DE19739360A1 - Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen der Leber und Niere - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvor­ stufen in der Leber und den Nieren, wo bei in einer Leber- oder Nierengewebe­ probe die Gegenwart des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS-1) in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung eines spezifischen Reagenzes, beispielsweise eines Antikörpers, und der Sichtbarma­ chung des gebildeten Komplexes nachgewiesen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung des Verfahren zum Testen von Sub­ stanzen, die im Verdacht stehen, Leber- und/oder Nierenkrebs erzeugen zu können.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt zu den häufigsten malignen Neoplas­ men beim Menschen und verursacht jährlich weltweit mindestens 250 000 Tote. Chronische Infektionen mit dem Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virus, die Auf­ nahme von Nahrungsmitteln, die Hepatokarzinogene enthalten, beispielsweise das natürlich vorkommende Aflatoxin B₁, sowie Alkoholmißbrauch werden als die hauptsächlichen Risikofaktoren für das Entstehen von HCC angesehen. Darüber hinaus wurde ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines hepatozel­ lulären Adenoms bei Frauen beobachtet, die Empfängnisverhütungsmittel ein­ nehmen, sowie sowohl bei Frauen als auch bei Männern, die mit anabolen Steroidhormonen behandelt wurden. Zu den weiteren Stoffen, die in der men­ schlichen Umwelt auftreten und für die zumindest bei Nagern gezeigt werden konnte, daß sie an der Entstehung von Leberkrebs beteiligt sind, gehören bei­ spielsweise Nitrosamine, organische chlorierte Restizide, polychlorierte Bipheny­ le, Phthalate und Hypolipidämie bewirkende Medikamente.

Zur Diagnose von Krebsvorstufen der Leber bei Labortieren und neuerdings auch beim Menschen wurden bisher konventionelle, beispielsweise mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Gewebeschnitte hergestellt, daneben aber auch verschiedene Markerenzyme, wie zum Beispiel die plazentare Form der Glutathion-S-Trans­ ferase oder die Gamma-Glutamyltransferase, bestimmt. Die Karzinogenese wird auch durch frühe Änderungen im Energiestoffwechsel begleitet, beispielsweise durch die exzessive Glykogenspeicherung in herdförmigen präneoplastischen Läsionen. Somit kann eine Diagnose auch mittels des histochemischen Nachwei­ ses von Veränderungen des Glykogengehalts der Leberzellen durchgeführt werden.

Ein entscheidender Nachteil der Diagnose unter Verwendung dieser Marker ist jedoch, daß entweder keine Unterscheidung von frühen und späten Gewebsver­ änderungen bei der Krebsentstehung möglich ist oder die Tumorvorstufen für diagnostische Zwecke nicht deutlich genug vom umgebenden Gewebe abge­ grenzt werden können. Letzteres trifft insbesondere auf die Glykogenbestim­ mung zu, da Glykogen auch in unverändertem Gewebe in großen Mengen vorkommt. Es ist somit mit dem im Stand der Technik beschriebenen diagnosti­ schen Verfahren nicht möglich, frühe Krebsvorstufen zu erkennen, was eine wesentliche Voraussetzung für eine möglichst frühzeitige und damit wirksame Therapie ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines diagnostischen Verfahrens zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentan­ sprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren erlaubt die Erkennung von frühen Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren und ist damit zur Krebsfrüherken­ nung geeignet. Es basiert darauf, daß man in einer Gewebeprobe die Gegenwart des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS-1) in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung an ein Reagenz nachweist.

