2, Teil B, aus einer Schicht 3b aus TiO_xC_yH_z oder gemäß Fig. 2, Teil C, aus einer Doppelschicht 3c, gebildet aus den Schichten 3a und 3b nach Teil A und B der Fig. 2, aufgebaut sein.

Vorzugsweise liegt dabei, wie in Fig. 2C dargestellt, die Schicht 3a direkt auf der Wandung 2, während die Schicht 3b außen liegt. Es hat sich nämlich gezeigt, daß SiO_xC_yH_z besser als TiO_xC_yH_z an den typischerweise verwendeten Kunststoffmaterialien haftet.

Die Beschichtungsfolge kann jedoch auch prinzipiell umgekehrt sein oder mehrere Lagen dieser Folge übereinander aufgebracht werden.

Das Aufbringen der Schicht 3 nach Fig. 1 bzw. der Schichten 3a, 3b und 3c nach Fig. 2 erfolgt nach dem PICVD-Verfahren (Plasma-Impuls-Chemical-Vapor-Deposition). Diese Technologie ist beispielsweise bekannt durch die DE 40 08 405 C1 sowie durch die US 5,154,943 und wird bislang insbesondere zur Erzeugung von Sperrschichten auf Kunststoffbehältern angewendet (DE 44 38 359 A1 und vorgenannter Aufsatz).

Das Prinzip einer Beschichtungsstation, in der das PICVD-Verfahren durchgeführt wird, ist in Fig. 3 dargestellt. In einer Vakuumkammer 4 befindet sich die zu beschichtende Mikrotiterplatte 30. Diese Vakuumkammer 4, die als Reaktionskammer dient, kann mittels einer Vakuumeinrichtung 5, die typischerweise eine Vakuumpumpe und die notwendigen Armaturen aufweist, entlüftet werden, z. B. auf einen Druck von 0,3 mbar. Oberhalb der Vakuumkammer 4, getrennt durch ein Mikrowellenfenster 6, befindet sich eine Horn-Mikrowellenantenne 7. Über diese Mikrowellenantenne wird eine Mikrowellenstrahlung 8 impulsweise in die Vakuumkammer 4 geleitet, die im Innern der Vakuumkammern ein Mikrowellenplasma bildet. Die Impulsdauer ist dabei ein zusätzlicher Parameter, der die Zusammensetzung der abgeschiedenen Schicht beeinflußt.

Die Mikrowellenimpulse, deren Dauer im Bereich von 0,1 bis 10 ms liegt, werden von einem Mikrowellengenerator 9 erzeugt, der über ein Magnetron 10 mit der Mikrowellenantenne 7 verbunden ist. Die Mikrowellen-Anordnung besitzt typischerweise Standard-Komponenten der 2,45 GHz Technologie.

Über eine Gaszufuhr Anordnung 11 wird einmal das Gas, in welchem ein Plasmabogen gezündet wird, typischerweise Sauerstoff sowie Inertgase (z. B. Stickstoff, Argon, Helium, Wasserstoff), und zum anderen das zur Schichtbildung notwendige Gas, das Reaktionsgas, eingeleitet. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind es typischerweise metall-organische Reaktionsgase, wie Hexamethyldisiloxane (HMDSO) oder Titantetraisopropoxide (TIPT), aus denen über die Wahl einer geeigneten Impulsdauer die Schichten SiO_xC_yH_z bzw. TiO_xC_yH_z aufgebaut werden.

Eine Prozeßsteuerung 12 steuert den Ablauf in bekannter Weise, bei dem zunächst aus der Zufuhranordnung 11 die Mischung aus Sauerstoff und dem Reaktionsgas in die Vakuumkammer 4 eingeleitet wird. Danach wird durch einen Mikrowellenimpuls 8 ein Plasma in der Vakuumkammer gezündet, das die Moleküle des Reaktionsgases spaltet. Die dabei entstehenden Crack- Produkte diffundieren zur nächst gelegenen Oberfläche, hier der Mikrotiterplatte 30 und bauen nach und nach die gewünschte Schicht 3 auf. In der Impulspause bis zur Zündung des nächsten Impulses, die im Bereich von 100 ms liegt, werden jeweils die verbrauchten Reaktionsgase aus der Vakuumkammer nach Art eines Zweitakt-Motors durch Absaugen mittels der Vakuumstufe 5 entfernt und durch frisches Reaktionsgas und Sauerstoff ersetzt.

