DE19735926C2 - Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen.

NADH, die reduzierte Form von NAD⁺ (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid), ist als wasserstoffübertragendes Coenzym an der Energiegewinnung in der Zelle maßgeblich beteiligt und zeigt bei Anregung mit Licht von 337 nm eine natürliche Fluoreszenz. Diese kann zur Charakterisierung des zellulären Energiestoffwechselzustandes benutzt werden.

Die quantitative Messung der NADH-Eigenfluoreszenz ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung des Energiestoffwechsel­ zustandes zellulärer Systeme.

Für die Durchführung entsprechender Untersuchungen wurde daher eine Zahl verschiedener Meßanordnungen vorgeschlagen, die sich im wesentlichen in zwei Kategorien gliedern. In Mikroskop-Anordnungen (vorzugsweise in Epifluoreszenz-Konfiguration); und in faseroptische Systeme.

Als Anregungs-Lichtquellen kommen entweder Quecksilberdampf-Lampen (365-nm-Linie) für Gleichlicht-(CW-)Anregung oder Stickstofflaser (337-nm- Linie) für gepulste Anregung zur Anwendung.

Ziel aller speziellen Anordnungen zur Fluoreszenz-Messung von NADH ist eine möglichst hohe Ausbeute an Fluoreszenz-Photonen. Diese Ausbeute wird in der Hauptsache durch eine optimierte Anregung und durch zweckmäßige Gestaltung des Detektorsystems erreicht.

Hinsichtlich der Anregungsbedingungen besitzen Quecksilberdampf-Lampen gegenüber dem Stickstofflaser gravierende Nachteile. Die Anregung erfolgt weit ab von der maximalen Absorptionswellenlänge des NADV von 337 nm und mit im Vergleich zu Lasern geringen Intensitäten. Zugleich führt der CW- Betrieb zu einem erheblichen, die Ergebnisse verfälschenden Photobleaching des untersuchten Fluorophors, was bei Anregung mittels gepulster Stick­ stofflaser (Pulsdauer typisch 1 ns) vermieden wird.

In beiden Fällen erfolgt die Anregung jedoch während eines einmaligen (bei speziellen Anordnungen auch doppelten) Durchgangs des Anregungslichtes durch die zu untersuchende Probe. Dies hat einen sehr geringen Anregungs- Wirkungsgrad zur Folge. Einer möglichen Erhöhung der Anregungsintensität sind durch dann einsetzende photochemische und thermische Schädigungen der zu untersuchenden Zellproben Grenzen gesetzt.

Die Detektion des isotrop emittierten Fluoreszenzlichtes erfolgt bei Mikroskopanordnungen nur im Aperturkegel des eingesetzten Mikroskopobjektives. Dadurch wird nur ein geringer Teil der emittierten Photonen tatsächlich erfaßt. Anordnungen mit speziell ausgebildeten Spiegeln im hinteren Proben-Halbraum gestatten gegebenenfalls eine Detektion mit annähernder 2π-Geometrie (s. beispielsweise "Studies of the Metabolism of Cell Cultures by Microspectrofluorometry" Höhne; Schramm; Moritzen; Burgmann; Kronfeldt in "Optical and Imaging Technics for Biomonitoring", Proceedings SPIE, Vol. 2628 (1996), S. 90 bis 94).

Zu berücksichtigen ist bei der Gestaltung des Detektorsystems weiter die kurze Fluoreszenz-Abklingzeit des NADH von ca. 600 ps, die den Einsatz spezieller schneller Detektoren erfordert.

Vorteilhaft gegenüber Mikroskop-Anordnungen ist der Einsatz von faseroptischen Meßanordnungen (s. beispielsweise "Fibre-optical Approach to the Fluorescence Spectroscopy of Cell Cultures" Höhne; Schramm; Moritzen; Burgmann; Kronfeldt in BiOS Symposium Wien 1996, Proc. SPIE, Vol. 2927 (1996), S. 99 bis 105). Sie gestatten die simultane Detektion der Fluoreszenz von einer größeren Anzahl von Zellen (typisch 1000 Zellen gegenüber typisch 5 bis 10 Zellen beim Mikroskop). Dies führt zu einer höheren Photonenausbeute, da ein größerer Fluorophor-Pool erfaßt wird und bei gleicher lokaler Energiedichte am Probenort mit einer erheblich höheren integralen Anregungsenergie gearbeitet werden kann. Als Folge davon ergibt sich außerdem ein wesentlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis. Bezüglich der Gestaltung der Detektoranordnung bestehen jedoch bei den Faseranordnungen die von Mikroskop-Anordnungen bekannten Nachteile der einmaligen Anregung, der kleinen Anregungsfläche und der begrenzten Detektorapertur. So wird mit Faseranordnungen bei einem Detektionsareal von typisch 1 mm² nur ein geringer Teil des in der Zellkultur einer Flächenausdehnung von größer 100 mm² zur Verfügung stehenden Fluorophor-Pools tatsächlich bei der Messung erfaßt.