Die Karzinogenese in Leber und Niere ist dadurch gekennzeichnet, daß zuerst präneoplastische Foci (glykogenotische Foci, GSF; gemischtzellige Foci, MCF; basophile Foci, BCF) entstehen, aus denen sich dann schließlich das hepatozel­ luläre Karzinom (HCC) oder Nierenzellkarzinom (NCC) entwickelt. Bei der Um­ wandlung von GSF zu HCC bzw. NCC kommt es, wie schon vorstehend ange­ deutet, in der Leber zu enzymatischen Veränderungen, wobei Glukose bevorzugt über den Pentosephosphatzyklus und Glykolyse metabolisiert wird. Dabei nimmt dann das ursprünglich im Überschuß gespeicherte Glykogen allmählich ab, andererseits kommt es zu einer Zunahme der basophilen Ribosomen und der Zellvermehrung. Über die Zwischenstufe der MCF entsteht schließlich der basophile neoplastische Phänotyp. Durch verschiedene Untersuchungen wurde nachgewiesen, daß in den GSF das Stoffwechselmuster der Antwort der Hepa­ tozyten auf Insulin entspricht. Tatsächlich wurde bei diabetischen Ratten be­ obachtet, daß nach Transplantation von Inselzellen in die Leber, die unter diesen Bedingungen Insulin im Übermaß sezernierten, hepatozelluläre Neoplasmen entstehen. Insulin ist ein pleiotropes Hormon, das sich in Hepatozyten auf den Stoffwechsel sowie die Mitose auswirkt. Dies erfolgt durch eine Signaltransduk­ tionskaskade, bei der IRS-1 das intrazelluläre Substrat der Insulinrezeptortyrosin­ kinase darstellt. Die Überexpression von IRS-1 in HCC oder NCC konnte nach­ gewiesen werden. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, daß es bei Überexpres­ sion von IRS-1 in Leberzellinien zur Transformation der Zellen kommt. Bisher wurde jedoch die Expression von IRS-1 in frühen Stadien der Leber- und Nieren­ zellkrebsentstehung nicht untersucht.

In der vorliegenden Anmeldung wurde überraschenderweise festgestellt, daß in den frühen, glykogenspeichernden Krebsvorstufen (GSF, MCF) IRS-1 stark über­ exprimiert wird, während es im normalen Leber- und Nierengewebe nur in sehr geringen, histochemisch nicht nachweisbaren Mengen vorkommt. Während der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde in Ratten die Expression von IRS-1 in mehr als 400 präneoplastischen Foci von veränderten Hepatozyten (FAH) und in 12 hepatozellulären Karzinomen (HCC; induziert mit N-Nitrosomorpholin, NNM) mittels Westernblots und über immunhistochemi­ schen Nachweis untersucht. Mittels Westernblots konnte IRS-1 in der Leber von NNM-behandelten und unbehandelten Ratten nachgewiesen werden. IRS-1 war jedoch in normalem Leberparenchym immunhistologisch nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ergab der immunhistochemische Nachweis, daß IRS-1 beson­ ders in den GSF und MCF, die auch exzessiv Glykogen gespeichert hatten, überexprimiert wurde. Somit ist eindeutig, daß die Überexpression von IRS-1 in GSF und MCF zu einer präneoplastischen Glykogenose führt und ein frühes Ereignis bei der Karzinogenese darstellt. Während der Progression der frühzeitig auftretenden GSF zu MCF, BCF und HCC bzw. NCC wird dann die Expression von IRS-1 wieder herunterreguliert. Dabei wird der präneoplastische insulinomi­ metische Phänotyp allmählich in den malignen neoplastischen Phänotyp umge­ wandelt. Diese im Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse decken sich auch mit den bisherigen Untersuchungen am Menschen, so daß die obigen Ergebnisse voll übertragbar sind. Somit kann die Überexpression von IRS-1 als ein spezifischer Marker für frühe Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber und Nieren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Leber- oder Nierengewebeprobe bzw. daraus gewonnene Nukleinsäu­ ren mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die Gegenwart von IRS-1 in glykogenetischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das Reagenz nachweist.