Soll eine Mehrfachschicht gemäß Fig. 2C erzeugt werden, wird, sobald die genügende Schichtdicke für die Schicht 3a, bestehend aus SiO_xC_yH_z, erreicht ist, das entsprechende Reaktionsgas - hier Hexamethyldisiloxan (HMDSO) - durch das zur Erzeugung der Schicht 3b, bestehend aus TiO_xC_yH_z, notwendige Reaktionsgas Titantetraisopropoxid (TIPT) ersetzt. Zur Erzeugung eines unscharfen Überganges zwischen den beiden Schichten kann für einen gewissen Zeitraum ein Gemisch aus beiden Reaktionsgasen einleiten. Für gleichmäßige Übergänge kann man dabei den Anteil des ersten Reaktionsgases vermindern und gleichzeitig den Anteil des zweiten Reaktionsgases stetig bis auf den Nennwert erhöhen.

Bei Mikrotiterplatten 30 mit konventionellen typischen Abmessungen von 120 × 80 mm genügt, wie in Fig. 3 dargestellt, eine einzige Hornmikrowellenantenne 7 mit den entsprechenden Komponenten. Bei größeren Abmessungen wird ein Array von Mikrowellenantennen entsprechend der DE 38 30 249 C2, vorzugsweise gesteuert entsprechend der DE 196 34 795 A1, verwendet.

Zusätzlich oder anstelle von Sauerstoff als Gas für das Plasma können auch andere aus der Plasmatechnik bekannte Gase zur Erzeugung eines Plasmabogens verwendet werden, wie beispielsweise Argon, Helium, Wasserstoff oder Stickstoff; weitere Beispiele dafür werden z. B. in dem Buch "Plasma-Technik" von Schade u. a., erschienen 1990 im Verlag Technik GmbH Berlin, beschrieben.

Mittels der Beschichtungstechnologie nach Fig. 3 lassen sich überraschenderweise die sehr komplex geformten Mikrotiterplatten 30 erfolgreich beschichten, ohne daß es zu größeren unbeschichteten Bereichen käme. Ebenso überraschenderweise können auch relativ thermolabile Kunststoffbasismaterialien wie Polystyrol oder PMMA nach dem PICVD- Verfahren nach Fig. 3 beschichtet werden.

So wurde in einem Ausführungsbeispiel eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol ohne weitere vorhergehende Reinigung mit Hilfe des PICVD-Verfahrens mit SiO_xC_yH_z beschichtet. Die beschichteten Mikrotiterplatten weisen eine deutlich erhöhte Beständigkeit gegenüber Azeton und DMSO auf.

Eine Funktionalisierung der beschichteten Oberfläche einer Kavität, z. B. das Einstellen von Proteinbindungsfähigkeit gelingt, indem die Oberfläche zunächst mit einem Silanisierungsreagenz beaufschlagt wird, um funktionelle Gruppen auf die Oberfläche zu bringen. An diese funktionellen Gruppen (z. B. -PH, -SH, NH₂) können dann durch bekannte chemische Reaktionen andere Reagenzien reaktiv gekoppelt werden.

Claims (5)

1. Mikrotiterplatte aus transparentem Kunststoff mit spalten- und zeilenförmig zu einer Rundwabenstruktur angeordneten kleinen Kavitäten (1), die zumindest an den Wandungen (2) mit einer Innenbeschichtung versehen sind, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der chemischen Resistenz gegenüber Lösungsmitteln die Beschichtung aus einer Schicht (3) aus SiO_xC_yH_z und/oder TiO_xC_yH_z besteht, die mit dem PICVD-Verfahren aufgebracht ist.

2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Schichten (3a, 3b) vorhanden sind, eine erste, unmittelbar auf das Kunststoffbasismaterial der Wandung der Kavitäten (1) aufgebrachte SiO_xC_yH_z-Schicht, auf der eine TiO_xC_yH_z-Schicht als zweite, äußere Schicht aufgebracht ist.

3. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Polystyrol oder Polymethylmethacrylat (PMMA) als Kunststoffbasismaterial besteht.

4. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Polycarbonat (PC), Polyethylenterephtalat (PET) oder aus Cycloolefincopolymeren (COC) besteht.

5. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die innere Kavitätenoberfläche funktionale Gruppen aufweist, die durch Silanisierungsmethoden aufgebracht sind.