Aus der Photometrie ist das Prinzip der ULBRICHTKUGEL (auch als "Integrierendes Photometer" bezeichnet) bekannt. Diese Anordnung besteht aus einer Hohlkugel mit ideal diffus reflektierender Innenfläche, in deren Wand ein Photonendetektor eingesetzt ist. In dieser Kugel bildet sich ein absolut homogenes und isotropes Photonenfeld aus, dessen Intensität mit hoher Präzision aus dem Verhältnis von Detektorfläche zu Kugelinnenfläche bestimmt werden kann. In typischen Anwendungen befindet sich das photometrisch oder spektroskopisch zu untersuchende Objekt innerhalb der Kugel. Ist das zu untersuchende Objekt nicht selbstleuchtend, erfolgt die Beleuchtung durch ein weiteres Fenster mit einer externen Lichtquelle. Besonders vorteilhaft ist die 4π-Detektionsgeometrie sowie die Homogenität des Lichtfeldes an allen Punkten des Untersuchungsobjektes. Bei den bisher verwendeten Meßanordnungen (s. z. B. W. Schmidt, "Optische Spektroskopie", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1994, S. 91 bis 93) mit Ulbrichtkugeln wurden ausschließlich Gleichlichtquellen für die externe Beleuchtung ein­ gesetzt.

Es ist eine Anordnung zur Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz von Pflanzen aus EP 0 354 745 A2 bekannt, bei der eine aus zwei Halbschalen bestehende Ulbrichtkugel verwendet wird. Dabei wird die Kugel zum Einbringen der Pflanzenprobe geöffnet und mittels einer Gummidichtung wieder licht- und gasdicht verschlossen. Für die rechnergesteuerte Messung der Fluoreszenz wird eine geregelte Gleichlichtquelle benutzt, in deren Strahlengang ein mechanischer Unterbrecher und Kantenfilter angeordnet sind, die die Anregungswellenlänge auf den blauen Bereich beschränken.

In Rev. Sci. Instrum., 59, 1988, Seiten 934 bis 936 wird ein mit ähnlichen Anregungs- und Nachweismitteln ausgestattetes integrierendes Fluorimeter beschrieben, bei dem eine geschlossene Ulbrichtkugel benutzt wird, die zwei Öffnungen in der Kugelkalotte aufweist, durch die das Probenmaterial eingebracht werden kann: lebende Pflanzenteile durch die eine Öffnung oder in einem Probenglasröhrchen befindliche Suspensionen durch die andere.

In US 4,395,126 wird eine weitere Fluoreszenzeinrichtung mit geschlossener Ulbrichtkugel beschrieben, deren Innenauskleidung abweichend von der sonst üblichen so modifiziert wurde, daß die Wellenlänge des Anregungslichtes stark absorbiert wird, während das Fluoreszenzlicht in üblicher Weise stark reflektiert wird. Für die Anregung wird eine Blitzlampe eingesetzt, deren Impulsdauer mit 10^-8 Sekunden relativ kurz ist. Auch diese Anordnung ist nicht für die Laserfluoreszenzmessung an ausgedehnten Zellkulturschichten geeignet.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, eine Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen anzugeben, die eine effektive Fluoreszenz-Anregung der Zellkultur mit Impulslicht von 337 nm ermöglicht, die meßtechnische Erfassung der gesamten Zellkultur mit einer Messung gewährleistet und bei der die Detektion der Fluoreszenz vorteilhaft in 4π- Geometrie erfolgt.