Die für das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren verwendbaren Nachweisver­ fahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen immunhistochemische Nach­ weisverfahren (z. B. die APAAP-Methode) oder den Nachweis von IRS-1 mittels geeigneter Nukleinsäure-Sonden, da die Gegenwart von überexprimiertem IRS-1 mit einer stark erhöhten Konzentration der entsprechenden RNA korreliert ist.

Die für IRS-1 codierende cDNA wurde von Sun et al., Nature 352, S. 72-77 (1991) veröffentlicht und es ist für einen Fachmann in Kenntnis dieser Sequenz kein Problem die geeigneten Sonden zum Nachweis der IRS-1 mRNA auszuwäh­ len und zu konstruieren. Dafür kommt die dem Fachmann bekannte in-situ Hybrisidierung, Northern Blot oder Dot Blot in Frage.

Die Nachweisverfahren umfassen die Entnahme einer Gewebeprobe der Leber, die Herstellung von Gewebeschnitten, die Inkubation der Gewebeschnitte mit einem für IRS-1 spezifischen Reagenz und die Sichtbarmachung der erhaltenen spezifischen Komplexe in den Gewebeschnitten.

Die Entnahme der Gewebeprobe der Leber kann durch verschiedene, dem Fach­ mann bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Feinnadelbiopsie oder laparoskopischer Biopsie. Für die anschließende Behandlung mit dem für IRS-1 spezifischen Reagenz werden Gewebeschnitte nach üblichen Verfahren herge­ stellt, beispielsweise mittels Gefrierschnitt. Im Anschluß daran werden die präparierten Gewebeschnitte mit dem für IRS-1 spezifischen Reagenz behandelt.

Zu geeigneten Reagenzien für das erfindungsgemäße Verfahren zählen IRS-1 spezifische Antikörper sowie mit IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäure- Sonden (DNA oder RNA).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gewebeprobe mit einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, die IRS-1 erkennen können, als Reagenz in Berührung gebracht und so dann bestimmt, ob der Antikörper oder das Frag­ ment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.

Verfahren zur Gewinnung solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise bezüglich der polyklonalen Antikörper die Verwendung von IRS-1-Präparaten zur Immunisierung geeigneter Tiere und die Gewinnung von Serum. Ein geeigneter polyklonaler Antikörper ist beispielsweise ein gegen IRS-1 gerichteter Antikörper wie er von der Firma Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA erhältlich ist.

Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein monoklonaler Antikör­ per oder ein Fragment davon eingesetzt. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Dazu werden beispielsweise Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und kloniert. Anschließend wird ein Klon selektioniert, der einen Anti­ körper produziert, der für IRS-1 spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels IRS-1 nach dem Enzym-Antikör­ per-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Klone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Klone werden BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoklonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktio­ nierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinität­ schromatographie) gereinigt. Der gewonnene Antikörper kann direkt verwendet werden oder es kann ein Fragment davon verwendet werden. In diesem Zu­ sammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoklonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humani­ sierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper oder ein Fragment davon.

Nach Behandlung des Gewebeschnitts mit dem Antikörper erfolgt eine Weiterbe­ handlung zur Sichtbarmachung und Lokalisation der immunhistochemischen Reaktion durch spezielle Reagenzien, die mit bestimmten Enzymen, Fluoreszenz­ farbstoffen oder radioaktiven Verbindungen markiert sind. Die Auswertung der spezifisch angefärbten Gewebeschnitte erfolgt bevorzugt visuell mittels mikro­ skopischer Vergrößerung. Dabei sind GSF durch eine übermäßige Speicherung von Glykogen gekennzeichnet, das am alkoholfixierten Gewebeschnitt durch Behandlung mit dem Perjod-Schiff's Reagenz als rote Granula im Zytoplasma der Leberzellen dargestellt ist. Die MCF zeichnen sich durch eine Mischung von rotgefärbten Glykogenspeicherzellen und glykogenärmeren Zellen aus, die im Extremfall kein Glykogen mehr enthalten und dann durch Gegenfärbung der Schnitte mit basischen Farbstoffen, z. B. Toluidinblau oder Cuprolinblau, die im Zytoplasma vor allem die Ribosomen anfärben, als blaue Zellen in Erscheinung treten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als IRS-1 nachweisendes Reagenz eine mit der IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäuren-Sonde einge­ setzt. Der Nachweis erfolgt über die dem Fachmann bekannte in-situ Hybrisidie­ rung, Northern Blot oder Dot Blot. Diese Verfahren sind dem Fachmann hinrei­ chend bekannt und es ist ihm auch vertraut aus den Gewebeschnitten mRNA zu gewinnen. In diesem Zusammenhang sei auf Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); DNA Cloning, Vol. I und II (D.N. Glover eds., 1985) und Nucleic Acid Hybridisation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984) hingewiesen.