Die Aufgabe wird durch eine Anordnung zur Messung der NADH- Eigenfluoreszenz von Zellkulturen mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die Perfusionskammer mit der zu untersuchenden Zellkultur, welche an der Unterseite des Deckglases aufgewachsen ist, ist in einer Ulbrichtkugel angeordnet. Impulslicht zur Fluoreszenzanregung tritt über die Eintrittsöffnung in die Ulbrichtkugel ein. Bei entsprechender Dimensionierung der Kugel, z. B. einem Durchmesser von 5 cm, stellt sich innerhalb von typisch 5 ns nach der Pulseinkopplung durch diffuse Vielfachreflexion an den Kugelwänden ein fast ideal homogenes und isotropes Anregungslichtfeld im Kugelinneren ein, das in Abhängigkeit von den Absorptionsverlusten auf der Kugelwand langsam exponentiell abklingt. Bei geeigneter Wahl der Kugelbeschichtung ergibt sich so eine sehr geringe Abklingrate des Anregungsfeldes, die eine hohe Zahl von Durchgängen des Anregungslichtes durch die Zellkultur (typisch 50 bis 100 Durchgänge in einem Zeitraum von der Länge der Abkling-Zeitkonstante) ermöglicht. Daraus folgt ein hoher Anregungswirkungsgrad. Wegen der räumlichen Homogenität des Lichtfeldes in der Kugel wird zudem die gesamte Zellkultur gleichmäßig zur Fluoreszenz angeregt.

Die Kammer ist an den Stirnseiten mit Scheiben aus UV-durchlässigem Glas abgeschlossen, deren Außenflächen mit einer reflexionsmindernden Schicht versehen sind. Das Deckglas der Perfusionskammer ist abnehmbar und als Zuchtplatte der zu untersuchenden Zellkulturen ausgebildet.

Die Detektion des von der Zellkultur emittierten Fluoreszenzlichtes erfolgt mittels eines unmittelbar an der Austrittsöffnung der Kugel plazierten Impulsdetektors. Zur Unterdrückung des höherfrequenten Anregungslichtes ist in der Detektorapertur ein optisches Kantenfilter angeordnet. Als Detektor ist in Ausführungsformen sowohl ein Photomultiplier für integrale als auch ein Polychromator für spektral aufgelöste Messungen vorgesehen. In beiden Fällen wird eine Detektion der isotrop emittierten Fluoreszenzphotonen in 4π- Geometrie erreicht. Durch die diffuse Vielfachreflexion der Fluoreszenzphotonen an der Kugelinnenwand erhöht sich die Integrationszeit und die Detektionswahrscheinlichkeit. Wegen der langen Abklingzeitkonstan­ ten für das Anregungs- und Fluoreszenz-Lichtfeld (typisch 100 ns) können vergleichsweise langsame, aber empfindliche Detektoren zum Einsatz kommen.

In einer Weiterbildung erfolgt die Anregung der in der Perfusionskammer befindlichen Zellkultur mittels eines Impulslasers, insbesondere mittels eines Stickstofflasers.

Eine weitere Ausbildung der Erfindung betrifft die Perfusionskammer. So ist die Perfusionskammer zylinderförmig ausgebildet, wobei der Durchmesser des Zylinders wesentlich größer ist als seine Höhe.

Die erfindungsgemäße Lösung gestattet, die NADH-Fluoreszenz einer gesamten Zellkultur sehr empfindlich zu messen und vereinfacht die integrale Ermittlung des Energiestoffwechselzustandes einer Zellkultur wesentlich.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung soll anhand einer Zeichnung näher erläutert werden.

Dabei zeigt die einzige Figur schematisch die Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen.

In dem Ausführungsbeispiel der Erfindung weist die Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen eine Ulbrichtkugel 1 auf, die sich aus den beiden Kugelhalbschalen 11 und 12 sowie dem Zylinderring 131 zusammensetzt, der Bestandteil der Perfusionskammer 13 ist. Diese Ulbrichtkugel 1 ist auf der Innenseite mit einem hochreflektierenden Belag 111, 121, 1311 ausgekleidet. Die zylinderförmige Perfusionskammer 13 ist in der Äquatorialebene der Ulbrichtkugel 1 angeordnet. Die Perfusionskammer 13 besteht aus einem Zylinderring 131, dessen Innendurchmesser mit dem der Ulbrichtkugel 1 übereinstimmt, und zwei planparalell angeordneten Glasscheiben 132 und 133, von denen die obere Glasscheibe 133 für das Aufbringen und Einsetzen der Zellkultur 1332 abnehmbar ausgebildet ist. Beide Scheiben sind aus UVA-durchlässigem Material gefertigt und tragen auf ihren Außenflächen reflexionsmindernde Schichten 1321 und 1331, um die Fresnel-Reflexion an den Glas-Luft-Grenzflächen zu minimieren. An den Innenseiten ist eine hinreichende Brechungszahl-Anpassung durch die Füllung der Kammer mit der wässrigen Nährlösung gegeben. Die Nährlösung kann über die Einlauföffnung 134 und die Auslauföffnung 135 zugeführt bzw. ausgetauscht werden.