Die gebildeten Komplexe zwischen IRS-1 und Reagenz können dadurch sichtbar gemacht werden, daß ein anders markiertes Reagenz oder andere Substrate verwendet werden. Beispiele für geeignete Märkierungen sind Enzyme (Per­ oxidase, Galaktosidase), fluoreszierende (Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin­ isothiocyanat) oder radioaktive Verbindungen. Neben farbigen Substraten (Bro­ mo-Chloro-Indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium,Diaminobenzidin,Aminoethyl­ carbazol) können alternativ auch lumineszierende Verbindungen (Dioxetane) angewendet werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur Bestimmung von Substanzen, die Leber- und/oder Nierenkrebs induzieren kön­ nen, wobei man sich die oben beschriebenen Beobachtungen zunutze macht, d. h. die zu untersuchende Substanz wird einem Tier appliziert, nach einem geeigneten Zeitraum wird eine Gewebeprobe entnommen, diese mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung ge­ bracht und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das Reagenz nachgewiesen. Das Vorhandensein von IRS-1 in GSF und/oder MCF läßt dann darauf schließen, daß die verabreichte Substanz hepato- bzw. nephrokarzinogen wirkt.

Dabei wird die zu untersuchende Substanz dem Tier, beispielsweise einer Maus, einem Kaninchen oder einer Ratte, in geeigneter Weise und in geeigneten Kon­ zentrationen appliziert. Bevorzugt wird eine Dosis von 10% der Dosis bei der nach einmaliger Gabe 50% der Versuchstiere sterben (L_D 50) appliziert, eventuell nach Sensibilisierung der Leber durch einmalige Gabe eines bekannten Karzino­ gens (z. B. Diethylnitrosamin). Nach einem Zeitraum von ca. 4 Wochen bis 4 Monaten werden Feinnadelbiopsien durchgeführt bzw. den getöteten Tieren Gewebeproben entnommen und die Gewebeschnitte hinsichtlich der Expression von IRS-1 in GSF und MCF untersucht. Dadurch sollte es im Vergleich zu den bisher gebräuchlichen Testverfahren (Langzeitversuch über 2-3 Jahre mit Tumor­ nachweis als Endpunkt) möglich sein, die Anzahl an Versuchstieren zu reduzie­ ren und den Zeitraum zwischen Applikation des potentiellen Karzinogens und Untersuchung der Versuchstiere zu verkürzen, da nicht bis zur Entstehung eines HCC oder NCC gewartet werden muß.

Von den Erfindern wurde überraschenderweise herausgefunden, daß auch in der Niere lange Zeit vor Ausbildung von Nierenzellkarzinomen glykogenotische Herde auftreten. Sie lassen sich im Prinzip wie die präneoplastischen Herde der Leber erfassen. Der Nachweis einer IRS-1 Überexpression kann damit auch zur Früh­ erkennung der Nierenkrebsentstehung eingesetzt werden. Dies gilt für Labortiere ebenso wie für den Menschen.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Durchführung der oben diskutierten Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein für IRS-1 spezifisches Reagenz, wie vorstehend definiert, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kit ebenfalls IRS-1, beispielsweise zur Durch­ führung einer Kontrollreaktion. Das Kit enthält außerdem noch weitere Reagen­ zien, die üblicherweise in immunhistochemischen Verfahren verwendet werden, wie Puffer, Träger, Marker usw.

Es kann davon ausgegangen werden, daß die Überexpression des IRS-1 nicht nur eine Begleiterscheinung bei der Entstehung des Leberkrebses ist, sondern auch damit ursächlich in Zusammenhang steht. Somit würde es die Repression der Überexpression an IRS-1 oder die Reduzierung der Menge an überexprimier­ tem IRS-1 bzw. dessen Inaktivierung erlauben, bereits in einem sehr frühen Stadium der Krebsentstehung therapeutische Maßnahmen zu ergreifen.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschreiben, welche zeigen:

Fig. 1 Westernblot-Analyse von Lebergewebe zum Nachweis von IRS-1

Spuren A-D, Westernblot-Analyse zum Nachweis des 165 kD IRS-1 in Homo­ genaten von unbehandeltem (Spur B) und mit N-Nitrosomorpholin-behandeltem (Spuren C + D) Rattenlebergewebe. Aliquots (10 µg) von zellulärem Gesamt­ protein wurden einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit polyklonalem anti-1RS-1-Antikörper (Fa. Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA) inkubiert. Der gebundene Antikörper wurde mit Ziegen-anti-Ka­ ninchen-IgG, welches mit alkalischer Phosphatase markiert war, nachgewie­ sen; Spur A, 3T3-Zellen (positive Kontrolle); Spur B, unbehandelte Rattenleber; Spur C, präneoplastische Rattenleber; Spur D, hepatozelluläres Karzinom; links, Molekulargewichtsmarker

Fig. 2 Immunhistochemische Analyse von Gewebeschnitten bezüglich der Korrelation des Glykogengehalts und der IRS-1-Expression

Die Korrelation von Glykogengehalt (bestimmt durch die PAS-Reaktion, A, E, G, I, K) und der Expression von IRS-1 (nachgewiesen in situ mit polyclonalem anti-IRS-1-Antikörper (Kaninchen), B, F, H, J, L) wurden untersucht. Die Spezifität der Immunreaktion (APAAP-Verfahren) wurde durch Substitution (C) und Kontrolle der Flüssigkeitsadsorption (D) in seriellen Gefrierschnitten von präneoplastischen (A-H) und neoplastischen (I-L) hepatozellulären Läsionen, die in Ratten mit N-Nitrosomorpholin induziert wurden, bestätigt. A, präneoplastische Glykogenoti­ sche Foci [], die eine deutliche positive Immunreaktion für IRS-1 zeigen, wäh­ rend in dem umgebenden Gewebe die Reaktion negativ ist (B, mit Cuprolin-Blau gegengefärbt), bei Substitution (C) und bei den Kontrollen der Flüssigkeitsad­ sorption, (D); E, gemischte Zell-Foci [], die sich aus glykogenotischen und glykogenarmen Zellen zusammensetzen, die eine Immunreaktion für IRS-1 zeigen (F); G, glykogenarme, basophile Zell-Foci [] innerhalb eines glykogenotischen Focus [], die mit einer positiven Immunreaktion für IRS-1 in glykogenotischen [], jedoch einer negativen Reaktion in einer glykogenarmen [] Zellpopulation assoziiert sind; I, Teil eines glykogenarmen, basophilen hepatozellulären Karzi­ noms in Nachbarschaft zu MCF [], assoziiert mit einer negativen Immunreak­ tion für IRS-1 (J), allerdings jedoch einer schwachen Immunreaktion in der präneoplastischen Zellpopulation []; K, Teil eines hepatozellulären Karzinoms, das relativ große Mengen an Glykogen enthält und das einige deutliche glykoge­ notische (klare) Zellen einschließt [], wobei sich eine Immunreaktion für IRS-1 zeigt, vor allem in glykogenotischen Zellen [].