Durch die Eintrittsöffnung 122 der Ulbrichtkugel 1 gelangt das Licht eines Impulslasers 2, z. B. eines Stickstoffimpulslasers mit einer Wellenlänge von 337 nm und einer Impulsbreite von 0,5 ns, über optische Anpassungs- und Einkoppelungselemente 3, z. B. eine Einkoppelungslinse 31 und eine Lichtleitfaser 32, in den Innenraum der Ulbrichtkugel 1.

An die Austrittsöffnung 123 der Ulbrichtkugel 1 ist der Impulsdetektor 4 angekoppelt, der im dargestellten Beispiel aus einem Photoempfänger 42, beispielsweise einem Photomultiplier (PMT), mit vorgeschaltetem Kantenfilter 41 zur Blockierung der Anregungswellenlänge von 337 nm, einem Impulsverstärker 43 mit Torschaltung 431, einer Sample & Hold-Schaltung 44 und einem A/D-Wandler 45 besteht.

Die Impulselektronik kann andererseits (hier nicht dargestellt) auch durch einen an die Austrittsöffnung 123 angekoppelten Polychromator gebildet sein, an dessen Ausgang ein CCD-Empfänger mit der entsprechenden CCD- Steuerelektronik angeordnet ist.

Ferner ist ein Triggergenerator 5 vorhanden, der den Impulslaser 2 und mit einstellbarer Verzögerungszeit die Torschaltung 431 am Eingang des Impulsverstärkers 43 auslöst, so daß der Signalverlauf erst dann vom Impulsverstärker 43 aufgenommen wird, wenn sich nach Einkopplung des Laserimpulses eine homogene, isotrope Lichtverteilung in der Ulbrichtkugel 1 eingestellt hat.

Claims (5)

1. Anordnung zur Messung der NADH-Eigenfluoreszenz von Zellkulturen, aufweisend eine Ulbrichtkugel (1) mit mindestens je einer Eintrittsöffnung (122) und einer Austrittsöffnung (123), einem Mittel zur Anregung der NADH- Eigenfluoreszenz mit Impulslicht und Mitteln zur Messung und Auswertung der Intensität der NADH-Eigenfluoreszenz, wobei in der Äquatorialebene der aus zwei Kugelhalbschalen (11, 12) bestehenden Ulbrichtkugel (1) eine zylinderförmig ausgebildete, sich über die gesamte Äquatorialebene der Ulbrichtkugel (1) erstreckende Perfusionskammer (13) angeordnet ist, deren parallel zur Äquatorialebene liegende Stirnflächen aus Glasscheiben (132, 133) aus UV-durchlässigem Glas gebildet sind, wobei die Außenflächen der Glasscheiben (132, 133) mit einer reflexionsmindernden Schicht (1321, 1331) versehen sind, und eine Glasscheibe (133) als Deckglas abnehmbar und als Zuchtplatte der zu untersuchenden Zellkulturen (1332) ausgebildet ist, und die Perfusionskammer (13) eine in der Äquatorialebene liegende von außen zugängliche Einlauföffnung (134) und eine von außen zugängliche Auslauföffnung (135) für die Versorgung der lebenden Zellkulturen (1332) mit einer Nährlösung aufweist und die Mittel zur Messung und Auswertung der Intensität der NADH-Eigenfluoreszenz der lebenden Zellkulturen (1332) einen als Photoempfänger (42) ausgebildeten Impulsdetektor (4) mit davor angeordnetem Kantenfilter (41) aufweisen, an den der Reihe nach ein mit einer Torschaltung (431) versehener Impulsverstärker (43), eine Sample & Hold-Schaltung (44) und ein Analog-Digital-Wandler (45) angeschlossen sind.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Impulsdetektor (4) als Polychromator mit nachgeschaltetem CCD- Empfänger und CCD-Steuerelektronik ausgebildet ist.

3. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Anregung der NADH-Eigenfluoreszenz der in der Perfusionskammer (13) befindlichen Zellkulturen (1332) mit Impulslicht ein Impulslaser (2) ist.

4. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Impulslaser (2) ein Stickstofflaser ist.

5. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zylinderförmig ausgebildeten Perfusionskammer (13) wesentlich größer als ihre Höhe ist.