Vergrößerung bei Fig. 1 und 2: 64×; Der Balken entspricht 100 µm; hv, kleine Lebervene
PAS, Periodsäure-Schiff'sche Reaktion; APAAP; Alkalische Phosphatase-anti-Alkalische Phosphatase.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren

Verwendete Tiere und Probeentnahme: Präneoplastsiche hepatozelluläre Läsio­ nen wurden in erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten durch eine begrenzte Exposition gegenüber oral verabreichtem NNM (Stop-Modell; 12 mg NNM pro kg Körpergewicht) über einen Zeitraum von 7 Wochen induziert. Das Gewebe von NNM-behandelten bzw. unbehandelten Ratten wurde 15 und 20 Wochen nach Absetzen von NNM entnommen. HCC wurden durch orale Ver­ abreichung derselben Dosis an NNM über einen Zeitraum von 10 Wochen oder einer geringeren Dosis (1 mg/kg Körpergewicht pro Tag) über einen Zeitraum von bis zu 73 Wochen erzeugt. Lebergewebe wurde bei -150°C schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. Serielle Gefrierschnitte (6 µm) wurden mit Haematox­ ylin und Eosin gefärbt oder mit PAS-T (Periodsäure-Schiff'sche Reaktion, Gegenfärbung mit Toluidinblau) zum Nachweis von Glykogen behandelt.

Beispiel 2 Westernblot-Analyse von Lebergewebe mittels anti-IRS-1-Antikörpern

Gefriergetrocknetes Lebergewebe wurde in Puffer lysiert, der 0,05 M TBS (Tris-ge­ pufferte Kochsalzlösung), pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM EGTA, 1 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pep­ statin, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 2,5% SDS und 5% 2-Mercaptoäthanol ent­ hielt. Zur Entfernung von Zelltrümmern wurde bei 4°C zweimal jeweils 10 min. bei 15 000 g zentrifugiert. Danach wurde 5 min. gekocht und eine PAGE unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Gradientengelen (4-15%) durchgeführt. Die Proteinauftrennung und die Überführung auf eine Nitrozel­ lulose-Membran (Hybond C^c, 0,45 µ, Amersham Int., Little Chaltfont, England) wurden mittels des "PhastSystem" von Pharmacia (Uppsala, Schweden) durch­ geführt. Im Anschluß daran wurde die Membran 20 min. mit fettfreier Trocken­ milch (3%) in PBS behandelt, 30 min. bei Raumtemperatur und zusätzlich 24 Stunden bei 4°C mit 3 µg/ml polyclonalem anti-IRS-1-Kaninchen-Antikörper (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) inkubiert, worauf die Inkuba­ tion mit 1,2 µg/ml mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-anti-Kanin­ chen-IgG erfolgte (90 min., RT; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Nach Behandlung mit 0,05% Twen-20 in PBS (15 min.) wurden Banden im Gel mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-Chlor-3-In­ dolylphosphat (Bachem Biochemica, Heidelberg, Deutschland) sichtbarge­ macht. Für Positivkontrollen wurde ein 3T3-Zellysat (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) verwendet (Fig. 1, Spur A).

Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Es zeigte sich, daß der verwendete Antikörper spezifisch an ein Protein mit etwa 165 kD gebunden war (Fig. 1, Spuren A-D). Dieses Molekulargewicht ist im Bereich von 165-180 kD, der dem Molekulargewicht von IRS-1 entspricht, das von verschiedenen Gruppen für IRS-1 aus verschiedenen Geweben bestimmt wurde. IRS-1 konnte deutlich sowohl in unbehandelten (Spur B), als auch in mit NNM behandelten Rattenlebern nach­ gewiesen werden (Spuren C und D). In der präneoplastischen Leber (Spur C), die viele FAH enthielt, die weniger als 5% der Parenchym-Fraktion besiedelten oder im HCC (Spur D) war eine Tendenz zu einer erhöhten Menge an IRS-1 im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zu beobachten.

Beispiel 3 Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 in Lebergewebe

Gefrierschnitte (6 µm) wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) befestigt, in 100% Methanol (15 min., -20°C) fixiert, mit Ziegenserum, 1 : 30 in TBS, abgeblockt und zuerst 30 min. bei RT, dann zusätzlich 24 Stunden bei 4°C mit 10 µg/ml anti-IRS-1-Antikörper inkubiert. Nach jedem der nachstehen beschriebenen Schritte wurden die Ge­ frierschnitte mit 0,05 M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) zweimal jeweils 3 min. ge­ spült. Anschließend wurden 18 µg/ml Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) und danach ein 1 : 10 verdünnter Kaninchen-APAAP-Komplex (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in zwei Zyklen dazugegeben. Nach Waschen mit destilliertem Wasser über einen Zeitraum von 5 min. wurden die Gefrierschnitte mit Neufuchsin gefärbt. Das Abblocken der endogenen alkalischen Phosphatase erfolgte durch Zugabe von 1,73 mM Levamisol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Einige der Gefrierschnitte wurden mit 1% Cuprolin-Blau (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) gegengefärbt. Schließlich wurden die Gefrierschnitte mit Glycerin- Gelatine bedeckt. Zum Nachweis der Spezifität der Immunfärbung wurde der primäre Antikörper in seriellen Gefrierschnitten gegen Affinitäts-gereinigtes IgG (10 µg/ml) (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) ausgetauscht. Zusätzlich zu dieser Substitutionskontrolle wurde in den Gefrier­ schnitten eine Flüssigkeitsadsorptionskontrolle nach Vorinkubation des anti-IRS-1-An­ tikörpers mit dem entsprechenden immunisierenden Peptid (Ratten-IRS-1-Pep­ tid, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) über einen Zeitraum von 3 Stunden bei RT und bei einem Mengenverhältnis von 1 : 10 g/g durch­ geführt. Beide Kontrollen erwiesen sich als negativ.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen sind in Fig. 2 dargestellt. Wie in (A) zu sehen ist, kann IRS-1 in normalem Leberparenchym immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis läßt sich dadurch erklären, daß in normalen Hepatozyten nur eine sehr geringe Menge an IRS-1 enthalten ist. Im Gegensatz dazu zeigt jedoch die Mehrzahl der präneopla­ stischen FAH eine mehr oder weniger starke Immunreaktion bezüglich IRS-1. Die Immunreaktion ist auf das Zytoplasma beschränkt, wobei sich gelegentlich eine auffallende perinucleäre Lokalisation zeigt. Insgesamt wurden über 400 FAH untersucht und entsprechend den veröffentlichten Kriterien in die Klassen GSF, MCF und BCF eingeteilt. Die IRS-1-Expression war besonders deutlich in den früh auftretenden GSF (Fig. 2A + B). Von den 93 untersuchten GSF waren 96% positiv bezüglich IRS-1. In den sich etwas später entwickelnden MCF war IRS-1 immunhistochemisch ebenfalls eindeutig nachweisbar (Fig. 2E + F). 97% der beobachteten MCF waren ebenfalls positiv,allerdings war die Expression von IRS-1 nicht ganz so stark im Vergleich zu den GSF. Die Stärke der Immunreak­ tion bezüglich IRS-1 war eng mit der Anzahl der Glykogen-speichernden Zellen innerhalb der FAH korreliert. Die Immunreaktion nahm mit dem zunehmenden Ersatz der glykogenotischen durch Glykogen-arme basophile Zellen ab, was ein Anzeichen dafür ist, daß eine grundsätzliche Verschiebung des Metabolismus beim Übergang von frühen zu späten FAH stattfindet. Dies ist in Übereinstim­ mung mit früheren Beobachtungen. FAH, die ausschließlich aus basophilen Zellen bestanden, werden kaum beobachtet, jedoch waren von den 6 aufgefun­ denen BCF alle negativ bezüglich IRS-1 (Fig. 2G + H). Dies trifft ebenfalls auf die Mehrheit der 12 untersuchten HCC zu, in denen Glykogen-arme basophile Zellen vorherrschten (Fig. 2I + J). Lediglich in 3 HCC konnte eine schwache Anfärbung für IRS-1 beobachtet werden, die Immunreaktion war jedoch auf hochdifferen­ zierte Zell-Subpopulationen beschränkt, die immer noch etwas Glykogen enthiel­ ten (Fig. 2K + L).

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überexpression von IRS-1 ein frühes Ereignis bei der Karzinogenese der Leber darstellt, das mit der Akkumulation von Glyko­ gen in GSF und MCF eng korreliert ist. Diese Korrelation betrifft nicht nur die gesteigerte Expression von IRS-1 in glykogenotischen Zellen des Typs GSF und MCF, sondern auch die praktisch zeitgleich damit einhergehende Reduktion sowohl der IRS-1-Überexpression und der Glykogenakkumulation während des Auftretens von entdifferenzierten basophilen Zellen in MCF, BCF und hepatozel­ lulären Neoplasmen. Es kann ausgeschlossen werden, daß der starke Zusam­ menhang zwischen IRS-1-Expression und der Glykogenakkumulation durch eine unspezifische Bindung des Antikörpers an das Glykogenmolekül bedingt ist, und zwar anhand der nachstehenden Beobachtungen. Obwohl beträchtliche Mengen an Glykogen auch in den extrafocalen Hepatozyten von NNM-behandelten Tieren (Fig. 2A) und im Parenchym von unbehandelten Kontrolltieren gespeichert wur­ den, war die Immunreaktion für IRS-1 in diesen Bereichen des Parenchyms grundsätzlich negativ (Fig. 2B). Darüber hinaus wurde Glykogen während der einzelnen Schritte der immunhistochemischen Verarbeitung ausgewaschen, vor allem während der hohen Anzahl an Waschschritten. Dies konnte dadurch verifiziert werden, daß in denselben Gefrierschnitten sowohl eine Immunreaktion als auch die PAS-Reaktion durchgeführt wurden. Bei der Durchführung der PAS-Reaktion nach der Immunreaktion enthielten die Schnitte einschließlich der IRS-1-positiven Foci kein Glykogen mehr. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Phänotyp der frühen Phase der Entstehung des Leberkrebses, d. h. die präneoplastische Glykogenose in der Leber, durch eine Überexpression von IRS-1 bedingt ist.

Claims (13)

1. Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in Leber und/oder Niere, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Leber- oder Nierengewebe­ probe bzw. daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das Insulin- Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder ge­ mischtzelligen Foci (MCF) nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Anti­ körper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ein monoklona­ ler Antikörper oder ein Fragment davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper ein Mausantikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein Fragment davon.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Reagenz mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindun­ gen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz zum Nachweis von IRS-1 eine mit einer für IRS-1 codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nu­ kleinsäure ist.

7. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiertes Reagenz enthält und andere Puffer, Lösungen, Vorrichtungen oder Träger, die üblicherweise in immunologischen oder molekularbiologi­ schen Nachweisverfahren verwendet werden.

8. Verfahren zur Bestimmung von hepato- oder nephrokarzinogenen Substan­ zen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz einem Tier appliziert, nach einem geeigneten Zeitraum eine Gewebeprobe entnimmt, diese bzw. daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) nachweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Anti­ körper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Antikörper ein monoklona­ ler Antikörper oder ein Fragment davon ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ein Mausantikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein Fragment davon.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Reagenz mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindun­ gen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Reagenz eine mit einer für IRS-1 codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure ist.